Name: הבהרת שיטה חדשה למדמיין המרה ניוון בכבד מטמורפוזה בים צמד הים ( Petromyzon מרינוס) (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-06-06T14:15:00.000+00:00
Duration: 7 min 3 s
Description: למד שיטת CLARITY מותאמת לחקר ניוון מערכת המרה בדג-נרוק Petromyzon marinus במהלך מטמורפוזה. השיטה מאפשרת הדמייה תלת-ממדית של מבני כבד שקופים באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים מודים לתרומה של מפרץ המונד ביולוגי תחנה, אגמי מרכז מדע גדול, גיאולוגי אמריקאי. אנו מודים גם למסגרת ד&quot;ר מלינדה במרכז למיקרוסקופי מתקדם באוניברסיטת מדינת מישיגן לתמיכה הטכנית שלה במיקרוסקופיה confocal סריקת לייזר. מחקר זה נתמך על ידי מענקים מוועדת דיג האגמים הגדולים לYWCD ו-WML.

1. פתרון הכנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך L 1 10x 0.1 M חיץ מלוח פוספט (PBS, pH 7.4): לשקול 26.2 פוספט נתרן g (monobasic), 115 פוספט נתרן g (dibasic), ו87.66 NaCl גרם. ממיסים בכ -800 מיליליטר מזוקק H 2 O, להתאים את pH, ולהעלות את עוצמת הקול ל1 ליטר עם מזוקקי H 2 O. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך מלוח 1 L 0.1 M חיץ פוספט (pH 7.4): קח 100 מיליליטר 10x PBS, ולהוסיף 900 מיליליטר מזוקק H 2 O. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך מלוח 1 L 0.1 M חיץ פוספט (pH 7.4) עם 0.1% טריטון X-100: קח 100 מיליליטר 10x PBS, להוסיף 1 מיליליטר טריטון X-100, ולהביא את הנפח של עד 1 ליטר עם מזוקקי H 2 O. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך חיץ L 1 0.1M 10x פוספט (PB, pH 7.4): לשקול 26.2 פוספט נתרן g (monobasic) ו115 פוספט נתרן g (dibasic). ממיסים בכ -800 מיליליטר מזוקק H 2 O, להתאים את pH, ולהעלות את עוצמת הקול ל1 ליטר עם מזוקקי H 2 O. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך 1 L 0.1 M חיץ פוספט (pH 7.4): קח 100 מיליליטר PB 10x,ולהוסיף 900 מיליליטר מזוקק H 2 O. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך 1 L 0.1 M חיץ פוספט (pH 7.4) עם 0.1% טריטון X-100: קח 100 PB 10x מיליליטר, להוסיף 1 מיליליטר טריטון X-100, ולהביא את הנפח של עד 1 ליטר עם מזוקקי H 2 O. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך פתרון מונומר הידרוג&#39;ל 400 מיליליטר (acrylamide 4%, 0.25% bis-acrylamide, paraformaldehyde 4%, 0.0075% persulfate אמוניום, saponin 0.0005% ב0.1 M PBS): לשקול 0.3 persulfate אמוניום גרם ו0.2 saponin גרם. הוספת 210 מיליליטר מזוקק H 2 O, acrylamide 40 מיליליטר 40%, 10 מיליליטר 2% bis-acrylamide, 40 מיליליטר 10x PBS (pH 7.4), 100 מיליליטר paraformaldehyde 16%, ומערבבים היטב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך פתרון 4 L סליקה (4% SDS בחומצה בור 0.2 ז): לשקול 49.464 חומצה בור גרם ו160 גרם SDS. ממיסים בH על 3.5 L מזוקק 2 O, כדי להתאים את pH 8.5 עם NaOH, ולהביא את הנפח עד 4 L. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך פתרון גליצרול 80% L 1: מדוד גליצרול 800 מיליליטר, להוסיף 200 מיליליטר מזוקק H 2 O, ומערבבים היטב. </li></ol> 2. הכנת רקמה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרון הידרוג&#39;ל מונומר וaliquot 10 מיליליטר לכל צינור צנטריפוגות 15 מיליליטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתח את כל הרקמות ולתקן בהידרוג&#39;ל ל2 ימים ב 4 ° C. ודא כי פתרון הידרוג&#39;ל הוא לפחות 10x הנפח של הרקמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תביא את רקמות הידרוג&#39;ל הקבועים (בצינור צנטריפוגות 15 מיליליטר) למכסת מנוע קטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פלמר הרקמות קבועות הידרוג&#39;ל ידי הוספת 5 μl TEMED, לערבב היטב, ולתת לשבת במנדף בטמפרטורת חדר למשך 2-3 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את הג&#39;ל העודף ביסודיות. הערה: ג&#39;ל במיוחד יהיה לעכב את תהליך הסליקה וחדירת הנוגדנים במהלך מכתים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה הרקמות קבועות ב10 מיליליטר ניקוי פתרון שבייקר אינקובטור נקבעו על 70 סל&quot;ד ו50 מעלות צלזיוס במשך כמה ימים עד שהרקמה הופכת שקופה. שינוי פתרון ניקוי לפחות פעם ביום ולהסיר את הג&#39;ל העודף מהרקמות כאשר משנה את פתרון הסליקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש לשטוף את הרקמה ב10 מיליליטר 0.1 M PB עם 0.1% טריטון X-100 ב70 rבערב, ו37 ° C במשך לילה. חזור על פעולה זו 3 פעמים ולהסיר את הג&#39;ל העודף מהרקמות כאשר משנה את פתרון החיץ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה הרקמה הבהירה בפתרון הנוגדן הראשוני בPB עם 0.1% טריטון X-100 ב70 סל&quot;ד ו37 מעלות צלזיוס למשך 2 ימים. שים לב: להפוך את פתרון נוגדן ראשוני מספיק כדי להטביע את כל הרקמות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש לשטוף את הרקמה ב10 PB מיליליטר עם 0.1% טריטון X-100 ב70 סל&quot;ד ו37 מעלות צלזיוס למשך לילה. חזור על פעולה זו 3 פעמים ולהסיר את הג&#39;ל העודף מהרקמות כאשר משנה את פתרון החיץ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע את השלבים הבאים בחדר חשוך או תחת אור עמום. כסה את הדגימות עם נייר כסף כדי למנוע הלבנת צילום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה הרקמה הבהירה עם פתרון הניאון המשני נוגדנים בPB עם 0.1% טריטון X-100 וסרום החסימה ב70 סל&quot;ד ו37 מעלות צלזיוס במשך יום 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש לשטוף את הרקמה ב10 PB מיליליטר עם 0.1% טריטון X-100 ב70 סל&quot;ד ו37 מעלות צלזיוס למשך לילה. חזור על פעולה זו 3 פעמים ולהסיר את f ג&#39;ל העודפתrom הרקמה בעת שינוי פתרון החיץ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש לשטוף את הרקמה ב10 מיליליטר PBS ב70 סל&quot;ד ו37 מעלות צלזיוס למשך לילה. חזור על פעולה זו 3 פעמים ולהסיר את הג&#39;ל העודף מהרקמות כאשר משנה את פתרון החיץ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה הרקמה הבהירה בגליצרול 80% ב70 סל&quot;ד ו37 לילה מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחסן את הרקמה הצבעונית הניאון על 4 מעלות צלזיוס לפני מיקרוסקופיה confocal. </li></ol>

