גזירה ללא מזין של תאים עצביים קרסט אב קדמון מפלוריפוטנטיים אדם בתאי גזע

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא להפיק תאי מוצא של רב השבתי העצבי (neural crest progenitor cells) מתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים באמצעות פרוטוקול קצר, הניתן לשחזור ומוגדר. תאים אלו יכולים לשמש להמשך מחקר של מחלות הקשורות לרב השבתי העצבי in vitro, או להמשך גזירה של תאים אלו לתאי צאצאים. דבר זה מושג תחילה על ידי זריעה של תאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים בצפיפות גבוהה כשכבה אחת (monolayer) על matrigel.

השלב השני הוא גדיעת התאים לתאי אפיתל עצביים (neuro epithelial cells) באמצעות רצף ושילוב מוגדרים של מולקולות קטנות המשפיעות על מסלולי איתות מרכזיים. לאחר מכן, תאי האפיתל העצביים נזרעים מחדש ומובאים לדDifferentiation נוספת לתאי אב של רכס עצבי (neural crest progenitor cells). השלב הסופי הוא בידוד תאי הרכס העצבי באמצעות מיון תאים מופעל פלואורסצנציה (fluorescence activated cell sorting).

בסופו של דבר, נעשה שימוש באימונופלואורסצנציה ובבדיקות תפקודיות, כגון יכולת הנדידה של התא, כדי להראות שנוצרו תאי רב-עצב (neural crest) תקינים. היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני פרוטוקולים קיימים להשגת תאי רב-עצב מתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים הוא משך הזמן הקצר יותר. התהליך נמשך רק 18 ימים.

השיטה ניתנת לשחזור טוב יותר בשל היעדר תאי הזנה מסוג MS5. קל להגדיל את קנה המידה שלה, והיא ניתנת לשחזור גבוה בין קווי תאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים. ההשלכות של טכניקה זו משתרעות על מחקרים של מנגנוני מחלות אנושיות הקשורות לשושלת הנוירו-רואלית, והיא מראה פוטנציאל לשיפור הדיוק במידול in vitro ובסריקת תרופות למחלות אלו.

לפני תחילת פרוטוקול זה, ודאו שמושבות תאי הגזע הפלוריפוטנטיים האנושיים גדולות מספיק כדי להיראות בעין ועדיין בעלות קצוות חדים עם מעט תאים מבדלים בגבולותיהן. כאשר תאי ה-H PSCs מוכנים לפיצול, שאבו את המצע, שטפו פעם אחת עם 5 mL של 1XPBS והוסיפו 4 mL של 0.05% trypsin-EDTA לתאים. לאחר מכן, נערו את הצלחת בעוצמה באופן אופקי במשך שתי דקות, עד שניתן לראות תחת המיקרוסקופ את הפיברובלסטים העובריים של העכבר נפרדים מהפלטה כתאים בודדים.

מושבות ה-HPSC יישארו צמודות לצלחת כמושבות, לאחר מכן יש לשאוב מיד וביסודיות את ה-trypsin ולהשאיר את הצלחת בטמפרטורת החדר למשך שתיים עד ארבע דקות. יש להוסיף לצלחת 2 mL של מצע HES ולהשתמש בפיפט P 1000 כדי לנתק את התאים. אם התאים אינם נמסרים בקלות, יש לדגור את הצלחת למשך שתיים עד שלוש דקות נוספות.

בטמפרטורת החדר, העבירו את ת сусפנזיית התאים לפרועת קונוית של 15 מיליליטר המכילה שמונה מיליליטר של מצע HES, בתוספת 10 micromolar Y 2 7 6 3 2 dihydrochloride. לאחר מכן, שאבו את המטריג'ל מתוך צלחת 10 סנטימטר שטופלה מראש, והניחו את התאים על הצלחת שעובדה במטריג'ל ביחס של אחד לאחד או אחד לשניים. דגרו את התאים למשך לילה בטמפרטורה של 37 degrees Celsius באינקובטור עם 5% carbon dioxide.

