Name: נתיחה וניתוח במורד הזרם של הזברה פינק עוברים בשלבים מוקדמים של פיתוח (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-06-21T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 23 s
Description: למד שיטת נתיחה לעוברי זברה פינק בשלבים מוקדמים לשימור רקמות לניתוח גנים ורעלנים. הטכניקה מאפשרת מחקר בביולוגיה התפתחותית וטוקסיקולוגיה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים מודים למקורות המימון שלהם, תכנית הווארד יוז הרפואי במכון לתואר ראשון מדע חינוך למכללת ויליאם ומרי; נותן חסות לגרנט: NIH (MSS); מספר גרנט: R15NS067566. הם גם מכירים תמיכה ממכללת ויליאם ומרי, החוג לביולוגיה במכללה לאמנויות ומדעים לקבלת סיוע בטיפול בבעלי חיים.

<ol><li>Eng, M. L., Elliott, J. E., MacDougall-Shackleton, S. A., Letcher, R. J., Williams, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+exposure+to+2%2C2%27%2C4%2C4%27%2C5-pentabromodiphenyl+ether+%28BDE-99%29+affects+mating+behavior+of+zebra+finches%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicol+Sci%22%5BJournal%5D)">Early exposure to 2,2',4,4',5-pentabromodiphenyl ether (BDE-99) affects mating behavior of zebra finches.</a> Toxicol Sci. 127, 269-276 (2012).</li>
<li>Winter, V., Elliott, J. E., Letcher, R. J., Williams, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Validation+of+an+egg-injection+method+for+embryotoxicity+studies+in+a+small%2C+model+songbird%2C+the+zebra+finch+%28Taeniopygia+guttata%29%5BTitle%5D)+AND+%22Chemosphere%22%5BJournal%5D)">Validation of an egg-injection method for embryotoxicity studies in a small, model songbird, the zebra finch (Taeniopygia guttata).</a> Chemosphere. 90, 125-131 (2013).</li>
<li>Maney, D. L., Goodson, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurogenomic+mechanisms+of+aggression+in+songbirds%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Genet%22%5BJournal%5D)">Neurogenomic mechanisms of aggression in songbirds.</a> Adv Genet. 75, 83-119 (2011).</li>
<li>Kirn, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+relationship+of+neurogenesis+and+growth+of+brain+regions+to+song+learning%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+and+Language%22%5BJournal%5D)">The relationship of neurogenesis and growth of brain regions to song learning.</a> Brain and Language. 115, 29-44 (2010).</li>
<li>Fisher, S. E., Scharff, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FOXP2+as+a+molecular+window+into+speech+and+language%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Genetics%22%5BJournal%5D)">FOXP2 as a molecular window into speech and language.</a> Trends in Genetics. 25, 166-167 (2009).</li>
<li>Tokarev, K., Tiunova, A., Scharff, C., Anokhin, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Food+for+Song%3A+Expression+of+C-Fos+and+ZENK+in+the+Zebra+Finch+Song+Nuclei+during+Food+Aversion+Learning%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Food for Song: Expression of C-Fos and ZENK in the Zebra Finch Song Nuclei during Food Aversion Learning.</a> PLoS One. 6, (2011).</li>
<li>Vargha-Khadem, F., Gadian, D. G., Copp, A., Mishkin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FOXP2+and+the+neuroanatomy+of+speech+and+language%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">FOXP2 and the neuroanatomy of speech and language.</a> Nat Rev Neurosci. 6, 131-138 (2005).</li>
<li>Schulz, S. B., Haesler, S., Scharff, C., Rochefort, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Knockdown+of+FoxP2+alters+spine+density+in+Area+X+of+the+zebra+finch%5BTitle%5D)+AND+%22Genes%2C+Brain+and+Behavior%22%5BJournal%5D)">Knockdown of FoxP2 alters spine density in Area X of the zebra finch.</a> Genes, Brain and Behavior. 9, 732-740 (2010).</li>
<li>Jarvis, E. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Avian+brains+and+a+new+understanding+of+vertebrate+brain+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Avian brains and a new understanding of vertebrate brain evolution.</a> Nat Rev Neurosci. 6, 151-159 (2005).</li>
<li>Brainard, M. S., Doupe, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translating+birdsong%3A+songbirds+as+a+model+for+basic+applied+medical+research%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Translating birdsong: songbirds as a model for basic applied medical research.</a> Annu Rev Neurosci. 36, 489-517 (2013).</li>
<li>Mayer, U., Watanabe, S., Bischof, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+memory+and+the+avian+hippocampus%3A+Research+in+zebra+finches%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol+Paris%22%5BJournal%5D)">Spatial memory and the avian hippocampus: Research in zebra finches.</a> J Physiol Paris. , (2012).</li>
<li>Warren, W. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genome+of+a+songbird%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The genome of a songbird.</a> Nature. 464, 757-762 (2010).</li>
<li>Agate, R. J., Scott, B., Haripal, B., Lois, C., Nottebohm, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenic+songbirds+offer+an+opportunity+to+develop+a+genetic+model+for+vocal+learning%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Transgenic songbirds offer an opportunity to develop a genetic model for vocal learning.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 106, 17963-17967 (2009).</li>
<li>Birkhead, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Internal+incubation+and+early+hatching+in+brood+parasitic+birds%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+Royal+Society+Biological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Internal incubation and early hatching in brood parasitic birds.</a> Proceedings of the Royal Society Biological Sciences. 278, 1019-1024 (2011).</li>
<li>Haesler, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FoxP2+expression+in+avian+vocal+learners+and+non-learners%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">FoxP2 expression in avian vocal learners and non-learners.</a> J Neurosci. 24, 3164-3175 (2004).</li>
<li>Godsave, S. F., Lohmann, R., Vloet, R. P. M., Gahr, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Androgen+receptors+in+the+embryonic+zebra+finch+hindbrain+suggest+a+function+for+maternal+androgens+in+perihatchingsurvival%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">Androgen receptors in the embryonic zebra finch hindbrain suggest a function for maternal androgens in perihatchingsurvival.</a> Journal of Comparative Neurology. 453, 57-70 (2002).</li>
<li>Stern, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+chick%3B+a+great+model+system+becomes+even+greater%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">The chick; a great model system becomes even greater.</a> Dev Cell. 8, 9-17 (2005).</li>
