Name: שיטה של permeabilization של דרוזופילה עוברים למבחנים של מולקולה קטנה פעילות (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-07-13T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 4 s
Description: למדו שיטת permeabilization לעוברי Drosophila לבדיקת פעילות מולקולות קטנות. השיטה מסירה שכבות קליפת הביצה החיצוניות באמצעות חומרי ממס ומאפשרת הוספת תרופות או רעלנים לחקר השפעותיהם על התפתחות העוברים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

עבודה זו נתמכה על ידי NIH/NIEHS R03ES021581 (הוענק ל-M.D.R.) ועל ידי המרכז לבריאות הסביבה של אוניברסיטת רוצ'סטר (NIH/NIEHS P30 ES001247).

1. הכנת תרבויות טוס, פתרונות, ומכשירי טיפול בעובר <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את תרבות כלוב של דרוזופילה. הנח 500 זבובים + הזדווגות של הזן הרצוי במצוידים בצלחת ענבים אגר 10 סנטימטר ומקום של שמרים להדביק כלוב אוכלוסייה. לשמור על התרבות בחממה מבוקרת C לחות 25 °. הערה: &#160; תרבויות כלוב דורשות יום או ימים של אוויר, כדי לרכוש דפוסי עובר הנחת עקביים. צלחות ענבים עם שמרים להדביק משתנות פעם בבוקר ופעם בערב באוויר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן EPS. פתרונות חמים של חומרים פעילי שטח (DEA cocamide ואלכוהול Ethoxylated) ב 37 ° C. פיפטה 18 מיליליטר של d-limonene לבקבוקון נצנץ זכוכית מצויד בבר ומערבב קטן. פיפטה 1 מיליליטר כל אחד משני החומרים פעילי השטח (5% הריכוז סופי של כל אחד) לd-limonene. מערבבים היטב ולהסיר בר ומערבב. הערה: פתרון מניות זה של רווח למניה הוא טוב לכ 2 חודשים בטמפרטורת חדר. הפתרוןיש לחמם על 37 מעלות צלזיוס והסתחרר לsolubilize מלוא שטח לפני השימוש. EPS ו-D-limonene צריך להיות מאוחסן במכל זכוכית כפי שהם יהיו לפזר כמה פלסטיקים לאורך זמן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרון dechorionation העובר, מדיומים דגירה, צבע ופתרונות בסמים. מערבבים 25 מיליליטר של אקונומיקה עם 25 מיליליטר H 2 O ומקום בצלחת רדודה. להכין מדיום שונה בסיסי דגירה (MBIM) וMBIM-T על פי מתכון שלפני 1,12. הכן ילדס וסאנג בינוני M3 תא התרבות וPBS על פי הפרוטוקול של היצרן (ראה חומרי רשימה). הכן פתרון מניות של צבע permeabilization ב10 מ&quot;מ ריכוז בDMSO. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרכיב מכשירי עובר טיפול ובאספקה: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן dechorionation וסל טיפולי EPS (ראה איור 1 א). חותכים את סעיף 3 סנטימטר של צנטריפוגות תרבות צינור חד פעמי 50 מיליליטר פוליפרופילן / עם מסור עדין שיניים. הפוך את סומק ריתוך משטח על ידי שפשוף קטע הצינור על נייר זכוכית דבקלמשטח המעבדתיים. ולד קטע הצינור לרשת ניילון Nitex ידי התכת שולי סעיף הצינור על אש ולחיצה על לרשת על צלחת זכוכית. בואו מגניב ולקצץ את רשת נוספת. הערה: הצדדים ותחתונים העצום לאפשר לשטיפה מהירה ומלאה משל אקונומיקה והרווח למניה שיורית בצעדים המתאימים. צריכה להתבצע פעולות הריתוך מתחת למכסת מנוע קטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את סל פיתוח. חותכים את החלק העליון של צנטריפוגות / תרבות צינור 50 מיליליטר מיושר עם שולי הכובע. להסיר ולשנות את הכובע על ידי חיתוך פתיחה מרכזית וחריצים לאורך השפה כפי שמוצג באיור 1. הברג את הכובע על הרשת ועל האשכולות של סעיף הצינור מנותק ולקצץ רשת נוספת. הערה: הכובע מכיל חריצים בשפה המאפשרות דיפוזיה למדיום בתפזורת כשהוא מוצב בצלחת המאגר 60 מ&quot;מ (איור 1 ב &#39;). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את מרכיבי תא שקופיות. לחתוך רבוע של קרום לעשות את זה הוא גדול יותר מאשרקאמרי פתיחת השקופית. למרוח שכבה דקה מאוד של שומן ואקום לשפה הפנימית של הפתח. להדביק את קרום DO לתוך הפתח איטומו נגד הגריז עם הטבעת המייצבת. לקצץ קרום DO עודף על ידי קיצוץ אותו קרוב לטבעת המייצבת. הערה:. ניתן למצוא מפרט לקאמרי השקופית בKiehart et 13 אל חדר זה ​​אינו זמין באופן מסחרי ודורש ייצור מותאם אישית על ידי חנות מכונה. </li></ol></li></ol> 2. Staging, dechorionation, והרוויחו למניה טיפול בעוברים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Staging עוברים על ידי אוסף מתוזמן. הגדר ענבים / שמרים טרי צלחת לכלוב התרבות לטוס בבוקר. אפשר לעוברים להיות מונחים לשעה 1 ב25 ° C. בטל צלחת