Name: בידוד של ילודים extrahepatic Cholangiocytes (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-06-05T13:45:00.000+00:00
Duration: 7 min 54 s
Description: למד לבודד ולגדול כולנגיוציטים extrahepatic מעכברים נאונטליים באמצעות ניתוח מדויק וג'ל קולגן עבה. שיטה זו מאפשרת חקר פיתוח צינורות המרה ופתולוגיות קשורות בביולוגיה התפתחותית.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים מודים לCore פתולוגיה המולקולרית וההדמיה של מרכז NIDDK UPenn מולקולרית מחקרים בעיכול ומחלות כבד (DK50306 P30) לקבלת סיוע בהדמיה. עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מהמוסד הלאומי לבריאות (R01 DK-092,111) ומפרד וסוזן Biesecker ילדים מרכז כבד (לRGW) ועל ידי מענק מרשת ילדות מחלת הכבד מחקר והחינוך (לSK).

התהליך כולו מתבצע בטמפרטורת חדר, אלא אם כן צוין אחרת. כל העבודה של בעלי החיים צריכה להתבצע בתנאים אנושיים תחת פרוטוקול שאושר על ידי הוועדה המקומית בבעלי חיים מוסדיים טיפול ושימוש (IACUC). 1. הכנת הציוד ופתרונות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את השולחן כירורגית העכבר בסמיכות למכסת המנוע בתרבית הרקמה והחממה (איור 1 א). הערה: ציוד הנדרש כולל מיקרוסקופ לנתח, מקור אור, איריס מספריים ארוכה וישרה 12.5 סנטימטר, מלקחיים 6 אינץ שאינו משוננים מעוגלים עם טיפים בסדר, ו4 אינץ מלקחיים משוננים, עם קצוות מעוגלים (איור 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקום מכשירים מעוקרים בכוס זכוכית של אלכוהול 70% על שולחן הניתוחים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלא שלוש 60 מ&quot;מ צלחות פטרי סטרילית עם תקשורת בידוד סטרילי (טבלת 1); הנח שתי על שולחן ניתוחים ואחד בשכונה, כולם על קרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח קולגן זנב חולדה,תמיסת מלח סטרילית 10x פוספט (PBS), מים סטריליים, סטרילי N NaOH 1 ותאים אפיתל מרה תקשורת (BEC) (טבלת 1) במכסת המנוע בתרבית הרקמה. הערה: קולגן צריך להיות על קרח. </li></ol> 2. בידוד המרה Duct ותרבות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים עכברים ילודים בין 0-3 ימים של חיים, על ידי חשיפה לפחמן דו חמצני עד אבדן הכרה ואחריו נקע בצוואר הרחם, על פי הנחיות IACUC (תרשים 1C). הערה: ניתן להשתמש בעכברים מבוגרים בהתאם לצרכימים של ניסוי ספציפיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח לבעלי חיים במצב שכיבה ולעשות חתך אופקי קטן שחצה את קו האמצע באזור של האגן. הרחב את החתך הזה רוחבי ואת שני הצדדים של הבטן, ויצר דש בצורת U. הפעל דש כדי לחשוף את איברי הבטן. ברגע שהבטן פתוחה, לנוע בזהירות את המעיים מתוך חלל הבטן לכיוון צד ימין של בעלי החיים להדמיה טובה יותר של צינור הכבד ומרה משותפת. הערה: ייתכן שיהיה צורך להאריך את החתכים הרוחב לתוך בית החזה כדי לקבל זיהוי טוב יותר של הכבד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות מיקרוסקופ לנתח, לזהות את צינור מרה המשותפת, כבד ומעיים. זהה את צינור המרה המשותף ראשון (1D איור), תוך שימוש בזהירות, כמבנים הם מאוד עדינים. עם מלקחיים המשוננים המשוננים ולא, בקפדנות נקייה ולאסוף את רקמות חיבור כולל שומן המקיף את המרה. השתמש באחד מלקחיים להחזיק את הצינור ואחר לניקוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בטכניקה דומה כדי לנקות את כיס המרה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקם את הצינוריות וכיס המרה ניקו לתוך הצלחת הראשונה של מדיה בידוד על קרח. לעסות בעדינות את המבנים עם המלקחיים משוננים שאינו בזמן בתקשורת כדי להסיר עוד יותר רקמות חיבור ולהסיר מרה מן כיס המרה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את הצינורות וכיס מרה למנה השנייה של תקשורת בידוד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הבידוד של צינורות וכיס מרה מ5 בעלי חיים, להעביר אתחתיכות לצלחת פטרי השלישית, במכסת המנוע. הערה: אם תאים הם להיות מבודדים יותר מ 5 בעלי חיים, לעשות בקבוצות, תוך שימוש בפתרונות מפתיעים לכל קבוצה של 5 בעלי חיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן ג&#39;לי קולגן עבה במכסת המנוע בתרבית רקמה: הערה: כל מנה בגודל ניתן להשתמש. צלחת תרבות 60 מ&quot;מ עם נפח סופי של 3 מיליליטר קולגן לכל קבוצה של 5 ילודים עובדת היטב. זה צריך להיות מוכן טרי בעת הטבעת צינורות מבודדים טרי. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח קולגן עכברוש זנב, תמיסת מלח סטרילית 10x פוספט (10x PBS), סטרילי DH 2 O, וסטרילי N NaOH 1 על קרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחשב את הכמויות של DH 2 0, 10x PBS, NaOH, וקולגן הנדרש לג&#39;לי עם ריכוז סופי של 2 קולגן מ&quot;ג / מיליליטר ב 1x PBS, באמצעות נפח של 1 N NaOH שווה 0.023 פעמים הנפח של קולגן, הוסיף. הערה: אם מקור חלופי של קולגן משמש, בצע את הוראות היצרן לנטרול והיווצרות ג&#39;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים יחד DH 2 0, 10x PBS, ו1 N NaOH, ולאחר מכן להוסיף קולגן וגם פיפטה כדי להבטיח גם ערבוב. