הקלטת תיקון מהדק מצורף תא אחד ערוצים

שתואר כאן הוא הליך לקבלת משתרע הקלטה הנוכחית ארוך מערוץ יון אחד עם טכניקת התיקון-clamp מצורף תא. שיטה זו מאפשרת להתבוננות, בזמן אמת, את הדפוס של תצורות ערוץ פתוחות קרובים העומדות בבסיס האות הביולוגית. נתונים אלה להודיע ​​על נכסי ערוץ בממברנות ביולוגיות באין מפריע.

המטרה הכוללת של הליך זה היא למדוד זרם חשמלי דרך תעלת יונים בודדת. זה מושג על ידי ביטוי הטרולוגי ראשון של תעלת היונים המעניינת בתאים שקל לעבוד איתם ותורמים למטרות הניסוי. השלב השני הוא שימוש בפיפטה מלוטשת אש כדי להשיג אטימה יציבה על קרום התא.

לאחר מכן, הנסיין צריך לקבוע את מספר הערוצים הקיימים בתיקון, ואם מדובר בזרם שיא של ערוץ יחיד, השלב האחרון הוא לעבד ולנתח את הנתונים. בסופו של דבר, הקלטת זרם מתעלות יונים בודדות משמשת לחקירת התכונות הביופיזיקליות שבאמצעותן פועלים חלבוני הממברנה הללו, המהווה את הבסיס לאופן שבו תאים עצביים ותאים מעוררים אחרים מתקשרים. בניגוד לשיטות המאפשרות למדוד זרמים דרך מספר ערוצי יונים פעילים, היתרון בגישה זו הוא שמדידת זרמים דרך תעלת יונים בודדת מאפשרת לך לדמיין ולהפריד מגוון רחב של דפוסי תגובה הטבועים בערוץ מסוים.

ניתן להשתמש בשיטה זו כדי לענות על שאלות מפתח בתחום מדעי המוח, כגון מודולטורים פיזיולוגיים וטיפוליים המשפיעים על התקשורת בין נוירונים. בדרך כלל, אנשים חדשים בטכניקה זו יתקשו מכיוון שקשה להשיג הקלטות רעש נמוכות המכילות רק תעלת יונים אחת. כאשר מנסים לראשונה את השיטה הזו, זה ממש שימושי לראות מישהו עושה את זה כי כדי להשיג אטימה יציבה באמת, שזה הדבר החשוב ביותר בשיטה זו, אתה צריך להתקרב לתא בעדינות בזווית מסוימת, והכי חשוב, אתה צריך להיות מתמיד כדי להתכונן לטרנספקציה.

תאי HEK 2 93 מצופים בכלים של 35 מילימטר יום אחד מראש כדי להביא אותם למפגש של 50 עד 60% בצינור סטרילי. הכן את תערובת הטרנספקציה. הוסף מיקרוגרם אחד מכל CDNA מעניין, 315 מיקרוליטר מים מזוקקים כפולים ו -350 מיקרוליטר של ערימות 42 מילימולריות.

לבסוף, הוסף 35 מיקרוליטר של סידן כלורי טיפה ליצירת המשקעים. מערבלים את הצינור למשך חמש שניות ומוסיפים 175 מיקרוליטר של תרחיף טרנספקציה לכל אחת מארבע הכלים. מצופה יום קודם.

דגרו על התאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך שעתיים. לאחר הדגירה יש להסיר את המדיה ולשטוף עם PBS. לאחר מכן, הוסף שני מיליליטר של מצע גידול, בתוספת שני מילי-מולרי מגנזיום כלוריד כדי למנוע אקסיטוטוקסיות בתיווך קולטן MDA.

ראשית משוך שתי פיפטות הקלטה סימטריות מזכוכית סיליקט ילד באמצעות מושך אנכי. לאחר מכן, יש צורך בליטוש אש כדי להשיג את הקוטר והעמידות המתאימים. לאחר מכן, הגדר להקלטה על ידי פתיחת תוכנת רכישת הנתונים של QUB ובחירת חלון הרכישה.

תחת פריסה. פתח קובץ נתונים חדש של QUB על ידי לחיצה על נתונים חדשים והזן את הפרמטרים הניסיוניים לשימוש. התאם את קנה המידה של המשרעת ל-0.1 וולט לפיקו amp על ידי לחיצה ימנית על קובץ הנתונים, בחירת מאפיינים ולחיצה על כרטיסיית הנתונים.