זו ולהחליף עם ענבים / שמרים טרי לצלחת הנחת עובר הבאה של שעה 2 ב 25 ° C. לאסוף צלחת זו ומקום ב18 חממת מעלות צלזיוס למשך בימוי התפתחותיים נוסף. הערה: 1 שעות של פיתוח ב ° C25 שווה לשעה 2 בפיתוחב18 ° C. ההשפעה של הזדקנות על 18 מעלות צלזיוס לעומת 25 ° C ב שמירת permeabilization EPS בעוברים בשלב מאוחר ניתן לראות באיור 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Dechorionation. לשטוף בעדינות עוברים מצלחת ענבים לתוך סל רשת באמצעות 25 מים מעלות צלזיוס ברז ומכחול. יש לשטוף את השמרים עודפים מהעוברים בסל מתחת לזרם עדין של מים ברז. לטבול את הסל באקונומיקת 50% למשך 2 דקות. שטוף ביסודיות עובר תחת זרם של מים ברז. הערה: בעדינות להשפריץ פתרון אקונומיקה על העוברים לסירוגין באמצעות פיפטה פלסטיק. בעוד 2 דקות בדרך כלל מספיק עבור dechorionation מלא, זמן דגירה זה צריך להיבדק על ידי בדיקה ישירה ובהתאם. לשמור עובר Dechorionated בסל השקוע במים ברז ולפנות מייד לצעד EPS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> EPS טיפול <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן שש מנות 60 מ&quot;מ עם כ 10 מיליליטר של PBS בכל אחד. הכן את הדילול הרווח למניה על ידי המסת 75 EPS μl ב2.925 מיליליטר MBIM (1:40) בכוס זכוכית מיליליטר 50 עם מתערבל. הערה: צורות תחליב לבנים מתערובת זו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כתם מים עודפים מתחתית סל הרשת עם מעבדה לנגב. לטבול את הסל ברווח למניה מדוללת בכוס ומייד מערבולת כדי לפזר עוברים בפתרון EPS בחלק התחתון של הסל. המשך מתערבל בקשה ל30 שניות. הערה: יכולים להיות מגוונים דילולים EPS וזמני חשיפה לשלוט חדירות. מומלץ כי דילולים EPS האופטימלי וזמני טיפול שיוקמו באופן אמפירי עם הזנים של זבובים בשימוש. הגדלת זמן חשיפה ל60-90 שניות היא חיובית לבמה 12 ועוברים מבוגרים יותר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר סל, למחוק משם EPS העודף עם מעבדה לנגב. להמשיך עם שש שטיפות רציפים ב10 מיליליטר של PBS במנות 60 מ&quot;מ. השתמש פיפטה פלסטיק להשפריץ בעדינות עוברים עם PBS בכל אחד מששת שוטף. המשך לצבוע וצעדים לטיפול בסמים. הערה: יכולה להיות מסולקת למניה של את הכיור. </li></ol></li></ol>3. דיי והתרופות טיפול בעוברי permeabilized <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דיי טיפול <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 5 μl של 10 מ&quot;מ Cy5 * צבע חומצה קרבוקסילית ל1 מיליליטר של MBIM-T (50 מיקרומטר ריכוז סופי) בצינור 1.5 מיליליטר microfuge ומערבולת לערבב. הערה: * בחירה של צבע תלוי בניתוח במורד הזרם. חומצה קרבוקסילית Cy5 היא יעילה לניתוחים שלאחר מכן באמצעות קיבוע וimmunostaining. Rhodamine B הוא שימושי עבור ניתוח של עוברי חיים. הפליטה האדומה של Rhodamine B, והפליטה הירוקה של מטבוליטים שלה 1, יכולים להציג כמה סיבוכים עם יישומים במורד הזרם באמצעות הקרינה. תרופה או רעלן ניתן להוסיף לפתרון הצבע להתחיל בטיפול בשלב זה, או להגביל את הטיפול תרופתי / רעל לדופק בשלב זה. יש להקפיד לטפל ולהיפטר מתרופות ורעלים על פי MSDS ותקני בטיחות סביבתית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את העוברים מסל הרשת לפתרון לצבוע באמצעות מכחול. שווי הצינור ולהפוך שוב ושוב על מנת להבטיח אתעוברים לצוף בחופשיות בתרחיף בתמיסת הצבע. הנח צינור על כיסא נדנדה nutating 15 דקות בטמפרטורת חדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את הצינור מnutator ולתת עובר להתיישב. הסר את פתרון צבע עם טפטפת קנס ולהחליף עם 1 מיליליטר של MBIM-T כדי לשטוף. הפוך לצינור מחדש להשעות עוברים לחלוטין. בואו עוברים להתיישב וחזור עם עוד שלוש שטיפות MBIM-T. הסר את כל MBIM-T משטיפה סופית ולהמשיך לשלב דגירה. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה של התפתחות עובר <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברה עובר לאחד משני תאים: סל הפיתוח או קאמרי שקופיות. הערה: סל הפיתוח עדיף לתקופות ארוכות יותר התפתחותית, והיא נדרשת לצעדי קיבעון וimmunostaining הבאים הם להיות מוצא להורג. קאמרי השקופיות הוא אופטימלי עבור הזמן לשגות הדמיה ברזולוציה גבוהה יותר, והוא יעיל ביותר לתקופות קצרות התפתחותית (למשל, האירועים העובריים המוקדמים). תרופה או רעלן ניתן להוסיף לבינונית בריכוזים שונים וד העוברevelopment ניתן לנטר בזמן אמת עם עוברים בשידור חי או בנקודתי קצה באמצעות קיבוע סטנדרטי וimmunostaining פרוטוקולים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיתוח בסלסלות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש לנקות את סל פיתוח על ידי התזה עם 70% אתנול, לשטוף היטב במים דה מיונן וכתם יבש עם מעבדה לנגב. הכן 6 מיליליטר של מדיום דגירה עם ריכוז רצוי של תרופה או רעלן. הנח את סל הפיתוח במדיום בטיפול נטילת מנה 60 מ&quot;מ לא לבועות אוויר מלכודת מתחת לבסיס הרשת. הערה: שני כלי תקשורת נפוצות: MBIM לבד, או MBIM/M3 בתערובת 50:50, האחרון להיות יעילים יותר לתקופות פיתוח ארוכות יותר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את עוברי permeabilized לרשת פני השטח בבסיס של סל עם מכחול. בעדינות להשפריץ את העוברים עם תקשורת מהמאגר שמסביב. לפזר את העוברים עם המכחול, כך שהם בשכבה על הרשת. הערה: המשך להדמיה מיקרוסקופית ולהעריך את מאפייני permeabilization ויכולת קיום של יחסי הציבורeparation (ראה שלב 4). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיתוח בלשכת השקופיות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך תא שקופיות ולהחיל חרוז קטן של שומן ואקום על המערכת של הפתיחה. הנח 150 μl של מדיום עם כמות רצויה של תרופה או רעלן על פני השטח של קרום לעשות בתוך הפתח. הערה: שני כלי תקשורת נפוצות: MBIM לבד, או MBIM/M3 בתערובת 50:50, האחרון להיות יעילים יותר לתקופות פיתוח ארוכות יותר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את עוברי permeabilized לירידה של תקשורת עם מכחול. לפזר את העוברים שהופך אותם להתיישב על הקרום בירידה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזהירות להחיל coverslip מעגלי 25 מ&quot;מ מעל הפתח ובכך משטח את המדיום. לחץ כלפי מטה בעדינות לאורך ההיקף של coverslip כדי ליצור חותם עם הגריז. הערה: המשך כדי מיקרוסקופיה הדמיה כדי להעריך את מאפייני permeabilization וכדאיות של ההכנה (ראה שלב 4). </li></ol></li></ol></li></ol> 4. Identification של עוברי קיימא permeabilized <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לזהות עוברי permeabilized. שים לב עוברים תחת epifluorescence עם מיקרוסקופ מצויד במצלמה דיגיטלית. לרכוש תמונות (באורך הגל הכחול כדי לקבוע את autofluorescence חלמון הפרופיל) של מספר שדות באמצעות מיקרוסקופ קבוע והגדרות מצלמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקבוע permeabilization של עוברים המבוססים על עוצמת הקרינה היחסית. השתמש בסטראו עם מרחק עבודה גדול כדי להכיל את הסל ולאפשר למניפולציות של העוברים. המיקרוסקופ צריך להיות מצויד בשלב תכנות XYZ, תאורת epifluorescence ומצלמה דיגיטלית. תמונת העוברים דואגים להקליט חשיפה ופרמטרי עמדת במה של כל תמונת עובר כדי לאפשר הערכה מחדש של אותו עובר בנקודת זמן מאוחרת יותר (ראו תוצאת נציג באיור 3). הערה: דפוסי ספיגת צבע ישתנו בהתאם לצבען המשמש, משך חשיפה וגיל עובר. מגוון רחבשל ספיגת צבע על פני הכנה אחת אופיינית ומשקפת את השונות במידת permeabilization. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לזהות עוברים ובת קיימא. לאחר סימון מיקום של עוברי permeabilized, להמשיך בפיתוח עובר בטמפרטורת חדר או 25 ° C. חזור סל או תא שקופיות למיקרוסקופ. שים לב תחת הקרינה ערוץ כחולה ולרכוש תמונה של autofluorescence חלמון בזוהו בעבר עוברי permeabilized. להעריך את הכדאיות לפי התקדמות רגילה של הפצת חלמון (ראה ראנד et al. 1 ותוצאת נציג באיור 3). הערה: תכונות מורפולוגיות אחרות של העובר נצפה עם מיקרוסקופ brightfield ניתן להשתמש כדי להעריך את הכדאיות. מומלץ כי קביעת הרמה של חדירות התואמת את הכדאיות להיקבע באופן אמפירי עם כל צבע ומתח של זבוב בשימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעריך את השפעות תרופה או רעלן בעוברי קיימא permeabilized. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עוברי processed עם הפרוטוקול הנ&quot;ל עומדים על מספר הניתוחים הקונבנציונלי לאחר סמים או חשיפת רעלן. כמה סוגים השונים של ניתוחים נחשבים בדיון שלהלן וכוללים תצפית ישירה של המורפוגנזה בעוברת לחיות כמו גם immunostaining הודעה הקיבעון-מנתח. שתי גישות אלה משופרים על ידי שימוש בצבעים חיוניים (למשל, ה-GFP) החושפים דפוסי ביטוי גנים ושושלת תא ופרופילי מורפולוגיה. </li></ol>