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברגע שפתרון קולגן התעבה לג&#39;ל כמו עקביות בטמפרטורת חדר, כדי לשבץ באופן מיידי את הצינורות בקולגן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקום בחממה על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 למשך 30 דקות כדי לאפשר קולגן כדי לחזק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברגע ג&#39;ל יש הקרושה (שינויי צבע מברורים ללבן), כיסוי עם 3.5 מיליליטר של תקשורת BEC (טבלת 1) ו לדגור על 37 ° C CO, 2 5%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר תקשורת BEC 3 פעמים בשבוע ולהחליף עם תקשורת טרי 3.5 מיליליטר. </li></ol> 3. בידוד Cholangiocytes הראשי מהעבה קולגן ג&#39;ל הערה: תוך 3 שבועות, גיליונות של cholangiocytes (תאים עם גרעינים גדולים הארכה ישירות מצינורות מוטבעים) יהיו גלויים בקולגן העבה. אם יש מספר גדול של fibroblasts בצלחת, זה צריך להיות מושלך. אם יש כמה אזורים של המנהגידול פיברובלסטים, אלה ניתן לגזור עם אזמל ולהסיר לפני פיצול cholangiocytes. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן ג&#39;לי קולגן דק: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל קולגן לריכוז של 1 מ&quot;ג / מיליליטר עם PBS סטרילית. שים לב: שימוש 1 מיליליטר ל100 צלחת מ&quot;מ; להתאים בהתאם לכלים בגודל אחרים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מורחים את פתרון קולגן באופן שווה עם מפזר תא (מנות גדולות) או קצה פיפטה (מנות קטנות), ולאחר מכן משאיר בטמפרטורת חדר למשך 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כסה צלחת עם DMEM/F12 ולדגור על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 למשך 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את הצלחת מן החממה ולשטוף עם 1x PBS. מייד לשאוב PBS 1X. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעיל עם שכבה שנייה דקה של קולגן, מתפשטת על ידי החלפה של הצלחת או הצבת צלחת על שייקר. לדגור על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 למשך 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר קולגן יש הקרושה, כיסוי צלחת עם DMEM/F12 ולדגור על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 למשך 30 דקות. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיצול תאים מהג&#39;ל קולגן איכס: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עם מרית תרבית תאים או מגרד תא, לגרד ג&#39;ל קולגן בעדינות מהצלחת, כך שהוא צף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרון collagenase על ידי דילול collagenase סוג XI (ראה רשימת חומרים) ל10 מ&quot;ג / מיליליטר עם DMEM/F12. מערבבים היטב וסינון סטרילי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 1 מיליליטר של תמיסת collagenase (לעיל) ל60 מנה מ&quot;מ של תאים בקולגן העבה. אל תסיר את תקשורת BEC (שאמורה להיות 3 מיליליטר). דגירה צלחת ל30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר תמיסה המכילה תאים, ואת המקום ב15 מיליליטר צינור חרוטי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספין למטה ב2,200 XG במשך 5 דקות. בטל supernatant מחדש להשעות גלולה בנפח דומה של DMEM/F12. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספין פתרון שוב ב2,200 XG במשך 5 דקות. הסר supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend גלולה ב 3 מיליליטר של טריפסין 0.5%, ולדגור על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 למשך 5 דקות. לאחר דגירה, פיפטה הפתרון למעלה ולמטה כדי לשבור את הגיליונות של cholangiocytes. הוסף 5 מיליליטר של תקשורת BECפתרון ספין nd ב1,500 XG במשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר supernatant, וגלול resuspend ב DMEM/F12, אז ספין פתרון ב1,500 XG במשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את supernatant מחדש להשעות גלולה בתקשורת BEC (טבלת 1). פלייט תאים על ג&#39;ל קולגן הדק שנעשה בעבר. </li></ol></li></ol> 4. מעבר ואחסון של תאים הערה: תאים על ג&#39;ל קולגן הדק ניתן לפצל לפי צורך. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף צלחות עם PBS סטרילי לפני דוגרים בטריפסין 0.25% ב37 מעלות צלזיוס למשך 10-15 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנטרל עם נפח שווה של מדיה BEC, וגלולה ב1,500 XG במשך 5 דקות. יש לשטוף גלולה עם DMEM/F12, ולאחר מכן גלולה ב1,500 XG במשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאי resuspend בתקשורת BEC לחלוקה לצלחות תרבית תאי קולגן מצופים. הערה: לחלופין, ניתן resuspended תאים באמצעי אחסון ומאוחסנים במקפיא -80 ° C או חנקן נוזלי (טבלה 1). </li></ol>

