ניתוח מקיף של תמלול Dynamics מדוגמאות המוח בעקבות ניסיון התנהגות
August 26th, 2014
כתב יד זה מתאר פרוטוקול המיישם פרופיל מקיף לניתוח תוכניות שעתוק המושרות בגרעיני מוח ספציפיים של מכרסמים בעקבות פרדיגמות התנהגותיות. כאן, גישה זו מודגמת בהקשר של פרופיל גנים המושרים בגרעין האקומבנס (NAc) של עכברים לאחר חשיפה חריפה לקוקאין, תוך שימוש במערכי qPCR מיקרופלואידיים.
המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא לחקור דינמיקת שעתוק וגרעיני מוח מוגדרים של עכברים בעקבות התנסות התנהגותית. זה מושג על ידי הרגלת בעלי החיים תחילה ורישום הפעילות התנועתית שלהם לאחר הזרקת מי מלח. לאחר ההתרגלות, פעילות תנועתית נרשמת לאחר מנה אחת של קוקאין, דגימות מגרעין האקומבנס נאספות ומשמשות לבידוד RNA והכנת CDNA.
ניתוח QPCR הבא מבוצע על מנת לחקור ביטוי גנים המושרה על ידי התנהגות. בסופו של דבר, מתקבלות תוצאות המראות דינמיקת שעתוק בעקבות ניסיון בקוקאין מדגימים את הפרוטוקול ד"ר האטו, מנהל המעבדה, דום מואר, סטודנט לתואר שני מהמעבדה ודוראן סטודנט לתואר ראשון מהמעבדה במשך שלושה ימים רצופים. כל עכבר מורגל לתהליכי הטיפול וההזרקה, מסדר עכברים בכלובים לפני תחילת הניסוי, כך שעכברים לא יועברו בעתיד בין כלובים ועכברים לעולם לא יישארו בבידוד לתקופה ממושכת.
30 דקות לפני תחילת הבדיקה, יש להעביר את כל כלובי הבדיקה לחדר ההתנהגות כדי לאפשר לבעלי החיים להתאקלם בסביבה. יש לתת זריקה תוך-צפקית של 250 מיקרוליטר מי מלח מיד לאחר ההזרקה, למקם את העכבר בתא התנהגות כדי לעקוב אחר הפעילות התנועתית למשך 15 דקות. ניתן היה למקם את העכבר בתא ההתנהגות למשך 20 דקות.
פעילות המנוטרת מהדקה השנייה עד 17. חזור על שלבים אלה באותה שעה ביום במשך היומיים הבאים. ביום הרביעי, תנו זריקה אחת של קוקאין או מי מלח, בהתאם לקבוצה, והניחו מיד את העכבר בתא כדי לנטר את הפעילות המוטורית המקומית במשך 20 דקות בנקודות זמן נבחרות לאחר החשיפה לקוקאין, לחלץ את המוח ולהניח אותו בקור כקרח, תמיסת CSF למשך דקה עד שתיים להתקרר ולהתקשות.
לאחר הסרת המוח הקטן ונידוף עודפי נוזלים, הדביקו את המוח לשלב הרטט כשהחלק הרוסטרלי פונה כלפי מעלה. מלאו את החדר ב-CSF קר כקרח ופרסו חלקים של 200 מיקרון עד לזיהוי ברור של גרעין האקומבנס. שימו לב היטב לצורת הקורפוס קלוסום, למיקום וצורת הקומיסורה הקדמית ולחדרים בזמן החיתוך.
לאחר זיהוי האזור הנכון, פורסים שני חלקים של 400 מיקרון שמהם ינותח גרעין האקומבנס תחת סטריאוסקופ. השתמש בלהב עדין כדי לנתח את גרעין האקומבנס הרחק מהפרוסות. ארבעה מעברים מהירים של הלהב באזור הנכון אמורים לבודד את הרקמה המתאימה באופן מיידי.
מניחים את הרקמה המבודדת ב-900 מיקרוליטר של מגיב ליזה, ומאחסנים במינוס 80 מעלות צלזיוס עד למיצוי RNA כדי להתחיל להפשיר את הצינורות ב-37 מעלות צלזיוס ולהומוגניזציה. באמצעות מחט בקוטר 25, הסיבובים הראשונים עשויים להיות קשים ודורשים דחיפת הרקמה כנגד דופן הצינור כדי להפוך אותה להומוגניזציה לחתיכות קטנות. כדי להבטיח הומוגניזציה נכונה, פיפטה את הליזאט על מגרסת קאיה, מיני עמוד ספין וצנטריפוגה.
