ניתוח מקיף של תמלול Dynamics מדוגמאות המוח בעקבות ניסיון התנהגות

המטרה הכללית של הניסוי הבא היא לחקור דינמיקה של שעתוק וגרעיני מוח מוגדרים של עכברים בעקבות התנסות התנהגותית. דבר זה מושג תחילה על ידי הרגלת בעלי החיים והקלטת הפעילות הלוקומטורית שלהם לאחר הזרקת סליין. לאחר ההרגלה, נרשמת הפעילות הלוקומטורית לאחר מנה בודדת של קוקאין, ולאחר מכן נאספים דגימות מה-nucleus accumbens המשמשות לבידוד RNA ולהכנת CDNA.

בשלב הבא, מבוצע ניתוח QPCR כדי לחקור ביטוי גנים המושרה על ידי התנהגות. בסופו של דבר, מתקבלים תוצאות המראות דינמיקה של שעתוק בעקבות חשיפה לקוקאין. את הפרוטוקול ידגימו ד"ר Hatu, מנהל המעבדה, Dum Muer, סטודנט לתארים מתקדמים מהמעבדה, ו-Duran, סטודנט לתואר ראשון מהמעבדה. במשך שלושה ימים רצופים, כל עכבר עובר הרגלה לנהלי הטיפול וההזרקה; העכברים מאורגנים בכלובים לפני תחילת הניסוי, כך שהעכברים לא יועברו בין כלובים בעתיד ולא יישארו בבידוד למשך תקופה ממושכת.

30 דקות לפני תחילת הבדיקה, יש להעביר את כל כלובי הניסוי לחדר ההתנהגות כדי לאפשר לבעלי החיים להתרגל לסביבה. לאחר מתן זריקה תוך-פריטוניאלית של 250 µL סליין, יש להניח את העכבר בתא התנהגות כדי לנטר את הפעילות המוטורית למשך 15 דקות. ניתן להניח את העכבר בתא ההתנהגות למשך 20 דקות.

פעילות שננטרה מהדקה השנייה עד הדקה ה-17. חזור על שלבים אלה באותה שעה של היום במהלך שני הימים הבאים. ביום הרביעי,ןתן הזרקה בודדת של cocaine או saline, בהתאם לקבוצה, והנח מיד את העכבר בתא כדי לנטר פעילות מוטורית מקומית למשך 20 דקות בנקודות זמן נבחרות לאחר החשיפה ל-cocaine, הוצא את המוח והנח אותו בתוך תמיסת A CSF קרה מאוד (בקרח) למשך דקה אחת עד שתי דקות לקירור והקשחה.

לאחר הסרת המוзжеולת וספיגת עודפי נוזלים, הדביקו את המוח למסבך של מכשיר ה-vibram כאשר החלק הרוסטרלי פונה כלפי מעלה. מלאו את התא ב-A CSF קר מאוד ובצעו חיתוכים של 200 micron עד לזיהוי ברור של ה-nucleus accumbens. במהלך החיתוך, שימו לב היטב לצורת ה-corpus callosum, למיקום ולצורה של ה-anterior commissure ולחדרים.

לאחר זיהוי האזור הנכון, חתכו שני נתחים בעובי 400 microns מהם יבודד ה-nucleus accumbens תחת סטריאוסקופ. השתמשו בלהב דק כדי להפריד את ה-nucleus accumbens מהנתחים. ארבעה מעברים מהירים של הלהב באזור הנכון אמורים לבודד את הרקמה המתאימה באופן מיידי.

העבירו את הרקמה המבודדת ל-900 µL של ריאגנט ליזיס, ואחסנו בטמפרטורה של 80°C- עד לביצוע הפקת ה-RNA. כדי להתחיל, הפשירו את המבחנות בטמפרטורה של 37°C ובצעו הומוגניזציה. בעת שימוש במחט בכיול 25 gauge, ייתכן שהסבבים הראשונים יהיו קשים וידרשו דחיסה של הרקמה כנגד דופן המבחנה כדי להומוגניז אותה לחתיכות קטנות. כדי להבטיח הומוגניזציה תקינה, העבירו את הליזאט בעזרת פיפט לתוך עמודת Kaya Shredder Mini Spin ובצעו סנטריפוגה.

