Name: DNA-RNA בשילוב פלורסנט באתרו הכלאה (דגים) לחקר איון כרומוזום X בתאי גזע הבדיל נקבה עכבר עוברי (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-06-14T14:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 54 s
Description: חקור שיטת FISH משולבת לזיהוי DNA ו-RNA במקביל בתאי גזע עובריים של עכברה נקבה. השיטה מאפשרת מחקר של הכבדת כרומוזום X וויסות גנים בפיתוח עוברי.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים מודים לכל חברי המחלקה לשעתוק ופיתוח של ארסמוס MC בעבר ובהווה על דיונים מועילים ומעוררים במהלך השנים האחרונות. אנו רוצים גם להודות לשלושת הסוקרים האנונימיים על מתן משוב מועיל. העבודה במעבדת גריבנאו נתמכת על ידי מימון ממועצת המחקר ההולנדית (NWO-VICI) ומענק התחלתי של ERC.

1. אינדוקציה של התמיינות בתאי גזע עוברי נקבה כדי לגרום איון כרומוזום X הערה: תאי גזע עובריים בעכבר נקבה (על פי בקשה) גדלים בתנאים בתאי גזע עובריים רגילים על תרבות מנות gelatinized המצופה fibroblasts העכבר העוברי (MEFs). אנחנו כאן להניח שהקורא מכיר את טכניקות תרבית תאים סטנדרטיות 39-41. כדי לגרום להתמיינות, תאי גזע עובריים גדלו במנות T25 יופרדו מMEFs, ויהיו מצופים במדיום בידול. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר בינוני ES מתרבית תאי הגזע העובריים, ולשטוף פעמיים עם תרבית תאי PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 1.5 מיליליטר טריפסין-EDTA (לפני לחמם 37 מעלות צלזיוס), ותאי דגירה ב37 מעלות צלזיוס למשך 7 דקות. לאחר 3.5 דקות, לנער את הצלחת בעדינות כדי לשבור את המושבות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשבית טריפסין-EDTA על ידי הוספת 3.5 מיליליטר של מדיום התמיינות לתאים. תאי פיפטה מעלה ומטה כדי להשיג פתרון תא בודד, ולאסוףבצינור 15 מיליליטר. ספין 5 דקות ב200 XG, ולאסוף תאים ב10 מיליליטר של מדיום בידול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף השעיה תא למנת תרבות שאינה gelatinized, ודגירה עבור שעה 1 בחממה תרבות תא. הערה: MEFs יוכל לדבוק בצלחת התרבות שאינה gelatinized, ואילו תאי גזע עובריים יישארו בהשעיה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בינתיים, להוסיף coverslips מעוקר זכוכית (24 x 24 מ&quot;מ) ל6 צלחות היטב, להוסיף ג&#39;לטין 0.2%, ו דגירה במשך 5 דקות מינימליות בטמפרטורת חדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 1 שעות, לאסוף את supernatant של תרבית תאי ES מצופה מראש, אשר כוללת בעיקר תאי גזע עובריים שאינו דבקים. פלייט תאי גזע עובריים ל6 גם צלחות המכילות coverslips. הערה: השתמש ב⅙ ה של צלחת T25 מחוברות ל6 בארות של צלחת 6 באר. זה יאפשר בידול מחוברות גם לאחר 3 ימים של בידול. שנה בינונית על בסיס יומי. לקורסים ארוכים יותר זמן התמיינות, תאי גזע עובריים מראש מצופים צלחת במדיום התמיינות בחיידקי מנות, וincubאכלתי על שייקר סלולרי משולב בחממת תרבות תא. זה יאפשר לתאים ליצירת גופי embryoid, אשר יכול להיות מצופה לcoverslips 1-2 ימים לפני הקיבעון. </li></ol> 2. קיבוע של התאים מובחנים ES לניתוח FISH DNA-RNA לאחר <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר בינוני בידול מתרבויות בידול, ולשטוף פעמיים עם תרבית תאי PBS. הערה: הוסף PBS בזהירות כדי למנוע את התאים שנשטפו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר תרבית תאי PBS ולתקן את התאים על ידי הוספת paraformaldehyde 4% (PFA) / PBS, ודגירה של 10 דקות בטמפרטורת חדר. זהירות: PFA הוא רעיל ויכול לגרום לסיכון בריאותי משמעותי כאשר להיות בשאיפה או בעת מגע על עור או בעיניים. יתר על כן, PFA הוא מסרטנת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר PFA 4% / PBS, ולשטוף coverslips 3x עם 70% אתנול. הערה: השטיפה נכונה היא חשובה, כמו כל זכר של PFA יפריע לצעדי דגים שלאחר מכן. ניתן לאחסן coverslips ב70% אתנול ב -20 מעלות צלזיוס במשך כמה חודשים לפני Fניתוח ISH. </li></ol> 3. תיוג של בדיקות DNA לניסויים בדגים הערה: קבל קטע DNA של הגן של עניין (אורך מינימאלי&gt; 2 KB לRNA FISH, או&gt; 20 kb לדגי DNA), או BAC מכסה את הגן של עניין. לגילוי RNA, חללית קטנה יותר יכולה להיות מספיק בהשוואה לגילוי ה-DNA, שכן סביר להניח שעתוק יגרום תמלילים מרובים, אשר ניתן לאתרם בו זמנית. לאיתות חזקה על גדיל עותק דנ&quot;א היחיד, נדרשת בדיקה ארוכה יותר, כדי להיות מסוגל לזהות מספר מספיק של haptens המשולב. רצוי, אזור גנומי שאינו עיבד נבחר לעיצוב הבדיקה ה-DNA. בנוסף, בעת שימוש בחללית קטנה יותר כדי לזהות RNA, זה יהיה למנוע שהלוקוסים הגנומי שממנו RNA הוא עיבד הוא שיראו בגישת FISH DNA-RNA בשילוב, אם כי לא ניתן לשלול את זה באופן מלא. כדי לזהות עכבר Xist, שימשה בדיקה cDNA 5.5 kb. לDetection של כרומוזום X, ניתן להשתמש במספר בדיקות BAC. תוצאות טובות הושגו בתערובת של BAC RP23-100E1 וBAC CT7-474E4, אשר ממוקמים בסמיכות למוקד Xist. בהתאם לגן או כרומוזום של עניין, כמה בדיקות שונות ייתכן שתידרשנה כדי להשיג תוצאות אופטימליות. בכל פעם שעובד עם חומרים אשר ישמש לRNA-FISH, השתמשו טיפים סטריליים מסנן, H RNase ללא 2 O, ולעבוד בסביבה נקייה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח 1 מיקרוגרם של ה-DNA ולדלל בH 2 O בנפח כולל של 16 μl. הוסף 4 μl של digoxigenin או פתרון תיוג ביוטין (ראה חומרים כימיים), מערבב על ידי vortexing ולדגור על 16 מעלות צלזיוס במשך 90 דקות. הערה: ביוטין או נוקלאוטידים שכותרת digoxigenin עכשיו יהיה משולב על ידי nick-תרגום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בינתיים, להכין את עמודות G50 להסיר נוקלאוטידים שאינם משולבים. קח מזרק 2 מיליליטר, להסיר את סטמפר, ולהוסיף כותנה מעוקרת לתוך המזרק. להוסיף כדורי G50 בt הפתרוןo למלא את המזרק, במקום מזרק בצינור 15 מיליליטר ו צנטריפוגות ב XG 642 דקות 1. הערה: בסביבות 80% מהמזרק צריכים עכשיו להיות מלאים עם G50. חזור כאשר פחות G50 הוא הווה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 90 דקות, להוסיף 40 μl של H 2 O לתערובת תגובת nick-התרגום, ולהוסיף התגובה לטור G50. הוספת צינור ריק תחת העמודה, ו צנטריפוגות ב XG 642 למשך 2 דקות. לאסוף את הזרימה דרך בצינור תגובה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדוד את עוצמת הקול של הזרימה דרך עם טפטפת, ולהוסיף H 2 O להגיע להיקף כולל של 200 μl. לזרז את הזרימה דרך ה-DNA על ידי הוספת 13.3 μl זרע סלמון (10 מ&quot;ג / מיליליטר), 13.3 tRNA שמרי μl (10 מ&quot;ג / מיליליטר), ה-DNA 26.7 עכבר μl Cot-1 (1 מ&quot;ג / מיליליטר) ו28 μl 2 M NaAc, pH 5.6. מערבבים על ידי vortexing, ולהוסיף 533 קרח μl אתנול 100% קרים. לנער את הצינור, ו צנטריפוגות ב XG 16,200 למשך 30 דקות ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את supernatant ולשטוף גלולה פעמיים עם 70% אתנול. צנטריפוגה ב XG 16,200 במשך 5 דקות ב4 ° C, ואוויר יבש גלולה. הוסף 50 μl של פתרון +50 הכלאה, ולדגור על 37 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות כדי להקל על ההמסה. הערה: בדיקה תווית יכולה להיות מאוחסנת במשך מספר שנים ב -20 ° C. זהירות: 50 + פתרון הכלאה מכיל פוראמיד, שהוא רעיל, עלול לגרום לגירוי במערכת הנשימה עור, עיניים ו, ​​והוא גם teratogen. </li></ol> 4. Permeabilization, טרום טיפול וכלאה של תאים קבועים לCombined DNA-RNA FISH <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רעננות תאים קבועים על coverslips, על ידי הסרת 70% אתנול והתוספת של תרבית תאי PBS ל6 גם הצלחות. דגירה במשך 5 דקות. חזור על פעולה שלוש פעמים בסך הכל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר תרבית תאי PBS, ולהוסיף פפסין 0.2% עד 6 הצלחות היטב, לpermeabilize התאים. דגירה 6 צלחות היטב באמבט מים ב 37 מעלות צלזיוס למשך 4 דקות. הסר פפסין, ולהשבית עם H RNase ללא 2 O. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאים שלאחר תיקון על ידי דוגרים עם PFA 4% / PBS במשך 5 דקות בטמפרטורת חדר. לאחר fixatiב, לשטוף פעמיים עם תרבית תאי PBS במשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מייבש את התאים על ידי דוגרים עם אתנול 70% במשך 3 דקות, אתנול 90% במשך 3 דקות ו100% אתנול במשך 3 דקות. העברת coverslips מתוך 6 צלחות היטב, וcoverslips האוויר יבש במשך כמה דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאי גיל על ידי דוגרים coverslips על 65 מעלות צלזיוס במשך שעה 1 על צלחת חום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טרום להכליא בדיקה FISH עם DNA Cot-1 עכבר על ידי הוספה יחד במשך כל coverslip להיות מנותחים, 25 μl של פתרון +50 הכלאה, DNA Cot-1 0.5 עכבר μl, μl 1 של הבדיקה Xist כותרת ביוטין וμl 1 של digoxigenin הבדיקה BAC שכותרתו גילוי כרומוזום X. מערבבים על ידי vortexing, ולפגל על ​​C ° 99 למשך 5 דקות. דגירה באופן מיידי ב-C ° 37 45 דקות, כדי לאפשר DNA Cot-1 כדי להכליא לחזור על רצפים הנמצאים בבדיקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר ההזדקנות, במקום 50 μl של חיץ denaturation (בהיקף של 70% formamide/2x חיץ פוספט SSC/10 מ&quot;מ) בשקופית זכוכית, ולשים את coverslips על גבי עם תאים מול towards חיץ denaturation. לדגור על 65 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת coverslips חזרה ל6 צלחות היטב, ותאים שלאחר תיקון, על ידי דוגרים באתנול 70% קרח קר למשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מייבש את התאים על ידי דגירה לאחר מכן ב70% אתנול במשך 3 דקות, אתנול 90% במשך 3 דקות ו100% אתנול במשך 3 דקות. הסר את coverslips מ6 צלחות היטב, ולתת אוויר יבש במשך כמה דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספוט חללית הכלאה מראש בשקופית זכוכית, ודגירת coverslip על גבי. מגלשות מקום בתא humidified מלא 50 מיליליטר 50% formamide/2x SSC, ודגירת הלילה בשעה 37 ° C. </li></ol> 5. רוחצת פוסט כלאה ונוגדן מתווך איתור של בדיקה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלא 6 צלחות היטב עם 2x SSC, וטרום חם עד 42 ° C. הוספת coverslips לאחר דגירה הלילה, ודגירה על C ° 42 למשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר SSC 2x, ודגירת coverslips עם SSC formamide/2x 50% עבור 10 דקות ב42 ° C. חזור על פעולה 3 פעמים בסך הכל (30 דקות של כביסה בסך הכל). </li&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר 50% formamide/2x SSC, ולשטוף שקופיות עם טריס-מלוחים Tween (TST) עבור 2 x 5 דקות בטמפרטורת חדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספוט 50 μl טריס-מלוח-BSA (TSBSA) לכל coverslip על שקופיות זכוכית חדשות, ודגירת coverslips במהופך לחסימה ב30 דקות בטמפרטורת חדר בחדר חשוך TST-humidified. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת coverslips חזרה ל6 צלחות היטב, ולשטוף 2 x 5 דקות עם TST. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספוט 50 μl של נוגדן כבשים נגד חפירות (1:500 בTSBSA) לכל coverslip על שקופיות זכוכית חדשות, ודגירת coverslips הפוכה לשלב הדגירה הראשון ב30 דקות בטמפרטורת חדר בחדר חשוך TST-humidified. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת coverslips חזרה ל6 צלחות היטב, ולשטוף 2 x 5 דקות עם TST. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספוט 50 μl של נוגדן ארנב נגד כבשים מצומד עם FITC (1:250 בTSBSA) לכל coverslip על שקופיות זכוכית חדשות, ודגירת coverslips במהופך לשלב הדגירה השנייה במהלך 30 דקות בטמפרטורת חדר בחדר חשוך TST-humidified . </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טרנסfer coverslips חזרה ל6 צלחות היטב, ולשטוף 2 x 5 דקות עם TST. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספוט 50 μl של נוגדן העז נגד ארנב מצומד עם FITC (1:250 בTSBSA) לכל coverslip על שקופיות זכוכית חדשות, ודגירת coverslips במהופך לשלב הדגירה השלישית במהלך 30 דקות בטמפרטורת חדר בחדר חשוך TST-humidified . </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת coverslips חזרה ל6 צלחות היטב, ולשטוף 2 x 5 דקות עם TST. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספוט 50 μl של עכבר אנטי ביוטין נוגדנים (1:200 בTSBSA) לכל coverslip על שקופיות זכוכית חדשות, ודגירת coverslips במהופך לשלב הדגירה הרביעית ב30 דקות בטמפרטורת חדר בחדר חשוך TST-humidified. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת coverslips חזרה ל6 צלחות היטב, ולשטוף 2 x 5 דקות עם TST. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספוט 50 μl של נוגדן חמור אנטי עכבר מצומד עם Rhodamine (1:250 בTSBSA) לכל coverslip על שקופיות זכוכית חדשות, ודגירת coverslips במהופך לשלב הדגירה החמישית ב30 דקות בטמפרטורת החדר בchamb כהה humidified-TSTאה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת coverslips חזרה ל6 צלחות היטב, ולשטוף 2 x 5 דקות עם TST. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספוט 50 μl של נוגדן העז נגד סוס מצומד עם Rhodamine (1:250 בTSBSA) לכל coverslip על שקופיות זכוכית חדשות, ודגירת coverslips במהופך לשלב הדגירה השישי ב30 דקות בטמפרטורת חדר בחדר חשוך TST-humidified . הערה: הנוגדן העז נגד הסוס יזהה את הנוגדנים החמורים אנטי עכבר; כאשר עומדים לרשות החוקרת, נוגדן עז נגד חמור יעבוד גם כן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת coverslips חזרה ל6 צלחות היטב, ולשטוף 2 x 5 דקות עם TST. שטוף 5 דקות נוספות עם טריס-מלוח (TS). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מייבש את התאים על ידי דגירה לאחר מכן ב70% אתנול במשך 3 דקות, אתנול 90% במשך 3 דקות ו100% אתנול במשך 3 דקות. הסר את coverslips מ6 צלחות היטב, ולתת אוויר יבש במשך כמה דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לזהות ירידה של הרכבה בינונית עם DAPI (ראה חומרים כימיים) בשקופית זכוכית, ולהוסיף coverslip במהופך על גבי. לאטום שקופיות עם מסמר לכה ולהעריך את תוצאות דגים על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי (איור 1). </li></ol>

