Name: ניתוח מקיף של תמלול Dynamics מדוגמאות המוח בעקבות ניסיון התנהגות (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-08-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 14 s
Description: חקור דינמיקה תמלולית בגרעין האקומבנס של עכברים לאחר חשיפה לקוקאין באמצעות qPCR. פרוטוקול זה מאפשר ניתוח ביטוי גנים בתגובה לגירויים התנהגותיים במחקר התמכרויות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו מומנה על ידי מענק הקרן הלאומית למדע (ISF # 393/12), מענק המרכזים הישראליים למצוינות במחקר (I-CORE 1796/12), מענק קרן גרמניה-ישראל (GIF # 2299-2291.1/2011) ומענק שילוב קריירה ע"ש מארי קירי (FP7-PEOPLE-2013-CIG #618201). הצעדים הראשונים בפרויקט מומנו על ידי מלגת פוסט-דוקטורט של AXA ל-AC. אנו מכירים בכספי הסטארט-אפ הנדיבים הניתנים על ידי מרכז אדמונד ולילי ספרא למדעי המוח.
קריאה ביקורתית של חברי מעבדת Citri מוערכת מאוד.

<ol><li>Amit, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+module+of+negative+feedback+regulators+defines+growth+factor+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+genetics%22%5BJournal%5D)">A module of negative feedback regulators defines growth factor signaling.</a> Nature genetics. 39, 503-512 (2007).</li>
<li>Citri, A., Yarden, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EGF-ERBB+signalling%3A+towards+the+systems+level%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Molecular+cell+biology%22%5BJournal%5D)">EGF-ERBB signalling: towards the systems level.</a> Nature reviews. Molecular cell biology. 7, 505-516 (2006).</li>
<li>Holtmaat, A., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experience-dependent+structural+synaptic+plasticity+in+the+mammalian+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Experience-dependent structural synaptic plasticity in the mammalian brain.</a> Nature reviews. Neuroscience. 10, 647-658 (2009).</li>
<li>Kleim, J. A., Jones, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Principles+of+experience-dependent+neural+plasticity%3A+implications+for+rehabilitation+after+brain+damage%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+speech%2C+language%2C+and+hearing+research%22%5BJournal%5D)">Principles of experience-dependent neural plasticity: implications for rehabilitation after brain damage.</a> Journal of speech, language, and hearing research. 51, S225-S239 (2008).</li>
<li>Kauer, J. A., Malenka, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+plasticity+and+addiction%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Synaptic plasticity and addiction.</a> Nature reviews. Neuroscience. 8, 844-858 (2007).</li>
<li>Grueter, B. A., Rothwell, P. E., Malenka, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrating+synaptic+plasticity+and+striatal+circuit+function+in+addiction%5BTitle%5D)+AND+%22Current+opinion+in+neurobiology%22%5BJournal%5D)">Integrating synaptic plasticity and striatal circuit function in addiction.</a> Current opinion in neurobiology. 22, 545-551 (2012).</li>
<li>Robinson, T. E., Kolb, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+plasticity+associated+with+exposure+to+drugs+of+abuse%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropharmacology%22%5BJournal%5D)">Structural plasticity associated with exposure to drugs of abuse.</a> Neuropharmacology. 47, Suppl 1. 33-46 (2004).</li>
<li>Koob, G. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurobiological+mechanisms+in+the+transition+from+drug+use+to+drug+dependence%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience+and+biobehavioral+reviews%22%5BJournal%5D)">Neurobiological mechanisms in the transition from drug use to drug dependence.</a> Neuroscience and biobehavioral reviews. 27, 739-749 (2004).</li>
<li>Hyman, S. E., Malenka, R. C., Nestler, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+mechanisms+of+addiction%3A+the+role+of+reward-related+learning+and+memory%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+review+of+neuroscience%22%5BJournal%5D)">Neural mechanisms of addiction: the role of reward-related learning and memory.</a> Annual review of neuroscience. 29, 565-598 (2006).</li>
<li>Beurrier, C., Malenka, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+inhibition+of+synaptic+transmission+by+dopamine+in+the+nucleus+accumbens+during+behavioral+sensitization+to+cocaine%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+neuroscience%22%5BJournal%5D)">Enhanced inhibition of synaptic transmission by dopamine in the nucleus accumbens during behavioral sensitization to cocaine.</a> The Journal of neuroscience. 22, 5817-5822 (2002).</li>
<li>Robinson, T. E., Berridge, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+psychology+and+neurobiology+of+addiction%3A+an+incentive-sensitization+view%5BTitle%5D)+AND+%22Addiction%22%5BJournal%5D)">The psychology and neurobiology of addiction: an incentive-sensitization view.</a> Addiction. 95, Suppl 2. S91-S117 (2000).</li>
<li>Boening, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurobiology+of+an+addiction+memory%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+neural+transmission%22%5BJournal%5D)">Neurobiology of an addiction memory.</a> Journal of neural transmission. 108, 755-765 (2001).</li>
<li>Everitt, B. J., Robbins, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+systems+of+reinforcement+for+drug+addiction%3A+from+actions+to+habits+to+compulsion%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+neuroscience%22%5BJournal%5D)">Neural systems of reinforcement for drug addiction: from actions to habits to compulsion.</a> Nature neuroscience. 8, 1481-1489 (2005).</li>
<li>Volkow, N. D., Fowler, J. S., Wang, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+addicted+human+brain%3A+insights+from+imaging+studies%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+clinical+investigation%22%5BJournal%5D)">The addicted human brain: insights from imaging studies.</a> The Journal of clinical investigation. 111, 1444-1451 (2003).</li>
