שיטה של permeabilization של דרוזופילה עוברים למבחנים של מולקולה קטנה פעילות
13 ביולי 2014
מבוא של מולקולות קטנות לעובר דרוזופילה הפיתוח מציע פוטנציאל גדול לאפיון פעילות ביולוגית של תרכובות רומן, סמים ורעלים כמו גם לחיטוט מסלולים התפתחותיים בסיסיים. שיטות שתוארו במסמך זה מתארים את שלבים שלהתגבר על מחסומים טבעיים לגישה זו, המרחיב את התועלת של מודל עובר דרוזופילה.
המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא להכין עוברי דרוזופילה ברי קיימא עם קליפת ביצה חדירה כדי לבחון את הפעילות הביולוגית של תרופות או רעלים של מולקולות קטנות. זה מושג על ידי טיפול ראשון בעוברים בשלב התפתחותי עם אקונומיקה מדוללת כדי להסיר את שכבות קליפת הביצה החיצוניות. השלב השני הוא לחלחל לעוברים עם ממס שמדלדל את שכבת קליפת הביצה השעווה הדקה שחוסמת מומסים של מולקולות קטנות.
השלב השלישי הוא לטפל בעוברים באמצעות תרופה או רעלן וצבע כדי לאמוד בו זמנית את חדירות קליפת הביצה ולהכניס תרכובת מעניינת. לאחר התפתחות נוספת, ניתן לדמות את העוברים ישירות או לעבד אותם לאימונוהיסטוכימיה. בסופו של דבר, התוצאות יכולות להראות את הפעילות של תרופה או רעלן על התפתחות רקמות כפי שנקבע על ידי מיקרוסקופיה פלואורסצנטית עם ריאגנטים חיסוניים או קשרים חיוניים.
היום אציג את השיטה שלנו לחדירה של עוברי דרוזופילה לבדיקות של פעילות מולקולות קטנות. היתרונות העיקריים של טכניקה זו על פני שיטות קיימות כמו שימוש בממיסים אורגניים קונבנציונליים כגון הפטן לסלסול. קליפת הביצה היא שממס חדירת העובר שלנו, או EPS, הוא פספוס מים ויחסית לא רעיל.
תכונות אלו מקלות על טיפולים בעוברים לפיהם ניתן לשלוט בצורה מדויקת יותר בחשיפה לממסים וניתן לבצע אותן במדיה רלוונטית מבחינה פיזיולוגית, שניהם מביאים לכדאיות גבוהה יותר של העובר. הרעיון לשיטה זו עלה לי לראשונה כששקלתי כיצד להסיר את שכבת השעווה של קליפת הביצה. בהיותי גולש, הרהרתי בשימוש הנפוץ בממס הדרים כדי להסיר את שאריות השעווה מבסיס המגלשיים.
זה גרם לי לתרגם את היישום הזה לקליפת ביצת עובר הזבוב, ולאחר ניסוי וטעייה שהובילו לפתרון הרכב ה-EPS, הכינו כלובי אוכלוסייה עם לפחות 500 זבובים בגיל ההזדווגות של הזנים הרצויים. הכלובים צריכים להיות מתאימים למיץ ענבים בגודל 10 סנטימטרים. מאוורר עם מעט רסק שמרים.
החלף את הצלחות הללו פעמיים ביום. לאחר מספר ימים, הזבובים יותנו לתרבית ויטילו עוברים באופן קבוע יותר. EPS עשוי מחומרים פעילי שטח ותמיסות ממס מגבילות והוא טוב לחודשיים.
כאשר הם מאוחסנים בטמפרטורת החדר, יש לחמם את פעילי השטח ל-37 מעלות צלזיוס בעת ערבוב EPS טרי לטיפול ב-EPS מטפלים בעוברים עם סלים העשויים משלושה סנטימטרים, כך שצינור פוליפרופילן של 50 מיליליטר ורשת ניילון מחוספסים. קצוות פלסטיק נמסים לרשת ביתר קלות במהלך שלבי פיתוח מאוחרים יותר. העוברים מטופלים גם עם סלים העשויים מכסים של צינורות של 50 מיליליטר.
הכובע נקדח ומחורץ, וההברגה בין הכובע לצינור מאבטחת את הרשת. לחלופין, נעשה שימוש בתא החלקה של מכונה מקומית ומוכן עם חתיכת חמצן חדירה. האם קרום מאובטח מעל הפתח על ידי טבעת מחזיק כדי לקצור את העוברים.