<ol><li>Paradis, K., Sharp, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+duct-like+structure+formation+after+isolation+of+bile+ductular+cells+from+a+murine+model%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Lab.+Clin.+Med%22%5BJournal%5D)">In vitro duct-like structure formation after isolation of bile ductular cells from a murine model.</a> J. Lab. Clin. Med. 113 (6), 689-694 (1989).</li>
<li>Vroman, B., LaRusso, N. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+characterization+of+polarized+primary+cultures+of+rat+intrahepatic+bile+duct+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Lab.+Invest%22%5BJournal%5D)">Development and characterization of polarized primary cultures of rat intrahepatic bile duct epithelial cells.</a> Lab. Invest. 74 (1), 303-313 (1996).</li>
<li>Kumar, U., Jordan, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+culture+of+biliary+epithelial+cells+from+the+biliary+tract+fraction+of+normal+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Liver%22%5BJournal%5D)">Isolation and culture of biliary epithelial cells from the biliary tract fraction of normal rats.</a> Liver. 6 (6), 369-378 (1986).</li>
<li>Ishii, M., Vromen, B., LaRusso, N. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+morphologic+characterization+of+bile+duct+epithelial+cells+from+normal+rat+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Isolation and morphologic characterization of bile duct epithelial cells from normal rat liver.</a> Gastroenterology. 97 (5), 1236-1247 (1989).</li>
<li>Strazzabosco, M., Fabris, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+the+bile+ducts%3A+Essentials+for+the+clinical+hepatologist%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Hepatol%22%5BJournal%5D)">Development of the bile ducts: Essentials for the clinical hepatologist.</a> J. Hepatol. 56 (5), 1159-1170 (2012).</li>
<li>Carpentier, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+ductal+plate+cells+give+rise+to+cholangiocytes%2C+periportal+hepatocytes%2C+and+adult+liver+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Embryonic ductal plate cells give rise to cholangiocytes, periportal hepatocytes, and adult liver progenitor cells.</a> Gastroenterology. 141 (4), 1432-1438 (2011).</li>
<li>Cho, W. K., Mennon, A., Boyer, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+functional+polarized+bile+duct+units+from+mouse+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Gastrointest.+Liver+Physiol%22%5BJournal%5D)">Isolation of functional polarized bile duct units from mouse liver.</a> Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 280 (2), (2001).</li>
<li>Karjoo, S., Hand, N. J., Loarca, L., Russo, P. A., Friedman, J. R., Wells, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extra-hepatic+cholangiocyte+cilia+are+abnormal+in+biliary+atresia%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pediatr.+Gastroenterol.+Nutr%22%5BJournal%5D)">Extra-hepatic cholangiocyte cilia are abnormal in biliary atresia.</a> J. Pediatr. Gastroenterol. Nutr. 57 (1), 96-101 (2013).</li>
<li>Sutton, M. E., op den Dries, S., Koster, M. H., Lisman, T., Gouw, A. S., Porte, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regeneration+of+human+extrahepatic+biliary+epithelium%3A+the+peribiliary+glands+as+progenitor+cell+compartment%5BTitle%5D)+AND+%22Liver+Int%22%5BJournal%5D)">Regeneration of human extrahepatic biliary epithelium: the peribiliary glands as progenitor cell compartment.</a> Liver Int. 32 (4), 554-559 (2012).</li>
<li>Cardinale, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multipotent+stem%2Fprogenitor+cells+in+human+biliary+tree+give+rise+to+hepatocytes%2C+cholangiocytes%2C+and+pancreatic+islets%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Multipotent stem/progenitor cells in human biliary tree give rise to hepatocytes, cholangiocytes, and pancreatic islets.</a> Hepatology. 54 (6), 2159-2172 (2011).</li>
</ol>

החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים מתחרים.

שתואר כאן הוא טכניקה לבודד cholangiocytes הטהור מדרכי המרה extrahepatic של עכברים של עכברים בכל הגילים, כולל תינוקות. הטכניקה מציעה את היתרון שניתן ללמוד cholangiocytes extrahepatic בנפרד מcholangiocytes intrahepatic, ועשויה להקל על מחקרים כדי לזהות את ההבדלים עיקריים בין האוכלוסיות של תאים אלה. אנו פורסמו לאחרונה מחקר אשר הוכיח ירידת cilia בcholangiocytes extrahepatic מבודדת בשיטה זו ונגועה בrotavirus רזוס 8. חסרונות כוללים שהטכניקה היא עבודה אינטנסיבית, והנתיחה מדוקדק...