<ol><li>Rudkin, G. T., Stollar, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+resolution+detection+of+DNA-RNA+hybrids+in+situ+by+indirect+immunofluorescence%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">High resolution detection of DNA-RNA hybrids in situ by indirect immunofluorescence.</a> Nature. 265, 472-473 (1977).</li>
<li>Imataka, G., Arisaka, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromosome+analysis+using+spectral+karyotyping+%28SKY%29%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Biochem+Biophys%22%5BJournal%5D)">Chromosome analysis using spectral karyotyping (SKY).</a> Cell Biochem Biophys. 62, 13-17 (2012).</li>
<li>Ross, F. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Report+from+the+European+Myeloma+Network+on+interphase+FISH+in+multiple+myeloma+and+related+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Haematologica%22%5BJournal%5D)">Report from the European Myeloma Network on interphase FISH in multiple myeloma and related disorders.</a> Haematologica. 97, 1272-1277 (2012).</li>
<li>Mastenbroek, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preimplantation+genetic+screening%3A+a+systematic+review+and+meta-analysis+of+RCTs%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Reprod+Update%22%5BJournal%5D)">Preimplantation genetic screening: a systematic review and meta-analysis of RCTs.</a> Hum Reprod Update. 17, 454-466 (2011).</li>
<li>Martins-Taylor, K., Xu, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concise+review%3A+Genomic+stability+of+human+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Concise review: Genomic stability of human induced pluripotent stem cells.</a> Stem Cells. 30, 22-27 (2012).</li>
<li>Rens, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resolution+and+evolution+of+the+duck-billed+platypus+karyotype+with+an+X1Y1X2Y2X3Y3X4Y4X5Y5+male+sex+chromosome+constitution%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Resolution and evolution of the duck-billed platypus karyotype with an X1Y1X2Y2X3Y3X4Y4X5Y5 male sex chromosome constitution.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 16257-16261 (2004).</li>
<li>Munsky, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+gene+expression+noise+to+understand+gene+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Using gene expression noise to understand gene regulation.</a> Science. 336, 183-187 (2012).</li>
<li>Miyanari, Y., Torres-Padilla, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+ground-state+pluripotency+by+allelic+regulation+of+Nanog%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Control of ground-state pluripotency by allelic regulation of Nanog.</a> Nature. 483, 470-473 (2012).</li>
<li>Kwon, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+fluorescence+in+situ+hybridization%3A+quantitative+imaging+of+single+RNA+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22BMB+Rep%22%5BJournal%5D)">Single-molecule fluorescence in situ hybridization: quantitative imaging of single RNA molecules.</a> BMB Rep. 46, 65-72 (2013).</li>
<li>Ji, N., van Oudenaarden, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+molecule+fluorescent+in+situ+hybridization+%28smFISH%29+of+C.+elegans+worms+and+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22WormBook%22%5BJournal%5D)">Single molecule fluorescent in situ hybridization (smFISH) of C. elegans worms and embryos.</a> WormBook. , 1-16 (2012).</li>
<li>Femino, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+single+RNA+transcripts+in+situ%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Visualization of single RNA transcripts in situ.</a> Science. 280, 585-590 (1998).</li>
<li>Buongiorno-Nardelli, M., Amaldi, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autoradiographic+detection+of+molecular+hybrids+between+RNA+and+DNA+in+tissue+sections%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Autoradiographic detection of molecular hybrids between RNA and DNA in tissue sections.</a> Nature. 225, 946-948 (1970).</li>
<li>Gall, J. G., Pardue, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+and+detection+of+RNA-DNA+hybrid+molecules+in+cytological+preparations%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Formation and detection of RNA-DNA hybrid molecules in cytological preparations.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 63, 378-383 (1969).</li>
<li>John, H. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-DNA+hybrids+at+the+cytological+level%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">RNA-DNA hybrids at the cytological level.</a> Nature. 223, 582-587 (1969).</li>
<li>Bauman, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+method+for+fluorescence+microscopical+localization+of+specific+DNA+sequences+by+in+situ+hybridization+of+fluorochromelabelled+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">A new method for fluorescence microscopical localization of specific DNA sequences by in situ hybridization of fluorochromelabelled RNA.</a> Exp Cell Res. 128, 485-490 (1980).</li>
<li>Wiegant, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+hybridization+with+fluoresceinated+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">In situ hybridization with fluoresceinated DNA.</a> Nucleic Acids Res. 19, 3237-3241 (1991).</li>
<li>Langer, P. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzymatic+synthesis+of+biotin-labeled+polynucleotides%3A+novel+nucleic+acid+affinity+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Enzymatic synthesis of biotin-labeled polynucleotides: novel nucleic acid affinity probes.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 78, 6633-6637 (1981).</li>
<li>Manuelidis, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+mapping+of+satellite+DNA+using+biotin-labeled+DNA+probes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">High-resolution mapping of satellite DNA using biotin-labeled DNA probes.</a> J Cell Biol. 95, 619-625 (1982).</li>
<li>Kislauskis, E. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isoform-specific+3%27-untranslated+sequences+sort+alpha-cardiac+and+beta-cytoplasmic+actin+messenger+RNAs+to+different+cytoplasmic+compartments%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Isoform-specific 3'-untranslated sequences sort alpha-cardiac and beta-cytoplasmic actin messenger RNAs to different cytoplasmic compartments.</a> J Cell Biol. 123, 165-172 (1993).</li>
<li>Singer, R. H., Ward, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actin+gene+expression+visualized+in+chicken+muscle+tissue+culture+by+using+in+situ+hybridization+with+a+biotinated+nucleotide+analog%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Actin gene expression visualized in chicken muscle tissue culture by using in situ hybridization with a biotinated nucleotide analog.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 79, 7331-7335 (1982).</li>
<li>Corput, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+in+situ+hybridization+using+horseradish+peroxidase-labeled+oligodeoxynucleotides+and+tyramide+signal+amplification+for+sensitive+DNA+and+mRNA+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Histochem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Fluorescence in situ hybridization using horseradish peroxidase-labeled oligodeoxynucleotides and tyramide signal amplification for sensitive DNA and mRNA detection.</a> Histochem Cell Biol. 110, 431-437 (1998).</li>
<li>Jonkers, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNF12+is+an+X-Encoded+dose-dependent+activator+of+X+chromosome+inactivation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">RNF12 is an X-Encoded dose-dependent activator of X chromosome inactivation.</a> Cell. 139, 999-101 (2009).</li>
<li>Barakat, T. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNF12+activates+Xist+and+is+essential+for+X+chromosome+inactivation%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">RNF12 activates Xist and is essential for X chromosome inactivation.</a> PLoS Genet. 7, (2011).</li>
<li>Gontan, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNF12+initiates+X-chromosome+inactivation+by+targeting+REX1+for+degradation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">RNF12 initiates X-chromosome inactivation by targeting REX1 for degradation.</a> Nature. 485, 386-390 (2012).</li>
<li>Lyon, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+action+in+the+X-chromosome+of+the+mouse+%28Mus+musculus+L%29%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Gene action in the X-chromosome of the mouse (Mus musculus L).</a> Nature. 190, 372-373 (1961).</li>
<li>Barakat, T. S., Gribnau, J. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((chromosome+inactivation+in+the+cycle+of+life%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">chromosome inactivation in the cycle of life.</a> Development. 139, 2085-2089 (2012).</li>
<li>Augui, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+X-chromosome+inactivation+by+the+X-inactivation+centre%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Regulation of X-chromosome inactivation by the X-inactivation centre.</a> Nat Rev Genet. 12, 429-442 (2011).</li>
<li>Brown, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+gene+from+the+region+of+the+human+X+inactivation+centre+is+expressed+exclusively+from+the+inactive+X+chromosome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A gene from the region of the human X inactivation centre is expressed exclusively from the inactive X chromosome.</a> Nature. 349, 38-44 (1991).</li>
<li>Brockdorff, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conservation+of+position+and+exclusive+expression+of+mouse+Xist+from+the+inactive+X+chromosome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Conservation of position and exclusive expression of mouse Xist from the inactive X chromosome.</a> Nature. 351, 329-331 (1991).</li>
<li>Borsani, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+a+murine+gene+expressed+from+the+inactive+X+chromosome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Characterization of a murine gene expressed from the inactive X chromosome.</a> Nature. 351, 325-329 (1991).</li>
<li>Barakat, T. S., Gribnau, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((X+chromosome+inactivation+and+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Exp+Med+Biol%22%5BJournal%5D)">X chromosome inactivation and embryonic stem cells.</a> Adv Exp Med Biol. 695, 132-154 (2010).</li>
<li>Chaumeil, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+role+for+Xist+RNA+in+the+formation+of+a+repressive+nuclear+compartment+into+which+genes+are+recruited+when+silenced%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">A novel role for Xist RNA in the formation of a repressive nuclear compartment into which genes are recruited when silenced.</a> Genes Dev. 20, 2223-2237 (2006).</li>
<li>Okamoto, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eutherian+mammals+use+diverse+strategies+to+initiate+X-chromosome+inactivation+during+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Eutherian mammals use diverse strategies to initiate X-chromosome inactivation during development.</a> Nature. 472, 370-374 (2011).</li>
<li>Gribnau, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((X+chromosome+choice+occurs+independently+of+asynchronous+replication+timing%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">X chromosome choice occurs independently of asynchronous replication timing.</a> J Cell Biol. 168, 365-373 (2005).</li>
<li>Namekawa, S. H., Lee, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+nascent+RNA%2C+single-copy+DNA+and+protein+localization+by+immunoFISH+in+mouse+germ+cells+and+preimplantation+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Detection of nascent RNA, single-copy DNA and protein localization by immunoFISH in mouse germ cells and preimplantation embryos.</a> Nat Protoc. 6, 270-284 (2011).</li>
<li>Van Tine, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+in+situ+detection+of+RNA%2C+DNA%2C+and+protein+using+tyramide-coupled+immunofluorescence%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Simultaneous in situ detection of RNA, DNA, and protein using tyramide-coupled immunofluorescence.</a> Methods Mol Biol. 292, 215-230 (2005).</li>
<li>Pollex, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live-Cell+Imaging+Combined+with+Immunofluorescence%2C+RNA%2C+or+DNA+FISH+to+Study+the+Nuclear+Dynamics+and+Expression+of+the+X-Inactivation+Center%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Live-Cell Imaging Combined with Immunofluorescence, RNA, or DNA FISH to Study the Nuclear Dynamics and Expression of the X-Inactivation Center.</a> Methods Mol Biol. 1042, 13-31 (2013).</li>
<li>Chaumeil, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combined+immunofluorescence%2C+RNA+fluorescent+in+situ+hybridization%2C+and+DNA+fluorescent+in+situ+hybridization+to+study+chromatin+changes%2C+transcriptional+activity%2C+nuclear+organization%2C+and+X-chromosome+inactivation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Combined immunofluorescence, RNA fluorescent in situ hybridization, and DNA fluorescent in situ hybridization to study chromatin changes, transcriptional activity, nuclear organization, and X-chromosome inactivation.</a> Methods Mol Biol. 463, 297-308 (2008).</li>
<li>Lin, S., Talbot, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+culturing+mouse+and+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Methods for culturing mouse and human embryonic stem cells.</a> Methods Mol Biol. 690, 31-56 (2011).</li>
<li>Meissner, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivation+and+manipulation+of+murine+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Derivation and manipulation of murine embryonic stem cells.</a> Methods Mol Biol. 482, 3-19 (2009).</li>
<li>Nichols, J., Ying, Q. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivation+and+propagation+of+embryonic+stem+cells+in+serum-+and+feeder-free+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Derivation and propagation of embryonic stem cells in serum- and feeder-free culture.</a> Methods Mol Biol. 329, 91-98 (2006).</li>
</ol>