הכניסו את הליזאט לתוך צינור מיקרו צנטריפוגה חדש וחלצו את ה-RNA בהתאם להוראות היצרן. לאחר טיהור RNA מתבצע שעתוק הפוך ל-CDNA וכן הגברה ספציפית של הדגימות עם פריימרים המכוונים כנגד קבוצת הגנים שנבחרו לניתוח. נהלים אלה מתוארים בגירסת הטקסט של הפרוטוקול.
שבבים מיקרופלואידיים מסחריים לניתוח QPCR מקיף זמינים ב-48 על 48. פורמט, המאפשר ניתוח של 48 דגימות עם 48 ערכות בדיקות, או בפורמט של 96 על 96 שבו 96 דגימות מנותחות עם 96 בדיקות. ברוב המקרים, בחירת השבב תלויה בעיקר במספר הדגימות שנותחו.
ראשית, הכינו את תערובת הדגימה בהתאם לשבב שנבחר לניסוי. היזהר בעת פיפטינג של 20 XDNA צבע מחייב טעינת דגימה. מערבבים את תמיסות תערובת הדגימה למשך 20 שניות לפחות וצנטריפוגה למשך 30 שניות לפחות.
ניתן לאחסן תגובות מוכנות לפרקי זמן קצרים בארבע מעלות צלזיוס עד שהשבב מוכן לטעינה. לאחר מכן, הכינו את תערובת הבדיקה, ערבבו היטב את תערובת הדגימה וצנטריפוגה כדי לסובב את כל הרכיבים. כפי שהוצג קודם לכן, לשבב IFC של המערך הדינמי יש כניסות לדגימות ובדיקות, כמו גם כניסות מוגדרות לנוזל קו בקרה המשמש להפעלת לחץ על התאים המיקרופלואידיים.
ראשית, הזריק נוזל קו בקרה לכל מצבר על השבב. לאחר מכן, הכניסו את השבב על ידי הכנסתו לבקר IFC והפעלת הסקריפט המתאים. בסיום התסריט, הסר את השבב הדרוך מבקר ה-IFC ופיפטה חמישה מיקרוליטר מכל בדיקה.
מערבבים על הצ'יפס. הוסף חמישה מיקרוליטר מכל תערובת דגימה לכניסות שלהם והחזיר את השבב לבקר IFC באמצעות תוכנת בקר IFC. הפעל את הסקריפט כדי לטעון את הדגימות והבדיקות לתוך השבב.
לאחר סיום סקריפט תערובת העומס, הסר את השבב הטעון מבקר ה-IFC. לאחר מכן, טען את השבב על המחזור התרמי וצור ריצת שבב חדשה הכוללת ניתוח עקומת התכה. שימוש בתוכנת המחזור התרמי מבטיח שתאי התגובה מזוהים כראוי ומאפשרים לתגובה לפעול עד לסיום.
עלייה בפעילות התנועתית ניכרה לאחר זריקת קוקאין חריפה אחת. בחתך עטרה זה, קווים לבנים עבים סימנו את מיקום החתכים שנעשו כדי להגדיר את גבולות גרעין האקומבנס. במהלך הדיסקציה, עקומות ההגברה של פריימרים המכוונות כנגד CFOs ו-phos B מדגימות שזוגות הפריימרים מגבירים את תעתיק היעד שלהם ביעילות של כ-100%.
בכל מחזור, התוצאות מראות כי הביטוי המושרה על ידי קוקאין של CFOs ו-phos B בגרעין האקומבנס היה הגבוה ביותר שעה ושעתיים לאחר החשיפה. בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כמו ריצוף הדור הבא על מנת לזהות תעתיק לא מאופיין חדש.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
סקירה
כתב היד הזה מתאר פרוטוקול לניתוח תוכניות תעתיק בגרעיני מוח ספציפיים של מכרסמים בעקבות פרדיגמות התנהגותיות. הגישה מוצגת באמצעות פרופיל של גנים שהושרו בגרעין האקומבנס (NAc) של עכברים לאחר חשיפה חריפה לקוקאין.
רכיבי מחקר עיקריים
תחום המדע
- מדעי המוח
- ניתוח התנהגותי
- פרופיל ביטוי גנים
רקע
- דינמיקה תעתיקית היא חיונית להבנת תגובות המוח להתנהגות.
- גרעין האקומבנס הוא אזור מרכזי המעורב בתגמול והתמכרות.
- חשיפה לקוקאין משנה את ביטוי הגנים במוח.