הזן את התאים מדי יום במצע HES עד שיהיו מוכנים להגבהה. לאחר מכן, התחל את ההגבהה העצבית כאשר התאים מגיעים למצב של 90%to 100%confluent. זהו יום אפס.

הזן את התאים מדי יום מיום אפס עד יום שלושה עם 10 milliliters של מצע דיפרנציאציה KSR המכיל 0.1 micromolar LDN 193189 ו-10 MICROMOLAR SB 431542. לאחר מכן, ביום הרביעי והחמישי, הזן את התאים עם 10 milliliters של מצע המכיל 75% מצע דיפרנציאציה KSR, 25% מצע דיפרנציאציה 2, 0.1 micromolar LDN 193189 ו-10 micromolar SB 431542. ביום השישי והשביעי, הזן את התאים במצע שהותאם להכיל 50% מצע דיפרנציאציה KSR ו-50% מצע דיפרנציאציה 2, בנוסף להעשרה ב-0.1 micromolar LDN 193189 ו-10 micromolar SB 431542.

בימים שמונה עד תשעה, האכילו את התאים במצע דיפרנציאציה המורכב מ-25%KSR ו-75%N2, כאשר שניהם מכילים 0.1 µM LDN 193189 ו-10 µM SB 431542. לאחר מכן, בימים תשעה ועשרה, הכינו כלי תרבית עם poly-L-ornithine, laminin 1 ו-fibronectin כפי שמתואר בפרוטוקול הכתוב, אשר ישמשו לריפרופטינג (replating) של התאים. ביום 11, האכילו את התאים במצע דיפרנציאציה N2, בתוספת 0.1 µM LDN 193189 ו-10 µM SB 431542. ביום 11, שאבו את תמיסת ה-laminin 1 וה-fibronectin מכלי התרבית שהוכשרו קודם לכן והניחו להם להתייבש בטמפרטורת החדר בתוך מCב תרביות רקמות למשך 20 עד 30 דקות.

בשלב הבא, הסירו את המצע מהתאים במצב התמיינות ושטפו את התאים פעם אחת עם XPBS. לאחר מכן, הוסיפו שמונה מיליליטר של acuate לכל צלחת של 10 סנטימטרים והדגירו את הצלחות למשך 20 דקות ב-37 °C. לאחר הדגירה, השתמשו במגבב תאים (cell lifter) כדי לנתק את התאים ולאחר מכן השעיו אותם מחדש בתמיסת ה-Accutane.

באמצעות פיפטה של 5 ml, העבירו את תרחיף התאים למבחנה קונית של 15 ml. לאחר מכן, הוסיפו למבחנה 5 ml של 1X PBS וסובבו את התאים במשך חמש דקות ב-115 Gs. השליכו את הנוזל העליון (supernatant) ותלו את משקע התאים ב-10 ml של 1X PBS. לאחר מכן, סננו את תרחיף התאים דרך מסנן תאים של 40 micron כדי להבטיח תרחיף של תאים בודדים.

ספרו את התאים באמצעות המוציטומטר (hemo cytometer). סובבו את התאים שוב במשך חמש דקות ב-115 Gs והשעיו אותם מחדש לריכוז של 100,000 עד 150,000 תאים ל-10 µL של מצע בידול N2 מועשר. השתמשו בפיפט רפטיטור (repeater pipette) כדי להניח טיפות של 10 µL מתליהיית התאים על צלחות תרבית של 15 ס"מ שטופלו מראש ב-poly L-ornithine.

למינין 1 ופיברונקטין. יש להמתין שהטיפות יעמדו בטמפרטורת החדר למשך 15 עד 20 דקות. לאחר מכן, יש להוסיף בזהירות רבה 30 milliliters של מצע בידול N2 מועשר לצלחת, מבלי להפר את הטיפות.

דגרו את התאים למשך לילה בטמפרטורה של 37 °C באינקובטור עם 5% carbon dioxide. ביום ה-12, האכילו בזהירות את התאים ב-20 milliliters של מצע בידוד N2 הכולל 200 micromolar as soic acid, 20 nanograms per milliliter של brain derived neurotrophic factor, 100 nanograms per milliliter של fiberblast growth factor eight ו-20 nanograms per milliliter של sonic hedgehog לכל צלחת בנ 直径 של 15 centimeter.