יש המחברים אין לחשוף.

שילוב ה-DNA-RNA FISH יכול להיות מאתגר מבחינה טכנית, כמו תנאים מתאימים לדנ&quot;א דגים יכולים להיות קשים מדי עבור מולקולות RNA פחות יציבה. כמה גישות יושמו ללמוד שני DNA ו-RNA באותו התא, לעקוף את הצורך בדגירה בו זמנית עם בדיקות לזיהוי שני DNA ו-RNA. לדוגמא, בגישת חפיפה, דגי RNA הראשונים מתבצע, ותאים הם צילמו, וקואורדינטות נלקחות. בהמשך לכך, אותו השקופיות המשמשות לדגי ה-DNA, שבמהלכו האות של RNA FISH הולכת לאיבוד. לאחר FISH-DNA, התאים הם צילמו שוב, והתמונות שהתקבלו משני RNA ודגי DNA ה...

לומדים תאים ורקמות באמצעות ניאון הכלאה באתרו (FISH) יש, מאז השקתו בסוף 1970s 1, אפשר לחוקרים ללמוד הגנים, ארגון הכרומטין וביטוי גנים ברמת subcellular. FISH-DNA משמש לעתים קרובות בציטוגנטיקה, karyotyping 2, אבחון הסרטן 3 וסינון גנטי טרום השרשה 4, ויש לו תפקיד חשוב במחקר מולקולרי 5-6 שכן היא מאפשרת זיהוי של חומצות גרעין בסביבה המקומית שלהם. ניתוח ביטוי תא בודד על ידי RNA FISH יכול לזהות תעתיקים עיקריים יליד וRNAs noncoding להיות עיבד מכרומוזומים, ומציע יתרונות לטכניקות אחרות שלהעריך ביטוי גנים ברמת אוכלוסייה, כולל למשל כמותית RT-PCR, ניתוח הגנום רחב ביטוי או סופג צפון . על ידי הדמיה תעתיקי רנ&quot;א שמקורם ישירות מהאתרים שלהם ממוצא, זה למשל היהשם לב שביטוי גנים הוא סטוכסטיים 7, ולפעמים יכול להיות אלל מסוים 8. שיפורים בטכניקה שאפילו הרשו לאיתור וכימות של מולקולות ה-mRNA יחיד בתוך התאים 9-11. העיקרון הבסיסי של דגים מורכב מהכלאה של חומצות גרעין בתוך התא לבדיקת חומצות גרעין באמצעות בסיס זיווג ווטסון וקריק מאוד ספציפי. הבדיקה יכולה להיות במישרין או בעקיפין מזוהה, וכתוצאה מכך אות שניתן דמיינו מיקרוסקופי. ניסיונות ראשוניים היו מורכבים מבדיקות שכותרתו רדיואקטיבית, שחסרונות המבוססים על נושאי בטיחות, ברזולוציה מרחבית מוגבלת והיכולת לזהות רק אחד יעד בכל פעם 12-14. הפיתוח הבא של תוויות nonradioactive, כוללים fluorochromes, haptens, ואנזימים, אפשר שימוש התפשטות הרחב של דגים כטכניקת ביולוגיה מולקולרית שבשגרה. הבדיקה FISH גם יכולה להיות מתויגת באופן ישיר עם fluorochשל רומא על ידי קישור כימי של מולקולות ניאון לחומצות גרעין רצפי 15 ואינטגרציה של נוקלאוטידים שכותרתו fluorescently 16-19, או הבדיקה ניתן דמיינו בעקיפין לאחר אינטגרציה של haptens (כולל ביוטין וdigoxigenin) וזיהוי חיסוני של haptens ידי נוגדנים ספציפיים hapten מצומדת ל כתב ניאון מולקולות 20-21. הגישה השנייה מאפשרת הגברה אות על ידי שימוש במספר שכבות של נוגדנים שכותרתו fluorescently אשר נמצא בשימוש כדי לשפר את האות המקורי, ומאפשרת זיהוי של מיני RNA אשר באים לידי ביטוי ברמות נמוכות. על ידי שילוב של טכניקות תיוג ישירות ועקיפות וhaptens השונים, כמה מטרות יכולות להיות דמיינו בו זמנית באותו התא. אחד הצעדים החשובים ביותר בפרוטוקולי דגים הוא ההכלאה של החללית ליעד שלו. למרות שבתאוריה, בדיקה תהיה ספציפית להיקשר רק ליעד שלה, הלכה למעשה, הייחוד הזהלא תמיד מושגת, כמו בדיקות עלולות להיקשר לאזורים הומולוגיים, ותנאי הכלאה לא תמיד יהיו אידיאליים למיני אזור DNA או RNA מסוימים. שוטף פוסט הכלאה לכן הם בעלי חשיבות מיוחדת, שכן הם יכולים להגדיל את ההחמרה של הליך הדגים, ויכולים למנוע ספציפי מחייב של בדיקות FISH, אשר יביאו ברמה גבוהה של רעשי רקע. כמולקולות RNA הן חד גדילים הם יכולים בקלות להיות הכלאה לבדיקת FISH. לעומת זאת, מולקולת DNA גדילים הכפולה צריכה ראשונה צעד denaturation, לאחר שבדיקה יכולה להכליא. זו מושגת בדרך כלל על ידי חימום של הדגימה, שתוצאתה denaturation של ה-DNA. עם זאת, בתנאים קשים אלה, מולקולות שבירות, חד גדילי רנ&quot;א עלולות ללכת לאיבוד. לפיכך, ה-DNA-RNA בשילוב הדגים דורש אופטימיזציה משמעותית של התנאים, ויותר מאתגר מבחינה טכנית בהשוואה לזיהוי הנפרד של RNA בלבד או ה-DNA. כאן אנו presenפרוטוקול מפורט של ת&quot;א בשילוב דגי DNA-RNA, בו זמנית אשר אפשרו לנו ללמוד איון כרומוזום X (xci) בתאי גזע עוברי בעכבר נקבת 22-24. Xci הוא מנגנון חיוני להתפתחות עוברית אפיגנטיים נשית 25, ותוצאות בheterochromatinization ומכאן השתקה של אחד משני כרומוזומי X ביחידים נקבת 26-27. חיוני לתהליך זה הוא RNA Xist noncoding 28-30, אשר מוסדר על ידי RNF12 22-23 וREX1 24 החלבונים. ביטוי Xist הופך שהוגברו על כרומוזום העתיד לא פעיל X (Xi) במהלך התפתחות עוברית או על התמיינות תאי גזע עובריים במבחנה , ויכול להתפשט לאורך כרומוזום X ובכך למשוך אנזימי הכרומטין שיפוץ אשר תוצאת כיבוי תעתיק של כרומוזום X ביום 31. זו הפצת Xist RNA ניתן דמיינו ידי RNA FISH כמו ציפוי של כרומו Xמסוים, המכונה גם ענן Xist. מאחר ותאי גזע עובריים נקבה יכולים לאבד את אחד מכרומוזומי X שלהם בשל חוסר יציבות גנומית, אנו ואחרים מועסקים בשילוב ה-DNA-RNA FISH ללמוד xci, כדי לוודא שתאים רק יציבים karyotypically מוערכים בניתוח של תהליך חשוב זה 22,32 -34. כמו עם כל טכניקה מולקולרית ביולוגיה, כמה פרוטוקולים מעולים שונים כבר פורסמו 35-38. כאן אנו מציגים השיטה שלנו, החל מהגיוס של התמיינות בתאי עכבר גזע עובריים, קיבעון של תאים, תיוג של בדיקות FISH על ידי ניק-תרגום, שלפני טיפול בתאים קבועים כדי לאפשר permeabilization וספיגת בדיקה שלאחר מכן, הכלאה של החללית כדי יעד, ולבסוף זיהוי של הבדיקה על ידי נוגדנים שכותרתו fluorescently. הפרוטוקול במסמך שהוצג מאפשר גילוי נאמן של Xist RNA וכרומוזום X בתוך תקופה של יומיים, ואת היסודות של טכניקה זו יכול ככל הנראה להיות מותאם לotמערכותיה ותחומי המחקר.