<ol><li>Applegate, V. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Natural+history+of+the+sea+lamprey+%28Petromyzon+marinus%29+in+Michigan%5BTitle%5D)+AND+%22US+Fish+and+Wildlife+Service+Special+Science+Report+on+Fishery+Service%22%5BJournal%5D)">Natural history of the sea lamprey (Petromyzon marinus) in Michigan.</a> US Fish and Wildlife Service Special Science Report on Fishery Service. (55), (1950).</li>
<li>Hardisty, M. W., Potter, I. C. The general biology of adult lampreys. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHardisty%2C+MW+%22The+biology+of+lampreys%22">The biology of lampreys</a>. Hardisty, M. W., Potter, I. C. 1, New York Academic Press. 127-206 (1971).</li>
<li>Youson, J. H., Potter, I. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+description+of+the+stages+in+the+metamorphosis+of+the+anadromous+sea+lamprey%2C+Petromyzon+marinus+L%5BTitle%5D)+AND+%22Can.+J.+Zool%22%5BJournal%5D)">A description of the stages in the metamorphosis of the anadromous sea lamprey, Petromyzon marinus L.</a> Can. J. Zool. 57, 1808-1817 (1979).</li>
<li>Boomer, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cholangiocyte+apoptosis+is+an+early+event+during+induced+metamorphosis+in+the+sea+lamprey%2C+Petromyzon+marinus+L%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pediatr.+Surg%22%5BJournal%5D)">Cholangiocyte apoptosis is an early event during induced metamorphosis in the sea lamprey, Petromyzon marinus L.</a> J. Pediatr. Surg. 45, 114-120 (2010).</li>
<li>Kasai, M., Suzuki, H., Ohashi, E., Ohi, R., Chiba, T., Okamoto, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Technique+and+results+of+operative+management+of+biliary+atresia%5BTitle%5D)+AND+%22World+J.+Surg%22%5BJournal%5D)">Technique and results of operative management of biliary atresia.</a> World J. Surg. 2, 571-580 (1978).</li>
<li>Suzuki, T., Hashimoto, T., Kondo, S., Sato, Y., Hussein, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluating+patients%E2%80%99+outcome+post-Kasai+operation%3A+a+19-year+experience+with+modification+of+the+hepatic+portoenterostomy+and+applying+a+novel+steroid+therapy+regimen%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatr.+Surg.+Int%22%5BJournal%5D)">Evaluating patients’ outcome post-Kasai operation: a 19-year experience with modification of the hepatic portoenterostomy and applying a novel steroid therapy regimen.</a> Pediatr. Surg. Int. 26, 825-830 (2010).</li>
<li>Hartley, J. L., Davenport, M., Kelly, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biliary+atresia%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Biliary atresia.</a> Lancet. 374, 1704-1713 (2009).</li>
<li>Morecki, R., Glaser, J. H., Cho, S., Balistreri, W. F., Horwitz, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biliary+atresia+and+reovirus+type+3+infection%5BTitle%5D)+AND+%22New+Engl.+J.+Med%22%5BJournal%5D)">Biliary atresia and reovirus type 3 infection.</a> New Engl. J. Med. 307, 481-484 (1982).</li>
<li>Shimadera, S., Iwai, N., Deguchi, E., Kimura, O., Fumino, S., Yokoyama, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+inv+mouse+as+an+experimental+model+of+biliary+atresia%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pediatr.+Surg%22%5BJournal%5D)">The inv mouse as an experimental model of biliary atresia.</a> J. Pediatr. Surg. 42, 1555-1560 (2007).</li>
<li>Sidon, E. W., Youson, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphological+changes+in+the+liver+of+the+sea+lamprey%2C+Petromyzon+marinus+L.%2C+during+metamorphosis%3A+I.+Atresia+of+the+bile+ducts%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Morphol%22%5BJournal%5D)">Morphological changes in the liver of the sea lamprey, Petromyzon marinus L., during metamorphosis: I. Atresia of the bile ducts.</a> J. Morphol. 177, 109-124 (1983).</li>
<li>Yeh, C. -Y., Chung-Davidson, Y. -W., Wang, H., Li, K., Li, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+synthesis+and+secretion+of+bile+salts+as+an+adaptation+to+developmental+biliary+atresia+in+the+sea+lamprey%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Nat.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Intestinal synthesis and secretion of bile salts as an adaptation to developmental biliary atresia in the sea lamprey.</a> Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 109, 11419-11424 (2012).</li>
<li>Chung, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+and+molecular+interrogation+of+intact+biological+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structural and molecular interrogation of intact biological systems.</a> Nature. 497, 332-337 (2013).</li>
<li>Alarcón, V. B., Filosa, M. F., Youson, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytokeratins+in+the+liver+of+the+sea+lamprey+%28Petromyzon+marinus%29+before+and+after+metamorphosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Tissue+Res%22%5BJournal%5D)">Cytokeratins in the liver of the sea lamprey (Petromyzon marinus) before and after metamorphosis.</a> Cell Tissue Res. 287, 365-374 (1997).</li>
<li>Youson, J. H., Ogilvie, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrastructural+features+of+degeneration+of+the+gallbladder+during+lamprey+biliary+atresia%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+and+Cell%22%5BJournal%5D)">Ultrastructural features of degeneration of the gallbladder during lamprey biliary atresia.</a> Tissue and Cell. 22, 477-492 (1990).</li>
<li>Morii, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Onset+of+apoptosis+in+the+cystic+duct+during+metamorphosis+of+a+Japanese+lamprey%2C+Lethenteron+reissneri%5BTitle%5D)+AND+%22Anat.+Rec%22%5BJournal%5D)">Onset of apoptosis in the cystic duct during metamorphosis of a Japanese lamprey, Lethenteron reissneri.</a> Anat. Rec. 293, 1155-1166 (2010).</li>
</ol>