המקור וההתפתחות של cholangiocytes הפנים וextrahepatic הם שונים במידה ניכרת. הכבד מתפתח מdiverticulum של האנדודרם המעי הקדמי הגחון 5. אזור הזנב של diverticulum מהווה את עץ המרה extrahepatic, ואילו באזור הגולגולת יוצר עץ המרה intrahepatic 5. cholangiocytes צינור intrahepatic נגזרים מתאים סביב צלחת ductal באזורי פורטל פרי 6. תאים אלה היכולת להתמיין גם hepatocytes או cholangiocytes 6. יש לכך השלכות קליניות משמעותיות בהתחשב בעובדה שcholangiopathies עשוי במיוחד למטרת קטגוריה אחת של cholangiocytes. לדוגמא, atresia מרה בתחילה משפיע על צינוריות extrahepatic של הילוד, בעוד Alagille תסמונת משפיעה על צינוריות intrahepatic. יש תיאורים רבים של הבידוד של cholangiocytes intrahepatic ויחידות צינור מרה מעכברים וחולדות. בתוךvestigators הצליח לבודד תאים בודדים על ידי בידוד צינור ותוצאה שלאחר מכן, או על ידי עיכול כבד ונוגדנים לנתץ של cholangiocytes להביע סמנים פני תא ספציפיים 1-4. יחידות צינור מרה פונקציונליות ומקוטבות היו מבודדות על ידי עיכול כבד וסינון גודל 7. יחידות צינור מרה הן מסוגלים להגיב לגירויי הפרשה ולהפגין הפרשת נוזלי 7, בעוד cholangiocytes המבודד הוכחו לפתח מבני ductular במבחנה 1,2. מגבלות של שיטות אלה כוללים את הצורך במומחיות מיוחדת טכנית וציוד מיוחד לזלוף כבד עם אנזימי עיכול. בנוסף, קיים סיכון של זיהום עם תאי mesenchymal 3. שיטה לבודד cholangiocytes צינור המרה extrahepatic, במיוחד מצינורות מרה extrahepatic בילוד, לא תוארה בעבר. מאמר זה מתאר טכניקה פשוטה לבודד בילודזה גם תאי צינור המרה extrahepatic מבוגרים ברמות גבוהות של טוהר. טכניקה זו תאפשר המחקר של הבדלים בין cholangiocytes ומחקר במנגנונים של מחלות כמו atresia מרה שכוללות צינורות extrahepatic הפנים וextrahepatic.