<table><tbody><tr>תאי <td></td><td></td><td>גזע עובריים של עכברים נקבות</td><td>יהיו זמינים על פי בקשה</td></tr><tr>ניתן להפיק<td>פיברובלסטים</td><td></td><td></td> עובריים של עכברים <td>מעוברי E13.5, או באמצעות מקורות מסחריים למשל </td></tr><tr><td>מדיום</td><td></td><td></td> <td>תרבית תאי ES MilliporeDMEM, 15% סרום עגל עוברי, 100 U/ml פניצילין, 100 מ"ג/מ"ל סטרפטומיצין, חומצות אמינו לא חיוניות, 0.1 מ"מ &#947;-מרקפטואתנול, ו-1,000 U/ml LIF. מסננים, מעקרים ומאחסנים ב-4 & #176; C למשך שבועיים לכל היותר.</td></tr><tr><td>LIF</td><td>Chemicon</td><td>ESG1107</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Invitrogen</td><td>11960085</td><td></td></tr><tr><td>סרום עגל עוברי</td><td>Invitrogen</td><td>10099141</td><td></td></tr><tr><td>פניצילין&ndash; סטרפטומיצין (100x)</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>חומצות אמינו לא חיוניות</td><td>Invitrogen</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>&#947;-mercaptoethanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7522</td><td></td></tr><tr><td>מדיום התמיינות תאי ES</td> IMDM-Glutamax<td></td><td></td><td>, 15% סרום עגל עוברי מומת בחום, 100 U/ml פניצילין, 100 מ"ג/מ"ל סטרפטומיצין, חומצות אמינו לא חיוניות, 37.8 &#956; l/L monothioglycerol ו-50 &#956; גרם/מ"ל חומצה אסקורבית</td></tr><tr><td>IMDM-Glutamax</td><td>Invitrogen</td><td>31980-030</td><td></td></tr><tr><td>חומצה אסקורבית (50 מ"ג/מ"ל)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4403</td><td></td></tr><tr><td>מונותיוגליצרול</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M6145</td><td></td></tr><tr><td>T25 כלי תרבית תאים</td><td>גריינר ביו-וואן</td><td>690160</td><td></td></tr><tr><td>כלי תרבית תאים 6 בארות</td><td>גריינר ביו-וואן</td><td>662160</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA בדרגת תרבית תאים 0.25% (v/v) טריפסין/0.2% (w/v) EDTA ב-PBS</td><td>Gibco</td><td>25200-056</td><td></td></tr><tr><td>צינורות פלקון</td><td>Falcon</td><td>352196</td><td></td></tr><tr><td>24 x 24 מ"מ כיסויים</td><td>Menzle</td><td>780882</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1890-100G</td><td>מכינים תמיסת PBS של 0.2% ג'לטין/תרבית תאים, וחיטוי</td></tr><tr><td>פפסין</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>P7000</td><td>מדולל ל-0.2% ב-0.01 M HCl (pH 2.0)</td></tr> <tr><td>מוחלט 100% אתנול</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>32221-2.5L</td><td>השתמש ב-100% אתנול מוחלט ו-RNAse מים ללא אתנול כדי לייצר 70% ו-90% תמיסות אתנול</td></tr><tr><td></td><td>בקסטר</td><td>TKF7114</td><td></td></tr><tr><td>קצות מסנן סטריליים</td><td>Rainin Bio Clean</td><td>GP-L10F, GP-L200F, RT-1000F</td><td></td></tr><tr><td>ערכת תיוג דיגוקסיגנין (תרגום DIG-Nick)</td><td></td>ערכת תיוג <td>ביוטין</td> 11745816910 <td></td>Roche</tr><tr><td>(תרגום ביוטין ניק)</td><td>Roche</td><td>11745824910</td><td></td></tr><tr><td>Sephadex G50</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5080</td><td></td></tr><tr><td>מזרק 2 מ"ל</td><td>BD Plastipak</td><td>300013</td><td></td></tr><tr><td>כותנה</td><td></td><td></td><td></td>מעוקרת</tr><tr><td>שפופרות אפנדורף</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td>30120086</tr><tr><td>שמרים tRNA 10 מ"ג/מ"ל</td><td>Invitrogen</td><td>15401-029</td><td></td></tr><tr><td>DNA זרע סלמון 10 מ"ג/מ"ל</td><td>Invitrogen</td><td>15632-011</td><td></td></tr><tr><td>מיטת עכבר-1 DNA 1 מ"ג/מ"ל</td><td>Invitrogen</td><td>18440-016</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf ספסל עליון מיקרוצנטריפוגה</td><td>Eppendorf</td><td>דגם 5417R</td><td></td></tr><tr><td>צנטריפוגה מקוררת Eppendorf</td><td>Eppendorf</td><td>דגם 5810R</td><td></td></tr><tr><td>2 M NaAc, pH 5.6</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7670</td><td></td></tr><tr><td>50+ תמיסת</td><td></td><td></td> הכלאה <td>50% פורממיד, 2x SSC, 50 מ"מ מאגר פוספט pH 7, 10% דקסטרן סולפט pH 7</td></tr><tr><td>פורממיד</td><td>אקרוס אורגניים</td><td>3272350000</td><td></td></tr><tr><td>דקסטרן סולפט</td><td>Fluka</td><td>31403</td><td></td></tr><tr><td>10 מ"מ מאגר פוספט, pH 7</td><td></td><td></td><td>הוסף 57.7 מ"ל של 1 M Na2HPO4 ו-42.3 מ"ל 1 M NaH2PO4; השתמש במים מטופלים DEPC</td></tr><tr><td>ובמאגר</td><td></td><td></td> דנטורציה חיטוי <td>70% פורממיד/2x SSC/10 מ"מ מאגר פוספט pH 7</td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2287</td><td></td></tr><tr><td>2 M Tris pH 7.5 תמיסת</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>כביסה Tris-saltine-Tween (TST)</td><td></td><td></td> <td>100 מ"ל 10x מי מלח, 50 מ"ל 2M Tris, 500 & #956; l Tween-20, להוסיף מים ללא RNAse עד 1 ליטר</td></tr><tr><td>תמיסת</td><td></td><td></td> מלח 10x <td>להמיס 85 גרם NaCl ב-1 ליטר H2O ללא RNAse, וחיטוי</td></tr><tr><td>Tris-מלח-BSA (TSBSA)</td><td></td><td></td><td>500 &#956; l 10x מי מלח, 250 & #956; l 2 M Tris, 1 מ"ל 100x BSA, 3.25 מ"ל ללא RNAse H2O</td></tr><tr><td>BSA, מטוהר, 100x</td><td>New England Biolabs</td><td>B9001S</td><td></td></tr><tr><td>נוגדן נגד חפירה כבשים</td><td>אבחון</td><td></td> רוש <td>שימוש 1:500 מדולל</td></tr><tr><td>בנוגדנים נגד כבשים TSBSA מצומד עם FITC</td> מעבדות <td></td><td>ג'קסון</td><td>שימוש 1:250 מדולל בנוגדנים נגד ארנב TSBSA</td></tr><tr><td>מצומד עם FITC</td><td>Jackson </td><td></td><td>מעבדות משתמשות ב-1:250 מדולל</td></tr><tr><td>בנוגדנים נגד ביוטין</td> TSBSA <td>אבחון</td><td></td> רוש <td>משתמש ב-1:200 מדולל</td></tr><tr><td>בנוגדנים נגד עכבר TSBSA מצומד עם רודמין</td><td>ג'קסון מעבדות</td><td></td><td>שימוש ב-1:250 מדולל בנוגדנים נגד סוס עזים TSBSA</td></tr><tr><td>מצומד עם רודמין</td><td>ג'קסון מעבדות</td><td></td><td>משתמשות ב-1:250 מדולל בתמיסת כביסה TSBSA</td></tr><tr><td>Tris-מלח (TS)</td><td></td><td></td><td>10 מ"ל 10x מי מלח, 5 מ"ל 2 M Tris, 85 מ"ל ללא RNAse H2O</td></tr><tr><td>מדיום הרכבה Vectashield עם DAPI</td><td>Vectorlabs</td><td>H-1200</td><td></td></tr><tr><td>לכה</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>לציפורניים מיסקרוסקופ פלואורסצנטי</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