<li>Kuenzel, W. J., Medina, L., Csillag, A., Perkel, D. J., Reiner, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+avian+subpallium%3A+new+insights+into+structural+and+functional+subdivisions+occupying+the+lateral+subpallial+wall+and+their+embryological+origins%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research%22%5BJournal%5D)">The avian subpallium: new insights into structural and functional subdivisions occupying the lateral subpallial wall and their embryological origins.</a> Brain Research. 1424, 67-101 (2011).</li>
<li>Tickle, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+contribution+of+chicken+embryology+to+the+understanding+of+vertebrate+limb+development%5BTitle%5D)+AND+%22Mech+Dev%22%5BJournal%5D)">The contribution of chicken embryology to the understanding of vertebrate limb development.</a> Mech Dev. 121, 1019-1029 (2004).</li>
<li>Vergara, M. N., Canto-Soler, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rediscovering+the+chick+embryo+as+a+model+to+study+retinal+development%5BTitle%5D)+AND+%22Neural+Development%22%5BJournal%5D)">Rediscovering the chick embryo as a model to study retinal development.</a> Neural Development. 7, (2012).</li>
<li>Davey, M. G., Tickle, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+chicken+as+a+model+for+embryonic+development%5BTitle%5D)+AND+%22Cytogenet+Genome+Research%22%5BJournal%5D)">The chicken as a model for embryonic development.</a> Cytogenet Genome Research. 117, 231-239 (2007).</li>
<li>Murray, J. R., Varian-Ramos, C. W., Welch, Z. S., Saha, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryological+staging+of+the+zebra+finch%2C+Taeniopygia+guttata%5BTitle%5D)+AND+%22J+Morphol%22%5BJournal%5D)">Embryological staging of the zebra finch, Taeniopygia guttata.</a> J Morphol. , (2013).</li>
<li>Hawkins, P., Morton, D. B., Cameron, D., Cuthill, I., Francis, R., Freire, R., Gosler, A., Healy, S., Hudson, A., Inglis, I., Jones, A., Kirkwood, J., Lawton, M., Monaghan, P., Sherwin, C., Townsend, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laboratory+birds%3A+refinements+in+husbandry+and+procedures.+Fifth+report+of+BVAAWF%2FFRAME+%2FRSPCA%2FUFAW+Joint+Working+Group+on+Refinement%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Anim%22%5BJournal%5D)">Laboratory birds: refinements in husbandry and procedures. Fifth report of BVAAWF/FRAME /RSPCA/UFAW Joint Working Group on Refinement.</a> Lab Anim. , (2001).</li>
<li>Pearse II, R. V., Esshaki, D., Tabin, C. J., Murray, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+expression+analysis+of+intra-+and+extraarticular+connective+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Orthopaedic+Research%22%5BJournal%5D)">Genome-wide expression analysis of intra- and extraarticular connective tissue.</a> Journal of Orthopaedic Research. 27, 427-434 (2009).</li>
<li>Pizard, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-mount+in+situ+hybridization+and+detection+of+RNAs+in+vertebrate+embryos+and+isolated+organs%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Whole-mount in situ hybridization and detection of RNAs in vertebrate embryos and isolated organs.</a> Current Protocols in Molecular Biology. 66, (2004).</li>
<li>Warren, M., Puskarczyk, K., Chapman, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chick+embryo+proliferation+studies+using+EdUlabeling%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">Chick embryo proliferation studies using EdUlabeling.</a> Developmental Dynamics. 238, 944-949 (2009).</li>
<li>Salic, A., Mitchison, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+chemical+method+for+fast+and+sensitive+detection+of+DNA+syntesis+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+U+S+A%22%5BJournal%5D)">A chemical method for fast and sensitive detection of DNA syntesis in vivo.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 105, 2415-2420 (2008).</li>
<li>Hoogesteijn, A. L., DeVoogd, T. J., Quimby, F. W., De Caprio, T., Kollias, G. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reproductive+impairment+in+zebra+finches+%28Taeinopygia+guttata%29%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Toxicology+and+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Reproductive impairment in zebra finches (Taeinopygia guttata).</a> Environmental Toxicology and Chemistry. 24, 219-223 (2005).</li>
<li>Winter, V., Williams, T. D., Elliott, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+three-generational+study+of+In+ovo+exposure+to+PBDE-99+in+the+zebra+finch%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Toxicology+and+Chemistry%22%5BJournal%5D)">A three-generational study of In ovo exposure to PBDE-99 in the zebra finch.</a> Environmental Toxicology and Chemistry. 32, 562-568 (2013).</li>
<li>Kitulagodage, M., Buttemer, W. A., Astheimer, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adverse+effects+of+fipronil+on+avian+reproduction+and+development%3A+maternal+transfer+of+fipronil+to+eggs+in+zebra+finch+Taeinopygia+guttata+and+in+ovo+exposure+in+chickens+Gallus+domesticus%5BTitle%5D)+AND+%22Ecotoxicology%22%5BJournal%5D)">Adverse effects of fipronil on avian reproduction and development: maternal transfer of fipronil to eggs in zebra finch Taeinopygia guttata and in ovo exposure in chickens Gallus domesticus.</a> Ecotoxicology. 20, 653-660 (2011).</li>
<li>Hallinger, K. K., Zabransky, D. J., Kazmer, K. A., Cristol, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Birdsong+differs+between+mercury-polluted+and+reference+sites%5BTitle%5D)+AND+%22The+Auk%22%5BJournal%5D)">Birdsong differs between mercury-polluted and reference sites.</a> The Auk. 127, 156-161 (2010).</li>
<li>Chen, C. C., Wada, K., Jarvis, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Radioactive+in+situ+Hybridization+for+Detecting+Diverse+Gene+Expression+Patterns+in+Tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Radioactive in situ Hybridization for Detecting Diverse Gene Expression Patterns in Tissue.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2012).</li>
<li>Chen, C. C., Balaban, E., Jarvis, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interspecies+Avian+Brain+Chimeras+Reveal+That+Large+Brain+Size+Differences+Are+Influenced+by+Cell%E2%80%93Interdependent+Processes%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Interspecies Avian Brain Chimeras Reveal That Large Brain Size Differences Are Influenced by Cell–Interdependent Processes.</a> PLoS One. 7, (2012).</li>
<li>Chen, C. C., Winkler, C. M., Pfenning, A. R., Jarvis, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+profiling+of+the+developing+avian+telencephalon%3A+Regional+timing+and+brain+subdivision+continuities%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">Molecular profiling of the developing avian telencephalon: Regional timing and brain subdivision continuities.</a> The Journal of Comparative Neurology. 521, 3666-3701 (2013).</li>
</ol>

יש המחברים אין לחשוף.

