Name: בנייה ואפיון של Bioreactor פולד רומן וקאלי (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-08-01T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 11 s
Description: חקור את השפעת הגירוי הרטטי על תאי גזע מזנכימליים באמצעות ביוריאקטור המחקה פונציה. השיטה משתמשת בסקפולדים מ-PCL וממברנות סיליקון לניתוח תגובות תאיות ברמות החלבון והתרגום.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים לד&quot;ר ג&#39;פרי קפלן לאימונים שלו וייעוץ על ההדמיה confocal. אנו מודים גם למעבדת קק מיקרוסקופית אלקטרונים וד&quot;ר Chaoying Ni לקבלת סיוע SEM. עבודה זו ממומנת על ידי המכון הלאומי לבריאות (NIDCD, R01DC008965 וR01DC011377). ABZ מודה אינטגרטיבית השכלה בוגרת ותכנית (IGERT) למימון המחקר Traineeship NSF.

1. Bioreactor עצרת (וידאו 1) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך תבנית אלומיניום (למות עגול + סיכת spacer) עם ממדים פנימיים וחיצוניים שנקבעו מראש (איור 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש בעובש משלב 1.1, לפברק קרום סיליקון (קוטר: 42 מ&quot;מ, עובי: 1.5 מ&quot;מ, איור 1) עם שרוול מושרש (קוטר: 12 מ&quot;מ, עובי ~ 0.25 מ&quot;מ, מעוצב על ידי סיכת spacer באיור 1) ב האמצע באמצעות ערכת אלסטומר סיליקון זמינה מסחרי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך זוג לוקי אקרילי (איור 2 (4, 5)) עם פתח עגול (קוטר: 24 מ&quot;מ) באמצע, לחרוט את החלק העליון (1.8 ס&quot;מ עובי) ותחתון (0.9 ס&quot;מ עובי) בלוקים עם רכסים וחריצים התאמה . 10 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כריך קרום סיליקון בין גושי אקריליק לזווג. אבטח את ההרכבה עם ארבעה ברגי פינה באמצעות מברג מומנט מיקרו להגדיר לכוח קבוע (35 CN · מ &#39;). כתוצאה מכך,, מ &#39;24 מים חזקקאמרי רטט עמוק מ &#39;רוחב ו18 מ&quot;מ נוצר (איור 2 ג). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הר 3 מיני וופר טווח ארוך &quot;(איור 2 ד, 8 Ω/20 W) מתחת לתא הרטט דרך קבוצה נוספת של ברגי פינה בשכונה אקריליק התחתונה. בשלב זה, מודול רטט אישי מורכב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשכפל שבעה מודולים רעידות נוספים. להדביק ארבעה מהם לאחת משני ברים נייחים אלומיניום (40 סנטימטר x 10 סנטימטר x 2.5 סנטימטר) על ידי הצבת בסיסי הרמקול בחורים במרווחים שווה עגולים (קוטר: 7 סנטימטר, עובי: 2 סנטימטר) חתוך לסורגים. לייצב את כל רמקול על ידי החדרת ברגים דרך הצד של בר האלומיניום לתוך כל חור עגול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בנפרד לשלוט ברמקולים על ידי בורר רמקולים. חבר רמקולי פרט לבורר על ידי הצמדת חוטים לכניסות החיוביות ושליליות על גוף הרמקול אז ליציאות המתאימות בבורר. בורר הרמקול מאפשר את האות מ tהוא מחולל אותות, לאחר שעברו דרך מגבר כוח, כדי להגיע לכל שמונת רמקולים בבת אחת (2E איור). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס את שני המערכים קאמריים, בורר הדובר והאלקטרוניקה קשורה במארז אנטי לחות. בית כולו ההרכבה בתרבית תאי חממה מסחרית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להאכיל את הכבלים הראשיים (דרך צינורות PVC כיתה רפואית) המחבר את מגבר הכוח ובורר רמקול באמצעות ההרכבה המסנן בחלק האחורי של החממה. </li></ol> 2. ייצור פיגום ואפיון <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפזר כדורי PCL בכלורופורם בריכוז של 15% WT. טען את הפתרון לתוך מזרק 10 מיליליטר כתרים עם מחט קהה הסתיים 21 G. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נעל את המזרק על משאבת מזרק לתכנות ולקבוע את קצב הזרימה ב1 מיליליטר / שעה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את האספן מכוסה רדיד האלומיניום מול המחט אופקית, עם מרחק קצה מחט לאספן של ~ 18 סנטימטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הצמד את alli החיוביקליפ תנין לאמצע של המחט, וקליפ תנין הקרקע לאספן האלומיניום, ולאחר מכן קבע את המתח באספקה ​​החשמל במתח הגבוה ב15 KV. זהירות: מתח גבוה, מרחק לשמור מהמחט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רצף להפעיל את משאבת המזרק ואספקת חשמל; מהירות נקי / להסיר את פתרון הפולימר השיורי המקיף את קצה המחט באמצעות מגבת נייר יבשה לפני שמטוסי סיבים יציבים וקונוס טיילור 19 נוצרים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאפשר הסיבים מצטברים על אספן אל לעובי של ~ 250-300 מיקרומטר (~ 7 שעות בתנאי ספינינג הנוכחיים). אחסן את הפיגומים שנוצר בייבוש ואקום ל1-2 ימים כדי להסיר כל ממס שיורית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תמונת הפיגומים, גמגום מצופים בזהב, תוך שימוש במיקרוסקופ אלקטרוני סורק כדי להראות מורפולוגיה סיבים עקבית. 10 </li></ol> 3. עצרת Bioreactor ואפיון <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אגרוף דיסק גלילי (קוטר: 8 מ&quot;מ) עם ארבע זרועות (אורך: 2מ&quot;מ) מחוץ למזרן PCL כ- סובב (איור 2 א) על ידי השימוש ראשון ביופסיה בקוטר מ&quot;מ 12 לחתוך את הקוטר החיצוני של הדיסק. לאחר מכן להשתמש בביופסיה שנייה, 8 מ&quot;מ לעשות חריצים ארוכים ארבעה 2 מ&quot;מ מחולקים באופן שווה סביב הלהב המעגלי להבקיע בי הזרועות הן להיחתך. לאחר הבקיע עם אגרוף 8 מ&quot;מ, השתמש בלהב סכין מנתחים כדי לחתוך את הקצוות של הזרועות כלפי חוץ. הכנס את הפיגום לתוך החריץ של קרום סיליקון באמצעות זרועות המורחבות (וידאו 1). שטח את הפיגום מוחדר בעדינות על ידי הלחיצה על המשטח באמצעות פינצטה השטוחה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צרף חתיכה קטנה של רדיד אל הדק (8 מ&quot;מ x 2 מ&quot;מ, צורה