dna-rna בשילוב פלורסנט<em&gt; באתרו</em&gt; הכלאה (דגים) לחקר איון כרומוזום x בתאי גזע הבדיל נקבה עכבר עוברי

Combined DNA-RNA Fluorescent In situ Hybridization (FISH) to Study X Chromosome Inactivation in Differentiated Female Mouse Embryonic Stem Cells

ניאון הכלאה באתרו (FISH) הוא טכניקה מולקולרית המאפשרת זיהוי של חומצות גרעין בתאים. FISH-DNA משמש לעתים קרובות בציטוגנטיקה ואבחון הסרטן, ויכול לזהות סטיות של הגנום, שלעתים קרובות יש השלכות קליניות חשובות. RNA FISH ניתן להשתמש בם כדי לזהות מולקולות RNA בתאים וספק תובנות חשובות בויסות של ביטוי גנים. שילוב של ה-DNA ודגי RNA בתוך אותו התא הוא מאתגר מבחינה טכנית, כמו תנאים מתאימים לDNA FISH עלולים להיות קשים מדי עבור מולקולות שבירות, חד גדילי רנ&quot;א. אנחנו כאן להציג את הפרוטוקול ישים בקלות המאפשר זיהוי המשולב, בו זמני של Xist RNA ו-DNA מקודד על ידי כרומוזומי ה-X. פרוטוקול FISH זה בשילוב ה-DNA-RNA סביר יכול להיות מיושם על מערכות אחרות שבו שניהם RNA ו-DNA צריכים להיות מזוהים.

באמצעות הפרוטוקול הנ&quot;ל לשילוב דגי DNA-RNA, היינו מסוגל לדמיין איון כרומוזום X בתאי גזע עובריים ממין נקבה. איור 1 מציג דוגמא מייצגת של ניסוי FISH DNA-RNA, שבו זיהינו את שני Xist (שהוא גלוי כXist RNA ענן שנקרא על כרומוזום X פעיל ולהצביע שעתוק בסיסי על כרומוזום X הפעיל), ואזור של כרומוזום X, המופיע כאות ממוקדת. שים לב שאחד מהאותות להצביע ממוקם בתוך ענן Xist, ובכך מראה כי ענן Xist אכן לוקליזציה לאורך, וציפוי כרומוזום X. בלמעלה ...

ניאון הכלאה באתרו (FISH) מאפשר זיהוי של חומצות גרעין בסביבה הטבעית שלהם בתוך תאים. אנחנו כאן מתארים פרוטוקול לזיהוי המשולב, בו זמני של RNA ו-DNA בדרך של דגים, אשר יכול לשמש כדי לחקור איון כרומוזום X בתאי גזע עובריים בעכבר.

DNA-RNA בשילוב פלורסנט<em&gt; באתרו</em&gt; הכלאה (דגים) לחקר איון כרומוזום X בתאי גזע הבדיל נקבה עכבר עוברי

Fluorescent in situ hybridization (FISH) is a molecular technique which enables the detection of nucleic acids in cells. DNA FISH is often used in ...