<ol><li>Rand, M. D., Kearney, A. L., Dao, J., Clason, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Permeabilization+of+Drosophila+embryos+for+introduction+of+small+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+biochemistry+and+molecular+biology%22%5BJournal%5D)">Permeabilization of Drosophila embryos for introduction of small molecules.</a> Insect biochemistry and molecular biology. 40, 792-804 (2010).</li>
<li>Jaeger, J., Manu,, Reinitz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+blastoderm+patterning%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Genet+Dev%22%5BJournal%5D)">Drosophila blastoderm patterning.</a> Curr Opin Genet Dev. 22, 533-541 (2012).</li>
<li>Kopczynski, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high+throughput+screen+to+identify+secreted+and+transmembrane+proteins+involved+in+Drosophila+embryogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">A high throughput screen to identify secreted and transmembrane proteins involved in Drosophila embryogenesis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95, 9973-9978 (1998).</li>
<li>Bejsovec, A., Chao, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T.+crinkled+reveals+a+new+role+for+Wingless+signaling+in+Drosophila+denticle+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">T. crinkled reveals a new role for Wingless signaling in Drosophila denticle formation.</a> Development. 139, 690-698 (2012).</li>
<li>Zappe, S., Fish, M., Scott, M. P., Solgaard, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+MEMS-based+Drosophila+embryo+injection+system+for+high-throughput+RNAi+screens%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+chip%22%5BJournal%5D)">Automated MEMS-based Drosophila embryo injection system for high-throughput RNAi screens.</a> Lab on a chip. 6, 1012-1019 (2006).</li>
<li>Delubac, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+system+with+integrated+microinjector+for+automated+Drosophila+embryo+injection%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+chip%22%5BJournal%5D)">Microfluidic system with integrated microinjector for automated Drosophila embryo injection.</a> Lab on a chip. 12, 4911-4919 (2012).</li>
<li>Mahowald, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fixation+problems+for+electron+microscopy+of+Drosophila+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Drosophila+Info+Serv%22%5BJournal%5D)">Fixation problems for electron microscopy of Drosophila embryos.</a> Drosophila Info Serv. 36, 130-131 (1962).</li>
<li>Margaritis, L. H., Kafatos, F. C., Petri, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+eggshell+of+Drosophila+melanogaster.+I.+Fine+structure+of+the+layers+and+regions+of+the+wild-type+eggshell%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+cell+science%22%5BJournal%5D)">The eggshell of Drosophila melanogaster. I. Fine structure of the layers and regions of the wild-type eggshell.</a> Journal of cell science. 43, 1-35 (1980).</li>
<li>Mazur, P., Cole, K. W., Mahowald, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Critical+factors+affecting+the+permeabilization+of+Drosophila+embryos+by+alkanes%5BTitle%5D)+AND+%22Cryobiology%22%5BJournal%5D)">Critical factors affecting the permeabilization of Drosophila embryos by alkanes.</a> Cryobiology. 29, 210-239 (1992).</li>
<li>Arking, R., Parente, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+RNA+inhibitors+on+the+development+of+Drosophila+embryos+permeabilized+by+a+new+technique%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+experimental+zoology%22%5BJournal%5D)">Effects of RNA inhibitors on the development of Drosophila embryos permeabilized by a new technique.</a> The Journal of experimental zoology. 212, 183-194 (1980).</li>
<li>Li, J. S., Li, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Major+chorion+proteins+and+their+crosslinking+during+chorion+hardening+in+Aedes+aegypti+mosquitoes%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+biochemistry+and+molecular+biology%22%5BJournal%5D)">Major chorion proteins and their crosslinking during chorion hardening in Aedes aegypti mosquitoes.</a> Insect biochemistry and molecular biology. 36, 954-964 (2006).</li>
<li>Strecker, T. R., McGhee, S., Shih, S., Ham, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Permeabilization+staining+and+culture+of+living+Drosophila+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Biotech+Histochem%22%5BJournal%5D)">Permeabilization staining and culture of living Drosophila embryos.</a> Biotech Histochem. 69, 25-30 (1994).</li>
<li>Kiehart, D. P., Montague, R. A., Rickoll, W. L., Foard, D., Thomas, G. H. High-resolution microscopic methods for the analysis of cellular movements in Drosophila embryos. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKiehart%2C+DP+%22Methods+in+Cell+Biology.+Drosophila+melanogaster%3A+Practical+uses+in+cell+and+molecular+biology%22">Methods in Cell Biology. Drosophila melanogaster: Practical uses in cell and molecular biology</a>. 44, Academic Press. San Diego. 518 (1994).</li>
<li>Patel, N. Drosophila melanogaster: Practical uses in cell and molecular biology. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPatel%2C+N+%22Methods+in+Cell+Biology%22">Methods in Cell Biology</a>. 44, Academic Press. 445-487 (1994).</li>
<li>Engel, G. L., Delwig, A., Rand, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effects+of+methylmercury+on+Notch+signaling+during+embryonic+neural+development+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicol+In+Vitro%22%5BJournal%5D)">The effects of methylmercury on Notch signaling during embryonic neural development in Drosophila melanogaster.</a> Toxicol In Vitro. 26, 485-492 (2012).</li>
<li>Limbourg, B., Zalokar, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Permeabilization+of+Drosophila+eggs%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+biology%22%5BJournal%5D)">Permeabilization of Drosophila eggs.</a> Developmental biology. 35, 382-387 (1973).</li>
<li>Schulman, V. K., Folker, E. S., Baylies, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+reversible+drug+delivery+to+internal+tissues+of+Drosophila+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Fly+%28Austin%29%22%5BJournal%5D)">A method for reversible drug delivery to internal tissues of Drosophila embryos.</a> Fly (Austin). 7, (2013).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