פיתוח אחרונים של מדריך עובריים בימוי 22 וביאור הגנום לעשות פינק הזברה אורגניזם מודל רצוי למחקרים התפתחותיים. עם זאת, בגודל ושבריריות הקטן של העוברים פינק זברה, אשר נעו מ 3 עד 7 מ&quot;מ בשלבי 1 - 10 22, יכולים לעשות והניתוחים קשים 11, 14. איתור והסרה נקיה עוברים מפני שטח של החלמון יכול להיות מאתגר. פרוטוקול זה מספק פירוט מספיק כדי לבצע את ההליך בקלות. פרוטוקול זה מדגים את השלבים הקריטיים, כי הם בדרך כלל לא ידועים, אך נחוצים כדי להבטיח לנתיחה מוצלחת. לדוגמא, זה הכרחי כדי להשאיר שכבה קטנה של חלמון בין העובר והגיליון לשקול נייר כדי למנוע דבק. שני זיהוי וההסרה של העובר יכולים להיות קשים. כדי לפתור זיהוי העובר על פני השטח של החלמון, להאיר ישירות מעל החלמון אחרי זה ישהוסר מהביצה, ולהסתכל על החלמון בזווית של ° 45 למצוא את העובר. ברגע שהעובר נמצא, לחתוך את החלמון בשוקל נייר נזהר שלא לקרוע את העובר. אם יישומים נוספים כוללים הדמיה להבדלים אנטומיים, הכלאה באתר, או מבחני התפשטות תאים, חשוב להסיר את קרום vitelline בשלב 1 - 8 22 להדמיה טובה יותר של מבנים. אם נתקל בקשיים בעת הסרת החלמון או קרום vitelline בשלבים מוקדמים, לתקן את העובר בPFA 4% לפני שטיפה ב1X PBS להפחתת שבירות עוברית. על ידי הסרת ראשונה קרום vitelline במהלך הנתיחה כפי שתואר, מבנים גלויים לעין וללא שינוי בעוברים פינק זברה לאחר ביצוע הכלאה באתרו. הגבלה של edu היא ממשל שכרכי מינון מעל 478 מוביל NL הרוג עוברי. עם זאת, טווח המינון העצום מאפשר varyinרמות גרם של תיוג תא שגשוג. התגובה &quot;לחץ&quot; בשימוש בערכה זו היא הנחושת (AAC Cu (I)) (I) האיץ-alkyne-תזיד-cycloaddition. בתגובה הספציפית הזה, מולקולה אנלוגית תימידין המכיל alkyne (edu) משולבת באופן פעיל על ידי חלוקת תאים. קבוצת alkyne בedu בולטת החוצה ממבנה הסליל של ה-DNA, והוא זוהה על ידי חשיפה למולקולה אזיד מצומד למולקולה ירוקה, ניאון אשר נקשר לקבוצת alkyne בחינם. הקרינה הירוקה מראה תאים מתרבים לאחרונה בעובר. יו orthogonality של אזיד והקבוצות alkyne מונעים כתמים שאינם ספציפיים, כי מינים תגובתי אלה אינם נוכחים באופן טבעי ביצורים. כמו כן, כי ה-DNA לא צריך להיות מפוגל על מנת שהתגובה להתרחש, ניתוח ה-DNA תלוי נוסף יכול להיות מבוצע 27 בקלות. מגבלה המובנית של שיטה זו היא בגודל הקטן וFragility של עוברים פינק זברה. הסרת קרום vitelline של עוברים בשלבים 1 - 15 22 יכול לגרום למבנים עובריים מזיקים אם אינו מבוצע בזהירות. עם זאת, פרוטוקול זה מפשט את השיטה לנתיחה, ומאפשר לחוקרים להשתמש בשלבים עובריים מוקדם לבחון אנומליות מבנית וביטוי גנים שלא נחקר בעבר בעומק. פרוטוקול זה מפותח את הדרך לשפע של מבחני סלולריים מולקולריים שיאפשר לחוקרים לקבוע את מקורותיה ההתפתחותי של פנוטיפים מבוגרים. לדוגמא, ניתן יהיה לבחון ביטוי גנים מעורב בלמידה ווקאלית בתנאים סביבתיים שונים או בעקבות טיפולים תרופתיים בשלבים המוקדמים של פיתוח 28, 29,30,31. למרות שלא הפגין במאמר זה, בשיטה זו פוטנציאל המאפשרת להליכים אחרים כגון רדיואקטיביים הכלאה באתרו על סעיפי זברה פינק רקמות וelectroporation / באובניתוח o 32, 33,34. בהתחשב בכך שפנק הזברה כבר נקבע כאורגניזם מודל חשוב בתוך גוף עצום של ספרות, במחקרים מסוג הזדמנויות שלא נוצל לקשר מנגנוני התפתחות בפיזיולוגיה והתנהגות בוגרים, בפרט התפתחות השפה 7, 9.

המטרה הכללית של טכניקה זו היא להשיג פינק זברה עוברים (guttata Taeniopygia) החל מהשלבים המוקדמים של עובר לשימוש במגוון רחב של מחקרים התפתחותיים. זברה פינק הפכו אורגניזם מודל ציפור שיר הדומיננטי והיה בשימוש נרחב במגוון תחומים, ובם רעלים 1,2, התנהגות 3, זיכרון ולמידת 4,5,6, neuroanatomy ההשוואתי 7,8, והתפתחות שפת 9,10 . כציפור השיר רק עם הגנום רצף, פינק הזברה מאפשר מחקר מולקולרי והגנטי של סדר הציפורי השיר, אשר מייצג מעל 50% ממיני ציפורים ידועים 11, 12,13. למרות השימוש במבוגרים ופנקו זברה לנוער במגוון רחב של תחומים, כמה מחקרים שבוצעו בעוברים פינק זברה, במיוחד בשלבים מוקדמים של פיתוח. זו ניתן לייחס לגודל הקטן של הביצים שלהםnd עוברים, והמעמד החדש שלהם כ14,15,16 אורגניזם מודל למחקרים בהם את העוף (Gallus Gallus domesticus) שימש בעבר כ17,18,19,20,21 מערכת מודל דומיננטית. עם זאת, כלומדים שאינם קולניים, תרנגולות אינן מערכת מודל מתאימה ללימוד הבסיס הגנטי של למידה ווקאלית, פיתוח של למידה ווקאלית, תורשתיות, התנהגות, ומעגלי הגרעינים הבזליים-קליפת המוח המעורב בלמידה מוטורית 10. חשוב לציין כי עוברים פינק זברה הם הרבה יותר עדין ויותר בקלות נפגע מעובר חומוס במהלך נתיחה ונהלים מולקולריים. בפרט, נדרשת זהירות רבה יותר בעת ביצוע פעולות permeabilization על עוברים פינק זברה. דטרגנטים חזקים ואנזימים שלא יפגעו עובר אפרוח יכולים לפגוע בעוברים פינק זברה. במונחים של טיפול באופן כללי, יש צורך לשים את הביצים פינק זברה בכוסות קטנות לפני ההשמה בחממהכדי למנוע מהם לפרוץ כאשר מתגלגלים במהלך דגירה. זברה פינק נוחות למחקרים התנהגותיים, בקלות ובשטף גדול מתרבים בכל ימות שנה בשבי, והם לומדים ווקאלי. מאפיינים אלו מאפשרים את השימוש של פינק זברה כדי לענות על הצורך לאורגניזם מודל המשלב פיתוח, גנטיקה, והיבטים התנהגותיים של שפה. ניתוחי שיטות, כמפורט להלן, בשילוב עם מדריך הזמני שפותח לאחרונה ספציפי לפנק זברה 22, להפיק את פינק הזברה אורגניזם מודל ההתפתחותי סטנדרטי שימושי יותר ויותר. עם זאת, קבלת עוברים בשלבים מוקדמים יכולה להיות מרתיעה. פרוטוקול זה מאפשר לחוקרים לקבל עוברים בראשית התפתחות בקלות. מחקרים חוקרים את ההתפתחות המוקדמת ואת הבסיס ההתפתחותי המולקולרי של התנהגויות מורכבות בפנקו זברה, או את השפעות טוקסיקולוגי בפיתוח בקטן אחרים, ציפורים passerine ימצאו המתודולוגיה לנתיחה זה שימושי.