לאחר החלפת המדיה בשני מיליליטר PBS המכילים סידן ומגנזיום, הרכיבו את צלחת התאים על במת המיקרוסקופ. התמקדו בשדה הסלולרי באמצעות מיקרוסקופ ניגודיות פאזה כדי להעריך שהתאים בריאים ומחוברים היטב לצלחת בצורה חד-שכבתית. עבור לזיהוי פלואורסצנטי כדי לוודא שהטרנספקציה הצליחה.

לאחר מכן, הגדר את הפרמטרים להקלטת ערוץ יחיד. הגדר את המצב למהדק מתח והמתח המופעל לפלוס 100 מילי-וולט עם פקודת החזקת המתח. במצב כבוי, בחר את לחצן בדיקת האיטום בהתבסס על הקרינה והמראה הכללי.

בחר תא לתיקון וודא תחת ניגודיות פאזה שהתא מחובר היטב לצלחת, יש לו חלק גדול משטח התא חשוף לתיקון ואחרת נראה בריא. מלאו פיפטה מלוטשת טרייה בתמיסה המתאימה לקולטני NMDA ולניסויים המחוברים לתאים והחליקו בעדינות כדי לעקור בועות אוויר. אבטח את פיפטת ההקלטה על ראש המגבר tagוודא שחוט הכסף שקוע בתמיסת הפיפטה כדי למנוע מתמיסת אמבטיה להיכנס לפיפטה.

במהלך הגישה, השתמש במזרק פלסטיק קטן המחובר למחזיק הפיפטה כדי להפעיל בעדינות לחץ חיובי. לאחר מכן, השתמש במניפולטור המיקרו כדי לכוון את הפיפטה לאמבטיה. סגירת המעגל החשמלי, מקם אותו ישירות מעל התא שנבחר לתיקון.

שימו לב לאוסילוסקופ עם הכניסה לאמבטיה. התנגדות הפיפטה צריכה להיות בטווח האופטימלי תוך ניטור חזותי של מיקום הצינור במיקרוסקופ ועמידותו חשמלית על האוסילוסקופ. המשך בגישה במרווחים קטנים עד שהפיפטה פוגעת בעדינות בתא.

אות הבדיקה יקטן מעט כדי להצביע על התנגדות מוגברת. כדי ליצור חותם, הרם את המזרק והפעל בעדינות לחץ שלילי קל דרך הצינור הרוחבי. על ידי משיכת המזרק, היווצרות חותם הבוכנה מסומנת על ידי השטחה מלאה של צורת הגל של אות הבדיקה באוסילוסקופ.

על המגבר. העבר את מתג הפקודה החיצונית מבדיקת איטום למצב כבוי. העבר את כרךtagפקודת החזקת המתח ממצב כבוי לחיובי והגדל את הרווח מ-10 x ל-100 x.

התבונן באוסילוסקופ לפעילות הערוץ, שאם קיימת תוצג כסטיות מרובעות כלפי מטה מקו הבסיס השטוח בעבר. אם פעילות הערוץ מוצגת באוסילוסקופ, התחל לרכוש נתונים לתוך הדיגיטלי שנפתח בעבר file ב-QUB על ידי לחיצה על כפתור ההפעלה, ולאחר מכן על כפתור ההקלטה. כדי להפסיק להשיג נתונים, לחץ על כפתור העצירה ב-QUB ושמור את קובץ ה-QDF אות שאינו משתטח לחלוטין, או קו בסיס שהופך רועש ולא יציב עשוי להצביע על אטימה חלשה.

במקרה זה, הסר והשליך את הפיפטה וחזור על שלבי ההליך עם פיפטה טרייה עד לקבלת אטימה נאותה. כדי להתחיל בתהליך ניתוח הנתונים, פתח את קובץ הנתונים המוקלט ב-QUB ובדוק את המעקב הנוכחי בממשק המקדים. תחת פריסה.

הסר את המסנן הדיגיטלי כדי להציג את המעקב המוקלט ברוחב פס מלא על ידי ביטול הסימון בתיבה שכותרתה fc. סרוק חזותית את העקבות כדי לזהות אי סדרים וחפצים תקציר. ניתן לתקן קוצים נוכחיים על ידי הדגשת אזור נקי סמוך מאותה מחלקת מוליכות.

לחיצה ימנית ובחירה באפשרות הגדר מחק מאגר תחילה, התקרב לספייק עד שנקודות דגימה בודדות יהיו גלויות. בחר את האזור להחלפה על-ידי סימון אזור זה בלבד. לחץ באמצעות לחצן העכבר הימני ובחר מחק כדי לתקן את קו הבסיס עבור הרשומה כולה.

