הבהרת שיטה חדשה למדמיין המרה ניוון בכבד מטמורפוזה בים צמד הים ( Petromyzon מרינוס)

המטרה הכוללת של הליך זה היא להבהיר את הכבד כולו ואת הצומת עם המעי לצורך ניתוחים גלובליים, מבניים ותאים של ניוון המרה. בצמד C מטמורפי. זה מושג על ידי קיבוע הרקמות בתמיסת מונומר ההידרוג'ל.

לאחר מכן, ההידרוג'ל מפולמר עם הרקמות הקבועות. לאחר מכן מסירים את קרום הפלזמה של הרקמה הקבועה והרקמה הופכת לשקופה. לבסוף, צביעה אימונו-פלואורסצנטית מבוצעת בסופו של דבר בלייזר עור ומיקרוסקופיה קונפוקלית משמשת להצגת שינויים מבניים ותאים גלובליים במהלך ניוון המרה ב-C Lampry המטמורפי.

שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום הביו-רפואי, כגון הקונקטומים במערכת העצבים המרכזית, ובמקרה שלנו, ניוון המרה במהלך מטמורפוזה של נקודת הסרום. ההשלכות של טכניקה זו משתרעות על טיפול או אבחון של מרה אנושית או אטרזיה מכיוון שמחלת תינוקות מולדת נדירה זו חולקת מאפיינים דומים עם ניוון ארי במהלך מטמורפוזה של נקודת הסרום. הרעיון לשיטה זו עלה לנו לראשונה כאשר מצאנו כתבה חדשותית בטבע והצגנו את הסרטון המקוון במהלך פגישת המעבדה שלנו המדגים את ההליך תהיה אן סקוט, סטודנטית לתואר שני מהמעבדה שלנו לאחר הכנת תמיסת מלח מבודדת פוספט ומאגר פוספט או pb, על פי פרוטוקול הטקסט.

במכסה אדים, הכינו 400 מיליליטר הידרוג'ל על ידי שילוב מים מזוקקים, 40% אקרילאמיד 2% ביס אקרילאמיד 10 XPBS, 16% פרפורם, אלדהיד, ספונין ואמוניום לסולפט. הכינו ליטר אחד של תמיסת ניקוי המורכבת מ-4% SDS ו-0.2 חומצה בורית מולארית, והכינו 500 מיליליטר של 80% גליצרול להכנת רקמה במכסה האדים. Eloqua 10 מיליליטר של תמיסת מונומר הידרוג'ל לצינורות צנטריפוגה של 15 מיליליטר.

נתח את דגימת הרקמה והנח את הרקמה בכל צינור של תיקון הידרוג'ל בארבע מעלות צלזיוס למשך יומיים. לאחר הדגירה מתחת למכסה אדים, פילמרו את הרקמה הקבועה על ידי הוספת חמישה מיקרוליטרים של טמיד. לאחר מכן מערבבים היטב ומאפשרים לדגימות לדגור עליו בטמפרטורת החדר למשך שעתיים-שלוש.

לאחר הדגירה, הסר היטב את עודפי הג'ל כדי לנקות את דגימות הרקמה. מניחים כל אחד ב-15 מיליליטר של תמיסת פינוי ודוגרים ב-50 מעלות צלזיוס ו-70 סל"ד למשך מספר ימים עד שהם הופכים שקופים. יש להחליף את תמיסת הניקוי לפחות פעם ביום ולהסיר עודפי ג'ל.

העבירו את הדגימות ב-15 מיליליטר של 0.1 PB מולארי עם 0.1% טריטון X 100 ב-37 מעלות צלזיוס ו-70 סל"ד למשך הלילה. חזור על הדגירה פעמיים נוספות עם מאגר טרי. כעת, לאחר שהרקמה נוקתה ונקייה מכל ג'ל עודף, טבלו את הדגימות בנוגדנים ראשוניים ב-PB tritton X 100 ודגרו ב-37 מעלות צלזיוס ו-70 סל"ד למשך יומיים לאחר הדגירה, השתמשו ב-15 מיליליטר PB עם 0.1% טריטון X 100 כדי לשטוף את דגימות הרקמה ב-37 מעלות צלזיוס ו-70 סל"ד למשך הלילה.

חזור על הכביסה שלוש פעמים לאחר הסרת מאגר הכביסה הסופי, הוסף תמיסת נוגדנים משנית פלואורסצנטית ב-PB עם 0.1%Trix 100 וחסימת סרום ודגירה בחושך ב-37 מעלות צלזיוס ו-70 סל"ד למשך יום אחד. לאחר שטיפת הדגימות שלוש פעמים ב-10 מיליליטר של PB tritton X 100 ב-37 מעלות צלזיוס ו-70 סל"ד למשך הלילה, בצע שלוש שטיפות לילה ב-PBS. לבסוף דגרו את הרקמה המובהרת ב-80% גליצרול מכוסה בנייר כסף למשך הלילה.

הדמיית מיקרוסקופיה קונפוקלית מבוצעת לאחר מכן באור כהה או עמום, אם כי האורות דולקים בסרטון זה למטרות הדמיה. מספר אירועים התפתחותיים חשובים מתרחשים במערכת המרה HEPA במהלך מטמורפוזה של c lampre, למשל, כפי שמוצג כאן, צינור המרה וכיס המרה עוברים אפופטוזיס ומתנוונים. לאחר שימוש בשיטת ההבהרה המותאמת וצביעה עם סמן תאי כבד ציטוקרטין 19 סמן אנטי אפופטוטי, נעשה שימוש במיקרוסקופיה קונפוקלית של סריקת לייזר BCL לביצוע חתך אופטי דרך הכבד השלם.

הצביעה העלתה כי התהליך הניווני מתרחש בשלבים מטמורפיים שניים עד ארבע. הלוחות העליונים הם מהחלק הקדמי והלוחות התחתונים הם מהקצה האחורי. מוצג כאן עץ המרה והנה תאים אפופטוטיים כהים למראה דנדריטי וכלי תעלות וצינורות בכבד.

איור זה מייצג תמונות תלת מימדיות המשחזרות את סדרת Z הקונפוקלית של שלושה כבדים בין שלבים מטמורפיים 2 ו-3 המסומנים בנוגדנים נגד ציטוקרטין 19 ו-BCL 2, עץ המרה והתאים האפופטוטיים הכהים למראה דנדריטי וכלי התעלות והצינורות שמסביב מסומנים על ידי חיצים לבנים ושחורים בהתאמה. מוצג כאן חתך אופטי קונפוקלי של דרכי המרה של דגימה בין שלבים מטמורפיים 2 ו-3 עם טיפות מרה בלומן. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד להבהיר את הרקמה כולה לצורך ניתוחי הדמיה נוספים.

אל תשכח שעבודה עם תמיסות פרפורם, אלדהיד ופולי אקרילאמיד עלולה להיות מסוכנת ביותר, ותמיד יש לנקוט באמצעי זהירות כגון לבישת כפפות ושימוש במכסה האדים בעת ביצוע הליך זה.