השיטה הנ&quot;ל מתארת ​​אמצעי להשגת עוברי דרוזופילה קיימא, כי הם נגישים לטיפולי מולקולה קטנים על פני מגוון רחב התפתחותית. שיטה זו מציגה את הרומן וממצא פשוט שהזדקנות עוברים על 18 מעלות צלזיוס מאפשר permeabilization של עוברים בשלב מאוחר באותה היעילות כפי שניתן לראות בעבר רק בעוברים בשלב מוקדם. בנוסף, שימוש בחומצה מרחיק האדומה צבע Cy5 קרבוקסיליות כאינדיקטור חדירות הוכחה כיעילה ביישומים שלאחר תיקון, ואינו מתערב בסמני ניאון אדומים וירוקים קונבנציונליים שניתן להשתמש בם כדי לחשו...

עובר דרוזופילה ממשיך להיות מודל המוביל לחקירה של מנגנונים בסיסיים של פיתוח 2. מודל רב עוצמה זו נתמך על ידי מערך רחב של כלים גנטיים מולקולריים המאפשרים מניפולציות של מהות כל גן בכל נקודת זמן ובמסגרת כל איבר מתפתח. הגודל הקטן, התפתחות מהירה, ואפיון המקיף של המורפוגנזה של עובר דרוזופילה להפוך אותו למודל של בחירה עבור מסכי גנטיים, שרבים מהם נחשפו מסלולים התפתחותיים בסיסיים 3,4. פנוטיפים רבים בעובר דרוזופילה אופיינו ולפרש בקלות, לעתים קרובות מתן אמצעים לזיהוי מנגנונים גנטיים מולקולריים שבבסיס אחראי לתכונה חריגה. מבחינה היסטורית, חסרון של מודל עובר הזבוב היה הקושי בהחדרת מולקולות קטנות לרקמות עובריים. מכשול זה מציב מגבלות על: 1)ing מולקולות קטנות ביו ידועות כמו בדיקות לחקור את מנגנוני התפתחות ו2) שימוש במודל שהוקם זה כדי להעריך פעילות טרטוגניות או תרופתי של מולקולות קטנות uncharacterized. כתוצאה מכך, פוטנציאל ההקרנה של עובר הזבוב כבר לא מנוצל באפיון של פעילות מולקולה קטנה. משלוח של מולקולות קטנות לעובר הזבוב יכול להיות מושגת בשתי שיטות: 1) permeabilization של קליפת הביצה ו2) microinjection. מאמר זה מציג התקדמות לשיטה של permeabilization, כי הם קלים לביצוע בהגדרה של מעבדה דרוזופילה קונבנציונלית. יצוין, כי ההתקדמות בשיטות microinjection עם טכנולוגית מיקרופלואידיקה תורמת גם היא לשיטות של החדרת תרכובות ל5,6 העובר. היכרות עם מולקולות לעובר הוא למנוע על ידי שכבת שעווה של קליפת הביצה 7. קליפת הביצה דרוזופילה מורכבת מחמש שכבות. מןמבפנים החוצה הם: קרום vitelline, שכבת השעווה, שכבת כוריוני הפנימית, endochorion וexochorion 8. שלוש שכבות כוריוני חיצוניות ניתן להסיר על ידי emersion הקצר של העובר באקונומיקה מהולה, צעד המכונה dechorionation. שכבת השעווה נחשפה אז יכולה להיות בסכנה כתוצאה מחשיפה לממסים אורגניים, כגון heptane ויוקטן 7,9, טיוח את עובר dechorionated חדיר, בזמן שהוא נשאר עטוף בקרום vitelline הבסיסי. עם זאת, שימוש בממסים אלה מציג סיבוכים בשל רעילותם ואת הקושי בויסות פעולתם החזקה permeabilizing, אשר שניהם יש השפעות שליליות מוחלטת על 9,10 כדאיות עובר. שיטה של permeabilization באמצעות permeabilization עובר הרכב כינה ממס (EPS) כבר תיארתי בעבר 1. ממס זה מורכב מחומרים פעילי שטח D-limonene וצמחי המאפשרים הממס להיות misciblE עם מאגרים מימיים. הרעילות הנמוכה של d-limonene והיכולת לדלל את הממס לריכוזים רצויים הניבה שיטה יעילה ליצירת עוברים חדירים עם כדאיות גבוהה 1. עם זאת, שני גורמים אנדוגני המשיכו להביא מגבלות ליישום. ראשית, עוברים להפגין את ההטרוגניות בחדירות לאחר טיפול EPS, גם כאשר הטיפול נלקח כדי לשמור על היערכות התפתחותיים קרובה. שנית, עוברים מבוגרים יותר משמונה שעות כ הוכיחו קשה permeabilize, עולה בקנה אחד עם התקשות של קליפת הביצה שמתרחשת לאחר הטלת הביצים 11. שתואר כאן הן התקדמות בשיטת EPS כי: 1) לסייע בזיהוי וניתוח עוברי permeabilized כמעט זהה, גם לאחר צעדי הקיבעון וimmunostaining הוצאו להורג ו2) לאפשר permeabilization של עוברים בנקודות זמן התפתחותיים מאוחרות (&gt; 8 שעות, שלב 12 ומעלה). באופן ספציפי, יישום של צבע מרחיק אדום,חומצה קרבוקסילית Cy5, מתוארת המשמשת כמחוון חדירות, שנמשך בעובר במהלך התפתחות ולאחר קיבוע פורמלדהיד. בנוסף, הוא הראה כי גידול עובר ב18 ° C שומר על קליפת הביצה במצב רגיש EPS, המאפשר permeabilization של עוברים בשלב מאוחר (שלבי 12-16). מקדמות אלה להתגבר על המגבלות שהוזכרו קודם לכן למתודולוגיה EPS. יישום זה ולכן יספק לחוקרי אמצעי להציג את המולקולות קטנות של עניין לעובר בנקודות זמן התפתחותיים שונים, תוך שמירה על כדאיות.