הניחו צלחת ענבים טרייה עם רסק שמרים על התרבות בבוקר. לאחר שעה, החליפו את הצלחת והשליכו את הצלחת הראשונה שנאספה. תנו לצלחת השנייה לאסוף עוברים במשך שעתיים בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס.
ואז אוספים את הצלחת ומעבירים אותה ל -18 מעלות צלזיוס.שם. אפשר לעוברים להתפתח לשלב הרצוי. כאשר העוברים מוכנים, יש לצבוע אותם לפני הטיפול ב-EPS.
שוטפים אותם מהצלחת לסל המחית במים ובעזרת מברשת. שנית, שטפו אותם במים זורמים עדינים כדי להסיר פסולת. שלישית, טבלו אותם באקונומיקה של 50% למשך שתי דקות עם זרימה תקופתית של תמיסת האקונומיקה.
לאחר מכן שטפו אותם מיד במים זורמים. כעת מלאו שש צלחות של 60 מילימטר כל אחת ב-10 מיליליטר PBS כדי לתפקד כאמבטיות ובצעו דילול של 1 עד 40 של מלאי EPS ב-MBIM מערבבים את התערובת. תחליב לבן ייווצר את עודפי המים מתחתית סל הרשת באמצעות מגבון ויטבול את העוברים בדילול ה-EPS בתנועה מסתחררת מתמדת.
לאחר סיבוב העוברים ב-EPS למשך 30 שניות, הסר אותם ומחק את התמיסה העודפת. לאחר מכן העבירו את הסל בין שש אמבטיות ה-PBS, התיזו בעדינות כדי לשטוף והמשיכו בצבע ובטיפול התרופתי. אופטימיזציה של חדירות וכדאיות היא החלק המסובך ביותר בפרוטוקול זה.
חדירות רגישה לשלב התפתחות העובר. הטמפרטורה שבה העוברים מזדקנים ויכולה גם להשתנות מאוד בין זנים בודדים של זבובים. יש להגיע באופן אמפירי לפרמטרים הטובים ביותר לדילול EPS וזמן החשיפה.
ראשית, הכינו תמיסה של 50 מיקרומולרית של צבע חומצה קרבוקסילית מדע בדיוני ב-M-B-I-M-T מיליליטר אחד בצינור מיקרופיש מספיק. ניתן להוסיף רעלן או תרופה בשלב זה לערבוב טיפולים אקוטיים. העבירו את עוברי הפרם מהסל לצינור המיקרו פוגה בעזרת מברשת.
מכסה את הצינור והפוך אותו מספר פעמים. לאחר מכן טען את הצינור על מוטטור ותן להם לדגור במשך 15 דקות. לאחר שהעוברים התייצבו, הסר את הצבע בעזרת פיפטה והוסיף בחזרה מיליליטר אחד של M-B-I-M-T לשטיפה. החייאה.
השעו את העוברים, תנו להם להתייצב והחליפו את ה-M-B-I-M-T. לאחר מכן עשו זאת בפעם השלישית והרביעית. לאחר השלמת הוואשה הרביעית, הסירו את כל ה-M-B-I-M-T והעבירו את העוברים לסל התפתחות לתקופות התפתחות ארוכות.
לסל הפיתוח תחילה, הכינו את הסל עם שטיפה של 70% אתנול ולאחר מכן מים יבשו בדם עם מגבון מעבדה. בסיום. לאחר מכן, העבירו את הסל לכלי של 60 מילימטר עם שישה מיליליטר מדיום דגירה המכיל את התרופה או הרעלן הרצויים.
העבירו את העוברים לרשת בסל בעזרת מברשת צבע על ידי הטלת מדיום הדגירה בעדינות מעליהם, פזרו את העוברים לשכבה חד-שכבתית. היזהר לא ללכוד בועות אוויר מתחת לרשת. כדי להשתמש תחילה בתא שקופיות, הכינו את החדר, הפכו את תא ההחלקה והניחו חרוז דק של שומן ואקום סביב קצה הפתח.
העומס הבא, 150 מיקרוליטר מהמדיום הרצוי על פני קרום ה-do בתוך הפתח. כעת, העבירו את העוברים למדיה באמצעות מכחול ופזרו אותם על הממברנה. סיים על ידי מריחת החלקת כיסוי עגולה של 25 מילימטר המשטחת את המדיום.
הפעל לחץ קל סביב ההיקף כדי להבטיח את האיטום. יש השפעה חזקה של גידול עוברים ב-18 מעלות צלזיוס על יכולתם לחלחל על ידי EPS ולקלוט צבע בשלבי התפתחות מאוחרים. זה מודגם על ידי היעדר ספיגת רומין BD בעוברים שטופלו ב-EPS שגדלו ב-25 מעלות צלזיוס ספיגת צבע חומצה קרבוקסילית מדע בדיוני הנראית כאן באדום חושפת את רמות החדירות השונות הנראות בדרך כלל בעוברים שטופלו ב-EPS.