מאונך, איור 2) לפיגום PCL כדי לסייע השתקפות לייזר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אבטח את הקרום / הפיגום התאסף סיליקון PCL (כמפורט בשלב 1.4) בחדר הרטט. הוסף 1.5 מיליליטר מים בחדר כדי ללחלח את פיגום PCL לפני הרטט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות מחולל הפונקציה, להציג את רטט סימןals (למשל, גלי סינוסי 200 הרץ עם מתח שיא לשיא, VPP, של 0.1 V) לתא אקריליק דחוק. השתמש במד מתח כדי למדוד את המתח בצורה מדויקת בכל קלט רמקול. הערה: את הודעת Vpp ממחולל הפונקציה יהיה שונה ממתח סופו של הדבר נמסר לרמקול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרכיב את LDV הנקודה אחת ולאבטח את ראש חיישן לייזר הסיב אופטי לחצובת ראש Pan-Tilt. זווית ראש החיישן, כך שהוא מצביע בניצב לשולחן. חבר את ראש חיישן LDV למודול רכישת נתונים דרך כבל קואקסיאלי אז מודול למחשב הנייד באמצעות כבל USB. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למקד את קרן הלייזר בניצב בנקודות שנקבעו מראש שונות על קרום סיליקון (איור 2 ואיור 3). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש בתוכנת רכישת נתונים, להקליט עקירת אמצע קרום. לחץ על &quot;הגדרות רכישה&quot; מתפריט &quot;אפשרויות&quot;; לאחר מכן לשנות את מצב המדידה ל&quot; FFT221;. בשלב הבא, לחץ על &quot;המדידה רציפה&quot; בסרגל הכלים הראשיים ולאחר מכן לחץ על השיא שנוצר בתדירות שנבחרה (איור 6 ד) כדי להקליט את העקירה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עלילה העקירה הרגילה אמצע קרום (w 0) כפונקציה של המיקום היחסי על פני המצע. לבנות מפת צבעי 3D של פרופיל התנודה פני השטח באמצעות תוכנת ניתוח 8.5 נתוני מקור. </li></ol> 4. תרבית תאי רטט <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> MSCs עצם אנושי תת התרבות שמקורם במח בצלוחיות תרבית רקמת T150 בצפיפות זריעה ראשונית של 4,000-5,000 תאים / 2 סנטימטר בתקשורת תחזוקת MSC. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחרי 7-8 ימים של תרבית תאים (ל~ confluency 85%), trypsinize התאים עם מגיב תא דיסוציאציה כגון Accutase, לספור באמצעות hemocytometer, צנטריפוגה (440 XG במשך 5 דקות), ומחדש להשעות את התא גלולה ב תקשורת טרי MSC תחזוקה בריכוז של 4.5 x 10 6 תאים / מיליליטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטבול את scaffo PCLld ב70% O / נ אתנול לאחר הממס מתאדה, חושף את שני הצדדים של הפיגום לקוטל חידקים אור UV (254 ננומטר) ל5-8 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> משרים את פיגום PCL בפתרון פיברונקטין 20 מיקרוגרם / מיליליטר ב 37 מעלות צלזיוס במשך שעה 1. הכנס את הפיגום מצופה פיברונקטין לתוך קרום סיליקון. להרכיב את bioreactor כמפורט בשלב 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפץ 40 μl של ההשעיה התא באופן שווה על פיגום PCL המאובטח. אפשר התאים לצרף ל1-1.5 שעה לפני הוספת 1.5 מיליליטר נוסף תקשורת טריות לתא הרטט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תרבות פיגום MSC העמוס PCL באופן סטטי במשך 3 ימים ולרענן את התקשורת עם השלמת תרבות סטטי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להטיל משטרי רטט שנבחרו למבנים התאיים. הערה: כדוגמא, תאים חשופים ל- HR-off 1-HR-on-1 (של) רטט ב200 הרץ עם aw 0 של ~ 40 מיקרומטר ל12 שעות ליום לתקופה של עד 7 ימים. מבני נתונים לגירויי רטט מיועדים לשמש כדגימות VIB וcultu אלהאדום באופן סטטי בתאי רטט זהים ישמש פקדים סטטיים כ( Stat). </li></ol> 5. הערכות ביולוגיות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף 200 תקשורת תרבות תא μl מכל תא בכל יום אחר (יום 1, 3, 5, ו -7) וברכה aliquots מהמדגם זהה יחד (800 μl כל אחד). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לכמת את הייצור התאי של מטריקס metalloproteinase-1 (MMP1) וHA באמצעות ערכת ELISA MMP1 פיתוח וערכת ELISA תחרותית hyaluronan, בהתאמה, בעקבות ההליך של היצרנים. בינתיים, assay הייצור של מבשר אלסטין מסיס בעקבות הליך ELISA שדווח בעבר. 8 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עם ההשלמה של מחזור הרטט שעבר ביום 7, להסיר במהירות את המבנים התאיים מתאי הרטט באמצעות פינצטה חדה ובקצרה לשטוף אותם עם שנאגרו מלוח פוספט הקר (PBS, 4 מעלות צלזיוס). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לצביעה החי / המתה, דגירה המבנים עם יודיד propidium (1:2,000 PBS) וSyto-13 (1:1,000 ב-PBS) בו זמנית למשך 5 דקות ב RT. תמונת המבנים המוכתמים במיקרוסקופ confocal multiphoton. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בנפרד, Snap-להקפיא את המבנים תאיים ושטף PBS על קרח יבש ולחלץ את RNA הסלולרי בסך הכל בעקבות פרוטוקול שדווח בעבר לניתוח גנטי. 9 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדוק את הכמות והאיכות של RNA חילוץ באמצעות ספקטרופוטומטר UV-Vis. דגימות RNA עם יחס A260/A280 וA260/A230 של 1.8-2.2 משמשות לניתוח qPCR שלאחר מכן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך לתמלל RNA (500 ng / מדגם) לתוך cDNA באמצעות ערכת שעתוק לאחור זמינה מסחרי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע את תגובת PCR על מערכת זיהוי רצף זמן אמת באמצעות תערובת הורים PCR זמינה מסחרי בעקבות ההליך שפורט קודם לכן. 8 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתח את תוצאות qPCR באמצעות תוכנת ניתוח נתונים qPCR מסחרית. כדי להבטיח את האמינות של ניתוח נתונים, גנים התייחסות מרובים (YWHAZ, TBP, PPIA) מועסקים כintפקדי ernal, והשונות של יעילות פריימר ספציפית נלקחים בחשבון. 8 </li></ol>