<li>Carlezon, W. A. Jr, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+cocaine+reward+by+CREB%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Regulation of cocaine reward by CREB.</a> Science. 282, 2272-2275 (1998).</li>
<li>Hope, B., Kosofsky, B., Hyman, S. E., Nestler, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+immediate+early+gene+expression+and+AP-1+binding+in+the+rat+nucleus+accumbens+by+chronic+cocaine%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Regulation of immediate early gene expression and AP-1 binding in the rat nucleus accumbens by chronic cocaine.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 89, 5764-5768 (1992).</li>
<li>Hope, B. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+a+long-lasting+AP-1+complex+composed+of+altered+Fos-like+proteins+in+brain+by+chronic+cocaine+and+other+chronic+treatments%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Induction of a long-lasting AP-1 complex composed of altered Fos-like proteins in brain by chronic cocaine and other chronic treatments.</a> Neuron. 13, 1235-1244 (1994).</li>
<li>Pulipparacharuvil, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cocaine+regulates+MEF2+to+control+synaptic+and+behavioral+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Cocaine regulates MEF2 to control synaptic and behavioral plasticity.</a> Neuron. 59, 621-633 (2008).</li>
<li>Robison, A. J., Nestler, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+and+epigenetic+mechanisms+of+addiction%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Transcriptional and epigenetic mechanisms of addiction.</a> Nature reviews. Neuroscience. 12, 623-637 (2011).</li>
<li>Hyman, S. E., Malenka, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Addiction+and+the+brain%3A+the+neurobiology+of+compulsion+and+its+persistence%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Addiction and the brain: the neurobiology of compulsion and its persistence.</a> Nature reviews. Neuroscience. 2, 695-703 (2001).</li>
<li>Nestler, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+neurobiology+of+cocaine+addiction.+Science+%26+practice+perspectives+%2F+a+publication+of+the%5BTitle%5D)+AND+%22National+Institute+on+Drug+Abuse%2C+National+Institutes+of+Health%22%5BJournal%5D)">The neurobiology of cocaine addiction. Science & practice perspectives / a publication of the.</a> National Institute on Drug Abuse, National Institutes of Health. 3, 4-10 (2005).</li>
<li>Robbins, T. W., Everitt, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurobehavioural+mechanisms+of+reward+and+motivation%5BTitle%5D)+AND+%22Current+opinion+in+neurobiology%22%5BJournal%5D)">Neurobehavioural mechanisms of reward and motivation.</a> Current opinion in neurobiology. 6, 228-236 (1996).</li>
<li>Kaplan, G. B., Moore, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+cognitive+enhancers+in+animal+models+of+fear+extinction%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacology%2C+biochemistry%2C+and+behavior%22%5BJournal%5D)">The use of cognitive enhancers in animal models of fear extinction.</a> Pharmacology, biochemistry, and behavior. 99, 217-228 (2011).</li>
<li>Chauvet, C., Goldberg, S. R., Jaber, M., Solinas, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+environmental+enrichment+on+the+incubation+of+cocaine+craving%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropharmacology%22%5BJournal%5D)">Effects of environmental enrichment on the incubation of cocaine craving.</a> Neuropharmacology. 63, 635-641 (2012).</li>
<li>Nithianantharajah, J., Hannan, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enriched+environments%2C+experience-dependent+plasticity+and+disorders+of+the+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Enriched environments, experience-dependent plasticity and disorders of the nervous system.</a> Nature reviews. Neuroscience. 7, 697-709 (2006).</li>
<li>Silingardi, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ERK+pathway+activation+bidirectionally+affects+visual+recognition+memory+and+synaptic+plasticity+in+the+perirhinal+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+behavioral+neuroscience%22%5BJournal%5D)">ERK pathway activation bidirectionally affects visual recognition memory and synaptic plasticity in the perirhinal cortex.</a> Frontiers in behavioral neuroscience. 5, 84(2011).</li>
<li>Tropea, D., Majewska, A. K., Garcia, R., Sur, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+dynamics+of+synapses+in+vivo+correlate+with+functional+changes+during+experience-dependent+plasticity+in+visual+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+neuroscience%22%5BJournal%5D)">Structural dynamics of synapses in vivo correlate with functional changes during experience-dependent plasticity in visual cortex.</a> The Journal of neuroscience. 30, 11086-11095 (2010).</li>
<li>Steketee, J. D., Kalivas, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drug+wanting%3A+behavioral+sensitization+and+relapse+to+drug-seeking+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacological+reviews%22%5BJournal%5D)">Drug wanting: behavioral sensitization and relapse to drug-seeking behavior.</a> Pharmacological reviews. 63, 348-365 (2011).</li>
<li>Citri, A., Pang, Z. P., Sudhof, T. C., Wernig, M., Malenka, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+qPCR+profiling+of+gene+expression+in+single+neuronal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+protocols%22%5BJournal%5D)">Comprehensive qPCR profiling of gene expression in single neuronal cells.</a> Nature protocols. 7, 118-127 (2012).</li>
</ol>

אין לנו מה לחשוף.