התפלגות דינמית של צבע המדע הבדיוני האדום הרחוק במהלך ההתפתחות, והתלכדותו בחלמון בתוך המעי המפותח שנראה עם אוטופלואורסצנציה כחולה חושפים קריטריון המשמש להערכת כדאיות. צבע המדע הבדיוני יכול גם לקבוע עובר חדיר קודם לאחר קיבוע פורמלדהיד וצביעה חיסונית. לאחר שעוברי EPS טופלו בצבע מדע בדיוני ורעלן מתיל כספית, הם נצבעו באנטיפה 2 הנראים בירוק כדי לסמן נוירונים מוטוריים ומעבדת אנטי E באדום כדי לסמן גופי תאי עצב
.צבע מדע בדיוני הוא פסאודו בצבע כחול. למתיל כספית יש השפעה על דפוס גופי תאי הנוירונים של הקורטונים המסומנים על ידי החצים בעוברי הטיפול בבקרה. לנוירונים אלה יש שניים מסודרים יותר המוצגים כאן בלבן ממחישים את ההסתעפות הנורמלית של נוירונים סגמנטליים בטיפול הבקרה שצוין על ידי ראשי החץ.
לשם השוואה, טיפול במתיל כספית משנה את דפוס ההסתעפות כפי שמסומן על ידי החצים הירוקים המוצקים. החץ הירוק החלול מסמן היכן נעקר ההסתעפות. לאחר שליטה, טיפולי חדירת עוברים בטכניקה זו יכולים להיעשות תוך כ-30 או 40 דקות אם זה מבוצע כראוי.
לאחר הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כמו קיבוע וצביעה חיסונית של העוברים על מנת לענות על שאלות נוספות כגון אילו רקמות ספציפיות מכוונות על ידי תרופה או רעלן במהלך ההתפתחות. אני מודה לך על הצפייה בהליך זה ואני מאחל לך בהצלחה ביישום שיטות אלה במעבדה שלך.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מאמר זה מתאר שיטה להכנת עוברים חיוניים של Drosophila בעלי קליפת ביצה חדירה, לצורך בדיקת הפעילות הביולוגית של תרופות במולקולות קטנות או רעלים. גישה זו נועדה לשפר את התועלת של מודל עובר ה-Drosophila למחקר ביולוגי.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- מדעי המוח
- ביולוגיה התפתחותית
- פרמקולוגיה
רקע
- עוברי Drosophila משמשים כמודל לחקר תהליכי התפתחות.
- מולקולות קטנות יכולות להשפיע על פעילות ביולוגית ומסלולי התפתחות.
- מחסומים טבעיים בעוברי הדרוזופילה מגבילים את החדרת תרכובות.
- התגברות על מחסומים אלו יכולה להרחיב את יכולות המחקר.
מטרת המחקר
- להכנת עוברי Drosophila לבדיקת תרופות של מולקולות קטנות או רעלים.
- להערכת חדירות קליפת הביצה לתרכובות שונות.
- להערכת ההשפעות של חומרים שהוכנסו על התפתחות רקמות.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- טיפול בעוברי דגים בתמיסת אקונומיקה מדוללת להסרת שכבות הכוריון החיצוניות.
- שימוש בממס להסרת שכבת השעווה של קליפת הביצה.
- החדרת תרופות או רעלים יחד עם צבע להערכת חדירות.
- דימות או עיבוד עובריים לצורך אימונוהיסטוכימיה לאחר הטיפול.
תוצאות עיקריות
- הכנה מוצלחת של עוברים עם קליפות ביצה חדירות.
- הדגמת פעילות ביולוגית של תרכובות שהוכנסו על ההתפתחות.
- מיקרוסקופיה פלואורסצנטית חשפה השפעות על התפתחות הרקמות.
- ריאגנטים אימונוכימיים אישרו את הפעילות של תרופות או רעלים.
מסקנות
- השיטה משפרת את מודל העובר של ה-Drosophila לבדיקת תרופות.
- היא מספקת תובנות לגבי השפעותיהם של מולקולות קטנות על ההתפתחות.