<table><tbody><tr><td>DMEM/F12 (1:1)</td><td>Gibco/ Life technologies</td><td>11320-033</td><td>500 מ"ל, בשימוש במדיה BEC</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S11150</td><td>25 מ"ל, בשימוש במדיה BEC</td></tr><tr><td>MEM עם חומצות אמינו לא חיוניות</td><td>Gibco/ Life technologies</td><td>11140-019</td><td>5 מ"ל, בשימוש במדיה BEC</td></tr><tr><td>טכנולוגיות אינסולין-טרנספרין-סלניום</td><td>Gibco/ Life</td><td>51300-044</td><td>5 מ"ל, בשימוש במדיה BEC</td></tr><tr><td>Na Pyruvate</td><td>Cellgro</td><td>25-000-CL</td><td>5 מ"ל, משמש במדיה BEC</td></tr><tr><td>תרכיז שומנים מוגדר כימית</td><td>Gibco/ Life technologies</td><td>11905-031</td><td>5 מ"ל, המשמש במדיה BEC</td></tr><tr><td>פניצילין-סטרפטומיצין</td><td>Cellgro</td><td>30-002-CI</td><td>5 מ"ל, משמש במדיה BEC ו-500 &#956; l בבידוד</td></tr><tr><td>Gentamicin</td><td>Gibco / Life technologies</td><td>15750-060</td><td>0.2 מ"ל, בשימוש במדיה BEC ו- 500 & # 956; l בבידוד</td></tr><tr><td>אתנולמין</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>E9508-100 מ"ל</td><td>0.13 מ"ל, משמש בתמיסת ויטמין MEM מדיה</td></tr><tr><td></td><td>BEC Gibco / Life טכנולוגיות</td><td>11120-052</td><td>5 מ"ל, המשמש במדיה BEC</td></tr><tr><td>מעכב טריפסין פולי סויה</td><td>Biowhittaker</td><td>17-605E</td><td>5 מ"ל, המשמש במדיה BEC. הממס הוא PBS, מערבבים לריכוז מלאי של 5 מ"ג/מ"ל</td></tr><tr><td>L-גלוטמין</td><td>Cellgro</td><td>25-005-CL</td><td>5 מ"ל, המשמש במדיה BEC</td></tr><tr><td>תמצית יותרת המוח בקר</td><td>Gemini</td><td>500-102</td><td>1.1 מ"ל, בשימוש במדיה BEC</td></tr><tr><td>Dexamethasone</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D4902</td><td>0.5 מ"ל, בשימוש במדיה BEC, Stock conc 393 & #956; גרם/מ"ל לדלל עם אתנול</td></tr><tr><td>3 3',5-טריודו-L-תירונין</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>T6397</td><td>0.5 מ"ל, בשימוש במדיית BEC, סטוק קונק 3.4 מ"ג/מ"ל לדלל עם אתנול</td></tr><tr><td>גורם גדילה אפידרמיס</td><td>Millipore</td><td>01-101</td><td>0.5 מ"ל, בשימוש במדיה BEC, 25 & #956; גרם/מ"ל לדלל עם DMEM F12+1% BSA</td></tr><tr><td>Forskolin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F6886</td><td>5 מ"ל, בשימוש במדיה BEC, לשימוש בריכוז מלאי של 0.411 מ"ג/מ"ל ולדלל עם DMSO</td></tr><tr><td>Fungizone</td><td>Gibco/ Life technologies</td><td>15290-018</td><td>1 מ"ל, בשימוש במדיה BEC ו-500 &#956; l בבידוד</td></tr><tr><td>קולגן זנב עכברוש</td><td>BD Biosciences</td><td>354236</td><td>משתנה בהתאם לריכוז הקולגן</td></tr><tr><td>PBS 10x</td><td>USB Corporation</td><td>75889</td><td>שימוש ב-10x, סטרילי, המשמש לייצור קולגן, הכמות המשמשת תלויה בריכוז הקולגן</td></tr><tr><td>dH2O</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>סטרילי, המשמש לייצור קולגן, הכמות המשמשת תלויה בריכוז הקולגן</td></tr><tr><td>NaOH 10 N</td><td>Fischer Scientific</td><td>ss255-1</td><td>מדולל ל-1 N, סטרילי, משמש לייצור קולגן, הכמות בשימוש תלויה בריכוז הקולגן</td></tr><tr><td>קולגנאז מסוג XI מ-Clostridium histolyticum</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C7657</td><td>לדלל ב-DMEM ובמסנן סטרילי לפני השימוש</td></tr><tr><td>trypsin-EDTA (1x) 0.25%</td> <td>Gibco/ Life technologies</td><td>25200-056</td><td>3 מ"ל, דגירה מקסימום 10 דקות</td></tr><tr><td>טריפסין-EDTA (10x) 0.5%</td><td>Gibco / Life technologies</td><td>15400-054</td><td>3 מ"ל, דגירה מקסימום 10 דקות</td></tr><tr><td>מיקרוסקופ ניתוח</td><td>ניקון</td><td>SMZ645</td><td>דגמים אחרים מקובלים</td></tr><tr><td>מקור אור (תאורה פיבראופטית)</td> <td>Schott-Fostec</td><td>Ace EKE LR 92240</td><td>דגמים אחרים מקובלים</td></tr><tr><td>12.5 ס"מ מספריים ישרים לקשתית</td><td>Kent Scientific</td><td></td><td>דגמים אחרים מקובלים</td></tr><tr><td>6 אינץ' מלקחיים מעוקלים לא משוננים עם טיפים עדינים</td> מדעי <td></td><td>מיקרוסקופיה אלקטרונית</td><td>דגמים אחרים מקובלים</td></tr><tr><td>מלקחיים אל חלד משוננים בגודל 4 אינץ' עם קצות עדינים</td><td>מדעי</td><td></td> מיקרוסקופיה <td>אלקטרונית דגמים אחרים מקובלים</td></tr></tbody></table>

בידוד של ילודים extrahepatic cholangiocytes

Isolation of Neonatal Extrahepatic Cholangiocytes

דרכי מרת התוך וextrahepatic של הכבד הן התפתחותית מובהקת, ועשויה להיות מושפע באופן דיפרנציאלי על ידי מחלות מסוימות. עם זאת, הבדלים בין cholangiocytes הפנים וextrahepatic, ובין תאי יילודים ומבוגרים, אינם מובנה היטב. שיטות לבידוד של cholangiocytes מצינורות המרה intrahepatic מבוססים היטב 1-4. בידוד של תאי ductal extrahepatic, במיוחד מהילוד, עדיין לא תאר, אם כי זה יהיה יתרון גדול בהבנת ההבדלים בין אוכלוסיות שונות וcholangiocyte בחקר מחלות כמו atresia מרה המופיעות למקד את צינוריות extrahepatic. שתואר כאן הוא טכניקה מותאמת לבודד תאי צינור המרה extrahepatic שני יילודים ועכבר מבוגר. טכניקה זו מניבה אוכלוסיית תא טהורה עם זיהום מינימאלי מתאי mesenchymal כמו fibroblasts. metho זהד מבוסס על הסרת צינוריות extrahepatic וכיס המרה, ואחריו לנתיחה קפדנית וגירוד כדי להסיר שכבות שומן ופיברובלסטים. מבנים מוטבעים בשכבות עבות של קולגן ותרבית למשך כ 3 שבועות כדי לאפשר תולדה של cholangiocytes בmonolayers, אשר לאחר מכן ניתן trypsinized ומחדש מצופים לשימוש ניסיוני.

