הפקה של ארס וארס בלוטת Microdissections מהעכבישים לproteomic וניתוח transcriptomic
3 בנובמבר 2014
מאמר זה מספק פרוטוקול להפקת ארס מעכבישים באמצעות גירוי חשמלי כדי 1) לנהל אפיון proteomic, 2) ביטוי ארס גן הבלוטה לעורר, ו- 3) לבצע מחקרים תפקודיים של ארס. זה ואחריו תיאור של microdissections בלוטת ארס ללימודי ביטוי גנים.
המטרה הכללית של הליך זה היא להפיק ארס ולהוציא ב dissection בלוטות ארס מעכבישים לצורך מחקרים טרנסקריפטומיים ופרוטאומיים; דבר זה מושג תחילה על ידי הכנת הציוד והריאגנטים הדרושים לאיסוף ארס באמצעות גירוי חשמלי. השלב השני הוא קיבוע והרדמה של העכביש באמצעות פינצטה תחת מיקרוסקופ דיסקציה. לאחר מכן, העכביש מקבל פולסי זרם והארס המשוחרר נאסף באמצעות צינור מיקרו-קפילרי.
השלב האחרון הוא נתיחה של בלוטות הארס של העכביש כעבור יומיים עד שלושה ימים. בסופו של דבר, נעזרים בספקטרומטריית מסות או בניתוחים פרוטאומיים אחרים של הארס כדי להציג את הרצפים של חלבוני הארס המרכיבים אותו. הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית, שכן שלבי איסוף הארס קשים ללמידה מכיוון שהם כוללים רצף של פעולות מתואמות שיש לבצע במהירות, אך בזהירות.
כדי להתחיל, חברו את כבל החשמל של מעורר חשמלי לשקע וחברו את דוושת הרגל החיצונית לכניסת אות חיצונית. לאחר מכן, ודאו שמתג הקוטביות נמצא במצב רגיל (normal mode), חברו את האלקטרודה החיובית להדק המוצא האדום במעורר החשמלי וחברו את האלקטרודה השלילית להדק המוצא השחור. לאחר מכן, הגדירו את המעורר לפי הגדרות ההתחלה המומלצות הבאות.
בדקו את פלט האלקטרודה על ידי חיבור תפסים מסוג תנין למוליכי מד המתח החיובי והשלילי. לאחר מכן, הפעילו את מתג הכוח של הגירוי והעבירו זרם באמצעות דוושת הרגל. הכינו את הפינצטה קלת המשקל על ידי ציפוי של שיני אחת בפלסטיק נוזלי והמתינו ארבע שעות לייבוש הציפוי. לאחר שהפלסטיק התייבש, כרכו באופן הדוק 15 millimeters של קצה השיני הנגדי בפינצטה בשכבה אחת של חוט תפירה מכותנה, ואבטחו את החוט על ידי קשירת הקצה בקוץ.
בשלב הבא, בעזרת מספריים חדים, גזרו את קצהו של מחט היפודרמית קהה, באופן שיהיה קטן מספיק כדי לא לפגוע בעכביש, אך גדול מספיק כדי למנוע סתימה. החליקו את הפתח בעזרת נייר זכוכית וחברו את המחט למלכודת פסולת של ואקום. לאחר מכן, מקמו את הפינצטה העדינה באופן אופקי במצב סגור היטב, באמצעות תפס דו-שיני מצופה ויניל המחובר לבסיס מגנטי תחת שדה הראייה של מיקרוסקופ דיסקציה, כאשר השיני המצופה בפלסטיק נמצאת למעלה והשיני המצופה בחוט נמצאת למטה.
בשלב הבא, חברו תלישת תנין של אלקטרודה חיובית לפין התחתון שמעלה החוט, וחברו תלישת תנין שלילית למחט הוואקום המתכתית הקהה. לאחר מכן, הניחו את המוליך החיובי על פין המלקחיים שבין החוט לתלישת התנין ואת המוליך השלילי על מחט הוואקום הקהה. כדי לבדוק את זרם מעגל המד-וולט, לחצו על דוושת הרגל כדי לוודא שזוהה זרם מספיק, והסירו את המוליכים תוך써着用 משקפי מגן.