אפיון מוצלח של ביטוי גנים מרקמת המוח הבא פרדיגמות התנהגות תלוי: 1) טיפול זהיר של עכברים במהלך הפרדיגמה ההתנהגות; 2) לנתיחה מהירה ומדויקת של רקמה של עניין; 3) אמצעי RNA-בטוח כדי להבטיח את התקינות של רנ&quot;א; ו4) תכנון זהיר של פריימרים ופריסה ניסיונית כמו גם דיוק ותשומת לב לפרטים בהכנה לניתוח qPCR. המטרה של ההליך המתואר היא לאפיין את הדינמיקה של אירועי תעתיק הנגרמים על ידי ניסיון התנהגותיות; לכן, תשומת לב קפדנית ...

הארגון הדינמי של המוח מאפשר גמישות מחשבתית והתנהגות. חוויות מקודדות באמצעות שינויים במבנה ובחוזק של קשרים בין תאי עצב במוח 3. זה &quot;גמישות ניסיון תלוי&quot; היא התוצאה של גיוס של דפוסים ספציפיים של ביטוי גנים המספק את החלבונים הדרושים לשינוי של מבנה וכוח 4 הסינפטי. זיהוי של רשתות רגולטוריות גן תיווך ההיווצרות של זכרונות לטווח ארוך הוא עיקרון של מדעי מוח המולקולריים מרכזי, עם הציפייה שהזדהות האלמנטים הדומיננטיים של תוכניות תעתיק תספק תובנה לתוך עקרונות יסוד המסדירים את היווצרות זיכרון, כמו גם מטרות ל טיפול בניוון עצבי והפרעות נוירופסיכיאטריות. תוכניות תעתיק להתפתח בגלי temporally מוגדרים, כל אחד מהם לקודד גנים של אופי שונה, שהם חשובים עבור דשלבי ifferent ביישום לתוצאה של אירוע איתות 1,2. לכן חשוב לטפל בדינמיקת תעתיק על לוח זמנים זמניים מפורטים, על מנת לזהות את ההשלמה המלאה של גנים המושרה, ולקבל תובנה פונקצית הפוטנציאל שלהם בהתאם לדינמיקה של גיוסם. התמכרות לסמים היא צורה חזקה של פלסטיות ניסיון תלוי הנגרמת על ידי ההשפעות ארוכות טווח של תרופות של התעללות במעגלים עצביים במוח 5,6. חשיפה ראשונית, חריפה לתרופות עלולה להוביל להתפתחות של התמכרות ומעבר לשימוש כרוני. מידע מקושרת הוא אלמנט מכריע בהתפתחות של התמכרות. רמזים סביבתיים הקשורים לסמים מוקצים חשיבות משמעותית במוחם של משתמשים בסמים. מידע מקושרת והזכיר מתעלל תרופה של ניסיון בסמים בעבר יכול לגרום להישנות להשתוקקות לסמים גם לאחר תקופות של התנזרות ארוכות מחשיפה לסמים 7,8.מכאן האתגר הגדול הקליני בהתמכרות - הנטייה של מכורים שמפסיק אפילו זמן רב לאחר תסמיני גמילה שככו 9. רגישות התנהגות לקוקאין היא מודל פשוט של ניסיון הקוקאין שימושי בחקר המנגנונים של התמכרות לסמים. במודל נרחב למד את זה לרגישות לטווח ארוכה הנגרמת על ידי חשיפה כרונית לסמים של התעללות, מכרסמים הם מורגלים ראשון לזריקות מלוחים (intraperitoneal; IP) בסביבת רומן (קאמרי שדה פתוח שבו הפעילות של התנועה שלהם היא פיקוח) ; לאחר מכן, הם מקבלים זריקות יומיות של קוקאין בתאי השטח הפתוחים בזמן שהפעילות שלהם היא פיקוח 10 (איור 1). הפרדיגמה התנהגות זו בדרך כלל תוצאות ברגישות חזקה של התנהגות של תנועה (8-12 לקפל מעל הפעילות בסיסית) 11, שנשמרה לתקופה של חודשים לאחר הפסקת זריקות קוקאין, הממחישה את היווצרות הקודםעקבות זיכרון asive ניסיון סמים. המעגלים העצביים של גמול, מעורבים באופן טבעי בחיזוק התנהגויות חיוניות להצלחה של מינים (למשל האכלה, מין), מנוצלים על ידי סמים של התעללות לחזק התנהגויות הקשורים לסמים 12,13. מופיעים מנגנונים המולקולריים ותאיים על ידי אשר הניסיון של תרופות של התעללות מוגברת להיות דומה למנגנונים העומדים בבסיס ההיווצרות של זכרונות הצהרתיים או סמנטיים במבנים אחרים במוח 14. לכן, על חוסנו של מודל רגישות ההתנהגות הופך אותו למערכת מודל אטרקטיבית ללמוד מנגנונים של פלסטיות ניסיון תלוי. הגרעין הנסמך (NAC) הוא אינטגרטור של מעגלי הגמול של המוח מרכזי, ונקשר בהרחבה בהתפתחות של התמכרות 5,6. ההיווצרות של התמכרות תלויה בשעתוק של חלבונים חדשים בגרעין הנסמך, וחזק בduction של תוכניות שעתוק מובנים באופן ברור הוא ציין בNAC הבא ניסיון קוקאין 15-19. תגובת תעתיק החריפה לחשיפה לקוקאין עשויה לתפקד במספר הרמות על מנת להתאים לגירוי האינדוקציה החזק ולכוון את הייצור של חלבונים חדשים ש הם אחראים לשינויים המבניים ואלקטרו הנגרמים על ידי חשיפה לתרופה 6,19-22. על מנת לקדם את המחקר של מנגנונים מולקולריים של פלסטיות ניסיון תלוי במוח, פרוטוקול מתואר לניתוח המקיף של דינמיקת שעתוק בדגימות רקמת מוח בעקבות מניפולציה התנהגותית. הפרוטוקול