השימוש בתוצאות פרוטוקול זה בבידודה של אוכלוסייה של cholangiocytes ילוד עכבר extrahepatic עם טוהר מעולה, כפי שהודגם על ידי מכתים immunofluorescence K19 (2A דמויות ו2B); אנו משיגים תוצאות דומות לבודד תאים מעכברים בוגרים. יש לנו ציינו כי זה לוקח 3 שבועות לתאים מצינורות מרה מבודדים טרי כדי ליצור monolayers על ג&#39;לי קולגן עבה. Cholangiocytes לגדול בצורה ליניארית לאורך קולגן העבה, ויוצר יריעות של תאים מהצינורות המבודדים. יש לפצל תאים מחדש מצופים על ג&#39;ל קולגן הדק ...

טכניקה לבודד cholangiocytes מצינורות המרה extrahepatic של עכברים בילוד מתוארת. הצינורות בקפדנות הם גזורים, ולאחר מכן תאים מבודדים על ידי תולדה בג&#39;ל קולגן העבה. שיטה זו מספקת כלים שימושיים ללימוד פיתוח extrahepatic מרה צינור ופתולוגיה.

בידוד של ילודים extrahepatic Cholangiocytes

The intra and extrahepatic bile ducts of the liver are developmentally distinct, and may be differentially affected by certain diseases. However, ...