<table><tbody><tr><td>כלוב זבוב</td><td>Flystuff.com</td><td>59-101</td><td>http://flystuff.com/general.php</td></tr><tr><td>קוקמיד DEA [נינול 11-ס"מ]&nbsp;</td><td>Stepan Chemical</td><td>קוראת להזמנה מיוחדת</td><td>http://www.stepan.com/</td></tr> <tr><td>אלכוהול אתוקסילט [Bio-soft 1-7]&nbsp;</td><td>Stepan Chemical</td><td>קוראת להזמנה מיוחדת</td><td>http://www.stepan.com/</td></tr> <tr><td>d-לימונן (דרגת טוהר גבוהה במיוחד)</td><td>Florida Chemical Co.&nbsp;</td><td>קול קורא להזמנה מיוחדת</td><td>http://www.floridachemical.com/</td></tr> <tr><td>נתרן היפוכלוריט&nbsp;</td><td>פישר</td><td>SS290-4</td><td>http://www.fishersci.com/</td></tr> <tr><td>Tween-20&nbsp;</td><td>פישר</td><td>BP337</td><td>http://www.fishersci.com/</td></tr> <tr><td>PBS אבקת</td><td>סיגמא</td><td>56064C</td><td>http://www.sigmaaldrich.com/</td></tr> <tr><td>רודמין B</td><td>סיגמא</td><td>R6626</td><td>http://www.sigmaaldrich.com/</td></tr> <tr><td>CY5 חומצה קרבוקסילית</td><td>Lumiprobe</td><td>#23090</td><td>http://www.lumiprobe.com/p/cy5-carboxylic-acid</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>סיגמא</td><td>472310-100</td><td>http://www.sigmaaldrich.com/</td></tr> <tr><td>מגנים וסאנג M3 בינוני</td><td>סיגמא</td><td>S8398</td><td>http://www.sigmaaldrich.com/</td></tr> <tr><td>רשת ניילון Nitex&nbsp;</td><td>Flystuff.com</td><td>57-102</td><td></td></tr><tr><td>http://flystuff.com/misc.php ממברנת חמצן מומס (DO)&nbsp;</td><td>YSI</td><td>#5793</td><td>http://www.ysireagents.com/search.php</td></tr><tr><td>25 מ"מ עגול מס' 1 תלוש כיסוי מס' 1&nbsp;</td><td>VWR</td><td>48380-080</td><td>https://us.vwr.com/</td></tr> <tr><td>תערובת צלחות ענבים-אגר&nbsp;</td><td>Flystuff.com</td><td>47-102</td><td>http://flystuff.com/media.php</td></tr><tr><td>Nutator</td><td>VWR</td><td>82007-202</td><td>https://us.vwr.com/</td></tr></tbody></table>

