הפקה של ארס וארס בלוטת Microdissections מהעכבישים לproteomic וניתוח transcriptomic

המטרה הכוללת של הליך זה היא לחלץ ארס ולנתח בלוטות ארס מעכבישים לצורך מחקרים טרנסקריפטומיים ופרוטאומיים, זה מושג על ידי הכנת הציוד והריאגנטים הדרושים לאיסוף ארס על ידי גירוי חשמלי. השלב השני הוא לשתק עכביש מרדים בעזרת מלקחיים תחת מיקרוסקופ מנתח. לאחר מכן, העכביש פועם בזרם והארס המשוחרר נאסף באמצעות צינור מיקרו נימי.

השלב האחרון הוא לנתח את בלוטות הארס של העכביש יומיים-שלושה לאחר מכן. בסופו של דבר, ספקטרומטריית מסה או ניתוחים פרוטאומיים אחרים של הארס משמשים להצגת הרצפים של חלבוני הארס המרכיבים. הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית מכיוון שקשה ללמוד את שלבי איסוף הארס מכיוון שהם כרוכים ברצף של פעולות מתואמות שיש לבצע במהירות, אך בזהירות.

כדי להתחיל, חבר כבל חשמל אלקטרו סטימולטור לשקע וחבר את דוושת הרגל החיצונית לכניסת אות חיצונית. לאחר מכן, ודא שמתג הקוטביות נמצא במצב רגיל וחבר את האלקטרודה החיובית למסוף הפלט האדום בממריץ האלקטרו וחבר את האלקטרודה השלילית למסוף הפלט השחור. לאחר מכן הגדר את הסטימולטור להגדרות הראשוניות המומלצות הבאות.

בדוק את תפוקת האלקטרודה על ידי הצמדת תפסי תנין למד הוולט החיובי והשלילי מובילי בדיקה. לאחר מכן הפעל את מתג ההפעלה של הממריץ והעביר זרם באמצעות דוושת הרגל. הכן את המלקחיים במשקל נוצה על ידי ציפוי חוד אחד בפלסטיק נוזלי והמתן ארבע שעות לייבוש הציפוי לאחר שהפלסטיק התייבש עטוף היטב 15 מילימטרים מקצה החוד הנגדי AP בשכבה אחת של חוט תפירה כותנה ואבטח את החוט על ידי קשירת הקצה בקשר.

לאחר מכן, בעזרת מספריים חדים, חותכים את קצה המחט ההיפודרמית הבוטה, קטנה מספיק כדי לא לפגוע בעכביש, אך גדולה מספיק כדי למנוע סתימה. החלק את הפתח בנייר זכוכית והצמד את המחט למלכודת פסולת ואקום. לאחר מכן מקם את מלקחיים במשקל נוצה אופקית במצב סגור היטב באמצעות מהדק דו-שיניים מכוסה ויניל המאובטח לבסיס מגנטי מתחת לשדה הראייה של מיקרוסקופ מנתח עם החוד המצופה פלסטיק למעלה והחוד המצופה חוט בתחתית.

לאחר מכן, חבר קליפ תנין אלקטרודה חיובי לחוד התחתון במעלה הזרם של החוט, והצמד קליפ תנין שלילי למחט הוואקום המתכתית הבוטה. לאחר מכן הנח את ההובלה החיובית על חוד המלקחיים בין החוט לתפס התנין ואת העופרת השלילית על מחט הוואקום הבוטה. כדי לבדוק את זרם המעגל של מד הוולט, לחץ על דוושת הרגל כדי להבטיח שמתגלה זרם מספיק, והסר את המוליכים תוך כדי הרכבת משקפי מגן.

הכן מספר צינורות מיקרו נימיים לאיסוף ארס. לאחר מכן, הניחו רצועת מרק הרכבה בצלחת פטרי והניחו את נימי המיקרו על הרצועה. ביד עטויה כפפה החזיקו צינור מיקרו נימי יחיד בקצה אחד והחזיקו את הקצה השני עם מלקחיים מתכתיים סטריליים מעל להבת מבער בונסן ומשכו את הקצה הרחק מהלהבה ליצירת קצה מוארך תוך החזקת הקצה השני במצב נייח, בחנו את קצוות הנימים המיקרו תחת מיקרוסקופ מנתח וצרו פתח משופע קטן בקצה המשוך בעזרת מלקחיים מתכתיים מעוקרים.

סוגרים את הצינורות ומניחים אותם על קרח. כדי להתחיל בקיבוע עכביש, הפעל את גז תא ה-CO2. לאחר מכן העבירו את העכביש עם מלקחיים מתכתיים ארוכים מבקבוקון איסוף הפלסטיק הסגור לתוך תא ה-CO2.