- ניתן ליישם גישה זו במגוון מחקרים ביולוגיים.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למסמך ניהולי
שיטה זו מאפשרת להשתמש בעוברים של Drosophila כמערכת חדירה לסריקת מולקולות קטנות, ובכך נותנת מענה למגבלה מרכזית בפרמקולוגיה התפתחותית. על ידי התגברות על חוסר החדירות של קליפת הביצה תוך שמירה על חיוניות, השיטה תומכת בתיקוף מטרות בשלבים מוקדמים ובצמצום סיכונים מכניסטיים. הגישה מגבירה את הביטחון החזוי בהשפעות של תרכובות על מסלולים התפתחותיים, ומספקת מידע לקבלת החלטות לגבי תיק פיתוח בתהליך זיהוי מובילים.
יישומים אסטרטגיים במו"פ של ביו-פרמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בדיקה של היפותזות טיפוליות על ידי בדיקת פעילות של מולקולות קטנות ברקמות מתפתחות.
- ערך תפעולי: מספק מודל שניתן לטיפול גנטי לצורך תיקוף תפקודי של מטרות in vivo.
- ערך ניבוי: תומך בהפחתת סיכונים ביולוגיים באמצעות תצפית ישירה על שינויים פנוטיפיים המושרים על ידי התרכובת.
סריקה ופיתוח בדיקה
- מוכנות הבדיקה: מייצרת עוברים חדירים וסטנדרטיים התואמים לקריאות פלואורסצנטיות לצורך סריקת תרכובות.
- פלט כמותי: משתמשת בספיגת צבע (למשל, CY5) כאינדיקטור לחדירות כדי לנרמל את החשיפה לתרכובות בין הבארות.
- יכולת הרחבה (Scalability): תואמת לפורמטים של רב-בארות ולדימוי אוטומטי עבור יישומים בעלי תפוקה בינונית.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- רלוונטיות למחלה: רלוונטי למודלים של הפרעות התפתחותיות שבהם חשיפה עוברית מנבאת סיכון טרטוגני.
- המשכיות תרגומית: מקשר בין ממצאים in vitro להקשר התפתחותי דמוי in vivo לצורך שיפור המודלים החזויים.
- הפחתת סיכונים מכניסטית: מבהיר האם ההשפעות שנצפו נובעות מחדירות התרכובת או מפעילות ביולוגית מובנית.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת עיבוד (Pipeline)
השיטה משתלבת בתהליכי גילוי מוקדמים, ומאפשרת הערכת תרכובות לאחר זיהוי המטרה ולפני אופטימיזציה של תרכובת מובילה (lead optimization), במיוחד עבור מודולטורים של מסלולי פיתוח.
- ביולוגיה של התגליות: תומכת בבדיקת השערות על ידי קישור חשיפה למולקולות קטנות לפנוטיפים התפתחותיים באמצעות רפורטרים פלואורסצנטיים.
- סריקה: מספקת תוצאי חדירות ופעילות כמותיים וניתנים לשחזור כאשר היא משולבת עם צבעים רציומטריים.
- אנליטיקה: מאפשרת נורמליזציה של השפעות התרכובות באמצעות מדדי חדירות, ובכך משפרת את השוואת הנתונים בין תנאים שונים.
- מחקר טרנסלציונלי: מקשרת בין סריקה פנוטיפית מוקדמת להערכת טרטולוגיה פרה-קלינית באמצעות מסלולים התפתחותיים שמורים.
- שימוש חוזר ארגוני: מבססת פלטפורמה ניתנת לשימוש חוזר לסריקת ספריות לאורך שלבים התפתחותיים ורקעים גנטיים מרובים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון במטרה על ידי אישור הגישה של התרכובת לרקמות עובריות.
- ערך תפעולי: משפר את השחזוריות באמצעות שלבי חדירה (permeabilization) ושטיפה סטנדרטיים.
- ערך אסטרטגי: מפחית תוצאות שליליות שגויות בסריקה על ידי הבטחת אספקת התרכובת, ובכך משפר את דיוק שיעור הפגיעות (hit rate).
- השפעה על הפורטפוליו: מסייע בקבלת החלטות להמשך או הפסקה (go/no-go) על ידי אספקת סימנים מוקדמים לרעילות התפתחותית.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בטיפול ב-Drosophila, קביעת שלבי התפתחות העוברים ואופטימיזציה של חדירות (permeabilization).
- תלוי בגישה לממס EPS, תרכובות צבע ומערכות דימוי פלואורסצנטי.
- מחייב סטנדרטיזציה של גיל העוברים, הטמפרטורה וזמן החשיפה ל-EPS בין המשתמשים השונים.
- כולל שיקולי התאמה לרקעים גנטיים ולשלבי התפתחות שונים.
- כולל מגבלות מעשיות כגון שונות בין עוברים ואופטימיזציה של החדירות עבור כל זן.