שיטה של ​​permeabilization של<em&gt; דרוזופילה</em&gt; עוברים למבחנים של מולקולה קטנה פעילות

A Method of Permeabilization of Drosophila Embryos for Assays of Small Molecule Activity

עובר דרוזופילה כבר זמן רב מודל מעבדה רב עוצמה להבהרת מנגנונים מולקולריים וגנטיים המפקחים על פיתוח. הקלות של מניפולציות גנטיות עם המודל הזה החליפו גישות תרופתי כי הם דבר שבשגרה במודלים של בעלי חיים אחרים ומבחנים מבוססי תאים. כאן אנו מתארים ההתקדמות בפרוטוקול המאפשר יישום של מולקולות קטנות לעובר זבוב הפירות הפיתוח. השיטה מפרטת צעדים כדי להתגבר על האטימות של קליפת הביצה, תוך שמירה על כדאיות עובר. permeabilization קליפת הביצה על פני מגוון רחב של שלבי התפתחות מושגת על ידי יישום של permeabilization שתואר קודם לכן d-limonene עובר ממס (EPS 1) ועל ידי עוברי הזדקנות בטמפרטורה נמוכה (18 ° C) לפני טיפולים. בנוסף, שימוש בצבע מרחיק אדום (Cy5) כאינדיקטור permeabilization מתואר, אשר תואם עם יישומים במורד הזרם מעורבים שפעת אדומה וירוקה סטנדרטיתצבעי orescent בהכנות בשידור חי וקבועות. פרוטוקול זה הוא ישים למחקרים באמצעות תרכובות ביו לחקור מנגנוני התפתחות, כמו גם למחקרים שמטרתם להעריך את הפעילות טרטוגניות או תרופתי של מולקולות קטנות uncharacterized.

<html> מכשירי טיפול בעובר הם בתמונה באיור 1 על מנת לסייע בלדמיין את המכשירים &quot;תוצרת הבית&quot; למניפולציה בפרוטוקולים לעיל. תוצאות ניתן לראות באיור 2 ממחישות את ההשפעה החזקה של גידול עובר ב18 מעלות צלזיוס ביכולת שלהם להיות permeabilized ידי EPS בשלבים מאוחרים של התפתחות. מצב זה מיושם בשלב הפרוטוקול 2.1. יעילות של צבע החומצה קרבוקסילית Cy5 כדי לחשוף את הרמות השונות של חדירות לראות בדרך כלל בEPS עוברי מטופלים לראות באיור 3. הדינ...

מבוא של מולקולות קטנות לעובר דרוזופילה הפיתוח מציע פוטנציאל גדול לאפיון פעילות ביולוגית של תרכובות רומן, סמים ורעלים כמו גם לחיטוט מסלולים התפתחותיים בסיסיים. שיטות שתוארו במסמך זה מתארים את שלבים שלהתגבר על מחסומים טבעיים לגישה זו, המרחיב את התועלת של מודל עובר דרוזופילה.

The Drosophila embryo has long been a powerful laboratory model for elucidating molecular and genetic mechanisms that control development. The ease of ...

המטרה הכללית של הניסוי הבא היא להכין עוברים חיים של drosophila בעלי קליפת ביצה חדירה, כדי לבחון את הפעילות הביולוגית של תרופות מולקולות קטנות או רעלים המוחדרים אליהם. דבר זה מושג תחילה על ידי טיפול בעוברים בשלבי התפתחות עם תמיסת אקונומיקה מהולה להסרת השכבות החיצוניות של קליפת הביצה (הכוריון). השלב השני הוא החדרת ממס לעוברים, הממיס את שכבת השעווה הדקה של קליפת הביצה החוסמת מומסים של מולקולות קטנות.השלב השלישי הוא טיפול בעוברים באמצעות תרופה או רעלן וצבע, כדי להעריך בו-זמנית את חדירות קליפת הביצה ולהחדיר תרכובת רצויה. לאחר התפתחות נוספת, ניתן לדגום את העוברים באמצעות דימוי ישיר או לעבדם עבור אימונוהיסטוכימיה. בסופו של דבר, התוצאות יכולות להראות את השפעת התרופה או הרעלן על התפתחות הרקמות, כפי שנקבע באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית עם ריאגנטים אימונולוגיים או צבעים חיוניים.היום אציג את השיטה שלנו לחדירה של עוברים של drosophila לצורך בדיקות של פעילות מולקולות קטנות. היתרונות המרכזיים של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון שימוש בממסים אורגניים קונבנציונליים כמו heptane כדי להחדיר למעטפת הביצה, הם שממס החדירה לעוברים שלנו, או EPS, ניתן לערבב במים והוא אינו רעיל יחסית.תכונות אלו מקלות על טיפולים בעובריים שבהם ניתן לשלוט באופן מדויק יותר בחשיפה לממסים, וניתן לבצעם במדומים רלוונטיים מבחינה

a-method-permeabilization-drosophila-embryos-for-assays-small

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

אנו מתארים פרוטוקול יעיל להפקת "פילה" ההכנות של עוברים תסיסנית של גנוטיפים מסוימים. פרוטוקול זה מאפשר ביצוע יעיל של מגוון רחב של מסכי גנטית. זה גם מאפשר הדמיה מצוינת של מבנים בעובר מאוחר.