המטרה הכוללת של פרוצדורה זו היא לחקור את השבתת כרומוזום X בתאי גזע עובריים של עכבר נקבה שעברו דיפרנציאציה, באמצעות שילוב סימולטני של היברידיזציה פלואורסצנטית של DNA ו-RNA ב-situ, או DNA-RNA FISH. דבר זה מושג תחילה על ידי השראת דיפרנציאציה בתאי גזע עובריים של עכבר נקבה. במהלך תהליך זה, המדמה התפתחות עוברית תקינה לאחר השתחלה, מתחילה השבתת כרומוזום X, מה שמוביל להגברת התעתוק ולהצטברות של RNA של Xist, המקודד את כרומוזום ה-X שיהיה אינאקטיבי בעתיד.השלב השני הוא קיבוע של תאי הגזע העובריים המובחנים באמצעות פאראלדהיד. לאחר מכן, הכינו את הגששים לזיהוי DNA מכרומוזום X ושל RNA של ציסטות על ידי סימון מקטעי DNA בביוטין או בדיגוקסינין, באמצעות טרנסלציית חריצים (Nick translation).השלב הסופי הוא ביצוע פרוצדורת D-N-A-R-N-A FISH. תאי הגזע העובריים המובחנים עוברים פרמיאביליזציה, דנטורציה והיברידיזציה עם גששי FISH מסומנים, אשר מזוהים לאחר מכן באמצעות נוגדנים מצומדים פלואורסצנטית המזהים את הביוטין או את ה-diggen haps. לבסוף, נעשה שימוש במיקרוסקופיה אימונופלואורסצנטית כדי להראות את מיקום שני הכרומוזומים בתאים נקביים ולדמיין את הביטוי של RNA של cyst מכרומוזום X שעבר אינאקטיבציה.היתרון המרכזי של טכניקה זו בהשוואה לשיטות אחרות, כגון שיטות FISH שבהן RNA ו-DNA מזוהים באופן עקבי, הוא שבשימוש בפרוטוקול שלנו, אנו מסוגלים לזהות את שני סוגי חומצות הגרעין בו-זמנית באותה דגימה בתוך פחות משני ימים. למרות שביצוע FISH משולב של DNA ו-RNA יכול להיות מאתגר, שכן התנאים האופטימליים לזיהוי DNA או RNA שונים משמעותית. באמצעות הפרוטוקול המוצג כאן, אנו מסוגלים לזהות RNA ו-DNA קיימים המופקים משני כרומוזומיי X כמעט בכל התאים שנותחו.דבר זה אפשר לנו לחקור את השבת הפעילות של כרומוזום X בעודו קורה במהלך התמיינות של תאי גזע עובריים של עכברים נקבות או במהלך התפתחות לא תקינה של עכברים נקבות. למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנות לגבי תהליך השבת הפעילות של כרומוזום X, שהוא תהליך חשוב ומרתק המתרחש במהלך התפתחות עוברית מוקדמת של עכברים, סביר להניח שניתן יהיה להחיל אותה גם על מערכות ביולוגיות אחרות שבהן חשוב לזהות תמלילי RNA הנגזרים מהכרומטין הטבעי, שכן חשיבותם של RNA לא מקודדים במערכות ביולוגיות הולכת ומוערכת יותר, ולעתים קרובות גישות של תא בודד מועדפות על פני גישות חלופיות שבהן מוערכות אוכלוסיות תאים שלמות. אנו צופים שפרוטוקול זה יהיה מועיל עבור קהילה מדעית רחבה.תאי גזע עובריים של עכבר נקבי, או E ESL, גודלים תחת תנאי ESL סטנדרטיים בצלחות תרבית ג'לטיניזציה מצופות בפיברובלסטים עובריים של עכבר ORMs כדי להתחיל את הליך השראתה של הדיפרנציאציה. יש להסיר את מצע ה-ES מתרבית ה-ESL ולשטוף פעמיים עם PBS לתרבית תאים. הוסף 1.5 milliliters של TRIPSIN EDTA שחומם מראש ל-37 degrees Celsius והדגר את התאים ב-37 degrees Celsius למשך שבע דקות. לאחר 3.5 דקות, נער את הצלחת בעדינות כדי לפרק את המושבות.בטלו את פעולת ה-trypsin EDTA על ידי הוספת 3.5 milliliters של מצע דיפרנציאציה לתאים, פתחו את התאים בעזרת פיפטה (pipette up and down) כדי לקבל תמיסה של תאים בודדים ואספו אותם לשפופרת של 15 milliliter. סבבו במ centriuge למשך חמש דקות ב-200 Gs. לאחר איסוף התאים ב-10 milliliters של מצע דיפרנציאציה, העבירו את תרחיף התאים לצלחית תרבית של 10 centimeter שאינה ג'לטיניזית והדגירו למשך שעה אחת. באינקובטור לתרביות תאים, תאי MES יוכלו להיצמד לצלחית התרבית שאינה ג'לטיניזית, בעוד שתאי ES יישארו בתרחיף.בינתיים, הניחו לוחות כיסוי מזכוכית סטרילית בתוך פלטות שש-בארות, הוסיפו 0.2% gelatin והדגירו למשך חמש דקות לפחות. לאחר שעה בטמפרטורה של החדר, אספו את המשקע של תרבית ה-prepl ESL, אשר יורכב בעיקר מ-e ESLs שאינם נצמדים. לאחר דילול ה-E ESLs, פזרו אותם לתוך פלטות שש-בארות המכילות לוחות כיסוי.התחילו את הפרוצדורה על ידי הסרת מצע ההבחנה מתרביות ההבחנה ושטיפה כפולה עם PBS לתרבית תאים. הקפידו להוסיף את ה-PBS בזהירות כדי למנוע שטיפה של התאים. קבעו את התאים על ידי הוספת 4% para formaldehyde PBS ודגירה למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.לאחר 10 דקות, הסר את ה-para formaldehyde ושטוף את לבישי הזכוכית של המכסה שלוש פעמים ב-70% ethanol. כדי להכין את גששי ה-DNA לסימון, דלל תחילה מיקרוגרם אחד מכל DNA רלוונטי במים לנפח כולל של 16 µl. לאחר מכן, הוסף ארבעה µl של תמיסת סימון ox genin או biotin לאחר ערבוב ב-vortex, ודגור בטמפרטורה של 16 °C למשך 90 דקות.שלב זה ישלב את הנוקלאוטידים המסומנים בביוטין או ב-dig oxygen באמצעות תרגום NIC. בינתיים, הכינו עמודי G 50. כדי להסיר נוקלאוטידים שלא השתלבו, קחו מזרק של שני מיליליטר, הסירו את הבוכנה והוסיפו צמר סטרילי לתוך המזרק.הוסיפו כדוריות G 50 ותמיסה כדי למלא את המזרק. לאחר מכן, הניחו מזרק בתוך מבחנה לצנטריפוגה בנפח 15 מיליליטר וסובבו ב-642 GS למשך דקה אחת. לאחר הצנטריפוגציה, כ-80% מהמזרק אמור להיות מלא ב-G 50. לאחר 90 דקות, הוסיפו 40 microliters של מים לכל תערובת תגובה של NIC translation והעבירו את התגובה לעמודת ה-G 50.הניחו מבחנה ריקה מתחת לעמודה וסובבו בצנטריפוגה ב-642 Gs למשך שתי דקות. אספו את התסנן (flow through) למבחנת תגובה. מדדו את נפח התסנן באמצעות פיפט ולאחר מכן הוסיפו מים עד להגעה לנפח כולל של 200 microliters.כדי להשקיע את תסמיך הזרימה, הוסיפו DNA מזרה של סלמון, tRNA משמר, DNA מעכבר, 1D NA ונאצטט נתרן בריכוז 2 M תוך כדי ערבוב ב-vortex. הוסיפו 533 µL של 100% ethanol קר במיוחד, נערו את המבחנה וסובבו בצנטריפוגה ב-16,200 Gs למשך 30 דקות בטמפרטורה של 4 °C. עם סיום הסבוב, הסירו את העל-נוזל (supernatant) ושטפו את המשקע פעמיים עם 70% ethanol; סובבו בצנטריפוגה ב-16,200 Gs למשך חמש דקות בטמפרטורה של 4 °C וייבשו את המשקע באוויר.כאשר המשקע יבש, הוסף 50 µL של תמיסת היברידיזציה 50 Plus והדגר בטמפרטורה של 37 °C למשך 30 דקות. כדי להקל על ההמסה לפני החדירה, השקה מחדש תאים מקובעים: חשוף את הלמינציית הזכוכית על ידי הסרת ה-70% ethanol והוספת PBS לתרבית תאים אל התאים.