<ol><li>Titze, I. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical-Stress+in+Phonation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Voice%22%5BJournal%5D)">Mechanical-Stress in Phonation.</a> J. Voice. 8, 99-105 (1994).</li>
<li>Titze, I. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+Relation+Between+Subglottal+Pressure+and+Fundamental-Frequency+in+Phonation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Acoust.+Soc.+Am%22%5BJournal%5D)">On the Relation Between Subglottal Pressure and Fundamental-Frequency in Phonation.</a> J. Acoust. Soc. Am. 85, 901-906 (1989).</li>
<li>Gray, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+physiology+of+the+vocal+folds%5BTitle%5D)+AND+%22Otolaryngol.+Clin.+N.+Am%22%5BJournal%5D)">Cellular physiology of the vocal folds.</a> Otolaryngol. Clin. N. Am. 33, 679-698 (2000).</li>
<li>Thibeault, S. L., Gray, S. D., Bless, D. M., Chan, R. W., Ford, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histologic+and+rheologic+characterization+of+vocal+fold+scarring%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Voice%22%5BJournal%5D)">Histologic and rheologic characterization of vocal fold scarring.</a> J. Voice. 16, 96-104 (2002).</li>
<li>Hansen, J. K., Thibeault, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+understanding+and+review+of+the+literature%3A+Vocal+fold+scarring%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Voice%22%5BJournal%5D)">Current understanding and review of the literature: Vocal fold scarring.</a> J. Voice. 20, 110-120 (2006).</li>
<li>Pittenger, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multilineage+potential+of+adult+human+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells.</a> Science. 284, 143-147 (1999).</li>
<li>Hanson, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+Mesenchymal+Stem+Cells+From+Human+Vocal+Fold+Fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Laryngoscope%22%5BJournal%5D)">Characterization of Mesenchymal Stem Cells From Human Vocal Fold Fibroblasts.</a> Laryngoscope. 120, 546-551 (2010).</li>
<li>Tong, Z., Duncan, R. L., Jia, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulating+the+behaviors+of+mesenchymal+stem+cells+via+the+combination+of+high-frequency+vibratory+stimulations+and+fibrous+scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng.+Part+A%22%5BJournal%5D)">Modulating the behaviors of mesenchymal stem cells via the combination of high-frequency vibratory stimulations and fibrous scaffolds.</a> Tissue Eng. Part A. 19, 1862-1878 (2013).</li>
<li>Tong, Z., Sant, S., Khademhosseini, A., Jia, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlling+the+Fibroblastic+Differentiation+of+Mesenchymal+Stem+Cells+Via+the+Combination+of+Fibrous+Scaffolds+and+Connective+Tissue+Growth+Factor%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng.+Part+A%22%5BJournal%5D)">Controlling the Fibroblastic Differentiation of Mesenchymal Stem Cells Via the Combination of Fibrous Scaffolds and Connective Tissue Growth Factor.</a> Tissue Eng. Part A. 17, 2773-2785 (2011).</li>
<li>Jones, D. L., Wagers, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((No+place+like+home%3A+anatomy+and+function+of+the+stem+cell+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">No place like home: anatomy and function of the stem cell niche.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 9, DOI. 11-21 (1038).</li>
<li>Wang, J. H., Thampatty, B. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanobiology+of+Adult+and+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+Rev.+of+Cell+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Mechanobiology of Adult and Stem Cells.</a> Int. Rev. of Cell Mol. Biol. 271, 301-346 (2008).</li>
<li>Doroski, D. M., Levenston, M. E., Temenoff, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cyclic+tensile+culture+promotes+fibroblastic+differentiation+of+marrow+stromal+cells+encapsulated+in+poly+%28ethylene+glycol%29-based+hydrogels%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng.+Part+A%22%5BJournal%5D)">Cyclic tensile culture promotes fibroblastic differentiation of marrow stromal cells encapsulated in poly (ethylene glycol)-based hydrogels.</a> Tissue Eng. Part A. 16, 3457-3466 (2010).</li>
<li>Kim, B. S., Nikolovski, J., Bonadio, J., Mooney, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cyclic+mechanical+strain+regulates+the+development+of+engineered+smooth+muscle+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Cyclic mechanical strain regulates the development of engineered smooth muscle tissue.</a> Nat. Biotechnol. 17, 979-983 (1999).</li>
<li>Webb, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cyclic+strain+increases+fibroblast+proliferation%2C+matrix+accumulation%2C+and+elastic+modulus+of+fibroblast-seeded+polyurethane+constructs%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomech%22%5BJournal%5D)">Cyclic strain increases fibroblast proliferation, matrix accumulation, and elastic modulus of fibroblast-seeded polyurethane constructs.</a> J. Biomech. 39, 1136-1144 (2006).</li>
<li>Kim, Y. J., Sah, R. L. Y., Grodzinsky, A. J., Plaas, A. H. K., Sandy, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+Regulation+of+Cartilage+Biosynthetic+Behavior+-+Physical+Stimuli.%5BTitle%5D)+AND+%22Arch.+Biochem.+Biophys%22%5BJournal%5D)">Mechanical Regulation of Cartilage Biosynthetic Behavior - Physical Stimuli.</a> Arch. Biochem. Biophys. 311, 1-12 (1994).</li>
<li>Titze, I. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+and+validation+of+a+bioreactor+for+engineering+vocal+fold+tissues+under+combined+tensile+and+vibrational+stresses%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomech%22%5BJournal%5D)">Design and validation of a bioreactor for engineering vocal fold tissues under combined tensile and vibrational stresses.</a> J. Biomech. 37, 1521-1529 (2004).</li>
<li>Kutty, J. K., Webb, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vibration+stimulates+vocal+mucosa-like+matrix+expression+by+hydrogel-encapsulated+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Tissue+Eng.+Regen.+Med%22%5BJournal%5D)">Vibration stimulates vocal mucosa-like matrix expression by hydrogel-encapsulated fibroblasts.</a> J. Tissue Eng. Regen. Med. 4, 62-72 (2010).</li>
<li>Farran, A. J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+and+Characterization+of+a+Dynamic+Vibrational+Culture+System%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Tissue+Eng.+Regen.+Med%22%5BJournal%5D)">Design and Characterization of a Dynamic Vibrational Culture System.</a> J. Tissue Eng. Regen. Med. , (2011).</li>
<li>Reneker, D. H., Yarin, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrospinning+jets+and+polymer+nanofibers%5BTitle%5D)+AND+%22Polymer%22%5BJournal%5D)">Electrospinning jets and polymer nanofibers.</a> Polymer. 49, 2387-2425 (2008).</li>
<li>Wang, Y., Theobald, P., Tyrer, J., Lepper, P. The application of scanning vibrometer in mapping ultrasound fields. J. Phys.: Conf. Ser. 1, 167-173 (2004).</li>
<li>Brown, W. S., Morris, R. J., Hollien, H., Howell, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Speaking+Fundamental-Frequency+Characteristics+as+a+Function+of+Age+and+Professional%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Voice%22%5BJournal%5D)">Speaking Fundamental-Frequency Characteristics as a Function of Age and Professional.</a> J. Voice. 5, 310-315 (1991).</li>
<li>Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+mechanotransduction%3A+putting+all+the+pieces+together+again%5BTitle%5D)+AND+%22Faseb+J%22%5BJournal%5D)">Cellular mechanotransduction: putting all the pieces together again.</a> Faseb J. 20, 811-827 (2006).</li>
<li>Titze, I. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+and+validation+of+a+bioreactor+for+engineering+vocal+fold+tissues+under+combined+tensile+and+vibrational+stresses%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomech%22%5BJournal%5D)">Design and validation of a bioreactor for engineering vocal fold tissues under combined tensile and vibrational stresses.</a> J. Biomech. 37, 1521-1529 (2004).</li>
<li>Moore, J., Thibeault, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insights+Into+the+Role+of+Elastin+in+Vocal+Fold+Health+and+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Voice%22%5BJournal%5D)">Insights Into the Role of Elastin in Vocal Fold Health and Disease.</a> J. Voice. 26, 269-275 (2012).</li>
<li>Thibeault, S. L., Bless, D. M., Gray, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interstitial+protein+alterations+in+rabbit+vocal+fold+with+scar%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Voice%22%5BJournal%5D)">Interstitial protein alterations in rabbit vocal fold with scar.</a> J. Voice. 17, 377-383 (2003).</li>
<li>Branski, R. C., Verdolini, K., Sandulache, V., Rosen, C. A., Hebda, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vocal+fold+wound+healing%3A+A+review+for+clinicians%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Voice%22%5BJournal%5D)">Vocal fold wound healing: A review for clinicians.</a> J. Voice. 20, 432-442 (2006).</li>
<li>Clark, I. A., Swingler, T. E., Sampieri, C. L., Edwards, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+regulation+of+matrix+metalloproteinases+and+their+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Biochem.+Cell+B%22%5BJournal%5D)">The regulation of matrix metalloproteinases and their inhibitors.</a> Int. J. Biochem. Cell B. 40, 1362-1378 (2008).</li>
<li>Silver, F. H., Horvath, I., Foran, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viscoelasticity+of+the+vessel+wall%3A+The+role+of+collagen+and+elastic+fibers%5BTitle%5D)+AND+%22Crit.+Rev.+Biomed.+Eng%22%5BJournal%5D)">Viscoelasticity of the vessel wall: The role of collagen and elastic fibers.</a> Crit. Rev. Biomed. Eng. 29, 279-301 (2001).</li>
<li>Kutty, J. K., Webb, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+Engineering+Therapies+for+the+Vocal+Fold+Lamina+Propria%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng.+Part+B%3A+Rev%22%5BJournal%5D)">Tissue Engineering Therapies for the Vocal Fold Lamina Propria.</a> Tissue Eng. Part B: Rev. 15, 249-262 (2009).</li>
</ol>