העבירו בעזרת פיפט את הליזאט למבחנת מיקרו-צנטריפוגה חדשה ובצעו מיצוי של ה-RNA בהתאם להוראות היצרן. לאחר טיהור ה-RNA, תבוצע תעתוק הפוך ל-CDNA וכן הגברה מקדימה (preamplification) ספציפית למטרה של הדגימות באמצעות פריימרים המכוונים לקבוצת הגנים שנבחרה לניתוח. הליכים אלו מתוארים בגרסת הטקסט של הפרוטוקול.

שבבים מיקרופלואידיים מסחריים לניתוח QPCR מקיף זמינים בפורמט של 48 על 48, המאפשר ניתוח של 48 דגימות עם 48 סטים של גששים, או בפורמט של 96 על 96 שבו מנותחות 96 דגימות עם 96 גששים. ברוב המקרים, בחירת השבב תלויה בראש ובראשונה במספר הדגימות המנותחות.

ראשית, הכינו את תערובת הדגימה בהתאם לשבב שנבחר עבור הניסוי. יש לנהוג בזהירות בעת פיפוט של ריאגנט טעינת הדגימה 20 XDNA binding dye. ערבבו את תמיסות תערובת הדגימה למשך 20 שניות לפחות וסובבו בצנטריפוגה למשך 30 שניות לפחות.

ניתן לאחסן תגובות מוכנות למשך פרקי זמן קצרים בטמפרטורה של 4 °C עד שהשבב יהיה מוכן לטעינה. לאחר מכן, הכינו את תערובת הבדיקה, ערבבו את תערובת הדגימה ביסודיות וסובבו בצנטריפוגה כדי להשקיע את כל הרכיבים. כפי שהודגם קודם לכן, לשבב ה-IFC של המערך הדינמי יש פתחי כניסה לדגימות ולבדיקות, וכן פתחי כניסה ייעודיים לנוזל קו הבקרה המשמש להגברת הלחץ בתאי המיקרופלואידיקה.

ראשית, הזרק נוזל קו בקרה לכל צבירה (accumulator) על השבב. לאחר מכן, בצע הילוכים (priming) לשבב על ידי הנחתו בבקר ה-IFC והרצת הסקריפט המתאים. עם סיום הסקריפט, הוצא את השבב שעבר הילוכים מבקר ה-IFC וטפטף באמצעות פיפטה 5 µL מכל בדיקה.

ערבבו על השבב. הוסיפו חמישה µL מכל תערובת דגימה לכניסותיהן והחזירו את השבב לבקר ה-IFC באמצעות תוכנת בקר ה-IFC. הפעילו את הסקריפט כדי להטעין את הדגימות והבדיקות אל השבב.

בסיום הרצת סקריפט טעינת התערובת, הוציאו את השבב הטעון מבקר ה-IFC. לאחר מכן, טענו את השבב למחזור התרמי (thermal cycler) והגדירו הרצה חדשה לשבב הכוללת ניתוח עקומת התכה. באמצעות תוכנת המחזור התרמי, ודאו שתאי התגובה מזוהים כראוי והניחו לתגובה להסתיים.

עלייה בפעילות לוקומטורית הייתה ניכרת לאחר הזרקה חדה בודדת של קוקאין. בחתך קורונלי זה, קווים לבנים עבים סימנו את מיקומי החיתוכים שבוצעו להגדרת הגבולות של ה-nucleus accumbens. במהלך הניתוח, עקומות ההגברה של פריימרים המכוונים ל-CFOs ול-phos B מדגימות שזוגות הפריימרים מגבירים את התמליל המטרה ביעילות של כ-100%.

בכל מחזור, התוצאות מראות כי ביטוי CFOs ו-phos B בגרעין האקומבנס (nucleus accumbens) שהשרה הקוקאין היה הגבוה ביותר שעה ושעתיים לאחר החשיפה. בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כגון ריצוף דור הבא (next generation sequencing) במטרה לזהות תסניחים (transcripts) חדשים שטרם אופיינו.