<table><tbody><tr><td>חממת</td><td></td><td></td> ביצי עוף <td>אנו משתמשים בחממת חלון חובה-בטור תמונה, דגם אוויר במחזור&nbsp; &nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>ערכת הדמיה Click-iT EdU Alexa Fluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>C10337</td><td>זיהוי התפשטות תאים.&nbsp;</td></tr><tr><td>מיקרוסקופ דיסקציה&nbsp;</td><td></td><td></td><td>אנו משתמשים בנימי Olympus SZ61</td></tr><tr><td>7 אינץ' Drummond עבור מזרק Nanoject II</td><td>Drummond</td><td>3-00-203-G/X</td><td></td></tr><tr><td>Drummond Nanoject II מיקרו-מזרק</td><td>Drummond</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dumont פינצטה #55</td><td>World Precision Instruments</td><td>14099</td><td></td></tr><tr><td>אתנול (EtOH)</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>50 מ"ל שפופרת פלקון (פוליפרופילן)פישר</td><td> מדעי</td><td>06-443-18&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>FastPrep Lysis Matrix H tubes</td><td>MP biomedicals</td><td>6917-100</td><td>משמש למיצוי RNA, המשמש להומוגניזציה של עוברים</td></tr><tr><td>מנורות תאורה סיבים אופטיים (תאורה בעוצמה גבוהה)</td><td>דולן-ג'נר תעשיות&nbsp;</td><td>פייבר-לייט MI-150&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>בקבוקוני זכוכית עם מכסה בורג (מטופל ב-DEPC)</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>03-338A</td><td></td></tr><tr><td>צינור מיקרוצנטריפוגה eppe (1.5 מ"ל)</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>05-408-129</td><td></td></tr><tr><td>שמן מינרלי</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>M-8410</td><td></td></tr><tr><td>דוגמנות חימר</td><td></td><td></td><td>כל מותג</td></tr><tr><td>Narshige PB-7 חולץ מחט Narshige</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Omni Bead Ruptor Homogenizer</td><td>OMNI International</td><td>19-010</td><td>משמש למיצוי RNA</td></tr><tr><td>4% פרפורמלדהיד (4% PFA): 20 מ"ל 8% PFA (32 גרם פרפורמלדהיד, 350 מ"ל sdd H2O, התאם את ה-pH ל-7.6, 400 מ"ל sdd H2O), 20 מ"ל 2x PBS</td><td>קיבוע עוברים. זהירות, מזיק ואין לשאוף.&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>תמיסת מלח חוצץ פוספט (1x PBS): 200 מ"ל 10x PBS, 1,800 מ"ל Barnstead H2O, התאם את ה-pH ל-7.4</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>תמיסת מלח חוצצת פוספט (10x PBS): 800 מ"ל Barnstead, 2.013 גרם KCL, 80.063 גרם NaCl, 2.722 גרם KH2PO4 monobasic, 14.196 גרם Na2HPO4 dibasic, 200 מ"ל Barnstead H2O, התאם את ה-pH ל-6.5</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>תמיסת מלח חוצצת פוספט עם 0.1% Tween-20 (1x PTw): 1,800 מ"ל Barnstead H2O, 200 מ"ל 10x PBS, התאם את ה-pH ל-7.4, 2 מ"ל Tween-20</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>35 מ"ל צלחת פטרי מפלסטיק&nbsp;</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>08-757-100A</td><td></td></tr><tr><td>ניילון נצמד</td><td></td><td></td><td>כל מותג</td></tr><tr><td>Prepease RNA Spin Kit</td><td>PrepEase, Affymetrix</td><td>78766 1 KT</td><td>משמש למיצוי RNA, המשמש להומוגניזציה של עוברים</td></tr><tr><td>תערובת תגובה: 875 &mu; l 1xPBS, 100 מ"מ 20 &mu; l CuSO4 (רכיב ערכה E), 5 &mu; l Alexa Fluor 488 azide (רכיב ערכה B), 100 &mu; l תוסף מאגר תגובה מדולל (רכיב ערכה F)</td><td>Invitrogen</td><td>C10337</td><td>זיהוי התפשטות תאים.&nbsp;</td></tr><tr><td>sdd H2O</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>זרעים&nbsp;</td><td></td><td></td><td>אנו משתמשים בו כמיכל בעת דגירה של ביצים</td></tr><tr><td>אזמל נירוסטה&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>קופסת</td><td></td><td></td> קן סטנדרטית <td>אנו משתמשים ב-Abba פלסטיק פרוש Nestboxes</td></tr><tr><td>4 מ"ל, כובע מרופד טפלון, בקבוקוני זכוכית</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>02-912-352</td><td></td></tr><tr><td>פיפטות העברה (פוליאתילן)</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>13-711-7M&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>נייר שוקל 4 x 4</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>09-898-12B</td><td></td></tr></tbody></table>

נתיחה וניתוח במורד הזרם של הזברה פינק עוברים בשלבים מוקדמים של פיתוח

Dissection and Downstream Analysis of Zebra Finch Embryos at Early Stages of Development

פינק הזברה (guttata Taeniopygia) הפך אורגניזם מודל חשוב יותר ויותר בתחומים רבים של מחקר, כולל רעלים 1, 2, 3 התנהגות, וזיכרון ולמידת 4,5,6. כציפור השיר רק עם הגנום רצף, יש פינק הזברה פוטנציאל גדול לשימוש במחקרים התפתחותיים; עם זאת, מוקדם של פיתוח פינק זברה השלבים לא נחקרו היטב. היעדר המחקר בפיתוח פינק זברה ניתן לייחס את הקושי שלו לנתח את הביצה הקטנה ועובר. השיטה לנתיחה הבאה ממזערת את ניזק לרקמות עוברית, המאפשר חקירה של מורפולוגיה וביטוי גנים בכל שלבי התפתחות עוברית. זה מאפשר גם שדה בהיר והדמיה באיכות הקרינה של עוברים, השתמש בהליכים מולקולריים כגון הכלאה באתרו (ISH), מבחני התפשטות תאים, ומיצוי RNA למבחנים כמותיים כגון ריאה כמותייםl-Time PCR (qtRT-PCR). טכניקה זו מאפשרת לחוקרים ללמוד שלבים מוקדמים של פיתוח, שהיו קשה בעבר לגישה.