הכינו מספר צינורות קפילריים מיקרוסקופיים לאיסוף רעל. לאחר מכן, הניחו פס של פלסטלינה למשס (mounting putty) בתוך צלחת פטרי והניחו את הקפילריות המיקרוסקופיות על הפס. בעזרת יד עם כפפה, החזיקו צינור קפילרי מיקרוסקופי אחד מקצה אחד, והחזיקו את הקצה השני באמצעות פינצטה מתכתית סטרילית מעל להבה של מבער בונסן, ומשכו את הקצה הרחק מהלהבה כדי ליצור חוד מוארך בעוד הקצה השני מוחזק במקום קבוע; בחנו את קצוות הקפילריות המיקרוסקופיות תחת מיקרוסקופ דיסקציה וצרו פתח אלכסוני קטן בקצה שנמשך באמצעות פינצטה מתכתית סטרילית.
סגרו את המבחנות והניחו אותן על קרח. כדי להתחיל בהרדמת העכביש, הפעילו את הגז בתא ה-CO2. לאחר מכן, העבירו את העכביש באמצעות פינצטה מתכתית ארוכה מבקבוקון האיסוף מפלסטיק הסגור אל תוך תא ה-CO2.
השאירו את העכביש בתא למשך 5 עד 10 דקות ובדקו שהעכביש כבר אינו זז על ידי דחיפה עדינה בעזרת פינצטה ארוכה. לאחר מכן, השתמשו בפיפטת העברה עם תמיסת סלין כדי להרטיב את קצה הפינצטה.
בשלב הבא, הוציאו את העכביש המורדם מתא ה-CO2 על ידי הרמתו מרגליו הקדמיות. בעזרת פינצטה כהה (blunt) וכפפות, העבירו את העכביש המורדם למכשיר הפינצטה קלת המשקל. לאחר מכן, פתחו את שיני הפינצטה הסגורה והניחו את ה-cephalic thorax של העכביש ביניהן.
אפשרו לשיניים להיסגר כדי להבטיח שהעכביש מוחזק בחוזקה במקומו אך אינו נמעך. ודאו במהירות שהעכביש מונח כאשר צדו הגבי של ה-carapace פונה כלפי מטה, נשען על השן המצופה בחוט, וצדו הבטני פונה לעבר הציפוי הפלסטי, בעוד שהאלקטרודה החיובית נשארת מחוברת לשן התחתונה. לאחר מכן, כוון את הגדלה, הפוקוס ומקור האור של מיקרוסקופ ההבדילה עד שחלק ה-cery והניבים של העכביש גלויים בבירור. כדי להתחיל באיסוף הארס, הפעילו את הוואקום והתיזו מים על ה-colliery של העכביש.
באמצעות מחט זריקה קהה שנייה, שאבו את המים בעזרת מחט ואקום כדי להסיר זיהומים. לאחר מכן, התיקו את מחט הוואקום עם האלקטרודה השלילית למקורו (rostrum) של העכביש והנחילו פולס באמצעות דום הרגל. רגלי העכביש יתכווצו וארס יופיע כטיפות שקופות היוצאות מהניבים.
שאבו בעזרת ואקום שאריות של תוכן שנפלט במידה ובספקו. לאחר מכן, אספו טיפות רעל בעזרת קצה של מיקרו-קפילרית והעבירו את קצה הקפילרית אל מבחנה של 0.5 מיליליטר המכילה מים, אשר יישאבו אל תוך הקפילרית. הימנעו מדקירת העכביש בעזרת הקפילרית ומזיהום הקפילרית במשי ובדבק מהרשת.
בשלב הבא, חברו את מזרק ההעברה עם מתאם הצינור למיקרו-קפילרה בקצה הנגדי לקצה האיסוף, והעבירו את תמיסת הארס בחזרה אל תוך המבחנה. הניחו את המבחנה על קרח ואת המבחנות המכילות ארס אחסנו בטמפרטורה של minus 80 degrees Celsius. עם סיום איסוף הארס, הניחו בקבוק איסוף פלסטי פתוח יחד עם הפקק שלו בקרבת העכביש. להעברה מהירה, אחזו בזהירות ברגלי העכביש בעזרת פינצטה כירוגית קהה המוחזקת ביד אחת, ופתחו בזהירות פינצטה עדינה (featherweight) ביד השנייה.
לאחר מכן, העבירו את העכביש למבחנת האיסוף באמצעות פינצטה קהה. סגרו במהירות את הפקק. יומיים עד שלושה ימים לאחר איסוף הרעל, הרדימו את העכביש בתא CO2, מלאו נשא חנקן נוזלי והניחו אותו לצד מיקרוסקופ דיסקציה. נקו את אזור הדיסקציה ואת הפינצטה באמצעות RNA away.