המטרה הכללית של הליך זה היא לבודד ולתרבל תאי כולנגיוציטים (cholangiocytes) מהכבד של ילודים. הדבר מושג תחילה על ידי חשיפה כירורגית של איברי הבטן כדי לאפשר גישה לכבד ולדרכי המרה. השלב השני של ההליך הוא הסרה קפדנית של רקמת החיבור והשומנים המקיפים את דרכי המרה ואת כיס המרה.את צינורות המרה וכיס המרה המנוקים מניחים לאחר מכן על ג'ל קולגן עבה ומגדלים למשך שלושה שבועות. הקולנגיוציטים ינדדו מהצינורות ויפוצלו לג'לי קולגן דקים להמשך תרבית. לבסוף, התוצאות מראות שכבות חד-שכבתיות (monolayers) של קולנגיוציטים טהורים באמצעות מיקרוסקופיית אימונופלואורסצנציה.בדרך כלל, אנשים שאינם מנוסים בטכניקה זו מתקשים בשל קשיים טכניים בשיטת הדיסקציה, וכן בניקוי של תעלות מרה קטנות. לצורך הליך זה, הגדירו שולחן ניתוח לעכברים בקרבה למכסה של תרביות רקמה ולאינקובטור. הניחו את כל כלי הניתוח הסטריליים בכלי זכוכית המכיל 70% ethanol.הניחו שלושה צלחות בקוטר 60 מילימטר עם מצע על קרח. שתי צלחות דרושות על שולחן הניתוח, אך את שאר החומרים השאירו במנדף. הקולגן צריך להיות על קרח.התחילו במיקום עכבר新生 (neonatal) בן שלושה ימים או פחות, שהורדמה והורגה (euthanized), בתנוחה גבנית (supine) על לוח הניתוח. בצעו חתך אופקי קטן לאורך קו האמצע ליד האגן. הרחיבו את החתך היתר באופן סימטרי משני הצדדים, צרו סרטויה (flap) בצורת U וחשפו את האיברים.כעת הסיטו בזהירות את המעיים לימין הבטן. כדי לראות את הכבד ואת תעלת המרה, הרחיבו את חיתוכי העור כדי להגדיל את הש flap במידת הצורך. תחת מיקרוסקופ הניתוח, זהו ונקה בזהירות את תעלת המרה המשותפת.הסיר רקמה חיבורית ושומן היקפי. לאחר מכן, בצע את הפעולה גם עבור השאר. כדי לנקות את כיס המרה, הסר את תעלת המרה ואת כיס המרה, והנח אותם באחת מהצלחות שהוכשרו.מעכו את המבנים באמצעות פינצטה שאינה מדורגת כדי להסיר רקמת חיבור נוספת ולהוציא מרה. לאחר מכן, העבירו את הרקמות הנקיות לצ그러ת השנייה. חזרו על הליך זה עד לאיסוף רקמה מחמישה רכים מלידה בדיוק.התחילו בהכנת ג'ל קולגן סמיך. תמיד הכינו זאת כשלב ראשון ובצורה טרייה. רכזו את כל התמיסות הסטריליות על קרח.חשבו את הנפחים הדרושים עבור 2 mg של קולגן ל-1 mL של 1X PBS. הוסיפו 0.023 חלקים של נתרן הידרוקסיד לכל חלק של קולגן. ערבבו את המנות יחד בטמפרטורת החדר באמצעות פיפטינג.חיוני לערבב את ה-PBS, הנתרן הידרוקסיד והמים המזוקקים לפני הוספת הקולגן. מלאי הקולגן חייב להיות הרכיב האחרון שממסיפים לג'ל, ויש להעביר את התמיסה הסופית באמצעות פיפט. פעולה זו מונעת התגבבויות של הקולגן.כאשר התמיסה מתחילה לקבל עקביות דמוית ג'ל, הטמיעו מיד את הרקמות המבודדות, ולאחר מכן העבירו את הרקמות המוטמעות לאינקובטור למשך 30 דקות כדי שיתקשחו. לאחר ההתקשחות, כסו את הג'ל ב-3.5 milliliters של מצע BEC והמשיכו באינקובציה לאחר מכן. החליפו את מצע ה-BEC שלוש פעמים בשבוע. בתוך שלשה שבועות, ייווצרו שכבות של תאים עם גרעינים גדולים הנמתחים מהצינורות המוטמעים.אלו הם הכולנגיוציטים (cholangiocytes). אם בצלחת יש אוכלוסייה משמעותית של פיברובלסטים, ואלא אם ניתן להסירם על ידי גזירה, יש להשליך את הצלחת. כעת, הכינו ג'לים דקים של קולגן עם 1 mg של קולגן ל-1 mL של PBS; שפכו 1 mL על צלחת של 100 mm, פזרו את הקולגן באופן אחיד והמתינו 10 דקות.לאחר 10 דקות, כסו את הפלטה ב-7 mL של DM EMF 12 והדגרימו אותה למשך 10 דקות. לאחר הדגירה הקצרה, שטפו במהירות את הקולגן עם XPBS אחד. הסירו את כל ה-PBS באמצעות שאיבה ולאחר מכן הוסיפו שכבת קולגן שנייה, באופן דומה לאופן שבו נבנתה השכבה הראשונה.לאחר ההתגבשות, כסו את הפלטה ב-DMF 12 והדגירו אותה למשך 30 דקות. כעת הפרידו את התאים מהג'לים העבים. ראשית, בעזרת שפכטל או גורר, נתקו בעדינות את הקולגן מהפלטה כך שיהיה צף.בשלב הבא, הכינו תמיסת קולגנאז מסוננת והוסיפו 1 mL לכל צלחת של 60 מילימטר עם קולגן סמיך. לאחר מכן העבירו את הצלחת למקטורן. לאחר דגירה של 30 דקות, הסירו את כל התמיסה המכילה את התאים והעבירו אותה למבחנה של 15 mL.סובבו את המבחנה בצנטריפוגה והסירו את העליון באמצעות שאיבה. השעיקו את המשקע ב-4.5 milliliters של מצע DM F 12 וסובבו אותו שוב בצנטריפוגה. השעיקו את המשקע בשלושה milliliters של 0.5%Trypsin והדגירו את התאים בטמפרטורה של 37 degrees Celsius למשך חמש דקות, במהלכן ישתחררו שכבות התאים.לאחר חמש דקות, העבירו את הגושים דרך פיפט של 5 או 10 מיליליטר עד לפירוקם. לאחר מכן, הוסיפו 5 מיליליטר של מצע BEC וסובבו את התאים למטה (spin down). בצעו השעיה (resuspension) פעם שלישית.השעה את המשקע במצע DMM F 12 כשלב שטיפה והשק את התאים שוב. כעת, השעה מחדש את התאים במצע BEC וזראה אותם על השכבה הדקה שהוכנה. ג'לי קולגן גדלים עם התאים, וניתן לפצל אותם על ג'לי קולגן לפי הצורך.באמצעות הפרוטוקול המתואר, בודד אוכלוסייה של תאי כולנגיוציטים חוץ-כבדיים מעכברים ניונוטליים ברמת טוהר גבוהה, אשר נצבעה באימונופלורסצנציה ל-K 19. לאחר צפייה בסרטון זה, תהיו בעלי הבנה מעמיקה לגבי אופן בידודה של אוכלוסייה טהורה של תאי כולנגיוציטים חוץ-כבדיים מעכברים ניונוטליים, באמצעות שילוב של דיסקציה קפדנית של תעלות וצמיחה על ג'לים עבים של קולגן.

isolation-of-neonatal-extrahepatic-cholangiocytes

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

כאן אנו מתארים את הבידוד של CD133 לבטא בתאי גזע כבד סרטן בתאי גזע מהכבד Murine שלם, תהליך הדורש עיכול רקמות, העשרה התא cytometry בידוד תזרים. אנו כוללים שיטות מתקדמות בידוד תא בודד והרחבת משובט.

בידוד של הכבד CD133 + בתאי גזע משובטים עבור הרחבת

מתוארת טכניקה לבידוד הפטוציטים אנושיים ותאי כבד לא פרנכימליים מאותו תורם. סוגי תאי הכבד השונים בונים את הבסיס למודלים תפקודיים של כבד והנדסת רקמות. שיטה חדשה זו שואפת לבודד תאי כבד בתפוקה גבוהה ובכדאיות.