הצעדים נתחו באיור 1 מצביעים על הופעתו של העובר בזמן שמחובר לממברנה vitelline () ולהדגים את השיטה הנכונה כדי להפריד את העובר מן החלמון (ב &#39;). העובר יכול להיות מזוהה על ידי האזור של צומת, שהוא הרבה יותר קל מאשר קרום vitelline. העובר עצמו הוא לעתים קרובות קשה להבחין עד החלמון הוא חתך משם. ברגע שהעובר הוא גזור מהביצה, זה יכול להיות קבוע או הבזק הוקפא לשימוש עתידי. אם הכלאה באתר מתוכנן לעובר גזור, יש צורך להסיר את קרום vitelline כי הוא דבק בעובר דרך האזור של צומת. איור 2 ממחיש את הנראות משופרות של העובר ברגע שקרום זה מוסר (ג), והדרך הנכונה לקלף את קרום vitelline (A, B). לאחר נתיחה וקיבעון, הר שלם הכלאה באתרו בוצע כפי שניתן לראות באיור 3 (, א &#39;, ב&#39;, ב &#39;&#39;) ואיור 4 (, א&#39;, ב &#39;, ב&#39;) ואיור 5 (A, B, C) ​​כדי לזהות הבדלים בorthodenticle homeobox 2 (ביטוי Otx2) בעוברים מבחינה התפתחותית שנחשפו למינונים נמוכים של מתיל כספי. איור 5 מראה תוצאות בדיקה תחושה, חוסר הפגנה של רקע. באיור 4, למרות היותו גזור מן הביצה באותה נקודת הזמן, את העובר מבחינה התפתחותית החשוף לתיל כספי (MeHg) התקדם שלב 5 22 (ב &#39;, ב&#39;), ואילו עובר השליטה פיתח לשלב 6 22 (, &#39;). הקבוצה של עוברים גזורים ומוצגת באיור 4 נאספו מהקן ולקחה מן החממה באותו הזמן. למרות שחלק וריאציה טבעית נמצאת בפיתוח, המבוסס על נתונים נתיחה קודמים, אין זה סביר כי תנודות טמפרטורה בחממה יגרמו רק את העוברים מהתיל כספיים עמודים לדקה 2.4 להיות develo<html> עיכב pmentally. ההבדלים בשלבים להצביע על שינויים בהתפשטות תאים בעוברים התפתחותית החשופים לתיל כספי. לפני הנתיחה, edu הוזרק ליום 2 ביצים ואיפשר לדגירת הלילה. לאחר נתיחה וקיבעון של השלב 16 22 עובר, edu היה דמיינו באמצעות &quot;לחץ על&quot; כימיה, המאפשר זיהוי של תאים מתרבים כפי שניתן לראות באיור 6 (A, B, C). חשוב לעקוב בקפידה נקודות זמן בעת ​​ביצוע ביצים באינקובטור ובמהלך הניתוחים, כמו חשיפה לתיל כספי או ביצוע assay edu עלול לשבש התקדמות התפתחותית. ההזרקה המוקדמת בוצעה ביום 0, אשר היה היום של איסוף כמפורט בשלב 1.3. העובר הזה היה גזור כ 38 שעות מאוחר יותר (שלב 7 22). שיעור ההישרדות נמצא כ 90% (שיעור זהה עובר בקרה), כל עוד סכום ההזרקה היה תחת 478 NL. &quot;Jove_content&quot;&gt; מתודולוגיה לנתיחה זו מאפשרת גם להפקת RNA באיכות גבוהה. לאחר לנתח שלב 16 22 עוברים, מיצוי RNA בוצע על פי הפרוטוקול של היצרן ללא אופטימיזציה הנדרשת, כפי שניתן לראות באיור 7. הסרת קרום vitelline הייתה מיותרת להפקת RNA, ומאוחר יותר יישומי qRT-PCR. הערה: כל נתוני העובר הם בכיוון, כך שהאזורים הקדמי והאחוריים הם בחלק העליון והתחתון של התמונות, בהתאמה. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/51596/51596fig1highres.jpg" /> איור 1. נוהל איתור ולנתח עוברים פינק זברה, שלבי 1-10 22. אתר עובר על ידי בעדינות מגלגל את החלמון עד לבן הדיסק הקלוש הוא לכאורה (א &#39;). ברגעעובר נמצא במרכזו של החלמון, החלמון הוא גזור באופן הדרגתי (ב &#39;) שבו החתך הראשון מקל על לחץ של קרום vitelline (1) וקיצוצים שלאחר מכן (2) גובל באזור של צומת (ZJ) שהוא דבק בקרום vitelline. ברים סולם מייצגים 1 מ&quot;מ. <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/51596/51596fig2highres.jpg" /> איור 2. הסרת קרום vitelline ונראות של מבנים עובריים. בעקבות ההסרה של העובר מהחלמון, עובר מקום בצלחת פטרי המכילה 4% PFA. אם הכלאה באתר צריכה להתבצע, נראות של המבנים העובריים היא חיוניות ויכולות להיות מושגת על ידי הסרת קרום vitelline (א &#39;). גריפ קרום vitelline עם קנס נוסף הטה מלקחיים ובעדינות לקלף אותו מעובר על ידי טיפול בעובר באופן ישיר בקצה החיצוני, במידת צורך(ב). הסרת קרום vitelline מגבירה בהירות של מבנים עובריים, ומאפשרת לעוברים להיות צילמו או מעובד עם הכלאה באתרו (C). ברים סולם מייצגים 1 מ&quot;מ. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51596/51596fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/51596/51596fig3highres.jpg" /> איור 3. הר שלם הכלאה באתרו שבוצע על העוברים פינק זברה התפתחותית חשופים לתיל כספי. דפוסי ביטוי של orthodenticle homeobox 2 (Otx2) התאפיינו בעוברים שנחשפו ל0.0 תיל כספי עמודים לדקה (, &#39;) ו2.4 תיל כספי עמודים לדקה (ב&#39;, ב &#39; &#39;) באמצעות דיאטת הורים. המטלותrsal () וביטוי הגחון (א &#39;) של Otx2 גלוי לאורך שלפוחית ​​המוח התיכון והאופטי בשלב 22 12. עוברי קבוצת הטיפול נותחו באותה נקודת הזמן, אבל היו עיכוב התפתחותי כפי שניתן לראות בגב (B) ומבט הגחון (ב &#39;) של מבני ראש, אשר אופייניים לשלב 11 22 קיצורים:. MB, המוח התיכון; אופ, שלפוחית ​​אופטית. ברים סולם מייצגים 1 מ&quot;מ. <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/51596/51596fig4highres.jpg" /> איור 4. הר שלם &#160; באתר &#160; הכלאה בוצעה על העוברים פינק זברה התפתחותית החשופים לתיל כספי. דפוסי ביטוי של orthodenticle homeobox 2 (Otx2) אופיינו בשלב 6 22 אמברי<html> מערכת הפעלה חשופה לתיל כספי 0.0 עמודים לדקה (, &#39;) ושלב 5 22 עוברים שנחשפו ל2.4 תיל כספי עמודים לדקה (ב&#39;, ב &#39;) באמצעות דיאטת הורים. קיצורים: בבוקר, בשולים קדמי של המזודרם; לא, notochord, המזודרם notochord; פו, proamnion, blastopore הקדמי; ps, תכונה ראשונית 22. ברים סולם מייצגים 1 מ&quot;מ. <img alt="איור 5" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51596/51596fig5highres.jpg" width="600" /> איור 5. הר שלם באתרם &#160; הכלאה בוצעה על עוברים פינק זברה באמצעות בדיקה תחושה. () שלב 5 22 עובר. (ב &#39;) בשלב מוקדם 6 22 עובר. (C) שלב 11 עובר 22. ברים סולם מייצגים 1 מ&quot;מ. 6 &quot;src =&quot; / files/ftp_upload/51596/51596fig6highres.jpg &quot;/&gt; איור 6. התאגדות edu וtection דה בעוברים פינק זברה. Edu &quot;לחץ&quot; כימיה הייתה בשימוש כדי לזהות תאים מתרבים בשלב 16 22 עובר (A, B, C). Edu הוא שולב DNA במקום של תימידין 26, 27 והוא זוהה באמצעות לחץ כימיה 27. התפשטות היא נראית בבירור בקצוות לרוחב של somites, וtailbud. לוח מראה ריבוי המתרחש באופן בלעדי באחורי של העובר וגם מראה תאי שגשוג פרט. הלוח ב &#39;מציג את מיקומי שגשוג בכל העובר. לוח ג מראה האזור הקדמי, ומציג את telencephalon השגשוג מאוד (TE) ביתר פירוט. קיצורים: af, לקפל מי שפיר; FLB, ניצן forelimb; HLB, ניצן hindlimb; le, שלפוחית ​​עדשה; ms, mesencephalon; הר, Metencephalon; OPC, גביע אופטי; הרשות, קשת בלוע; SM, המזודרם somite; שחפת, tailbud; te, telencephalon. ברים סולם מייצגים 1 מ&quot;מ. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51596/51596fig6large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 7" src="/files/ftp_upload/51596/51596fig7highres.jpg" /> איור 7. איכות של RNA המופק מעוברים גזורים פינק זברה. בקרה (0.0 עמודים לדקה) ו1.2 עוברי תיל כספיים עמודים לדקה נותחה ופלאש קפוא כפי שמתואר בשלב 3.8. כל נתיב מציג RNA המופק משני עוברים הומוגני מכל קבוצת טיפול.

