הבהרת שיטה חדשה למדמיין המרה ניוון בכבד מטמורפוזה בים צמד הים ( Petromyzon מרינוס)

המטרה הכללית של הליך זה היא להבהיר את הכבד כולו ואת נקודת החיבור למעי לצורך ניתוחים גלובליים, מבניים ותאיים של דגנרציה של דרכי המרה בנחליל (lamprey) מסוג C בשלב המטמורפוזה. דבר זה מושג תחילה על ידי קיבוע הרקמות בתמיסת מונומר של הידרוג'ל.

בשלב הבא, ההידרוג'ל עובר פולימריזציה יחד עם הרקמות המקובעות. לאחר מכן, ממברנת הפלזמה של הרקמה המקובעת מוסרת והרקמה הופכת לשקופה. לבסוף, מבוצע צביעה אימונופלואורסצנטית, ובסופו של דבר נעשה שימוש בסריקת לייזר ומיקרוסקופיה קונפוקלית כדי להדגים שינויים מבניים ותאיים גלובליים במהלך דגנרציה של דרכי המרה ב-metamorphic c Lampry.

שיטה זו יכולה לסייע במתן תשובות לשאלות מפתח בתחום הביו-רפואי, כגון הקונקטומיות (connectomes) במערכת העצבים המרכזית, ובמקרה שלנו, דגנראציה של דרכי המרה במהלך מטאמורפוזה של serum point. להשלכות של טכניקה זו יש פוטנציאל בתחום הטיפול או האבחון של אטרזיה של דרכי המרה בבני אדם, מכיוון שמחלה מולדת נדירה זו בתינוקות חולקת מאפיינים דומים לדגנראציה של דרכי המרה במהלך מטאמורפוזה של serum point. הרעיון לשיטה זו עלה לראשונה כאשר מצאנו מאמר חדשותי ב-nature והצגנו את הסרטון המקוון במהלך פגישת המעבדה שלנו, אשר הדגים את הפרוצדורה שתבצע Ann Scott, סטודנטית לתואר מתקדם מהמעבדה שלנו, לאחר הכנת תמיסת סליין עם בופר פוספט (phosphate buffered saline) ובופר פוספט (phosphate buffer או pb), בהתאם לפרוטוקול הכתוב.

בתוך מנדף כימיים, הכין 400 milliliters של הידרוג'ל על ידי ערבוב של מים מזוקקים, 40%acrylamide 2%bis acrylamide 10 XPBS, 16%paraform, aldehyde, saponin, ו-ammonium per sulfate. הכין ליטר אחד של תמיסת הבהרה (clearing solution) המורכבת מ-4%SDS ו-0.2 molar boric acid, והכן 500 milliliters של 80%glycerol להכנת הרקמה בתוך המנדף. העבר 10 milliliters של תמיסת מונומר הידרוג'ל לתוך מבחנות צנטריפוגה של 15 milliliter.

יש לנתח את דגימת הרקמה ולהניח את הרקמה לתוך כל מבחנה של מקבע הידרוג'ל בטמפרטורה של 4 °C למשך יומיים. לאחר הדגירה תחת מ इथे, יש לבצע פולימריזציה של הרקמה המקובעת על ידי הוספת 5 µL של temid. לאחר מכן, יש לערבב היטב ולאפשר לדגימות לעבור דגירה בטמפרטורת החדר למשך שעתיים עד שלוש שעות.

לאחר הדגירה, הסירו ביסודיות את שאריות הג'ל כדי לנקות את דגימות הרקמה. העבירו כל דגימה ל-15 milliliters של תמיסת שקיפות (clearing solution) והדגירה בטמפרטורה של 50 °C ובמהירות של 70 RPMs למשך מספר ימים, עד להפיכתן לשקופות. החליפו את תמיסת השקיפות לפחות פעם אחת ביום והסירו כל שארית ג'ל עודפת.