בא לידי ביטוי בהקשר של הניסיון התנהגותי למד במעבדה Citri - רגישות התנהגות לקוקאין, תוך ניצול מערכים דינמיים microfluidic לניתוח תעתיק. הפרוטוקול המתואר הוא כמובן לא מוגבל ללימוד tהוא הגרעין נסמך בהקשר של רגישות התנהגות, אבל יכול להיות מיושם על מספר גדול של פרדיגמות התנהגות ואזורים במוח. למעשה, פרוטוקול זה יכול להיות מיושם על רקמות גוף מחוץ למוח, ומגוון רחב של חוויות או מניפולציות של האורגניזם למד. הפרוטוקול מחולק באופן גס לארבעה שלבים. בשלב הראשון, בעלי החיים כפופים לפרדיגמה ההתנהגות; בשלב השני הרקמה היא microdissected; בשלב השלישי - mRNA הוא, הפוך עיבד מטוהר ומשש, ובשלב האחרון את הנתונים מנותחים. בהקשר של לימוד דינמיקת תעתיק, העיתוי וההגדרה המדויקים של החוויה הם כנראה פרמטרים הניסיוניים החשובים ביותר כדי לשלוט. מסיבה זו, מודל ההתנהגות שלנו על פי בחירה הוא של רגישות התנהגות לקוקאין, מערכת המאפשרת רמה גבוהה של שליטת הנסיין על הפרמטרים של experience. פרדיגמות התנהגות נוספות המאפשרות תזמון מדויק ולטפל בדגמים שונים של פלסטיות ניסיון תלוי או היווצרות זיכרון זמינות. מודלים אלה כוללים מיזוג פחד 23, העשרה סביבתית חריפה 24,25, חיפושי אובייקט רומן 26 וחוויה חזותית הבא גידול כהה 27. ובכל זאת, רגישות התנהגות לקוקאין היא מניפולציה התנהגותית חזקה באופן עקבי, יוצר עקבות זיכרון נפוצות מאוד שנמשכות חודשים הבאים ניסיון קוקאין 28. המוח מחולק, ואחריו microdissection הידני של הגרעין נסמך. זה היה הניסיון שלנו שmicrodissection הידני מפרוסות המוח שהוכנו במהירות מספק את השיטה אמינה והמהירה ביותר של חילוץ הרקמות רלוונטיות לפרדיגמה ההתנהגות, ועם ניסיון, לגבולות הרקמה להיות ברורים וללא קושי מוכר. לחלופין, פרוסות דקות יכולות להיות הכנהed, ואחריו microdissection לייזר ללכוד. אמנם שיטה זו מאפשרת מאוד מוגדרת תיחום של האזור של עניין, הוא איטי (ובכך מסכן את ההפסד של mRNA יציב), מייגע ודורש ציוד ייעודי יקר (מצויד בהתקנת לייזר ללכוד מיקרוסקופ). הפרוטוקול המוגדר במסמך זה גם יכול להיות מותאם לניתוח תעתיק מתא בודד, על ידי שאיפה ידנית של הציטופלסמה של תאים מזוהים ויזואלית באמצעות טפטפות תיקון 29. חשוב לציין כי הפרוטוקול המתואר מספק ממוצע אוכלוסייה, בזמן שהוא סביר מאוד כי ברוב המקרים, רק תת אוכלוסיות של התאים בתוך הרקמה למעשה מעורבות במתן מענה לחוויה. זה עניין לפרופיל שעתוק באופן סלקטיבי מתוך אוכלוסיות תאים ספציפיות בתגובה לניסיון, אבל דיון בגישות אלה הוא מעבר להיקף הנוכחי. לטיהור mRNA, הפוך שעתוק ושאילתות qPCR, הרקמהמופר על ידי העברתו דרך מחטים דקות, ואחריו את הניצול של ערכות זמינות מסחרי (למידע נוסף, ראה לוח 8). הבחירה הוא הודיע ​​על ידי ניסיון עם מתודולוגיות אלה, המבטיחים מיצוי אמין של RNA באיכות גבוהה ותוצאות חזקות מיישומים במורד הזרם. בעוד הפרוטוקול מתואר לתפוקה גבוהה qPCR ניצול מערכים דינמיים, יכולות להיות נחקרות דוגמאות לביטוי גנים באמצעות נקודת סיום PCR, qPCR נמוך תפוקה, microarrays ביטוי גנים או רצף עמוק. ההעדפה לqPCR תפוקה גבוהה תוך ניצול מערכים דינמיים היא בשל העובדה כי mRNA המתקבל מגרעיני המוח הבאים פרדיגמות התנהגות הוא לעתים קרובות כמויות מגבילות. מערכים דינמיים מספקים פלטפורמה המאפשרת ניתוח מקיף יעיל של תמלילים ממספר גדול של דגימות במקביל בניסוי אחד. לאחר הרכישה הראשונית של מערכת microfluidic (נפוץ pu מוסדיrchase), ניסויים זולים יחסית להפעלה. בעקבות ניתוח זה, שאילתא נוספת של הדגימות יכולה להתבצע באמצעות פלטפורמות יקרות יותר כדי לחפש תעתיקי רומן (על ידי microarrays או RNAseq) עם המערכים הדינמיים מתן התייחסות מקיפה לאבטחת איכות. לבסוף, לניתוח נתונים, גישות סטנדרטיים מנוצלות. מצביעים ספציפיים לגבי בעיות שעלולות להתעורר יידונו בטקסט של הפרוטוקול. פרוטוקול זה הוא מתאים ביותר לחוקרים המעוניינים בחקירה יסודית של מערכת עניין שלהם, כדי לחקור את התנאים ומשכפל מרובים. הפרוטוקול הוא גם מתאים ביותר לחוקרים שכבר מושחז ב( באמצעות ניסויי microarray או RNAseq) על קבוצת משנה של 50-500 הגנים של עניין, שבו הם מעוניינים בביצוע שאילתות שוב ושוב.