Dissection חיים של תסיסנית עוברים: שיטות יעיל עבור הקרנת אוספים Mutant ידי מכתים נוגדן

כאן אנו מתארים שלם הר...

הר כולו RNA פלורסנט<em&gt; באתר</em&gt; הכלאה של<em&gt; דרוזופילה</em&gt; עוברים

האפידרמיס העוברי של עוברי דרוזופילה שלב מאוחר מאוד מספק מערכת vivo בתגובה לניתוח פצע מהיר ויכול להיות משולב עם מניפולציות גנטיות או טיפולי microinjection כימיים לקידום מחקרים בריפוי פצעים לתרגום למודלים של יונקים.

Assay וMicroinjection פצע<em&gt; בvivo</em&gt; לוקליזציה של עוריות פצע הכתבים תגובה ב<em&gt; דרוזופילה</em&gt; עוברים.

מטרת פרוטוקול זה היא לספק גישה פשוטה וזולה לאיסוף עוברים תסיסנית בקנה מידה בינוני (0.5-1 גרם) והכנת תמציות חלבון שניתן להשתמש ביישומים proteomic במורד הזרם, כגון זיקה טיהור ספקטרומטריית מסה (AP-MS ).

הכנה בינונית של<em&gt; תסיסנית</em&gt; עוברי תמציות עבור ניסויים פרוטאומיים

פרוטוקול זה נועד להעריך את הכדאיות של דרוסופילה בכל שלב התפתחותי, מעובר למבוגר. ניתן להשתמש בשיטה כדי לקבוע ולהשוות בין הכדאיות של גנוסוגים שונים או תנאי גדילה.

שיטה ישירה ופשוטה להערכת דרוזופילה מלאנוגסטרהכדאיות מעובר למבוגר

שלמות מכשול הדם במוח. היא קריטית לתפקוד מערכת העצבים בדרוזופילה מלאנוסטר, מכשול המוח בדם נוצר על ידי תאי גלאל במהלך הembryogenesis המאוחרות. פרוטוקול זה מתאר שיטות לטיפול בתפקוד ותחזוקה של מחסומי מוח בדם בד. מלאנוגסטר עוברים והזחלים השלישי.

שיטת שלמות המוח בדם בדרוזופילה מלאנוסטר

מוצג כאן פרוטוקול microinject ובו זמנית תמונה עוברי Drosophila מרובים במהלך התפתחות עוברית באמצעות צלחת מבוססת, דימוי תוכן גבוה.

הכנת עובר Drosophila ומיקרו-היתוך למיקרוסקופיה של תאים חיים שבוצעו באמצעות מנתח תוכן גבוה אוטומטי

בעובר דרוזופילה המוקדם, אברונים רבים הם תנועתיים. באופן עקרוני, ניתן לדמות אותם בשידור חי באמצעות בדיקות פלואורסצנטיות ספציפיות, אך קליפת הביצית מונעת יישום ישיר על העובר. פרוטוקול זה מתאר כיצד להציג בדיקות כאלה באמצעות מיקרו-איניג'קציה, ולאחר מכן לנתח תנועת אברונים בתפזורת באמצעות ולוסימטריה של תמונת חלקיקים.

הדמיה של סחר תלוי-שלד ציטוסקלטון של אברונים המכילים שומנים בעוברי דרוזופילה

כאן מוצג פרוטוקול ליישום מיקרוסקופ הרחבה בעוברי דרוזופילה מוקדמים להשגת הדמיה ברזולוציית על באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי קונפוקלי קונבנציונלי לסריקת לייזר.

שימוש במיקרוסקופ הרחבה להגדלה פיזית של עוברי דרוזופילה שלמים לצורך הדמיה ברזולוציית על

פרוטוקולים אלו מתארים כיצד לאפיין את הארגון ותפקוד החסימה של צמתקי מחיצה מקופלים באפיתל העוברי של דרוזופילה.

ניסויי צביעת חיסון וחדירת צבע להגדרת חלבוני צומת ספטט מקופלים בליבה באפיתל עוברי של דרוזופילה

למדו שיטת permeabilization לעוברי Drosophila לבדיקת פעילות מולקולות קטנות. השיטה מסירה שכבות קליפת הביצה החיצוניות באמצעות חומרי ממס ומאפשרת הוספת תרופות או רעלנים לחקר השפעותיהם על התפתחות העוברים.

שיטה של ​​permeabilization של

גלה סרטונים נוספים

שיטה של permeabilization של