אין אינטרסים כלכליים מתחרים קיימים.

הנדסה מוצלחת של רקמות לקפל ווקאלית פונקציונליות במבחנה דורשת הבילוי של microenvironment כמו מתקפל קולני לתווך ההתנהגויות של תאי multipotent. הדעה מקובלת היא כי מבני רקמה או איבר משקפים את הפונקציות שהם נדרשים לבצע. 22 לרקמות לקפל ווקאלית, התנודות בתדירות גבוהות המתרחשות במהלך phonation מוצעות להיות חשוב להבשלת רקמות. במחקר שלנו, פיגומי PCL משמשים כדי לספק תמיכה מבנית כמו ברצועות-אילו bioreactor לקפל ווקאלית נועד להציג אותות מכאניים רלוונטיים מבחינה פיזיולוגית ל...

לקפל ווקאלית האנושית, מורכבת משכבת ​​האפיתל, propria lamina (LP) ושרירי vocalis, הוא ברקמות רכות מיוחדות שממירה את זרימת אוויר מהריאות לגלים אקוסטיים להפקת צליל. 1 קפלי קול להתנדנד באופן קבוע במהלך phonation הנורמלי, תערוכת זנים של עד 30% בתדרים בסיסיים החל 100-300 הרץ. LP לקפל ווקאלית 2 מבוגרים הוא צבע מבנה מורכב משטחי (SLP), ביניים (ILP) ושכבה עמוקה (DLP). קבוצות נוספות סיווג האפיתל וSLP כשכבת רירית, ומשלבים את ILP וDLP לתוך הרצועה ווקאלי. 3 שכבת SLP מכילה בעיקר מטריקס אמורפי עם סיבי collagenous מפוזרים בדלילות, ואילו הרצועה מועשרת בקולגן בוגר וסיבים האלסטין כדי לספק כוח מספיק. 4 המבנה והמכניקה של קפלי קול יילוד להשתנות באופן משמעותי מעמיתיהם בוגרים שלהם. למרות שמנגנוןשל ויסות התפתחות לקפל ווקאלית והתבגרות עדיין לא מובן לחלוטין, ראיות ניסיוניות הצביעו על תפקידי ההגדרה של לחץ מכאני המופק מניקוד. כמה מצבים רפואיים, ובכלל זה שימוש לרעה בקול, זיהומים, חומרים מגרים כימיים וניתוחים, עלולים לגרום נזק לקפל ווקאלית. הפרעות לקפל ווקאלית להשפיע 3-9% מאוכלוסיית ארה&quot;ב. שיטות טיפול הנוכחיות להפרעות לקפל ווקאלית מוגבלות 5 וגישה הנדסית גזע מבוסס תאי רקמה התפתחה כאסטרטגיה מבטיחה לשחזור תפקוד לקפל ווקאלית. תאי גזע mesenchymal (MSCs) הם אלטרנטיבה מתאימה לfibroblasts לקפל ווקאלית העיקרית להנדסת רקמות לקפל ווקאלית. 6-9 מפרט גורל תאי גזע ופיתוח רקמות הבא מתווכים על ידי הנישה הספציפית שהם מתגוררים, אשר מצבו המכני הוא גורם חיוני. 10 כוחות מכאניים הם רגולטורים חיוניים של המורפוגנזה רקמהnd הומאוסטזיס, במיוחד לרקמות שנחשפות באופן שיגרתי לטעינה. 11 מנקודת מבט של הנדסת רקמות, זה כבר הוכיח כי חשיפה לגירויים פיזיולוגית מכאניים רלוונטיים מקדם גזע התמיינות תאים ושיפוץ מטריצת רקמות ספציפיות. 12-15 bioreactors תרבית רקמה נועדו לדמות את הסביבה הפיזיולוגית הרצויה לצמיחת תאים או רקמות במבחנה. להנדסת רקמות לקפל ווקאלית, זה קריטי במיוחד כדי לשחזר את הסביבה מכאנית של קפלי קול phonating. Bioreactor לקפל ווקאלית אידיאלית צריך למעשה לספק רמזי רטט לתאי תרבות, המאפשר שליטה קלילה על תדר, המשרעת ומשך זמן של תנודות. Titze ועמיתים לעבודה המציאו bioreactor וקאלי לקפל (bioreactor T1) 16 שמשלב מתיחה סטטית עם תדירות גבוהה (20-200 הרץ) תנודות כדי לעורר את הייצור של חלבוני מטריצה. מנצלגרם bioreactor זה, ווב ועמיתים 17 חקרו את ההשפעות של 10 יום, תנודות 100 הרץ על fibroblasts עורי בתרבית בחומצה היאלורונית (HA) מבוסס הידרוג&#39;ל. מבני נתונים לרעידות הציגו ביטוי גבוה של HA synthase-2, decorin, fibromodulin ומטריקס metalloproteinase-1 (MMP1), ביחס לבקרות סטטי (HAS2). השפעות גירוי נמצאו להיות תלוי בזמן. לאחרונה, הקבוצה שלנו 18 התאסף bioreactor וקאלי לקפל (bioreactor J1) באמצעות מגבר כוח, מחוללים אותות, רמקול חזק ומוקף קרום סיליקון circumferentially מעוגני המעביר את אוויר נדנוד לתאים המצורפים. fibroblasts עורלת ילודים טיפח בbioreactor J1 היו נתונים לשעה 1 של רטט ב60, 110 או 300 הרץ, עם מתח במטוס של עד 0.05%. תוצאות qPCR הציעו כי הביטוי של גנים מסוימים ECM שונו באופן מתון בתגובה לתדרי רטט המגווניםואמפליטודות. עיצובי bioreactor אלה, בעוד מסקרן, יש כמה מגבלות. לדוגמא, מערכת T1 דורשת מספר רב של מחברים וברים לצימוד מכאני, להגביל את התדרים מקסימאלי שניתן להשיג. יתר על כן, תאים עשויים להיות חשופים להפרעות חרדה ונוזל מכאניות בלתי רצויות שתסבכנה את פרשנות הנתונים. Bioreactor J1, לעומת זאת, מציג את יעילות המרת אנרגיה נמוכה יחסית ואינו ידידותי למשתמש. בנוסף, רטט בתדירות גבוהה מנתק את מבני התא עמוס מקרום סיליקון בסיסי. Bioreactor J2 לקפל ווקאלית שדווח כאן, שתוכנן על בסיס אותו העיקרון כמו גרסת J1, מותאם במיוחד עבור עקביות ושחזור. התנודות מחקה-phonation נוצרות מבחינה אווירודינמית בתאי רטט מותאמים באופן אישי שבו פולי MSC-מאוכלסים סיביים (ε-caprolactone) פיגומים (PCL) הם effectivהשיג איליי. הלייזר דופלר vibrometry (LDV) מאפשר למשתמש לאמת את פרופיל הרטט של ההרכבה קרום / פיגום. בהפגנה שלנו, MSCs חשופים לתנודות סינוסי 200 הרץ עם דפוס 1-HR-on-1-HR-off (של) עבור סכום כולל של שעות 12 ביום למשך 7 ימים. תגובות תאיות לרמזי רטט הוטלו נחקרות באופן שיטתי. בסך הכל, לקפל ווקאלית J2 מספק את התכונות הכי ידידותי למשתמש, המאפשר לימודי תרבות תא דינמי להתנהל בתפוקה גבוהה ואופנה לשחזור.

