Ex vivo מערכת תרבות ללמוד התפתחות בלוטת התריס

המטרה הכוללת של הליך זה היא לנתח תרבית ex vivo, עכבר, שתלים עובריים של בלוטת התריס או אונות כדי לאפשר חקר אירועים מורפוגנטיים והתמיינות המתרחשים במהלך התפתחות בלוטת התריס. זה מושג על ידי הסרת הלסת העליונה והחלק התחתון של הגוף ביום העוברי. E 12.5 עד E 14.5 עוברי עכבר לבידוד אזור הצוואר של העוברים.

בשלב השני מסירים את הצינור העצבי, הרקמות הצדדיות והלשון כדי לחשוף את החלק העליון של קנה הנשימה והוושט. לאחר מכן, ניצן בלוטת התריס, האזורים או האונות מנוקים עוד יותר מכל רקמות לא רצויות. בשלב האחרון, שתלי בלוטת התריס מצופים לתרבית על מיקרובאר מצופה או על פילטר.

בסופו של דבר, ניתן לבצע הדמיית זמן, צביעת חיסון או ניתוח ביטוי גנים כדי לחקור את הארגון התלת מימדי והזקיקים של האפיתל, כלי הדם של השתלים או התמיינות אב בלוטת התריס. שיטה זו יכולה לעזור לענות על התפתחות ובידול מרכזיים. שאלה לגבי ארגון תאי אפיתל בלוטת התריס בתלת מימד, היווצרות לומן, התמיינות תאים, קיטוב וגדילה.

ידגימו את ההליך פידל מרסל, סטודנט לתואר שני, ומיילה לה-קורטה, פוסט-דוקטורנטית שניהם מהמעבדה שלי במצב סטרילי במכסה הזרימה הלמינרית. שעתיים לפני בידוד רקמת בלוטת התריס יש לדלל קולגן סטרילי מסוג 1 ל-50 מיקרוגרם למיליליטר. ריכוז סופי במימן כלורי של 10 מילי-מולרי, ומניחים את הקולגן על קרח.

לאחר מכן מכסים כל אחת מהבארות של תא תרבית פלסטיק ב -200 מיקרוליטר של הקולגן המדולל ודוגרים את החדר בטמפרטורת החדר לאחר שעתיים, שאפו את הקולגן. שוטפים את הבארות במדיה M1 99 ומוסיפים לכל אחת נפח מינימלי של 200 מיקרוליטר מדיום תרבית. ובכן, הניחו את התאים המצופים בחממה ואז המשיכו בדיסקציה של בלוטת התריס.

ראשית, הנח את הרחם המנותח בצלחת של 10 סנטימטר המכילה HBSS. לאחר מכן, השתמש במלקחיים כדי להחזיק גפה אחת של הרחם ולאחר מכן פתח את הרחם במספריים קטנים כדי לשחרר כל אחד מהעוברים ברצף. השתמש במספריים כדי להפריד את העוברים מהשליה, ולאחר מכן העביר את העוברים בתוך הממברנות העובריות הנוספות שלהם לצלחת חדשה של 10 סנטימטרים המכילה HBSS טרי.

לאחר מכן, המשך את הדיסקציה תחת מיקרוסקופ סטריאו לכל עובר. ראשית, הסר את שק החלמון ואת מי השפיר. ואז להחזיק מחטי טונגסטן בנימי זכוכית כסכין ומזלג.

הסר את החלק העליון של הראש, כולל הלסת העליונה והאוזניים. החזק את העובר על גבו. לאחר מכן הסר חתיכה נוספת של הצינור העצבי ולאחר מכן הסר את החלק התחתון של העובר ממש מתחת לגפיים הקדמיות ומעל הלב.

כדי לכוון את הרקמה, העבירו את פרוסת העובר המכילה את אזור הצוואר של הלשון לתוך צלחת חדשה של 10 סנטימטרים המכילה HBSS טרי והסירו את הצינור העצבי והרקמות האחוריות לוושט ולקנה הנשימה. כעת חתכו בעדינות את פרוסת הרקמה משני צידי הלשון. לאחר מכן אתר את הוושט וקנה הנשימה, נתח את הלשון, והשאיר את נפיחות הרטינואיד ואת הרקמה משני צידי הוושט וקנה הנשימה.

לאחר הסרת הלשון, נתחו את הוושט והניחו את צד הגחון של קנה הנשימה כלפי מעלה. לאחר מכן נתח את הרקמות הלא רצויות כגון התימוס וכל הרקמות הממוקמות לרוחב עורקי קשת הלוע. לאחר מכן עבור עוברי E 13.5 או E 14.5, דמיין את אונות בלוטת התריס בכל צד של קנה הנשימה ונתח עוד יותר את האונות מקנה הנשימה.