לאחר מכן, מלאו צלחת פטרי קטנה בתמיסת סודיום ציטראט בריכוז 1x saline, והניחו אותה תחת מיקרוסקופ נתיחה. לאחר מכן, העבירו את העכביש מתא ה-CO2 אל צלחת הפטרי והשתמשו בפינצטה כדי להפריד במהירות את ה-cephalic thax מהבטן. לאחר מכן, החזיקו את ה-cephalic thax תחת מיקרוסקופ הנתיחה באמצעות פינצטה ומקמו את ה-colliery בתוך שדה הראייה.
השתמשו בקצוות החדים של זוג פינצטות שני כדי לחתוך את הקוטיקולה המחברת את ה-carabase להיבטים הלטרליים של ה-colliery באופן לטרלי. אחזו ב-colliery עם זוג הפינצטות השני ומשכו בעדינות קדימה ואחורה עד להוצאת בלוטות הארס. התהליך לא אמור להימשך יותר מ-15 דקות.
הפרידו את הבלוטות מהגופה והעבירו אותן לפחלון קריוגני בנפח 0.5 מיליליטר. הניחו את הפחלון הסגור בחנקן נוזלי. שילוב של טכניקות ספקטרומטריית מסה עם מאגרי נתונים של רצפים שהופקו מספריות cDNA של בלוטות הרעל איפשר את זיהוי חלבוני הרעל. Laro inept peptide היה אחד מ-36 החלבונים שזוהו ברעל של האלמנה השחורה באמצעות ספקטרומטריית מסה.
יש לזכור כי עבודה עם עכבישים כגון אלמנות שחורות עלולה להיות מסוכנת ביותר, ויש לנקוט תמיד באמצעי זהירות, כגון חבישת כפפות מגן, בעת ביצוע הליך זה.
סקירה כללית
מאמר זה מתווה פרוטוקול לחילוץ רעל מעכבישים באמצעות גירוי חשמלי, המקל על אפיון פרוטאומי ומחקרי ביטוי גנים. ההליך כולל מיקרו-דיסקציה של בלומי הרעל לצורך ניתוח מעמיק יותר.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- מדעי המוח
- ביולוגיה
- פרוטאומיקה
רקע
- הבנת ארס העכביש חיונית למחקרים ביולוגיים שונים.
- טכניקות להפקת ארס הן חיוניות לניתוחים פרוטאומיים וטרנסקריפטומיים.
- גירוי חשמלי הוא שיטה חדשנית לאיסוף ארס.
- מיקרו-דיסקציה של בלומי הארס מסייעת במחקר של ביטוי גנים.
מטרת המחקר
- פיתוח פרוטוקול אמין להפקת ארס.
- שיפור ההבנה של הרכב הארס ותפקודיו.
- גירוי ביטוי גנים בבלוטות הארס למחקרים נוספים.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- הכנת הציוד והריאגנטים לאיסוף ארס.
- קיבוע העכבישים באמצעות הרדמת CO2.
- גירוי חשמלי להשראת הפרשת ארס.
- איסוף הארס באמצעות צינורות מיקרו-קפילריים.
תוצאות עיקריות
- מיצוי מוצלח של ארס מעכבישים באמצעות הפרוטוקול המתואר.
- הוכחת יעילותה של גירוי חשמלי לאיסוף ארס.
- מתן בסיס לניתוח פרוטאומי עוקב של הארס.
- ביסוס שיטה לה disecling (הוצאה) של בלוטות הארס לצורך מחקרי ביטוי גנים.
מסקנות
- הפרוטוקול מציע גישה שיטתית להוצאת רעל.
- גירוי חשמלי הוא שיטה יעילה לאיסוף רעל של עכבישים.
- מחקר זה מניח את התשתית למחקרים עתידיים על רעלים של עכבישים.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למסגרת ניהולית
ארסים של עכבישים מהווים מקור עשיר של פפטידים ביו-אקטיביים בעלי פוטנציאל כמובילים לתרופות או כגששים מולקולריים למטרות תאיות. הפרוטוקול מאפשר איסוף מהימן של רכיבי ארס אותנטיים, ובכך מפחית זיהום מחלבונים בלוטתיים ומשפר את רמת הוודאות של תיקוף המטרה. הדבר תומך בשלבי הגילוי המוקדמים על ידי אספקת חומר ברמת טוהר גבוהה לצורך סריקת מנגנונים ומאמצי זיהוי מובילים.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופרמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בדיקה של רכיבי רעל לצורך זיהוי פעילות פונקציונלית נגד רצפטורים עצביים או שריריים.