<table><tbody><tr><td>ערכת אלסטומר סיליקון</td><td>Dow Corning</td><td>Sylgard 184</td><td>לרפא את הממברנה ב 100 & #176; C למשך שעתיים</td></tr><tr><td>PCL</td><td>Sigma Aldrich</td><td>440744-500G</td><td>Mn ~ 80 kDa, ממיסים O/N</td></tr><tr><td>כלורופורם</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>C7559-5VL</td><td></td></tr><tr><td>MSCs שמקורם במח עצם אנושי</td><td>Lonza</td><td>PT-2501</td><td>התקבל עם מעבר 2</td></tr><tr><td>אמצעי תחזוקה MSC</td><td>Lonza</td><td>PT-3001</td><td>10% FBS במדיה בזאלית בתוספת עם L-גלוטמין, גנטמיצין ואמפוטריצין</td></tr><tr><td>מגיב דיסוציאציה של תאי Accutase</td><td>Life Technologies</td><td>A11105-01</td><td></td></tr><tr><td>אתנול</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>E7023-500ML</td><td></td></tr><tr><td>פיברונקטין</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>F2006-1MG</td><td></td></tr><tr><td>MMP1 DuoSet ELISA ערכת</td><td>מו"פ & D מערכות</td><td>DY901</td><td></td></tr><tr><td>HA ELISA ערכת</td><td>Echelon Biosciences</td><td>&nbsp; ק-1200&nbsp; &nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Life Technologies</td><td>14190-136</td><td></td></tr><tr><td>פרופידיום יודיד&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>P1304MP</td><td></td></tr><tr><td>Syto-13&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>S7575</td><td></td></tr><tr><td>ערכת שעתוק הפוך QuantiTect&nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>205311</td><td></td></tr><tr><td>SYBR Green PCR מאסטר מיקס</td><td>Life Technologies</td><td>4309155</td><td></td></tr><tr><td>רמקול חלופי</td><td>DAYTON audio (באמצעות Parts Express)</td> <td>DS90-8</td><td>קונוס נייר, טווח מלא (80-13,000 הרץ), 85 dB</td></tr><tr><td>Ergo Micro מומנט מומנט</td><td>Mountz</td><td># 020377</td><td>טווח מומנט: 20-120 cN&#183; m</td></tr><tr><td>בורר רמקולים סטריאו</td><td>RadioShack</td><td>40-244</td><td>טיפול בהספק מרבי 50 W</td></tr><tr><td>מחולל פונקציות&nbsp;</td><td>אג'ילנט&nbsp;</td><td>33220A</td><td>טווח תדרים 1 ומיקרו; מגבר הספק Hz-20 MHz</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>אודיו PYLE</td><td>PylePro PT2400</td><td>תגובת תדרים: 10 הרץ-50 קילו-הרץ, שני רמקולים ערוצים</td></tr><tr><td>חממת תרבית תאים&nbsp;</td><td>תרמו פישר&nbsp;</td>משאבת מזרק <td>Steri-Cult 3307</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>מערכות משאבות עידן חדש</td><td>NE-300</td><td></td></tr><tr><td>ספק כוח מתח גבוה</td><td>Spellman</td><td>CZE 1000R</td><td>מתח יציאה: 0-30 קילו וולט</td></tr><tr><td>מיקרוסקופ אלקטרונים סורק&nbsp;</td><td>JEOL-USA</td><td>JSM-7400F</td><td></td></tr><tr><td>שולחן כתיבה זהב מקרטע ציפוי</td><td>דנטון ואקום</td><td>DSK00V-0013</td><td></td></tr><tr><td>דופלר לייזר ויברומטר&nbsp;</td><td>Polytec</td><td>PDV-100</td><td>מדידת מהירות ללא מגע (0-22 קילו-הרץ)</td></tr><tr><td>מערכת זיהוי רצף PCR&nbsp;</td><td>יישומי ביוסיסטמס</td><td>ABI7300</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ קונפוקלי מולטיפוטון</td><td>Zeiss</td><td>Zeiss 510Meta NLO</td><td></td></tr><tr><td>UV-VIS ספקטרופוטומטר&nbsp;</td><td>NanoDrop Products באמצעות Thermo Scientific</td><td>ND-2000</td><td></td></tr><tr><td>VibSoft Data Acquisition Software</td><td>Polytec</td><td></td><td>Acquisition רוחב פס עד 40 מגה-הרץ</td></tr><tr><td>Origin 8.5 Data Analysis Software&nbsp;</td>תוכנת ניתוח נתונים <td>qPCR qOriginLab</td><td></td><td></td></tr><tr><td>qPCR&nbsp;</td><td>Biogazelle</td><td>V2.3</td><td></td></tr><tr><td>סגסוגת אלומיניום&nbsp;</td><td>מקמאסטר-קאר</td><td>סגסוגת 6061</td><td></td></tr><tr><td>בלוקים אקריליים</td><td>מקמאסטר-קאר</td><td></td><td></td></tr><tr><td>תא נגד לחות פוליקרבונט</td><td>מקמאסטר-קאר</td><td></td><td>עמיד בפני פגיעות&nbsp; ברגי פוליקרבונט</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>כבל</td> / חוט אלקטרוני מקמאסטר-קאר <td></td><td></td></tr> צינורות <tr><td></td> PVC בדרגה רפואית תאגיד הפלסטיק האמריקאי <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>Tygon S-50-HL</td><td>מזרק 10 מ"ל שקוף, תואם</td></tr><tr><td>ביולוגית&nbsp;</td><td>בקטון דיקינסון</td><td>309604</td><td></td></tr><tr><td>21 גרם מחט קהה קצה</td><td>חלקים קטנים</td><td>NE-213PL-25</td> מתאמי קליפ תנין <td>באורך 1-1/2 אינץ'</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>RadioShack</td><td>270-354</td><td></td></tr><tr><td>אגרוף ביופסיה 8 מ"מ</td> מבודד לחלוטין<td><a href="http://www.sklarcorp.com/ProductListUS.aspx? מזהה מחלקה = 10& CategoryID=96">Sklar&nbsp; מכשירים כירורגיים</a></td><td>96-1152</td> ניקוב ביופסיה <td>סטרילי, חד פעמי</td></tr><tr><td>12 מ"מ</td><td>Acuderm (באמצעות Fisher Scientific)NC9998681</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>צלוחיות תרבית רקמות</td><td>תרבית תאי</td> <td>קורנינג</td><td></td> מטופלות</tr></tbody></table>