פרוש הזברה (Taeniopygiaguttata) הוא אורגניזם מודל בעל ערך; עם זאת, שלבים מוקדמים של התפתחות פרוש הזברה לא נחקרו בהרחבה. הפרוטוקול מתאר כיצד לנתח עוברים מוקדמים ליישומים התפתחותיים ומולקולריים.

The zebra finch (Taeniopygiaguttata) has become an increasingly important model organism in many areas of research including toxicology1,2, behavior3, and ...

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא להוציא על ידי דיסקציה עוברים של פנץ' זברה שלמים בשלבים עובריים מוקדמים מאוד, עבור יישומים התפתחותיים ומולקולריים בהמשך. דבר זה מושג תחילה על ידי חיתוך קליפת הביצה לאורכה וריקון עדין של תכולת הביצה על נייר WHE. לאחר מכן, מאתרים את אזור החיבור (zone of junction) וחותכים את החלמון שסביבו, כך שהעובר נשאר שלם.לאחר מכן מעבירים את העובר לצלוחית פטרי ושוטפים אותו לפני קיבוע או הקפאה מהירה (flash frozen) לצורך ניתוח מאוחר יותר. לבסוף, מסירים את קרומי החלמון (vitel membrane) מהעובר המקובע כדי להגביר את הבהירות של מבני העובר. בסיכום, ב-C, שתי היברידיזציות וטיפול ב-EDU מראים ביטוי גנים ותאים מתחלקים, בהתאמה, בשלבי התפתחות עובריים מוקדמים של הנחלי הזברה בתגובה לטיפול במתילכספית.היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שהיא ממזערת את הנזק לרקמה עוברית. דבר זה מאפשר לחקור את המורפולוגיה ואת ביטוי הגנים לאורך כל שלבי ההתפתחות. שיטה זו עשויה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בביולוגיה התפתחותית השוואתית ובטוקסיקולוגיה, כגון השפעותיהם של רעלים שונים על השלבים המוקדמים ביותר של ההתפתחות.הדגמה חזותית של טכניקה זו היא קריטית, שכן איתור צומת ה-zno והסרת קרומי ה-vilin במהלך הדיסקציה עלולים להיות קשים, כיוון שמבנים עובריים מוקדמים הם שבריים וקשים לתצפית. לאחר איסוף ביצי תוכי זברה (zebra finch) ודגירה שלהם בהתאם לפרוטוקול הכתוב, הכינו את החומרים הבאים לדיסקציה: סקלפל נקי, פינצטה בעלת חוד דק, שתי פינצטות בעלות חוד דק במיוחד, שלוש פיפטות העברה, ו-XPBS ו-4%para formaldehyde.אם בכוונתכם לקבע את העוברים, הניחו פיסת נייר גלי בגודל 10 על 10 סנטימטרים על בסיס מיקרוסקופ הדיסקציה כדי לספק משטח נקי שאינו סופג לצורך הדיסקציה. הוציאו את הביצה מהאינקובטור בנקודת הזמן הרצויה, כפי שנקבע על פי המדריך לתוכי זברה. לאחר מכן, באמצעות מנורת תאורה סיבית, בצעו בדיקת תאורה (candling) לביצה על ידי החזקתה לאורך הציר האנכי שלה והארת פנים הביצה.הניחו את קצה מקור האור מאחורי הביצה ואתרו את החלמון ואת העובר המתפתח. לאחר מכן, מקמו את הסכין (scalpel) בצד הנגדי לחלמון, ובבעיטה קלה, חתכו לאורך הביצה מקצהה ועד בסיסה. הסירו את תוכן הביצה באמצעות הפעלת לחץ זהירה בעזרת האגודל והאצבע על בסיס קצה הביצה, או באמצעות פינצטה כדי להפריד בעדינות את קליפת הביצה לאורך החתך.בחן את החלמון כדי לאתר את אזור החיבור הלבן (white zone of junction), הנראה כטבעת לבנה עמומה המקיפה את העובר המתפתח, והשתמש בפינצטה בעלת קצה דק כדי לכוון את החלמון כך שהעובר ימוקם במרכז, במטרה להפריד את העובר מהרקמה החוץ-עוברית. נקב את שולי החלמון כדי לשחרר את הלחץ ובצע חתכים בודדים לאורך קוטר החלמון לצד הדיסק העוברי.המשיכו ליצור קווים אלכסוניים עד שהחלק של החלמון שבו נמצא העובר יופרד בהצלחה. באמצעות פיפטת העברה, הסירו את קצוות החלמון, והשאירו כמות קטנה לסיכוך העובר על נייר הדרך כדי למנוע ממנו להיקרע. שטפו את הדיסק העוברי על ידי הנחת קצה של פיפטת העברה עם 1X PBS לידו בזווית של 45 מעלות הפונה לתחתית העובר, ושחררו את הבופר באמצעות כמות קטנה של 1X PBS.העבירו את העובר לצלוחית פטרי פלסטית קטנה. שטפו את העובר על ידי הוספת PBS נוסף לצלוחית וטפטוף של PBS בסמוך לעובר. סובבו את הצלוחית כדי לשטוף ולהסיר שאריות חלמון.לאחר מכן, הטה את הצלחת כדי לשאוב את הבאפר השארי. אם קיבעת את העובר עבור כלוכיל הכלאה (in situ hybridization), הוסף מיד 4% PFA כדי להטביعه, ולאחר מכן טפטף PFA ישירות על העובר כדי להשטיחו ולמנוע ממנו להתכרבל. דגרי למשך 12 שעות בטמפרטורה של 4 °C לאחר ייבוש של העובר בסדרת מתנול.