דגרו למשך חמש דקות, וחזרו על הפעולה שלוש פעמים בסך הכל כדי להנייד את התאים. הסירו את ה-PBS מתרבית התאים והוסיפו 0.2% pepsin ללוחיות בעלות שש בארות. דגרו את הלוחיות במקלחית במעלה של 37 °C למשך ארבע דקות.לאחר מכן, הסר את הפפסין ובטל את פעילותו באמצעות מים נקיים מ-RNA. בצע קיבוע משלים לתאים על ידי דגירה עם 4% paraformaldehyde ב-PBS למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר; לאחר הקיבוע, שטוף פעמיים עם תרבית תאים או PBS למשך חמש דקות. בצע דהידרטציה לתאים על ידי דגירה עם 70% ethanol למשך שלוש דקות, 90% ethanol למשך שלוש דקות ומאה אחוז ethanol למשך שלוש דקות.לאחר מכן, העבירו את לבישתי הזכוכית (cover slips) מלוחיות שש-הבארות והניחו להן להתייבש למשך מספר דקות. בצעו יישון (Aging) לתאים על ידי דגירה של לבישתי הזכוכית בטמפרטורה של 65 °C למשך שעה אחת על פלטה חימום. בינתיים, בצעו היברידיזציה מוקדמת של גששים (probes) לדגים עם mouse coat 1D NA על ידי הוספתם יחד עבור כל לבישתי זכוכית המיועדת לניתוח.25 µL של תמיססת היברידיזציה 50 plus. מיקרוליטר אחד של גשושית cyst המסומנת בביוטין, מיקרוליטר אחד של גשושית BAC המסומנת ב-digoxygen המזהה את כרומוזום X, ו-0.5 µL של mouse cot-1 DNA ערבבו באמצעות וורטקס ודנטורו בטמפרטורה של 99 °C למשך חמש דקות. דגרו מיד בטמפרטורה של 37 °C למשך 45 דקות כדי לאפשר ל-cot-1 DNA להתרחב (להיברידיזציה) לרצפים החוזרים הנמצאים בגשושית.לאחר שהתאים על לבישי הכיסוי התבגרו, טפטפו 50 µL של תמיסת ד-מטורציה (de maturation buffer) על תבנית זכוכית והניחו את לבישי הכיסוי כך שהתאים פונים כלפי תמיסת הד-מטורציה. דגרו בטמפרטורה של 65 °C למשך שתי דקות. קבעו את התאים באופן סופי על ידי העברת לבישי הכיסוי בחזרה לפלטות בעלות 6 בארות המלאות מראש באתנול 70% קר מאוד, ודגרו למשך חמש דקות.בצעו דהידרציה לתאים באמצעות דגירה עוקבת ב-70% ethanol למשך שלוש דקות, 90% ethanol למשך שלוש דקות ו-100% ethanol למשך שלוש דקות. הסירו את לוחות הכיסוי מפלטות שש הבארות והניחו להם להתייבש באוויר במשך מספר דקות. טפטפו Probe שעבר היברידיזציה מוקדמת על עלית זכוכית והניחו לוח כיסוי מעליה לדגירה.הניחו את השקופיות בתא לחות מלא ב-50 milliliters של 50%IDE שני XSSC והדגירו למשך לילה ב-37 degrees Celsius. לאחר הדגירה למשך לילה, העבירו את לביבות הכיסוי מהשקופיות לשישה לוחות דפנות (wall plates) שמולאו בשני XSSC שחומם מראש ל-42 degrees Celsius. הדגירו ב-42 degrees Celsius למשך חמש דקות.הסר שני XSSC והוסף 50%form MI שני XSSC. דגירה למשך 10 דקות ב-42 degrees Celsius. שטוף עם 50%form IDE שני X-S-S-C-A סך הכל שלוש פעמים למשך 10 דקות ב-42 degrees Celsius לכל שטיפה.לאחר השטיפה השלישית, הסירו את ה-50% מתוך ה-two XSSC ושטפו את השקופיות פעמיים עם tris saline tween או TST למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. לחסימה, טפטפו 50 µL של tris saline BSA או T-S-P-S-A. הניחו את כיסית הכיסוי על שקופיות זכוכית חדשות והניחו את כיסויות הכיסוי הפוך על השקופית; הדגירו למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר בתא לח וחושך המכיל TST. לאחר 30 דקות, העבירו את כיסויות הכיסוי חזרה לפלטות בעלות שישה בארות ושטפו פעמיים למשך חמש דקות עם TST. לדגירה של הנוגדן הראשוני, טפטפו 50 µL של sheep antigen and antibody לכל כיסית כיסוי על שקופיות זכוכית חדשות והניחו את כיסויות הכיסוי הפוך על השקופית; הדגירו למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר בתא לח וחושך המכיל TST.בשלב הבא, מדפיכי הזכוכית (cover slips) מדגריים עם סדרה של נוגדנים מסומנים פלואורסצנטית כדי להגביר את האות המקורי, כפי שפירוט זה מופיע בכתב היד המצורף. לאחר הדגירה עם סדרת הנוגדנים המסומנים פלואורסצנטית, יש לבצע דהידרטציה לתאים על ידי דגירה של שלוש דקות בכל אחת מהתמיסות הבאות: 70%ethanol, 90%ethanol ו-100%ethanol. הוצא את מדפיכי הזכוכית מלוחיות שש-הבארות והשאר אותם להתייבש באוויר למשך מספר דקות.לבסוף, טפטפו טיפה של מדיום קיבוע (mounting medium) בעזרת דאפי (dappy) על כל שקופית זכוכית. הניחו מכסה זכוכית (cover slip) הפוך מעל וסגרו את השקופיות בעזרת לק לציפורניים. שימוש בפרוטוקול זה ל-D-N-A-R-N-A FISH משולב מאפשר ויזואליזציה של אינאקטיבציית כרומוזום X בתאי ES נקביים בשלבי התמיינות.איור זה מציג דוגמה מייצגת של ניסוי A-D-N-A-R-N-A בדגים שבו מזוהים בו-זמנית הן RNA של cyst והן אזור בכרומוזום X. Cyst RNA הוא RNA לא מקודד החיוני לתהליך השבתת כרומוזום X. בתאי ESL נקביים המבדילים את עצמם, מזוהה כאן cyst RNA באמצעות גשושית CD NA המסומנת בביוטין, אשר ויזואליזציה שלה מתבצעת באמצעות נוגדנים המצומדים לרומין והיא מסומנת בצבע אדום.כרומוזום X מזוהה באמצעות גש BAC מסומן המכיל xigen, המדגים ויזואלית באמצעות נוגדנים המשורטטים ל-FITC המופיעים בירוק; הגרעינים נצבעים בשיטת נגד-צביעה באמצעות DPI המופיע בכחול. כמעט בכל תא מזוהים שני כרומוזומי X. מזוהים הן הצטברויות גדולות של סיסטים על כרומוזומי X הלא-פעילים (ענני סיסטים) והן ביטוי סיסטים בסיסי מהכרומוזום X הפעיל (נקודות סיסטים).נקודות ה-cyst אינן מזוהות בכל גרעין, מכיוון שבעקבות הגבייה, ביטוי ה-cyst הבזאלי פסק על כרומוזום X העתידי הפעיל. שימו לב שחלק מאותות ה-pinpoint המגיעים מכרומוזום X ממוקמים בתוך ענני cyst, ובכך מוכח שענן ה-cyst אכן ממוקם לאורך כרומוזום X ומקודד אותו לאחר שהתהליך הושלם. ניתן לבצע טכניקה זו בפחות מיומיים עם תוצאה אמינה, במידה והיא מבוצעת כראוי.לאחר צפייה בסרטון זה, תגיעו להבנה טובה של אופן השראת דיפרנציאציה של תאי גזע עובריים של עכבר נקבה, כיצד לקבע תאים אלו, וכיצד להכינם כדי לאפשר ביצוע combined D-N-A-R-N-A fish. זכרו כי להצלחת הניסויים שלכם חשוב לשמור על טמפרטורות וזמני דגירה קבועים כפי שצוין בפרוטוקול זה. כמו כן, חשוב לעבוד בסביבה נקייה.אם אתם משתמשים בסוג תא אחר או חוקרים מערכת ביולוגית אחרת, ייתכן שיידרש תהליך אופטימיזציה כדי להשיג תוצאה מיטבית. בהצלחה בניסוייכם.