לאחר מכן, מהיום ה-14 ועד היום ה-17, יש להאכיל את התאים מדי יומיים עד שלושה בתווך בידול N2 המכיל רק 200 µM חומצה רטינואיקה, 20 ng/mL של גורם נוירוטרופי נגזר מוח (BDNF) ו-100 ng/mL של גורם גדילה של פיברובלסטים 8 (FGF8). ביומיים 16 ו-17, יש להכין פלטות עם poly-L-ornithine, laminin 1 ו-fibronectin לשימוש עבור זריעה מחדש של תאי הרב רב-עצביים (neural crest cells).

לאחר ניתוח FACS ביום ה-18, לאחר מיון התאים בשיטת מיון תאים מופעל פלואורסצנציה (fluorescence activated cell sorting), ספרו את תאי הרב רב-עצביים (neural crest cells) ולאחר מכן סובבו אותם בצנטריפוגה ב-115 Gs למשך חמש דקות. השעיו מחדש את משקע התאים במצע התמיינות N2 המועשר ב-10 nanograms per milliliter.

FGF2 בריכוז 20 ng/mL, EGF ו-10 µM Y 2 7 6 3 2 di hydrochloride בריכוז של 30,000 תאים ל-10 µL. ייבשו היטב את צלחות התרבית שהוכשרו מראש עם poly L-lysine או laminin 1 ו-fibronectin. לאחר מכן, פזרו כ-50 עד 70 טיפות של תרחיף התאים לכל צלחת בקוטר 10 cm.

דגרו את התאים בטמפרטורת החדר למשך 15 עד 20 דקות, תוך הוספת 20 milliliters של מצע דיפרנציאציה N2 המועשר ב-10 nanograms per milliliter FGF2, 20 nanograms per milliliter EGF ו-10 micromolar Y 27632 dihydrochloride לכל צלחת של 10 centimeter, מבלי להפריע לטיפות.

לאחר מכן, דגרו את התאים למשך הלילה בטמפרטורה של 37 °C באינקובטור עם 5% carbon dioxide. לאחר הדגירה, תחזקו ותעבירו את תאי הרב רב-עוצמה של הרבב (neural crest cells), בהתאם לפרוטוקול הטקסט המצורף; תאי ה-neural crest הופקו מתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים בתוך 18 ימים, תוך שימוש בפרוטוקול בידול in vitro חדש זה, שאינו דורש תאי הזנה (feeder free).

ניתוח ה-FACS ביום ה-18 זיהה תאים שהיו חיוביים הן ל-HNK-1 והן ל-p75, דבר שאישר את נוכחותם של תאי רכס עצבי (neural crest cells). הן בפרוטוקול הגזירה ללא תאי מאכיל (feeder-free) והן בפרוטוקול התלוי בתאי מאכיל, תאי הרכס העצבי עברו דרך שלב של ורדצות עצביות (neural rosettes). בנוסף, לתאים שעברו מיון באמצעות FACS יש מורפולוגיה זהה והם ביטאו את סממני הרכס העצבי, HNK-1 ו-p75. השוואה של ביטוי הגנים הגלובלי של תאי רכס עצבי שנגזרו משני פרוטוקולי גזירה אלה מצאה ששתי קבוצות התאים מקבצות (cluster) זו ליד זו.

ניתוח של יכולת הנדידה של תאי הרכס העצבי (neural crest cells) שהופקו באמצעות הפרוטוקול ללא תאי מאכילה (feeder free) הראה כי התאים נדדו בהצלחה אל תוך השריטה לאחר 48 שעות. לתאים אלו יש גם פוטנציאל להבדיל אותם לתאים של מערכת העצבים האוטונומית, כפי שאושש על ידי צביעה חיובית ל-mash one ו-touch one לאחר ארבעה ימי בידול נוספים. לאחר צפייה בסרטון זה, תהיה לכם הבנה טובה לגבי האופן שבו מבצעים נוירליזציה לתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים ומפיקים תאי אב של רכס עצבי in vitro.