בנייה ואפיון של bioreactor פולד רומן וקאלי

Construction and Characterization of a Novel Vocal Fold Bioreactor

הנדסה במבחנה של רקמות פעילות מכנית דורשת הצגת תנאים מכניים רלוונטיים מבחינה פיזיולוגית לתאים מתורבתים. כדי לחקות את הסביבה הדינמית של קפלי הקול, נבנה ומאופיין ביו-ריאקטור חדשני של קפלי הקול המסוגל לייצר גירויים רטטים בתדרי פונציה בסיסיים. המכשיר מורכב ממחולל פונקציות, מגבר כוח, בורר רמקולים ותאי רטט מקבילים. תאי רטט בודדים נוצרים על ידי סנדוויץ' קרום סיליקון בהתאמה אישית בין זוג בלוקים אקריליים. קרום הסיליקון לא רק משמש כתחתית החדר אלא גם מספק מנגנון לאבטחת הפיגום עמוס התאים. אותות רטט, הנוצרים על ידי רמקול המותקן מתחת לבלוק האקרילי התחתון, מועברים לקרום באופן אווירודינמי על ידי האוויר המתנודד. שמונה מודולי רטט זהים, קבועים על שני מוטות מתכת נייחים, שוכנים בתא נגד לחות להפעלה ארוכת טווח בחממת תרבית תאים. מאפייני הרטט של הביוריאקטור של קפל הקול מנותחים באופן לא הרסני באמצעות ויברומטר דופלר לייזר (LDV). התועלת של מכשיר התרבות הדינמית מודגמת על ידי טיפוח מבנים תאיים בנוכחות רעידות סינוסואידיות של 200 הרץ עם תזוזה של אמצע הממברנה של 40 מיקרומטר. תאי גזע מזנכימליים המתורבתים בביו-ריאקטור מגיבים לאותות הרטט על ידי שינוי הסינתזה והפירוק של רכיבי מטריצה חוץ-תאיים הרלוונטיים לקפלי הקול. מערכת הביוריאקטור החדשנית המוצגת כאן מציעה פלטפורמה מצוינת במבחנה לחקר טרנסדוקציה מכנית הנגרמת על ידי רטט ולהנדסת רקמות קפלי קול פונקציונליות.

פיגומי PCL המפוברק על ידי electrospinning מכילים נקבוביות מיקרון בגודל ביניים וסיבים הסתבכו באופן אקראי עם קוטר ממוצע של 4.7 (איור 4 א) מיקרומטר. בהגדלה גבוהה יותר, חריצים ונקבוביים ננו גלויים על סיבים בודדים (איור 4). ציפוי של הפיגומים עם פיברונקטין משפר hydrophilicity ומקל על הידבקות התא הראשונית / מתפשט על פיגום PCL (תצפית לא פורסם). גל סינוסי בתדירות רצויה (ו, 100-30...

ביו-ריאקטור חדשני של קפלי הקול המסוגל לספק גירוי רטט רלוונטי מבחינה פיזיולוגית לתאים מתורבתים נבנה ומאופיין. מכשיר תרבית דינמי זה, בשילוב עם פיגום פולי (ε-קפרולקטון) סיבי, יוצר סביבה מחקה קפלי קול המווסתת את ההתנהגויות של תאי גזע מזנכימליים.

בנייה ואפיון של Bioreactor פולד רומן וקאלי

In vitro engineering of mechanically active tissues requires the presentation of physiologically relevant mechanical conditions to cultured cells. To ...

המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא לבחון את השפעתה של גרייה רטטית על תאי גזע מזנכימליים באמצעות ביו-ריאקטור שתוכנן לדמות פונציה (הפקת קול). דבר זה מושג על ידי יצירת פיגומים של poly epsilon Capralactone כדי לספק תשתית תלת-ממדית לתרביות תאים הדמיה לרצועה הקולית. כשלב שני, הפיגומים משולבים בממברנות סיליקון, המקלות על העברת התנודה למבני התאים.בשלב הבא נעשה שימוש בויברומטריה בלייזר דופלר כדי לקבוע את מאפייני הרעידה של כל שילוב של קרום ופיגום. לבסוף, ניתן לבצע אנליזות EISA ו-quantitative R-T-P-C-R כדי להעריך את התגובות התאיות ברמות החלבון והתרגום. שיטה זו יכולה לענות על שאלות מפתח בתחום הלרינגולוגיה, כגון האופן שבו מיתרי הקול מבשילים וההשלכות של שימוש שגוי בקול.השלכותיה של טכניקה זו משתרעות על הטיפול בהפרעות במיתרי הקול, וזאת בשל רמת השליטה התאית המתאפשרת כעת בשיטה זו לייצור הפיגום. ראשית, המיס pellets של PCL בכלורופורם בריכוז של 15% משקל. לאחר מכן, טען את התמיסה שהתקבלה למזרק של 10 milliliters עם מחט קהה במידה 21 gauge. נעול את המזרק במשאבת מזרקים תכנונית והגדר את קצב הזרימה ל-one milliliter לשעה.לאחר מכן, מקמו אספנית מכוסה בנייר אלומיניום מול המחט באופן אופקי, במרחק של כ-18 סנטימטרים מקצה המחט. בשלב הבא, חברו תפס תנימים חיובי למרכז המחט וחברו את התפס לאספנית לצורך הארקה. הגדירו את המתח בספק הכוח למתח גבוה ל-15 kilovolts, תוך הקפדה להתרחק מהמחט.לאחר מכן, הפעילו את משאבת המזרקים ואת ספק הכוח. השתמשו בנייר סופג יבש כדי להסיר במהירות את תמיסת הפולימר השארית המקיפה את קצה המחט, לפני שייווצרו סילון סיבים יציב וקונוס מעוצב. אפשרו לסיבים להצטבר על אספן האלומיניום במשך כשבע שעות, עד להשגת עובי של 250 עד 300 micrometers, ולאחר מכן אחסנו את התוצאה בצורת פיגומים בתוך מייבש ואקום למשך יום עד יומיים כדי להסיר שאריות ממס. פיגומי ה-PCL יכילו נקבוביות בין-ביתיות בגודל מיקרוני וסיבים שזורים באופן אקראי עם קוטר ממוצע של כ-4.7 micrometers.בהגדלה גבוהה יותר, חריצים ונשמים בננו-קנה מידה יהיו גלויים על הסיבים הבודדים להרכבת הביוראקטור. התחילו בשימוש במנקב ביופסיה בקוטר 12 מילימטר כדי לחתוך את הקוטר החיצוני של דיסק מעגלי בקוטר שמונה מילימטר מתוך מאט PCL שנסב לאחרונה. לאחר מכן, השתמשו במנקב ביופסיה שני של שמונה מילימטר כדי לסמן את המקומות שבהם ייחתכו הזרועות.לאחר הסימון, השתמש בלהב סקלפל כדי לחתוך את קצות הזרועות כלפי חוץ והכנס את הפיגום לתוך החריץ של ממברנת הסיליקון דרך הזרועות המורחבות. השטח את הפיגום שהוכנס על ידי לחיצה עדינה על פני השטח באמצעות פינצטה שטוחה, ולאחר מכן הצמד חתיכת רדיד אלומיניום דק בגודל שמונה מילימטר על שני מילימטר אל פיגום ה-PCL. כדי לסייע בהחזר הלייזר,יבסס את ממברנת הסיליקון ופיגום ה-PCL המורכבים בתוך תא הרעידה.לאחר מכן, מקם את ממברנת הסיליקון בין בלוקים אקריליים זוגיים. הדק את המכלול באמצעות ארבעה ברגי פינה בעזרת מברג מומנט מיקרו המכוון לכוח קבוע של 35 cent a Newton meters, ליצירת תא רעידה אטום למים ברוחב 24 millimeter ובעומק 18 millimeter. לאחר מכן, התקן mini wooer בעל טווח מורחב של שלושה רגליים מתחת לתא הרעידה באמצעות סט נוסף של ברגי פינה בבלוק האקרילי התחתון, ובכך השלם את הרכבת מודול רעידה בודד.לאחר שכפל שבעה מודולי רעידה נוספים, הצמד ארבעה מהמודולים לאחד משני מוטות האלומיניום הנייחים על ידי הצבת בסיסי הרמקולים בחורים מעגליים במרווחים שווים. חתוך את המוטות, ייצב כל רמקול על ידי הכנסת בורג מצד מוט האלומיניום לתוך כל חור מעגלי. לאחר מכן, חבר את הרמקולים הבודדים לבורר על ידי חיבור חוטים לכניסות החיובית והשלילית בגוף הרמקול וליציאות המתאימות בבורר.בורר הרמקולים מאפשר לאות ממחולל הפונקציות, לאחר מעברו במגבר הספק, להגיע לכל שמונת הרמקולים בו-זמנית. לאחר מכן, מקמו את שני מערכי התאים, את בורר הרמקולים ואת האלקטרוניקה הנלווית בתוך מארז נגד לחות, כאשר כל ההרכבה מאוחסנת בתוך אינקובטור מסחרי לתרביות תאים. העבירו את הכבלים הראשיים דרך קטע של צינור PVC בדרגה רפואית וחברו את מגבר ההספק ואת בורר הרמקולים באמצעות מכלול המסנן בגב האינקובטור.כדי לאפיין תחילה את הביוראקטור, הוסף 1.5 milliliters של מים לתא הרעידה כדי להמיה את פיגום ה-PCL לפני הרעידה. לאחר מכן, באמצעות מחולל הפונקציות, העבר אותות רעידה לתא האקרילי הדחוס. השתמש במד מתח בדיוק.מדדו את המתח בכל כניסת רמקול, ולאחר מכן הרכיבו את מערכת ה-laser doppler vibratory בנקודה אחת. הדקו את חיישן לייזר הסיב האופטי. התקינו את ראש החיישן על חצובה עם ראש pan tilt והטו אותו כך שיצביע בניצב לשולחן העבודה.לאחר מכן, חברו את ראש החיישן למודול רכישת הנתונים באמצעות כבל קואקסיאלי, ואת המודול למחשב נייד דרך יציאת ה-USB. מיקדו את קרן הלייזר באופן מאונך בנקודות שונות שנקבעו מראש על ממבנה הסיליקון, ולאחר מכן, באמצעות תוכנת רכישת הנתונים, לחצו על הגדרות רכישה (acquisition settings) בתפריט האפשרויות. כעת, שנו את מצב המדידה ל-FFT ולחצו על כלי המדידה הרציפה בסרגל הכלים הראשי.לחצו על השיא שנוצר בתדר הנבחר כדי לתעד את ההעתקה ולשרטט את העתקת מרכז הממברנה הנורמלית כפונקציה של המיקום היחסי לאורך התשתית. כדי להקים תרבית תאים רוטטת, בצעו תחילה תת-תרבית של תאי גזע מזנכימליים המופקים ממח עצם אנושי בבקבוקי T150 לתרבית רקמות, בצפיפות זריעה ראשונית של 4-5×10³ תאים לסמ"ר במצע תחזוקה למשך שבעה עד שמונה ימים. ביום שלפני הניסוי, טבלו פיגום PCL ב-70% ethanol למשך הלילה.בבוקר למחרת, נתק את התאים באמצעות Accutane, ולאחר מכן סבב את התאים בצנטריפוגה ותלה את המשקע במצע תחזוקה טרי בריכוז של 4.5 times 10 to the six תאים למיליליטר. לאחר התאיידות האתנול, חשוף את שני צדי הפיגום לאור UV קוטל חיידקים למשך חמש עד שמונה דקות. לאחר מכן, השרה את פיגום ה-PCL בתמיסת פיברונקטין בריכוז 20 microgram per milliliter בטמפרטורה של 37 degrees Celsius למשך שעה אחת.הכניסו את הפיגום למבנה הביוריאקטור כפי שהודגם acab, ולאחר מכן פזרו באופן אחיד 40 µL של תרחיף התאים על הפיגום המקובע. המתינו שעה עד 1.5 שעות כדי לאפשר לתאים להיצמד, ולאחר מכן הוסיפו 1.5 mL נוספים של מצע גידול טרי לתא הרטט. לאחר גידול סטטי של פיגום ה-PCL הטעון בתאי גזע מזנכימליים במשך שלושה ימים, רעננו את מצע הגידול ולאחר מכן החילו את משטרי הרטט הנבחרים על המבנים התאיים.תדרי הרטט נבחרו כך שישקפו את תדרי הדיבור הבסיסיים של בני אדם, וקיים קשר ליניארי בין ההעתקה הנורמלית לבין מתח השיא בטווח של 0 עד 0.125 וולט עבור כל התדרים שנבחנו; במתח שיא נתון, ההעתקה הנורמלית פוחתת ככל שהתדר עולה מ-100 ל-300 הרץ. תגובות תאיות לגירויי רטט שנבחנו ברמות mRNA במונחים של ביטוי חלבונים חיוניים של המטריצה החוץ-תאית של מיתרי הקול, כגון elastin, hyaluronan synthase one, collagen type three alpha one, ו-matrix metalloproteinase one, מראות כי רטט מחזורי של שעה אחת פעילה ושעה אחת של מנוחה מוביל לעלייה של פי 2.3 בביטוי elastin ביחס לבקרה הסטטית.ביום השביעי, הגירויים הרטטניים מגבירים גם הם את ביטוי הקולגן באופן מתון. ראוי לציין כי הביטוי של אנזימי עיצוב מחדש מרכזיים של המטריצה החוץ-תאית, hyaluronan synthase one ו-matrix metalloproteinase one, מוגבר באופן משמעותי על ידי אותות הרטט מהיום השלישי ועד היום השביעי. תאים שגודלו בתרבית דינמית ייצרו 4.2 ± 0.1 µg/mg למשקל פיגום יבש של אלסטין מסיס, כפי שזוהה ב-Elisa לאחר שבעה ימים של רטט.בעוד שבביקרות הסטטיות מצטברות רק 2.7 פלוס או מינוס 0.2 µg למילגרם אלסטין. בממוצע, רעידות של שבעה ימים, שעה פעילה ושעה הפסקה, גורמות לעליות של פי 2.2 ופי 4.7 ביחס לביקרות הסטטיות התואמות בהפרשת חומצה היאלורונית ו-MMP1, בהתאמה. למרות שהמערכת שלנו תוכננה לחקר פיזיולוגיה של VOCO form, ניתן להחיל אותה גם על מערכות רבות אחרות.לדוגמה, רקמות עור של אוזן ובני אדם. תודה שצפיתם. בהצלחה בניסויים שלכם.