<table><tbody><tr><td>Virusol</td><td>Oriek Medical</td><td>J29D</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane, USP 100%</td> <td>MINRAD INC</td><td>NDC 60307-110-25</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy plus Universal Mini Kit</td><td>QIAGEN</td><td>73404</td><td></td></tr><tr><td>QIAמגרסה</td><td>QIAGEN</td><td>79654</td><td></td></tr><tr><td>ערכת שעתוק הפוך cDNA בקיבולת גבוהה</td><td>Invitrogen</td><td>AB-4368814</td><td></td></tr><tr><td>TE Buffer</td><td>תא</td> התנהגות <td>1355656</td><td></td>Invitrogen</tr><tr><td>(MDF; 50 x 45 ס"מ)</td><td></td><td></td> קופסת פרספקס פנימית <td>בהרכבה עצמית</td></tr><tr><td>(30 x 30 ס"מ)</td><td></td><td></td>מצלמה ומקליט וידאו <td>בהרכבה עצמית</td></tr><tr><td></td><td>Campden Inst.</td><td>CMD-80051</td><td></td></tr><tr><td>תוכנת מקליט מדיה</td><td>Noldus</td><td>NDS-NMR3-00M</td><td></td></tr><tr><td>מספריים לקשתית</td><td>FST</td><td>FST-14062-09</td><td></td></tr><tr><td>Vibratome</td><td>Campden Inst.</td><td>7000SMZ-2</td><td></td></tr><tr><td>Bioanalyzer</td><td>Agilent Technologies</td><td>The Agilent 2100 Bioanalyzer</td><td></td></tr><tr><td>Thermal cycler</td><td>Bio-Rad</td><td>1852048</td><td></td></tr><tr><td>מרית מיקרו-כפית הפוכה</td><td>Bochem Instrument GmbH</td><td>3213</td><td></td></tr><tr><td>Biomark HD Reader</td><td>Fluidigm</td><td>BMHD-BMKHD</td><td></td></tr><tr><td>שבב מערך דינמי לביטוי גנים 96.96</td><td>Fluidigm</td><td>BMK-M-96.96</td><td></td></tr></tbody></table>

ניתוח מקיף של תמלול dynamics מדוגמאות המוח בעקבות ניסיון התנהגות

Comprehensive Analysis of Transcription Dynamics from Brain Samples Following Behavioral Experience

הקידוד של חוויות במוח ובאיחוד של זכרונות לטווח ארוך תלוי בשעתוק הגנים. זיהוי הפונקציה של גנים מסוימים בניסיון קידוד הוא אחד מהיעדים המרכזיים של מדעי מוח מולקולריים. יתר על כן, העמותה הפונקציונלית של גנים מוגדרים עם התנהגויות ספציפיות יש השלכות על הבנת הבסיס של הפרעות נוירופסיכיאטריות. אינדוקציה של תוכניות שעתוק חזקות נצפתה במוחם של העכברים הבאים מניפולציות התנהגותיות שונות. בעוד שחלק מאלמנטים גנטיים מנוצלים שוב ושוב הבא מניפולציות התנהגותיות שונות ובגרעינים שונים במוח, תוכניות תעתיק הן כללית ייחודיות לגירויים התרמה והמבנה שבו הם למדו 1,2. בפרסום זה, פרוטוקול מתואר לפרופיל תעתיק חזק ומקיף מגרעיני המוח של עכברים בתגובה למניפולציה התנהגותית.הפרוטוקול בא לידי הביטוי בהקשר של ניתוח של דינמיקת ביטוי גנים בגרעין נסמך הבא ניסיון קוקאין חריף. לאחר שהוגדר בניסיון vivo, הרקמה העצבית היעד היא גזור; ואחריו טיהור RNA, להפוך שעתוק וניצול של מערכי microfluidic לניתוח qPCR מקיף של גני המטרה מרובים. פרוטוקול זה מיועד לניתוח מקיף (פונה 50-500 גנים) של הגבלת כמויות של חומר מוצא, כגון דגימות מוח קטנות או אפילו תאים בודדים. הפרוטוקול הוא הכדאי ביותר לניתוח מקביל של דגימות מרובות (למשל תאים בודדים, ניתוח דינמי הבאים תרופות, נגיפי או הפרעות התנהגות). עם זאת, הפרוטוקול יכול גם לשמש להבטחת האפיון ואיכות של דגימות לפני לימודי כל הגנום על ידי microarrays או RNAseq, כמו גם אימות של נתונים המתקבלים ממחקרי הגנום.