אם העובר נמצא בין שלבים אחד לשמונה, הסיר את קרומי החלמון (vitel membrane), הדבקים לעובר, באמצעות פינצטה עדינה מאוד לאחיזת קצוות הקרומים הבולטים מעבר לאזור החיבור. הפוך את העובר בזהירות מספר פעמים כדי לשטוף גרגירי חלמון שנותרו ולשחרר את הדיסק העוברי מקרומי החלמון. אם לא נוצר מרווח בין אזור החיבור לקרומי החלמון, השתמש בפינצטה בעלת קצה עדין מאוד כדי לגרד בעדינות את אזור החיבור כדי לשחררו מהקרום.לאחר מכן, אחזו בממברנת ה-viel ובקצה ההיקפי של הדיסק העוברי באזור החיבור, ומשכו בעדינות את ממברנת ה-viel הרחק מהעובר. אם בכוונתכם לבצע הקפאה מהירה (flash freezing) של העובר לאחר הניתוח, הוסיפו במהירות 2-3 milliliters של 1XPBS לפטריה והטו אותה כדי להפריד את העובר מגרגרי ה-OK. לאחר הסרת הנוזל וחזרה על השטיפה פעמיים או שלוש, השתמשו בפינצטה בעלת קצה דק כדי להעביר את העובר למבחנה של מיקרו-צנטריפוגה המסומנת מראש, ובצעו הקפאה מהירה בחנקן נוזלי לפני האחסון בטמפרטורה של minus 80 degrees Celsius.ביצוע בדיקת שגשוג תאים בשיטת EDU באמצעות נורת מאיר סיב אופטי, נר וביצה. כדי לאתר את העובר או את החלמון, סמנו את הצד של הביצה המנוגד לעובר או לחלמון כדי להבטיח שהעובר לא ייפגע במהלך ההזרקה המיקרוסקופית. לאחר מכן, רפדו צלחת פלסטיק של 60 מילימטר בעזרת פלסטלינה, על ידי עיצובה לצורת קערה, כדי להחזיק את הביצה באוריינטציה הרצויה.כווננו את כיוון הנקודה המסומנת כדי לאפשר את הכנסת מחט המיקרו-הזרקה. לאחר משיכת שתי מחטי קפילריה מזכוכית לקצוות קהים, אחת ליצירת חור בביצה עם שמן מינרלי מאחור, טענו את המחט השנייה והכניסו אותה למיקרו-מזרק. הגדירו במיקרו-מזרק את נפח התמיסה לכל הזרקה ל-59.8 nanoliters, ולאחר מכן, באמצעות תמיסת EDU מלאי בריכוז 10 millimolar, טענו את מחט המיקרו-הזרקה. בעזרת הקפילריה מזכוכית בעלת הקצה הקהה, נקבו בזהירות חור בקליפה בנקודה המסומנת, תוך הקפדה לא לשבור את הקליפה או להפיל רסיסים ממנה לתוך חלל הביצה.כוון את הביצה כך שהחור יהיה בזווית של 45 מעלות בקו אחד עם מחט המיקרו-הזרקה שיוכנסת. לאחר מכן, באמצעות המיקרו-מניפולטור, הכנס את המחט הטעונה למשך כסנטימטר אחד אל תוך החלל והזרק את הכמות הרצויה של תמיסת EDU לתוך החלמון או העובר. השתמש מיד במספר שכבות של פלסטיק כדי לעטוף את הביצה ואת תומך החימר, והדבק את קצוות העטיפה לתחתית הצלחת כדי למנוע אידוי במהלך הדגירה.דגרו את הביצה בטמפרטורה של 37 °C על משטח יציב עד להגעה לשלב הרצוי, לפני הסרת עטיפת הפלסטיק וביצוע נתיחה לעובר בהתאם לפרוטוקול הכתוב; איור זה מציג היברידיזציה של NC שניים בעוברים שנתיחו וקובעו ונחשפו למינונים נמוכים של מתיל-כספית כדי לזהות ביטוי של ortho identical homeo box. כפי שניתן לראות במבט הגבי והבטני של מבני הראש, העוברים המטופלים הראו עיכוב התפתחותי בשלב 11 בהשוואה לעוברים שלא טופלו. בשלב 12, קבוצת ארבעת העוברים המוצגת משמאל דגרה למשך אותו פרק זמן.עם זאת, שני העוברים שלא טופלו בצד שמאל למעלה התקדמו לשלב שש, בעוד ששני העוברים שטופלו בכספית בצד שמאל למטה התקדמו רק לשלב חמש. עוברים אלו טופלו בחסון (sense probe) כדי להדגים היעדר צביעת רקע; מוצגים כאן תאים מתחלקים בעובר ביום השני שהוזרק ב-EDU ולאחר מכן הועבר להדגרה למשך לילה. כימיה של קליק (Click chemistry) מראה התחלקות בשוליים הלטראליים של הסומיטים ובניצן הזנב, וכן בצפוד (cephalon).ג'ל זה מכיל דגימות RNA שהופקו מעוברים של פנזיברה (zebra finch) בשלב 16 שנותחו ולא טופלו, או טופלו ב-1.2 חלקים למיליון של מתיל כספית, מה שמעיד כי שיטת הנתיחה המוצגת בסרטון זה מאפשרת הפקה של RNA באיכות גבוהה לאחר רכישת המיומנות. ניתן לבצע את הנתיחה בפחות מדקה אם היא מבוצעת כראוי. במהלך הליך זה, חשוב לבחון את החלמון מזווית כדי לאתר את העובר, שכן עוברים בשלבים מוקדמים עשויים להיות קשים לצפייה בעקבות הליך זה.ניתן לבצע שיטות נוספות, כגון היברידיזציה של in situ, בדיקות התרבות תאים והבטחת RNA לצורך אנליזות איכותניות, כדי לענות על שאלות נוספות במחקרי התפתחות ורעילות.