יש המחברים אין לחשוף.

פרוטוקול זה הוא שונה משיטה חדשה הנקראת &quot;בהירות&quot; 12, שCrosslinks רקמות שלמות עם polyacrylamide כדי ליצור הידרוג&#39;ל nanoporous, ולאחר מכן רצועות מן קרום הפלזמה של הרקמה כדי להשיג שקיפות אופטית וחדירות macromolecular. &quot;בהירות&quot; מאפשרת הדמיה בשלמות רקמות של השלכה ארוך טווח וחיווט במעגל מקומי במערכת העצבים. שיטה חדשה זו יכולה לשמש גם כדי להמחיש את מערכת המרה כולו בכבד צמד ים הים במהלך מטמורפוזה. זהו אתגר בביולוגיה כדי להשיג מידע ברזולוציה גבוהה ולשמור ע...

צמד ים ים לפתח דרך שלושה שלבי חיים שונים 1,2. צמד ים הזחל ים (L) מבלה את רוב הזמן במחילות כמו מתקני האכלת מסנן של קרקעית ים. לאחר שעובר שבעה שלבים מותמרים של שינויים דרמטיים במורפולוגיה וארגון מחדש באיברים פנימיים 3 חיצוניים, וכתוצאה מכך בני הנוער (JV) להיכנס לשלב טפיל שבמהלכו הם ניזונים דם ונוזלי רקמה מדג מארח, להגדיל את מסת הגוף יותר מ 100 פעמים . לאחר 1.0-1.5 שנות האכלה על דגי המארח בים או אגמים גדולים, מבוגרים להפסיק האכלה בתחילת האביב ונודדים לתוך נהרות כדי להשריץ ואז למות 1,2. במהלך המטמורפוזה, כבד צמד ים הים מאבד את כיס מרה ועץ המרה כולו, פנוטיפ מוטנטי אבולוציוני המחקה את atresia המרה מחלת תינוק האנושי. atresia מרה תינוקות הוא מחלת כבד נדירה בילדים עם סיבוכים רפואיים קשים 4,5,6,7, 8,9,10, לעומת זאת פתוגנזה ואטיולוגיה של atresia המרה אינן ידועות ברוב 4. חולים עם אטרזיה המרה למות בתוך שנתיים לאחר לידה, אלא אם כן התערבות כירורגית (הליך קסאי) מתבצעת 5. כתוצאה מכך, חולים אלה מחייבים ניהול נרחב קליני ולעתים קרובות השתלה כבד 6. תאוריות של etiopathogenesis atresia מרה רבות הוצעו, כגון זיהום ויראלי, מומים מולדים, מחלות אוטואימוניות, ועלבון רעיל. עם זאת, תרומתו של כל לפיתוחה של atresia המרה נשארת חד משמעית 7,8,9,10. בניגוד לתינוקות שסובלים atresia המרה פתולוגי, צמד ים הים לעבור בחינה התפתחותית מתוכנת atresia מרה ללא necroinflammation נרחב, סיסטיק או שחמת 10. בעלי החיים עלולים לסבול cholestasis חולפת במהלך תהליך זה 10, אבל להסתגל למצב ההתפתחותי הזהבאמצעות דה נובו סינתזה והפרשה של מלחי מרה במעי לאחר atresia מרה התפתחותי, בנוסף למנגנונים ידועים כגון הפחתה של סינתזת מלח מרה בכבד 11. תהליך התפתחותי זה בצמד ים ים מספק את ההזדמנות היחידה הידועה כדי לבחון את ההתקדמות של atresia מרה. שיטה חדשה שפותחה בשם &quot;בהירות&quot; מאפשרת הדמיה ברזולוציה גבוהה במערכות עצבים של יונקים מורכבים על ידי הפיכת רקמות שלמות להידרוג&#39;ל nanoporous השקוף אופטי 12. שימוש בכבד צמד ים ים ופרוטוקול CLARITY שונה, הדמיה בשלמות רקמות של ניוון מרה יכולה להיות מתועדת לאורך המטמורפוזה כבד.