איכות התוצאות שהתקבלו על ידי יישום פרוטוקול זה מכריע תלוי במספר הפרמטרים. תכנון ניסוי נכון יביא להפרעה מינימאלית לעכברי ניסוי, כך שהניסיון שנבדק (בדוגמא זו, שחשיפה לקוקאין) תהיה החוויה הדומיננטית ביותר בהיסטוריה המודרנית שלהם, ולכן תגרום לתעתיק חזק וספציפי תכנית. איור 1 מתאר את התכנית הניסיונית ולרגישות התנהגות לקוקאין, המגדיר את נקודות הזמן הבאות ניסיון קוקאין שבו הגרעין נסמך הוא גזור מעכברים ונותחו. הנקודה המכרעת הבאה היא זו של הגדרת הגבולות המדויקים לכריתה של ה...

כתב יד זה מתאר פרוטוקול המיישם פרופיל מקיף לניתוח תוכניות שעתוק המושרות בגרעיני מוח ספציפיים של מכרסמים בעקבות פרדיגמות התנהגותיות. כאן, גישה זו מודגמת בהקשר של פרופיל גנים המושרים בגרעין האקומבנס (NAc) של עכברים לאחר חשיפה חריפה לקוקאין, תוך שימוש במערכי qPCR מיקרופלואידיים.

ניתוח מקיף של תמלול Dynamics מדוגמאות המוח בעקבות ניסיון התנהגות

The encoding of experiences in the brain and the consolidation of long-term memories depend on gene transcription. Identifying the function of specific ...