dissection-downstream-analysis-zebra-finch-embryos-at-early-stages

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

שימוש הר שלם באתרו הכלאה קישור לביולוגיה מולקולרית האורגניזם

תהליכים התפתחותיים כגון התפשטות, דפוסים, בידול, והדרכה האקסון יכולים להיות מודל בקלות בחוט השדרה דג הזברה. במאמר זה, אנו מתארים הליך הרכבה לעוברי דג הזברה, אשר מייעל את ההדמיה של אירועים אלה.

נתיחה והרכבה לרוחב של עוברי דג הזברה: ניתוח התפתחות חוט השדרה

confocal הדמיה זמן לשגות היא טכניקה רבת עוצמה שימושית לאפיון התפתחות עוברית. כאן, אנו מתארים את המתודולוגיה ולאפיין המורפוגנזה craniofacial בסוג פראי, כמו גם PDGFRA, smad5, וSMO עוברים שעברו מוטציה.

ניתוח Craniofacial המורפוגנזה בדג הזברה שימוש 4D מיקרוסקופיה confocal

עובר דג הזברה הוא מודל מצוין למחקר בביולוגיה התפתחותית. במהלך עובר, דג הזברה מתפתחת עם מסת חלמון, אשר מציבה אתגרים תלת ממדים לתצפית מדגם וניתוח. פרוטוקול זה מתאר כיצד ליצור הכנות הר שטוחות דו ממדים של הר שלם באתרם דגימות (לוואי) מוכתמות דג הזברה עובר.

הר הכנה שטוחה לתצפית וניתוח של עובר דג הזברה דוגמאות ויטראז בהר שלם<em&gt; באתרו</em&gt; הכלאה

השיטה המתוארת כאן מאפשר ניתוח זמן לשגות של פיתוח איבר עוברי דג הזברה באמצעות הקרינה מיקרוסקופ לנתח מסוגל לבצע חתך אופטיים אסטרטגיות פשוטות של הסתגלות לתקן להיסחף מוקדי מישוריים.

ניתוח של פיתוח כליה דג הזברה עם זמן לשגות הדמיה באמצעות מיקרוסקופ לנתח מצויד עבור חתך אופטי

מיטוזה היא קריטית לכל אורגניזם חי ופגמים מובילים לעתים קרובות לסרטן ולהפרעות התפתחותיות. באמצעות פרוטוקול הדמיה זה ודגי הזברה כמערכת מודל, חוקרים יכולים לדמיין מיטוזה באורגניזם בעל חוליות חי ואת שלל הפגמים המתעוררים כאשר תהליכים מיטוטיים פגומים.

התבוננות mitotic חטיבת Dynamics בעובר דג הזברה לחיות

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לבידוד רקמת האשכים של דג הזברה הזחל, אשר יקל על חקירות של בידול מין דג הזברה ותחזוקה.

דיסקציה של רקמות הזחל דג הזברה האשכים

פרוטוקול זה מדגים שיטה מבוססת הקרינה לדמיין את כלי הדם וכדי לכמת את המורכבות שלה tropis Xenopus . כלי הדם ניתן הדמיה דקות לאחר הזרקת צבע פלואורסצנטי לתוך הלב הפועם של עובר לאחר מניפולציות גנטיות ו / או תרופתי ללמוד התפתחות הלב וכלי הדם in vivo .

ויזואליזציה וניתוח כמותי של אנגיוגנזה עובריים ב<em&gt; Xenopus טרופי</em

כאן, אנו מציגים את הפרוטוקול לתרבות רקמות תלת-ממדית של ציר הגוף האחורי של דג הזברה, המאפשר מחקר חי של פילוח בעלי חוליות. מודל הסבר זה מספק שליטה על התארכות הציר, שינוי מקורות מורפוגן והדמיה חיה ברמת הרקמה בתת-תאיות.

תרבות הסבר זנב תלת-ממדית לחקר פילוח בעלי חוליות בזברהפיש

מתוארת אסטרטגיית הכנת דגימה להדמיית עוברים מוקדמים של דגי זברה בתוך כוריון שלם באמצעות מיקרוסקופ יריעות אור. הוא מנתח את הכיוונים השונים שהעוברים רוכשים בתוך הכוריון בשלבי 70% אפיבולי וניצן ומפרט אסטרטגיות הדמיה להשגת רזולוציה בקנה מידה תאי בכל העובר באמצעות מערכת יריעות האור.

אסטרטגיות הדמיה והרכבה של מיקרוסקופ גיליון אור עבור עוברים מוקדמים של דגי זברה

למד שיטת נתיחה לעוברי זברה פינק בשלבים מוקדמים לשימור רקמות לניתוח גנים ורעלנים. הטכניקה מאפשרת מחקר בביולוגיה התפתחותית וטוקסיקולוגיה.

נתיחה וניתוח במורד הזרם של הזברה פינק עוברים בשלבים מוקדמים של פיתוח

גלה סרטונים נוספים