הגדר את קו הבסיס של זרם האפס על-ידי בחירת חלק מוקדם של הרשומה שבו קו הבסיס יציב. סמן לחיצה ימנית ובחר קבע קו בסיס. כאשר ההנחיה הבסיסית מופיעה, ודא בבדיקה חזותית שהיא מייצגת במדויק את רמת הבסיס.

זהה נקודות ברשומה שבהן התוכנית הבסיסית של הנתונים הגולמיים חורגת באופן ניכר מקו הבסיס שנקבע. תקן זאת על-ידי בחירת מקטע קטן של קו בסיס בתוך האזור הסוטה. לחץ לחיצה ימנית ובחר בפקודה הוסף צומת בסיסי.

כאשר הרשומה מכילה מדי פעם תקופות עם עודף רעש או חפצים, שלא ניתן לתקן בקלות, יש למחוק חלקים אלה, אך תחילה יש לפרק אותם למקטעים עוקבים. סמן מיד לפני האזור שיש להשליך. לחץ לחיצה ימנית ובחר קטע שבר.

לאחר מכן, סמן את הקטע שיש למחוק לחץ באמצעות לחצן העכבר הימני, בחר, מחק ולחץ על Enter כדי להפוך רשומות לאידיאליות. עבור לממשק MOD תחת פריסה. בלוח תצוגת הנתונים, בחר חלק קטן מהרשומה המכיל אירועים סגורים ופתוחים כאחד.

הזז את הסמן לחלונית הרזולוציה הגבוהה שמתחת ובתוך העקיבה שנבחרה, סמן מקטע נקי המייצג את קו הבסיס. הזיזו את הסמן לחלונית הדגם למטה, לחצו לחיצה ימנית על הריבוע השחור, שייצג את המצב הסגור ובחרו Grab. חזור על ההליך לפתיחת ערוצים על ידי הדגשת חלק מהתכונות המייצגות את המוליכות הפתוחה.

לחץ לחיצה ימנית על הריבוע האדום בלוח הדגם ובחר Grab. בצע את האידיאליזציה עבור החלק שנבחר של הרשומה על-ידי בחירה בלחצן SEL תחת מקור נתונים. לאחר מכן לחץ לחיצה ימנית על הכרטיסייה האידיאלית מתחת לקטע הדוגמנות בחלונית המוקפץ.

ודא שהפרמטרים הרצויים לניתוח נכונים ולאחר מכן לחץ על הפעל. תוצאת האידיאליזציה יחד עם היסטוגרמה של משרעת עבור החלק הנבחר מכוסה בנתונים כדי לאפשר בדיקה חזותית של האידיאליזציה. במידת הצורך, התאם את פרמטרי האידיאליזציה לקבלת התוצאה הטובה ביותר וחזור על הפעולה, בצע את האידיאליזציה עבור הקובץ כולו על-ידי בחירה בלחצן קובץ תחת מקור נתונים.

לאחר מכן לחץ לחיצה ימנית על הכרטיסייה האידיאלית ולחץ על הפעל. התוצאות עבור הקובץ כולו מוצגות. על גבי הנתונים, בדוק בזהירות את ההתאמה בין העקבות האידיאליות לנתונים המוקלטים.

מדי פעם מזוהים אירועים באופן שגוי שניתן להוציא מהעקבות האידיאליות. בחר את האירוע הלא נכון, לחץ לחיצה ימנית ובחר הצטרף ל-IDL. מוצגים כאן זרמי יוני סידן בלבד דרך קולטן NMDA יחיד בתא HEK 2 93.

באמצעות טכניקת מהדק התיקון המחובר לתא, אידיאליזציה של נתונים מייצרת היסטוגרמות משרעת, המשתלבות יפה בשתי מחלקות מוליכות נפרדות בתא זה. הקלטה מצורפת מתאי HEK 2 93, ערוץ רגיש אחד למנו מופעל במינוס 20 מילימטרים. לחץ כספית דרך פיפטת התיקון במהלך הפעלה מתמדת של מתח.

הקו המקווקו האדום מציין את רמת זרם האפס. הקלטות אלה מערוצים מקומיים מראות פעילות מתמשכת של קולטן NMDA שתועדה מהסומה של נוירון שנותק מקליפת המוח הקדם-מצחית של עובר חולדה ונשמר בתרבית במשך חמישה או 27 ימים. לאחר השליטה, ניתן לבצע הליך זה תוך 30 דקות עד שעה בהתאם למשך ההקלטה.

בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כמו ניתוח קינטי ומידול מצב כדי לקבוע את מנגנון השער של הערוץ ולהעריך את שיעורי התגובה. לאחר צפייה בסרטון זה, אתם אמורים להבין היטב כיצד להקליט ולהתחיל לנתח זרמים דרך חלבון תעלת יונים אחד.