שמור את העכביש בתא למשך חמש עד 10 דקות ובדוק שהעכביש כבר לא זז. דוחף אותו בעדינות עם מלקחיים ארוכים. לאחר מכן השתמש בפיפטה העברה עם תמיסת מלח כדי להרטיב את החוט על המלקחיים.

לאחר מכן, הוציאו את העכביש המורדם מתא ה-CO2 על ידי הרמת העכביש מרגליו הקדמיות. בעזרת מלקחיים מנתחים קהים וידיים עטויות כפפות, העבירו את העכביש המורדם למנגנון המלקחיים במשקל נוצה. לאחר מכן הפרד את השיניים של מלקחיים סגורים במשקל נוצה והנח את העכבישים בין השיניים.

אפשר לשיניים להיסגר כדי להבטיח שהעכביש מוחזק בחוזקה במקומו אך אינו נמעך ודא במהירות שהעכביש ממוקם בצד הגב של הקרפס כלפי מטה, מונח על החוד המצופה בחוט, והצד הגחוני של המכונית פונה לציפוי הפלסטיק בעוד האלקטרודה החיובית נשארת מחוברת לחוד התחתון. לאחר מכן, כוונן את מיקוד ההגדלה של מיקרוסקופ החיתוך ואת מקור האור עד שהעכבישים והניבים נראים בבירור. כדי להתחיל באיסוף הארס, הפעל את הוואקום ורסס את מכרה העכבישים במים.

בעזרת מחט מזרק שנייה עם קצה קהה שאבו את המים בעזרת מחט ואקום כדי להסיר זיהומים. לאחר מכן, גע במחט הוואקום עם האלקטרודה השלילית לדוכן העכביש והעביר דופק עם דוושת הרגל. רגלי העכביש יתכווצו והארס יהיה גלוי כטיפות שקופות היוצאות מהניבים.

שואב אבק רגורגיט במידת הצורך. לאחר מכן אוספים טיפות ארס עם קצה הנימים המיקרו ומעבירים את קצה הנימים לצינור של 0.5 מיליליטר עם מים, שיישאב לנימים. הימנע מניקוב העכביש עם הנימים וזיהום הנימים במשי ודבק מהקוצים.

לאחר מכן, חבר את מזרק ההעברה עם מתאם הצינור לנימים המיקרו בקצה הנגדי לקצה האיסוף והוציא את תמיסת הארס בחזרה לתוך הצינור והנח את הצינור על צינורות המכילים ארס לאחסון קרח במינוס 80 מעלות צלזיוס. בסיום, בסיום איסוף הארס, הניחו בקבוקון איסוף פלסטיק פתוח יחד עם כובעו קרוב לעכביש. להעברה מהירה, אחזו בזהירות ברגלי העכביש בעזרת מלקחיים קהים המוחזקים ביד אחת ופתחו בזהירות מלקחיים במשקל נוצה ביד השנייה.

לאחר מכן החלק את העכביש לתוך בקבוקון האיסוף בעזרת מלקחיים קהים. וסגרו במהירות את המכסה יומיים-שלושה לאחר איסוף הארס, הרדימו את העכביש בתא CO2, ואז מלאו נושא חנקן נוזלי והניחו אותו ליד מיקרוסקופ מנתח. נקה את אזור החיתוך והמלקחיים עם RNA משם.

לאחר מכן מלאו צלחת פטרי קטנה בנתרן ציטראט אחד מלוח, והניחו אותה מתחת למיקרוסקופ הניתוח. לאחר מכן, העבירו את העכביש מתא ה-CO2 לצלחת הפטרי, והשתמשו במלקחיים כדי להפריד במהירות את התאקס הצפאלי מהבטן. לאחר מכן החזק את ה-cephalic thax מתחת למיקרוסקופ הניתוח בעזרת מלקחיים ומקם את המכרה בשדה הראייה.

השתמש בקצוות החדים של זוג מלקחיים שני כדי לחתוך את הציפורן המחברת את הקרבאס להיבטים הצדדיים של המכרה לרוחב. אחזו במכרה עם זוג המלקחיים השני ומשכו בעדינות קדימה ואחורה עד שבלוטות הארס נשלפות החוצה. לוקח לא יותר מ -15 דקות.

הפרד את הבלוטות מהמכרה והעביר אותן לצינור בטוח של 0.5 מיליליטר. הנח את הצינור הסגור בחנקן נוזלי, תוך שילוב טכניקות ספקטרומטריית מסה עם מסדי נתונים של רצפים שנוצרו מבלוטת הארס CD NA. ספריות אפשרו זיהוי של חלבוני ארס. פפטיד לארו היה אחד מ-36 חלבונים שזוהו מארס האלמנה השחורה באמצעות ספקטרומטריית מסה.

אל תשכח שעבודה עם עכבישים כמו אלמנות שחורות עלולה להיות מסוכנת ביותר, ותמיד יש לנקוט באמצעי זהירות כגון לבישת כפפות מגן בעת ביצוע הליך זה.