combined-dna-rna-fluorescent-situ-hybridization-fish-to-study-x

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

הר שלמים הכלאה באתרו היא אחת הטכניקות הנפוצה ביותר בביולוגיה התפתחותית. כאן, אנו מציגים ברזולוציה גבוהה פלורסנט כפול פרוטוקול הכלאה באתרו לניתוח דפוס הביטוי המדויק של גן יחיד לקביעת חפיפה של תחומים הביטוי של שני גנים. אנו כוללים propidium גרעיני יודיד נגד כתם להדגיש ארגון רקמות.

דג הזברה שלמים הר ברזולוציה גבוהה פעמיים פלורסנט באתרו הכלאה

פעמיים פלואורסצנטי באתרו הכלאה בסעיפים המוח טריים

שילוב של טכניקות שונות על מנת למקסם את איסוף הנתונים מרקמות העכבר מוצג.

שילוב של צבע lipophilic, באתרו</emהכלאה>, אימונוהיסטוכימיה ו היסטולוגיה

אנו מדגימים immunoprecipitation הכרומטין (שבב) שיטה לזהות אינטראקציות גורם ספציפי על רקמות גנים במהלך או לאחר הופעת ביטוי גנים ברקמות ספציפיות ברקמות עובריים בעכבר. פרוטוקול זה צריך להיות רלוונטי נרחב לחקר ההפעלה רקמות ספציפיות גן כפי שהיא מתרחשת במהלך ההתפתחות העוברית נורמלי.

הכרומטין Assay immunoprecipitation עבור גנים ספציפיים רקמות באמצעות שלבים מוקדמים של עוברי עכברים

בין השלושה סוגי היתושים,...

פלואורני<em&gt; באתר</em&gt; הכלאה על כרומוזומים mitotic של יתושים

כאן אנו מתארים שלם הר...

הר כולו RNA פלורסנט<em&gt; באתר</em&gt; הכלאה של<em&gt; דרוזופילה</em&gt; עוברים

אנו מתארים פרוטוקול חזק ותכליתי לניתוח ארכיטקטורה גרעינית ידי דגי DNA 3D באמצעות בדיקות ניאון שכותרתו ישירות.

דגי ה-DNA 3D חזקים באמצעות בדיקות שכותרתו ישירות

פיתחנו פרוטוקול פלואורסצנטי  ספציפי לגדיל (FISH) המותאם אישית בקלות בשילוב עם אימונופלואורסצנטיות. זה מאפשר בחינה מפורטת של דינמיקת RNA עם תובנה בו-זמנית לגבי מבנה הכרומטין, הארגון הגרעיני וויסות השעתוק ברמת התא הבודד.

המהיר פלורסנט באתר הכלאת פרוטוקול לXist RNA משולב עם Immunofluorescence של היסטון שינוי באיון כרומוזום X

אנו מתארים הליך רב-יעד chromogenic כל הר הכלאה באתר (MC-תרצה) בעוברים שלמים תסיסנית מאפשרים זיהוי סימולטני וספציפי של שלושה דפוסי הפצת mRNA שונים על ידי מנוגד משקעים צבע.

רב-יעד Chromogenic כל הר<em&gt; באתר</em&gt; הכלאה להשוואת תחומים ביטוי גנים ב<em&gt; דרוזופילה</em&gt; עוברים

Reproducibly לספור את המספרים של mRNAs ב oocytes בודדים, מולקולה בודדת RNA פלורסצנטיות באתרו הכלאה (RNA-דג) היה אופטימיזציה עבור תאים שאינם מחסידי. Oocytes נאספו, hybridized עם הגששים ספציפית התעתיק, לכמת באמצעות תוכנה כימות של התמונה.

השימוש יחיד מולקולה פלורסנט ב באתרו הכלאה (SM-דג) כדי mRNAs Quantify ו Localize ב Oocytes מאתר

חקור שיטת FISH משולבת לזיהוי DNA ו-RNA במקביל בתאי גזע עובריים של עכברה נקבה. השיטה מאפשרת מחקר של הכבדת כרומוזום X וויסות גנים בפיתוח עוברי.

DNA-RNA בשילוב פלורסנט

גלה סרטונים נוספים