עבור עוברים E 12.5, ניתן לבצע את הדיסקציה כפי שהודגם זה עתה עד לאחר כריתת הלשון והוושט. לאחר מכן לאחר איתור עורקי קשת הלוע, הסר את כל הרקמות הצדדיות כמו עבור עוברים E 13.5 עד 14.5. לבסוף, בעזרת קצה מסנן רטוב מראש על מיקרו פיפטה P 200, העבירו את הרקמה המבודדת לתוך צלחת תרבית של 35 מילימטר המכילה מדיום תרבית טרום חם.

לפני ציפוי E 13.5 עד E 14.5 בלוטת התריס X. ראשית, שטפו את הרקמה על ידי העברה רצופה לשלוש בארות של צלחת 24 בארות המכילה מיליליטר אחד של מדיום תרבית חם מראש כדי לצלחת האונות על התאים המצופים מראש. ראשית, שאפו את מדיום התרבות והשתמשו במיקרו פיפטה עם קצות מסוננים כדי לצלחת בזהירות אונת בלוטת התריס אחת לכל אחד מתאי התרבות.

הסר את כל המדיום העודף ולאחר מכן הנח את תא התרבות לתוך חממת תרבית רקמות כדי לאפשר לצמחים להיצמד למטריצה. לאחר מכן, לאחר שעתיים, הוסיפו בעדינות 200 עד 300 מיקרוליטר של מדיום תרבית חם מראש לכל באר והניחו את התאים בחזרה לאינקובטור כדי לצלחת את אזור קנה הנשימה E 12.5 או אונות בלוטת התריס על מסננים נקבוביים למחצה. ראשית, מלאו את הבארות של צלחת 24 בארות במאה ו -30 מיקרוליטר של תרבית טרום חמה.

בינוני מניחים פילטרים על המדיום. הקפידו להימנע מלכידת בועות אוויר מתחת למסנן התרבות. לאחר מכן השתמש במיקרו פיפטה עם קצות מסוננים כדי להעביר בזהירות את האקספלן או האונות של בלוטת התריס, ונפח מינימלי של מדיום על מרכז כל אחד מהמסננים למקסימום של ארבעה x explan לכל מסנן.

כאשר מניחים את ה-X על המסנן, חשוב להעביר אותם למרכז המסנן עם כמות מינימלית של מדיום כדי למנוע מגע של מדיום וליצור מניסקוס עם דופן המסנן. לבסוף, הסר את כל המדיום העודף והשתמש במחט טונגסטן כדי לרווח אותם. לאחר מכן הניחו אותם באינקובטור תרבית הרקמה למשך עד שבעה ימים, החליפו את מדיום התרבית כל יומיים מתחת למכסה הזרימה הלמינרית.

לאחר יום אחד בתרבית על מסנן, קו האמצע בלה נראה כרקמה מוארכת המשתרעת לאורך העליון ויוצרת שתי אונות בכל צד של קנה הנשימה. עם תרבית, האונות מתרחבות ועוברות ארגון מורפוגנזה של תאי האפיתל למבנים זקיקים הנראים לעין מקרוסקופית. כפי שמודגם בתמונות אלה, ניתן לדמיין את הארגון והקיטוב של תאי האפיתל הקוהרנטיים והחיוביים על ידי תיוג חיסוני של אזרין.

עם הזמן, המבנים התוך-תאיים החיוביים של האזרין התמזגו עם קוטב התא שיהפוך לקוטב האפיקלי. במהלך תהליך זה, תאי אנדותל חיוביים ל-4 PCAM מתרבים ומתארגנים סביב הזקיקים המתפתחים ליצירת יחידות זקיקים אנגיו. כדי לכמת את ההתמיינות של תאי ה-thro, cytes ו-C, ניתן לאמוד את ביטוי הגנים על ידי R-T-Q-P-C-R של RNA, המבודד מאונות בלוטת התריס המתורבתות.

בעוד שהביטוי של גורם השעתוק של בלוטת התריס, NK X 2.1 אינו משתנה במהלך התרבית, הביטוי של התירוגלובולין הספציפי שלך ושל הקלציטונין הספציפי לתאי C גדל באופן דרמטי ומצביע על התמיינות תפקודית. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להיות בעל הבנה טובה כיצד לנתח ולתרבית אקספלור של בלוטת התריס. אינך מוכן לבצע ניסוי רווח ואובדן תפקוד באמצעות עוברים מסוג בר או NOCO.