- ערך תפעולי: מספק דגימות רעל מטוהרות הנקיות מזיהומים תאיים, ובכך משפר את ספציפיות הבדיקה.
- ערך ניבוי: תומך בזיהוי מועמדים (leads) על ידי קישור רצפי פפטידים להשפעות פיזיולוגיות באמצעות ספקטרומטריית מסות.
סריקה ופיתוח בדיקה
- ערך מדעי: מייצר תכשירים סטנדרטיים של ארס המתאימים לסריקה בעתקת שפע גבוהה (high-throughput screening) נגד תעלות יונים או GPCRs.
- ערך תפעולי: מקל על הכנת דגימות הניתנות לשחזור עבור בדיקות תפקודיות ומחקרי קישור.
- ערך הפלטפורמה: מאפשר יצירת ספריות ארס לצורך סריקה השוואתית בין מינים שונים.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- ערך מדעי: מאפשר אפיון של פפטידים המבטאים ארס ברמת הרצף לצורך הפחתת סיכונים במטרות.
- ערך תפעולי: תומך ברציפות משלב הגילוי ועד לתיקוף פרה-קליני באמצעות דיסקציה של בלוטות ואפיון טרנסקריפטומי.
- הפחתת סיכונים: מפחית תוצאות חיוביות שגויות על ידי הבחנה בין רעלני ארס מופרשים לבין חלבונים תוך-תאיים.
שילוב תהליכי עבודה ופייפליין
השיטה נכללת ברצף הגילוי, מהשלב של בדיקת היפותזת המטרה ועד לזיהוי מובילים (leads), ומספקת חומר ארס לסריקה תפקודית ולהמשך בירור מכניסטי.
- ביולוגיה של גילוי: תומכת בבדיקת השערות על ידי אפשור בידוד של רכיבי ארס טבעיים למחקרים של אינטראקציה עם רצפטורים.
- סריקה: מספקת תמריתי ארס סטנדרטיים להכנה למבחנים ולסריקה הדירה של תרכובות או פפטידים.
- אנליטיקה: מאפשרת רצף וכמתית של חלבוני ארס מבוססי ספקטרומטריית מסות לצורך ניתוח השוואתי.
- מחקר תרגומי: מקשרת בין הרכב הארס לפרופילי ביטוי גנים לצורך תיקוף מטרות והתאמת סממנים ביולוגיים.
- שימוש חוזר ארגוני: מבססת פלטפורמה ניתנת לשימוש חוזר להשגת ארס ממיני עכבישים שונים בתוכניות לגילוי רעלנים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון בתיקוף המטרה על ידי אספקת רכיבי ארס אותנטיים הנקיים מזיהומים בלוטתיים.
- ערך תפעולי: סטנדרטיזציה של איסוף ארס ודיסקציה של בלוטות עבור תהליכי עבודה פרוטאומיים וטרנסקריפטומיים ניתנים לשחזור.
- ערך אסטרטגי: משפר החלטות של go/no-go בשלבי גילוי מוקדמים על ידי הפחתת העמימות המכניסטית בנתוני סריקת ארס.
- השפעה על פורטפוליו: מאפשר תעדוף של מועמדים (leads) מופקים מארס, מותאם לסיכון, בהתבסס על פעילות שתוקפה באמצעות רצף.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות באלקטרופיזיולוגיה, מיקרו-דיסקציה וטיפול באורגניזמים ארסיים.
- תלוי בגירויים חשמליים, צינורות קפילריים מיקרוסקופיים, מערכות ואקום ומיקרוסקופיה לניתוח.
- מחייב הכשרה סטנדרטית בין הצוותים כדי להבטיח תנובה עקבית של ארס ושמירה על שלמות בלוטות הארס.
- כולל שיקולי התאמה לגדלי עכבישים שונים ולמורפולוגיה של בלוטות הארס.
- מוגבל בשל תנובת ארס נמוכה מפרטים בודדים, מה שמחייב איסוף משותף של דגימות כדי להשיג חומר אנליטי מספיק.