פרוטוקול הבידוד של hepatocytes האדם הראשי הקביל סרן אוכלוסיות של תאים בכבד ללא parenchymal

אנו מתארים פרוטוקול בזאת לבידוד איים שלמים מעכברים בילוד. Pancreata היו מעוכל חלקית עם collagenase, ואחריו כביסה בחירה ידנית. 20 - 80 אשכולות איון ניתן להשיג לכל לבלב מעכברים שזה עתה נולדו, אשר מתאימים מספר מחקרי איון.

בידוד יעיל של איי פונקציונלית מן היילודים עכבר לבלב

פציעות כבדות מלוות הרחבת תא ובתאים מייצגים אוכלוסייה הטרוגנית תא. סיווג רומן של תא הסלולר זה מאפשר הבחנה של תת מרובים. השיטה המתוארת כאן ממחישה את הזרימה cytometry ניתוח ובידוד טוהר גבוה של תת שונים שיכול לשמש מבחנים נוספים.

בידוד והעשרה של קבוצות משנה כבדים ובתאים המזוהים על ידי שילוב מרקר Surface Novel

פרוטוקול זה מתאר את הייצור של מערכת תלת-ממדי תא צורב של צינור המרה extrahepatic העכבר. אלה organoids בכיס המרה יכול להישמר בתרבות ללמוד ביולוגיה cholangiocyte. Organoids בכיס המרה אקספרס סמנים של קדמון והן תאים בכיס המרה, המורכבת של תאי אפיתל מקוטב.

דור של Organoids של צינורות המרה Extrahepatic העכבר

מוצג כאן הוא פרוטוקול לבידוד של העכבר hepatocytes מתוך כבדי העכבר למבוגרים באמצעות שונה קולגן הטכניקה הפרו הפרזיה. גם תיאר הוא התרבות ארוכת טווח של hepatocytes בקביעת כריך קולגן תלת-ממד, כמו גם immunolabeling של מרכיבים ציטושלד לחקר היווצרות המרה והתגובה שלה לטיפול.

בידוד וכריך קולגן 3D תרבות של העכבר הראשי Hepatocytes כדי ללמוד את התפקיד של שלד ציטוזה היווצרות של המרה בתוך מחוץ לגופית

פרוטוקול זה מפרט את השימוש בצנתר תוך ורידי מיוחד, צינורות חד פעמיים סטריליים סטנדרטיים, בקרת טמפרטורה בתוספת ניטור בזמן אמת, ומערכת אזעקה להליך זלוף קולגןאז דו-שלבי כדי לשפר את העקביות בכדאיות, בתפוקה ובפונקציונליות של הפטוציטים של חולדה ראשונית מבודדת.

בידוד של הפטוציטים ראשוניים של חולדות עם בקרת זלוף רב-פרמטרית

כאן אנו מתארים ומדגימים פרוטוקול לבידוד תאי אנדותל סינוסואידליים ראשוניים בכבד עכבר (LSEC). הפרוטוקול מבוסס על זלוף קולגן בכבד, טיהור תאים לא-פרנצ'ימליים על ידי צנטריפוגה במהירות נמוכה ובחירת חרוזים מגנטיים CD146. אנו גם מנצלים את הפנוטיפ ומאפיינים את ה-LSECs המבודדים הללו באמצעות ציטומטריית זרימה ומיקרוסקופ אלקטרונים סורק.

בידוד ואפיון של תאי אנדותל סינוסואידליים ראשוניים בכבד של עכבר

לתצפית על הפרעות בצינור המרה של מורין, נדרש צינור מרה שלם והכנה יעילה. לכן, גישה חדשה לבידוד כל מערכת צינורות המרה החוץ-כבדיים ביילודים מורין פותחה בהצלחה תוך שמירה על שלמות צינור המרה.

דיסקציה של צינור המרה החוץ-כבדי וכיס המרה בניודים של עכברים בני תשעה ימים

הפטוציטים עמוסי שומנים טבועים בהתחדשות הכבד, אך בדרך כלל הולכים לאיבוד עם צנטריפוגה הדרגתית של צפיפות. כאן, אנו מציגים פרוטוקול בידוד תאים אופטימלי השומר על הפטוציטים סטאטוטיים, ומניב אוכלוסיות מייצגות של הפטוציטים מתחדשים לאחר כריתת כבד חלקית בעכברים.

בידוד של הפטוציטים מתחדשים לאחר כריתת כבד חלקית בעכברים

למד לבודד ולגדול כולנגיוציטים extrahepatic מעכברים נאונטליים באמצעות ניתוח מדויק וג'ל קולגן עבה. שיטה זו מאפשרת חקר פיתוח צינורות המרה ופתולוגיות קשורות בביולוגיה התפתחותית.

בידוד של ילודים extrahepatic Cholangiocytes

גלה סרטונים נוספים