<table><tbody><tr><td>40% אקרילאמיד&nbsp;</td><td>ביו-ראד</td><td>161-0140</td><td></td></tr><tr><td>2% ביס-אקרילאמיד&nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0142</td><td></td></tr><tr><td>TEMED</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0800</td><td></td></tr><tr><td>אמוניום פרסולפט&nbsp;</td><td>סיגמא</td><td>A3678-25G</td><td></td></tr><tr><td>חומצה בורית</td><td>סיגמא</td><td>B7901-1KG</td><td></td></tr><tr><td>ספונין&nbsp;</td><td>סיגמא</td><td>47036</td><td></td></tr><tr><td>נתרן דודציל סולפט&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>L337-500G</td><td></td></tr><tr><td>נתרן פוספט (מונובסיסי)</td><td>Sigma</td><td>04269-1KG</td><td></td></tr><tr><td>נתרן פוספט (דו-בסיסי)</td><td>Sigma</td><td>S5136-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>X100-500ML</td><td></td></tr><tr><td>גליצרול&nbsp;</td><td>סיגמא</td><td>G9012-500 מ"ל</td><td></td></tr><tr><td>16% פרפורמלדהיד&nbsp;</td><td>מדעי מיקרוסקופיה אלקטרונית</td><td>15710-S</td><td></td></tr><tr><td>כדורי NaOH&nbsp;</td><td>EMD</td><td>SX0590-3</td><td></td></tr><tr><td>צינורות צנטריפוגה 15 מ"ל</td><td>כל מותג</td><td></td><td></td></tr><tr><td>כלי ניתוח&nbsp;</td><td>כל מותג</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

הבהרת שיטה חדשה למדמיין המרה ניוון בכבד מטמורפוזה בים צמד הים ( petromyzon מרינוס)

A New Clarification Method to Visualize Biliary Degeneration During Liver Metamorphosis in Sea Lamprey (Petromyzon marinus)

atresia מרה הוא מחלה נדירה של ינקות, עם 1 ב15,000 תדירות מוערכת בארצות הברית דרום מזרח, אך נפוצה יותר במדינות מזרח אסיה, עם תדירות מדווחת של 1 ב5,000 בטייוואן. למרות שהרבה ידוע על ניהול atresia מרה, פתוגנזה שלה היא עדיין חמקמקה. צמד ים הים (מרינוס Petromyzon) מספק הזדמנות ייחודית לבחון את המנגנון והתקדמות של ניוון מרה. צמד ים הים לפתח דרך שלושה שלבי חיים שונים: זחל, טפיל, ומבוגרים. במהלך המעבר מזחלים לנוער טפיל, צמד ים הים עובר מטמורפוזה עם ארגון מחדש דרמטי ושיפוץ במורפולוגיה חיצונית ואיברים פנימיים. בכבד, מערכת המרה כולו הולכת לאיבוד, ובם כיס המרה ועץ המרה. שיטה חדשה שפותחה בשם &quot;בהירות&quot; שונה כדי להבהיר את כל הכבד והצומת עם המעי בצמד ים ים מותמרים.התהליך של ניוון מרה היה דמיינו ולהבחין במטמורפוזה צמד ים ים באמצעות מיקרוסקופיה confocal סריקת לייזר. שיטה זו מספקת כלי רב עוצמה כדי לחקור atresia מרה במודל של בעלי חיים ייחודיים.