העבירו את הדגימות ל-15 milliliters של 0.1 molar PB עם 0.1%Triton X 100 בטמפרטורה של 37 degrees Celsius ובמהירות של 70 RPMs למשך הלילה. חזרו על האינקובציה פעמיים נוספות עם באפר טרי. כעת, לאחר שהרקמה שקופה ונקייה משאריות ג'ל, טבלו את הדגימות בנוגדן ראשוני ב-PB tritton X 100 והדגרימו ב-37 degrees Celsius וב-70 RPMs למשך יומיים. לאחר האינקובציה, השתמשו ב-15 milliliters של PB עם 0.1%tritton X 100 כדי לשטוף את דגימות הרקמה ב-37 degrees Celsius וב-70 RPMs למשך הלילה.

חזור על השטיפה שלוש פעמים לאחר הסרת תמיפת השטיפה האחרונה, הוסף תמיסת נוגדן משני פלואורסצנטי ב-PB עם 0.1% Trix 100 וסרום חוסם, והדגר בחושך בטמפרטורה של 37 degrees Celsius ובמהירות של 70 RPMs למשך יום אחד. לאחר שטיפת הדגימות שלוש פעמים ב-10 milliliters של PB tritton X 100 בטמפרטורה של 37 degrees Celsius ובמהירות של 70 RPMs למשך הלילה, בצע שלוש שטיפות למשך הלילה ב-PBS. לבסוף, הדגר את הרקמה המזוכללת ב-80% glycerol בכיסוי של נייר אלומינום למשך הלילה.

דימוי במיקרוסקופיה קונפוקאלית מבוצע לאחר מכן באור חשוך או עמום, אם כי בסרטון זה האורות דלוקים לצורכי ויזואליזציה. מספר אירועי התפתחות חשובים מתרחשים במערכת המרה של הכבד במהלך המטמורפוזה של ה-lamprey, לדוגמה, כפי שמוצג כאן, צינור המרה וכיס המרה עוברים אפופטוזיס וניוון. לאחר שימוש בשיטת הבהרה משופרת וצביעה עם הסמן לתאי כבד cytokeratin 19 וסמן אנטי-אפופטוטי BCL two, נעשה שימוש במיקרוסקופיה קונפוקאלית עם סריקה בלייזר לביצוע חיתוך אופטי דרך הכבד השלם.

הצביעה חשפה כי התהליך הניווני מתרחש בשלבים המטמורפיים שני עד ארבעה. הפאנלים העליונים הם מהקצה הקדמי והפאנלים התחתונים הם מהקצה האחורי. מוצג כאן עץ המרה וכאן תאים אפופטוטיים בעלי מראה דנדריטי כהה, וסביבם קנליקולי וצינורות בכבד.

איור זה מציג תמונות תלת-ממדיות ששוחזרו מסדרת Z קונפוקלית של שלושה כבדים בין שלבי גלגול שני ושלישי, המסומנים בנוגדי גופים נגד cytokeratin 19 ו-BCL two; עץ המבנה המגאלורסי (biliary tree) ותאי אפופטוזה כהים בעלי מראה דנדריטי, וכן קניקולות וצינורות מקיפים מסומנים בחצים לבנים ושחורים בהתאמה. מוצג כאן חיתוך אופטי קונפוקלי של צינורות המרה של דגימה בין שלבי גלגול שני ושלישי עם טיפות מרה בתוך הלומן. לאחר צפייה בסרטון זה, תהיה לכם הבנה טובה לגבי אופן הפיקת כל הרקמה לצורך ניתוחי דימיון נוספים.

יש לזכור כי עבודה עם תמיסות של פראפורמאלדהיד ופוליאקרילאמיד עלולה להיות מסוכנת ביותר, ויש לנקוט תמיד באמצעי זהירות, כגון חבישת כפפות ושימוש במנדף, בעת ביצוע פרוטוקול זה.