- מערכי qPCR מיקרו-נוזליים מאפשרים פרופיל מפורט של גנים.
מטרת המחקר
- לחקור שינויים תעתיקיים בגרעין האקומבנס לאחר חשיפה לקוקאין.
- לבסס פרוטוקול לבידוד RNA וניתוח ביטוי גנים.
- להבין את ההשפעה ההתנהגותית על ביטוי גנים במכרסמים.
שיטות ששימשו
- הרגלה של עכברים לטיפול ולהזרקת סליין.
- הקלטת פעילות לוקומוטורית לאחר מתן קוקאין.
- איסוף דגימות של גרעין האקומבנס לבידוד RNA.
- ניתוח QPCR להערכת שינויים בביטוי גנים.
תוצאות עיקריות
- דינמיקה תעתיקית נצפתה לאחר חשיפה לקוקאין.
- גנים ספציפיים זוהו כמיוחסים ב-NAc.
- הפרוטוקול הדגים פרופיל יעיל של ביטוי גנים.
- התוצאות תורמות להבנת הבסיס המולקולרי של ההתמכרות.
מסקנות
- המחקר מספק פרוטוקול חזק לניתוח ביטוי גנים בתגובה לגירויים התנהגותיים.
- הממצאים משפרים את הידע על תגובות תעתיקיות במחקר ההתמכרות.
- גישה זו ניתנת ליישם על פרדיגמות התנהגותיות אחרות במדעי המוח.
שאלות נפוצות
Executive Industry Relevance
This protocol enables biopharma R&D teams to quantitatively assess transcriptional dynamics in defined brain regions following behavioral or pharmacological perturbations, supporting target validation in neuropsychiatric drug discovery. By providing reproducible, quantitative gene expression readouts from limited tissue samples, it enhances predictive confidence in early-stage mechanistic studies and informs go/no-go decisions for CNS-targeted therapeutics. The approach is particularly valuable for de-risking hypotheses related to addiction, reward pathways, and behavioral phenotypes prior to investment in lead optimization.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of transcriptional programs in nucleus accumbens to validate functional relevance of genes implicated in cocaine-induced behavioral responses.
- Operational Value: Supports robust target hypothesis testing using microfluidic qPCR to quantify gene expression changes with high sensitivity from limited brain tissue.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Facilitates preparation of validated biological systems for downstream screening by establishing baseline transcriptional profiles following acute pharmacological challenge.
- Operational Value: Enables assay standardization and reproducibility through standardized RNA isolation, reverse transcription, and microfluidic qPCR workflows applicable across multiple samples.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Provides disease-relevant transcriptional readouts in a well-established model of psychostimulant response, supporting biomarker alignment and mechanistic de-risking.
- Operational Value: Ensures continuity from discovery through preclinical validation by delivering quantitative, multiplexed gene expression data suitable for cross-platform confirmation.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the early discovery continuum, supporting hypothesis-driven target validation and assay development prior to lead identification efforts in CNS drug discovery programs.
- Discovery Biology: Enables mechanistic interrogation of transcriptional dynamics following behavioral experience, supporting pathway clarification and target de-risking.
- Screening: Generates quantitative, multiplexed outputs that support assay readiness and reproducibility for compound screening campaigns.
- Analytics: Delivers normalized gene expression measurements from microfluidic qPCR arrays, enabling statistical comparison across experimental conditions and time points.
- Translational Research: Connects acute behavioral responses to molecular signatures in reward circuitry, supporting translational validity in addiction models.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable transcriptional profiling platform applicable across diverse behavioral paradigms and pharmacological challenges in neuroscience research.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by linking behavioral phenotypes to defined transcriptional responses in key brain regions.
- Operational Value: Enhances reproducibility and scalability of gene expression analysis through standardized microfluidic qPCR protocols suitable for multi-sample processing.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling early de-risking of CNS targets through mechanistic insight before costly lead optimization.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of targets by providing quantitative evidence of pathway engagement following pharmacological challenge.
Implementation Considerations
- Requires expertise in neuroscience techniques including behavioral testing, brain dissection, and RNA handling.
- Depends on access to microfluidic qPCR platforms and associated instrumentation for high-throughput gene profiling.
- Necessitates standardized protocols for sample collection, RNA isolation, and cDNA synthesis to ensure cross-experiment consistency.
- Involves adaptation considerations when applying the protocol to different brain regions, species, or behavioral paradigms beyond cocaine-induced nucleus accumbens responses.
- Practical limitations include tissue yield constraints from small brain nuclei and the need for careful normalization to account for sample variability.