המטרה הכללית של הניסוי הבא היא לחקור דינמיקה של שעתוק וגרעיני מוח מוגדרים של עכברים בעקבות התנסות התנהגותית. דבר זה מושג תחילה על ידי הרגלת בעלי החיים והקלטת הפעילות הלוקומטורית שלהם לאחר הזרקת סליין. לאחר ההרגלה, נרשמת הפעילות הלוקומטורית לאחר מנה בודדת של קוקאין, ולאחר מכן נאספים דגימות מה-nucleus accumbens המשמשות לבידוד RNA ולהכנת CDNA.בשלב הבא, מבוצע ניתוח QPCR כדי לחקור ביטוי גנים המושרה על ידי התנהגות. בסופו של דבר, מתקבלים תוצאות המראות דינמיקה של שעתוק בעקבות חשיפה לקוקאין. את הפרוטוקול ידגימו ד"ר Hatu, מנהל המעבדה, Dum Muer, סטודנט לתארים מתקדמים מהמעבדה, ו-Duran, סטודנט לתואר ראשון מהמעבדה. במשך שלושה ימים רצופים, כל עכבר עובר הרגלה לנהלי הטיפול וההזרקה; העכברים מאורגנים בכלובים לפני תחילת הניסוי, כך שהעכברים לא יועברו בין כלובים בעתיד ולא יישארו בבידוד למשך תקופה ממושכת.30 דקות לפני תחילת הבדיקה, יש להעביר את כל כלובי הניסוי לחדר ההתנהגות כדי לאפשר לבעלי החיים להתרגל לסביבה. לאחר מתן זריקה תוך-פריטוניאלית של 250 µL סליין, יש להניח את העכבר בתא התנהגות כדי לנטר את הפעילות המוטורית למשך 15 דקות. ניתן להניח את העכבר בתא ההתנהגות למשך 20 דקות.פעילות שננטרה מהדקה השנייה עד הדקה ה-17. חזור על שלבים אלה באותה שעה של היום במהלך שני הימים הבאים. ביום הרביעי,ןתן הזרקה בודדת של cocaine או saline, בהתאם לקבוצה, והנח מיד את העכבר בתא כדי לנטר פעילות מוטורית מקומית למשך 20 דקות בנקודות זמן נבחרות לאחר החשיפה ל-cocaine, הוצא את המוח והנח אותו בתוך תמיסת A CSF קרה מאוד (בקרח) למשך דקה אחת עד שתי דקות לקירור והקשחה.לאחר הסרת המוзжеולת וספיגת עודפי נוזלים, הדביקו את המוח למסבך של מכשיר ה-vibram כאשר החלק הרוסטרלי פונה כלפי מעלה. מלאו את התא ב-A CSF קר מאוד ובצעו חיתוכים של 200 micron עד לזיהוי ברור של ה-nucleus accumbens. במהלך החיתוך, שימו לב היטב לצורת ה-corpus callosum, למיקום ולצורה של ה-anterior commissure ולחדרים.לאחר זיהוי האזור הנכון, חתכו שני נתחים בעובי 400 microns מהם יבודד ה-nucleus accumbens תחת סטריאוסקופ. השתמשו בלהב דק כדי להפריד את ה-nucleus accumbens מהנתחים. ארבעה מעברים מהירים של הלהב באזור הנכון אמורים לבודד את הרקמה המתאימה באופן מיידי.העבירו את הרקמה המבודדת ל-900 µL של ריאגנט ליזיס, ואחסנו בטמפרטורה של 80°C- עד לביצוע הפקת ה-RNA. כדי להתחיל, הפשירו את המבחנות בטמפרטורה של 37°C ובצעו הומוגניזציה. בעת שימוש במחט בכיול 25 gauge, ייתכן שהסבבים הראשונים יהיו קשים וידרשו דחיסה של הרקמה כנגד דופן המבחנה כדי להומוגניז אותה לחתיכות קטנות. כדי להבטיח הומוגניזציה תקינה, העבירו את הליזאט בעזרת פיפט לתוך עמודת Kaya Shredder Mini Spin ובצעו סנטריפוגה.העבירו בעזרת פיפט את הליזאט למבחנת מיקרו-צנטריפוגה חדשה ובצעו מיצוי של ה-RNA בהתאם להוראות היצרן. לאחר טיהור ה-RNA, תבוצע תעתוק הפוך ל-CDNA וכן הגברה מקדימה (preamplification) ספציפית למטרה של הדגימות באמצעות פריימרים המכוונים לקבוצת הגנים שנבחרה לניתוח. הליכים אלו מתוארים בגרסת הטקסט של הפרוטוקול.שבבים מיקרופלואידיים מסחריים לניתוח QPCR מקיף זמינים בפורמט של 48 על 48, המאפשר ניתוח של 48 דגימות עם 48 סטים של גששים, או בפורמט של 96 על 96 שבו מנותחות 96 דגימות עם 96 גששים. ברוב המקרים, בחירת השבב תלויה בראש ובראשונה במספר הדגימות המנותחות.ראשית, הכינו את תערובת הדגימה בהתאם לשבב שנבחר עבור הניסוי. יש לנהוג בזהירות בעת פיפוט של ריאגנט טעינת הדגימה 20 XDNA binding dye. ערבבו את תמיסות תערובת הדגימה למשך 20 שניות לפחות וסובבו בצנטריפוגה למשך 30 שניות לפחות.ניתן לאחסן תגובות מוכנות למשך פרקי זמן קצרים בטמפרטורה של 4 °C עד שהשבב יהיה מוכן לטעינה. לאחר מכן, הכינו את תערובת הבדיקה, ערבבו את תערובת הדגימה ביסודיות וסובבו בצנטריפוגה כדי להשקיע את כל הרכיבים. כפי שהודגם קודם לכן, לשבב ה-IFC של המערך הדינמי יש פתחי כניסה לדגימות ולבדיקות, וכן פתחי כניסה ייעודיים לנוזל קו הבקרה המשמש להגברת הלחץ בתאי המיקרופלואידיקה.ראשית, הזרק נוזל קו בקרה לכל צבירה (accumulator) על השבב. לאחר מכן, בצע הילוכים (priming) לשבב על ידי הנחתו בבקר ה-IFC והרצת הסקריפט המתאים. עם סיום הסקריפט, הוצא את השבב שעבר הילוכים מבקר ה-IFC וטפטף באמצעות פיפטה 5 µL מכל בדיקה.ערבבו על השבב. הוסיפו חמישה µL מכל תערובת דגימה לכניסותיהן והחזירו את השבב לבקר ה-IFC באמצעות תוכנת בקר ה-IFC. הפעילו את הסקריפט כדי להטעין את הדגימות והבדיקות אל השבב.בסיום הרצת סקריפט טעינת התערובת, הוציאו את השבב הטעון מבקר ה-IFC. לאחר מכן, טענו את השבב למחזור התרמי (thermal cycler) והגדירו הרצה חדשה לשבב הכוללת ניתוח עקומת התכה. באמצעות תוכנת המחזור התרמי, ודאו שתאי התגובה מזוהים כראוי והניחו לתגובה להסתיים.עלייה בפעילות לוקומטורית הייתה ניכרת לאחר הזרקה חדה בודדת של קוקאין. בחתך קורונלי זה, קווים לבנים עבים סימנו את מיקומי החיתוכים שבוצעו להגדרת הגבולות של ה-nucleus accumbens. במהלך הניתוח, עקומות ההגברה של פריימרים המכוונים ל-CFOs ול-phos B מדגימות שזוגות הפריימרים מגבירים את התמליל המטרה ביעילות של כ-100%.בכל מחזור, התוצאות מראות כי ביטוי CFOs ו-phos B בגרעין האקומבנס (nucleus accumbens) שהשרה הקוקאין היה הגבוה ביותר שעה ושעתיים לאחר החשיפה. בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כגון ריצוף דור הבא (next generation sequencing) במטרה לזהות תסניחים (transcripts) חדשים שטרם אופיינו.

comprehensive-analysis-transcription-dynamics-from-brain-samples

Research

JoVE Journal

Behavior

התנהגות

עד לאחרונה, מחקרים ביטוי על המוח האנושי היו מוגבלים כימות של RNA או חלבון. בעזרת טכניקות immunoprecipitation הכרומטין המתואר במאמר זה, ניתן יהיה למפות מתילציה היסטון ורגולטורים אחרים epigenetic של ביטוי גנים במוח שלאחר המוות.