construction-and-characterization-of-a-novel-vocal-fold-bioreactor

Research

JoVE Journal

Bioengineering

הנדסה ביולוגית

המתודולוגיה בודה מודלים סינתטיים לקפל ווקאלית מתואר. הדגמים הם בגודל טבעי ו לחקות את המבנה רב שכבתיים של קפלי הקול האנושי. תוצאות מראים המודלים עצמית להתנדנד בלחצים דומים הלחץ הריאות להדגים זרימת המושרה התגובות התנודה כי הם דומים לאלה של קפלי הקול האנושי.

סינטטי, רב שכבתיים, עצמי מתנודדת ווקאלי דגם Fold ייצור

תרבות מסתובב בתא מערכת המאפשר לתאי האפיתל לצמוח בתנאים פיסיולוגיים וכתוצאה מכך היווצרות 3 D-המצרפי הסלולרי המתואר. מצרפים את התצוגה...

Culturing ויישומים של סיבוב bioreactor וול כלי נגזר מודלים 3D תא אפיתל

פוליפים קיפול קולי יכול לשבש את הדינמיקה קיפול הקול ולכן יכול להיות השלכות הרסניות על היכולת של המטופל לתקשר. הפרדת זרימה תלת מימדית הנגרמת על ידי פוליפ מודל רכוב על הקיר והשפעתו על עומס לחץ הקיר נבדקים באמצעות ולוצ'ימטריה של תמונת חלקיקים, הדמיה של קו חיכוך העור ומדידות לחץ על הקיר.

חקירת הפרדת הזרימה התלת מימדית הנגרמת על ידי מודל פוליפ קיפול ווקאלי

ההתנהגות התפקודית של תאים בתרבית ניתן לשפר על ידי culturing בלמעלה in vivo-כמו 3 ממדי סביבות תרבות 16-21. כתב יד זה מתאר את פעולת הגדרה ושל מערכת bioreactor סיבים חלולה עבור in vivo-כמו בתרבית רקמה יונקת.

ריאקטורים סיבים חלולים עבור<em&gt; In vivo</em&gt; תרבות הרקמות היונקת-כמו

מטרת הפרוטוקול הזה היא לבצע תרבות משותפת דינמית של מקרופאגים אנושיים ומיופיברובלסטים בפיגומי אלקטרו-ספון צינוריים כדי לחקור התחדשות רקמות מונחית חומרים, באמצעות ביו-ריאה המאפשרת ניתוק של לחץ גיסת ומתיחות מחזוריות.

ביו-ריאקטור רב-שלבי להערכת היכולת הדלקתית וההתחדשותית של ביו-חומרים תחת זרימה ומתיחות

הפרוטוקול מתאר ביוריאקטור התומך בהדמיה המאפשר הסרה סלקטיבית של האפיתל האנדוגני מקנה הנשימה של החולדה והתפלגות הומוגנית של תאים אקסוגניים על פני השטח של לומן, ולאחר מכן תרבית חוץ גופית ארוכת טווח של מבנה רקמת התא.

ביוריאקטור מונחה הדמיה ליצירת רקמת נתיב אוויר מהונדסת ביולוגית

מחקר זה מדגים ייצור של דגמי קיפול קולי לא דביקים וסופר-רכים על ידי הצגת דרך ספציפית ליצירת שכבות קיפול הקול, מתן תיאור מפורט של תהליך הייצור ואפיון תכונות הדגמים.

תהליך ייצור לדגמי קיפול קולי רך במיוחד ללא הדבקה

עיצבנו bioreactor טעינה מכאני רומן שניתן להחיל מאמץ מכאני uniaxial או biaxial לbiocomposite סחוס לפני ההשתלה לתוך פגם סחוס במפרק.

עיצוב של Bioreactor טוען מכונות Biaxial להנדסת רקמות

Fermentors משמשים כדי להגדיל את תשואת התרבות והפרודוקטיביות של תאים מהונדסים גנטיים. לאחר הקרנת מועמדי תרבית תאים של חיידקים או של בעלי חיים רבים בצלוחיות לרעוד, הצעד ההגיוני הבא הוא להגדיל ביומסה של התרבות שנבחרה עם fermentor. סרטון זה מדגים את ההקמה ותפעול של מערכת bioreactor המעבדתיים אופיינית.

מבצע של Bioreactor Benchtop

דה-סלולריזציה של איברים שלמים מייצרת פיגומים ביולוגיים טבעיים שעשויים לשמש לרפואה רגנרטיבית. מוצג תיאור של מודל פרימטים לא אנושי של התחדשות ריאות שבו ריאות שלמות עוברות דה-סלולריזציה ולאחר מכן נזרעות עם תאי גזע בוגרים ותאי אנדותל בביו-ריאקטור המאפשר זרימת כלי דם ואוורור מדיה נוזלית.

דה-סלולריזציה של ריאות פרימטים לא אנושיים ורסלולריזציה באמצעות ביו-ריאקטור מיוחד לאיברים גדולים

חקור את השפעת הגירוי הרטטי על תאי גזע מזנכימליים באמצעות ביוריאקטור המחקה פונציה. השיטה משתמשת בסקפולדים מ-PCL וממברנות סיליקון לניתוח תגובות תאיות ברמות החלבון והתרגום.

בנייה ואפיון של Bioreactor פולד רומן וקאלי

גלה סרטונים נוספים