Assay הכרומטין של רקמת מוח האדם

זרימת עבודה יעילה ללמוד מתילציה דנ"א ביטוי שינויים גנטיים על הלחץ מוקדם בחיים מוצג. החל מ הפרידה מן האם של עכברים בני יומם ובידוד של רקמות מוח נפרדים, אנחנו מייצגים את הפרוטוקול בו זמנית לבודד DNA ו-RNA של אגרופים רקמות המוח רצף bisulfite עתידיים RT-PCR ניתוח.

ניתוח אופטימיזציה של מתילציה דנ&quot;א ביטוי גנים מ, אזורים קטנים אנטומית מוגדרים של המוח

המנגנון העומד בבסיס ההשפעות הטיפוליות של ניתוח גירוי מוחי עמוק (DBS) זקוק לחקירה. השיטות המוצגות בכתב יד זה מתארות גישה ניסיונית לבחינת האירועים התאיים המופעלים על ידי DBS על ידי ניתוח פרופיל ביטוי הגנים של גנים מועמדים שיכולים להקל על נוירוגנזה לאחר ניתוח DBS.

ניתוח שינויי ביטוי הגנים בהיפוקמפוס העכברוש לאחר Deep Brain Stimulation של Anterior התלמוס הגרעין

זיהוי מולקולות ומסלולים השולטים בגמישות הסינפטית ובזיכרון הוא עדיין אתגר מרכזי במדעי המוח. כאן, מתואר תהליך עבודה המתייחס לכימות היחסי של חלבונים סינפטיים המעורבים כביכול בארגון מחדש מולקולרי של סינפסות במהלך למידה וגיבוש זיכרון בפרדיגמת למידה שמיעתית.

גבוהה פרופיל Proteome Synaptic החלטה כמותי של אזורים במוח העכבר לאחר למידה אפליה שמיעתית

פרוטוקול זה מתאר שימוש קומבינטורית של שבב-seq, 4sU-seq, הכולל RNA-seq ריבוזום פרופיל עבור שורות תאים ותאים הראשי. הוא מאפשר מעקב אחר שינויים בגורם שעתוק כריכה, תמלול דה נובו , עיבוד RNA, מחזור, תרגום לאורך זמן, ומציג את השתלשלות האירועים הכוללת בתאים מופעל ו/או המשתנה במהירות.

ניתוח בזמן אמת של גורם שעתוק כריכה, תמלול, תרגום, מחזור ולהציג אירועים גלובליים במהלך ההפעלה הסלולרית

כאן, אנו מתארים את הפרוטוקול ואת יישומו של מתיל-Seq, פלטפורמה epigenomic, באמצעות מודל עכברוש לזיהוי שינויים epigenetic הקשורים בחשיפה מתח כרוני. תוצאות מדגימים כי פלטפורמת מתיל-Seq עכברוש הוא מסוגל זיהוי הבדלים מתילציה הנובעים מחשיפה ללחץ אצל חולדות.

פלטפורמה מתיל-Seq חולדה כדי לזהות שינויים Epigenetic הקשורים בחשיפה מתח

אנו מציגים שיטה המותאמת במיוחד כדי לדמות את המוח כולו של Drosophila הבוגר במהלך ההתנהגות בתגובה לגירויים. הראש ממוקם כדי לאפשר גישה אופטית לכל המוח, בעוד הזבוב יכול להזיז את רגליו ואת האנטנות, את קצה הפרובוסיס, והעיניים יכולות לקבל גירויים חושיים.

הכנת מלנוגאסטר דרוזופילה למבוגרים להדמיית מוח שלמה במהלך תגובות התנהגות וגירויים

פרוטוקול זה מתאר את השימוש במכשיר הקלטה מותאם אישית ובאלקטרודות כדי להקליט פוטנציאלים של שדות מקומיים ולחקור את זרימת המידע בהיפוקמפוס העכבר ובקליפת המוח הקדם-מצחית.

הקלטות חוץ-תאיות כפולות בהיפוקמפוס העכבר ובקליפת המוח הקדם-מצחית

מוצג כאן צינור ניתוח וידאו המתגבר על אתגרים בניטור התנהגותי בסביבות MRI, ומאפשר זיהוי תגובות התנהגותיות ללא הדרכה לרמזים חיצוניים. ניתוח זה יאפשר הבנה מקיפה יותר של שינויים במצב פנימי מעוררים ופעילות כלל-מוחית.

פרופיל תגובות התנהגות אימהיות במהלך הדמיה של כל המוח

פרוטוקול זה נותן מסגרת משולבת המבוססת על שיטות נוירו-אתולוגיות חישוביות מתקדמות להבנת קידוד מוח בהקשרים נטורליסטיים.

פענוח התנהגות טבעית מהטמעה נוירו-אתולוגית

מאמר זה מציג פרוטוקול לשימוש ב-DeepSpaceDB, מסד נתונים דינמי ואינטראקטיבי לתעתיק מרחבי, המציע זרימות עבודה ודוגמאות לחקר ארגון רקמות וביטוי גנים הקשורים למחלות.

כריית מערכי נתונים של טרנסקריפטומיקה מרחבית באמצעות DeepSpaceDB

חקור דינמיקה תמלולית בגרעין האקומבנס של עכברים לאחר חשיפה לקוקאין באמצעות qPCR. פרוטוקול זה מאפשר ניתוח ביטוי גנים בתגובה לגירויים התנהגותיים במחקר התמכרויות.

ניתוח מקיף של תמלול Dynamics מדוגמאות המוח בעקבות ניסיון התנהגות

גלה סרטונים נוספים