אירועים התפתחותיים חשובים כמה להתרחש במערכת של כיס המרה במהלך המטמורפוזה צמד ים לים. צינור המרה וכיס המרה עוברים אפופטוזיס ומנוון (איור 1). שילוב של שיטת ההבהרה שונה וצביעה עם cytokeratin כבד סמן תא 19 (CK19, בהווה בשני cholangiocytes וhepatocytes לפני ואחרי מטמורפוזה 13) וBCL2 סמן אנטי אפופטוטיים באמצעות מיקרוסקופיה confocal, מערכת המרה כולו נתפסה לאורך ציר ה-Z ( איור 2) והמבנה 3 ממדים שוחזר (איור 3). מיקרוסקופיה confo...

צמד ים הים לאבד את כיס מרה ודרכי מרה במטמורפוזה, תהליך דומה לatresia מרה האנושי. קיבעון חדש ושיטת הבהרה (CLARITY) שונה כדי להמחיש את עץ המרה כולו באמצעות מיקרוסקופיה confocal סריקת לייזר. שיטה זו מספקת כלי רב עוצמה כדי לחקור ניוון מרה.

הבהרת שיטה חדשה למדמיין המרה ניוון בכבד מטמורפוזה בים צמד הים ( Petromyzon מרינוס)

Biliary atresia is a rare disease of infancy, with an estimated 1 in 15,000 frequency in the southeast United States, but more common in East Asian ...

המטרה הכללית של הליך זה היא להבהיר את הכבד כולו ואת נקודת החיבור למעי לצורך ניתוחים גלובליים, מבניים ותאיים של דגנרציה של דרכי המרה בנחליל (lamprey) מסוג C בשלב המטמורפוזה. דבר זה מושג תחילה על ידי קיבוע הרקמות בתמיסת מונומר של הידרוג'ל.בשלב הבא, ההידרוג'ל עובר פולימריזציה יחד עם הרקמות המקובעות. לאחר מכן, ממברנת הפלזמה של הרקמה המקובעת מוסרת והרקמה הופכת לשקופה. לבסוף, מבוצע צביעה אימונופלואורסצנטית, ובסופו של דבר נעשה שימוש בסריקת לייזר ומיקרוסקופיה קונפוקלית כדי להדגים שינויים מבניים ותאיים גלובליים במהלך דגנרציה של דרכי המרה ב-metamorphic c Lampry.שיטה זו יכולה לסייע במתן תשובות לשאלות מפתח בתחום הביו-רפואי, כגון הקונקטומיות (connectomes) במערכת העצבים המרכזית, ובמקרה שלנו, דגנראציה של דרכי המרה במהלך מטאמורפוזה של serum point. להשלכות של טכניקה זו יש פוטנציאל בתחום הטיפול או האבחון של אטרזיה של דרכי המרה בבני אדם, מכיוון שמחלה מולדת נדירה זו בתינוקות חולקת מאפיינים דומים לדגנראציה של דרכי המרה במהלך מטאמורפוזה של serum point. הרעיון לשיטה זו עלה לראשונה כאשר מצאנו מאמר חדשותי ב-nature והצגנו את הסרטון המקוון במהלך פגישת המעבדה שלנו, אשר הדגים את הפרוצדורה שתבצע Ann Scott, סטודנטית לתואר מתקדם מהמעבדה שלנו, לאחר הכנת תמיסת סליין עם בופר פוספט (phosphate buffered saline) ובופר פוספט (phosphate buffer או pb), בהתאם לפרוטוקול הכתוב.בתוך מנדף כימיים, הכין 400 milliliters של הידרוג'ל על ידי ערבוב של מים מזוקקים, 40%acrylamide 2%bis acrylamide 10 XPBS, 16%paraform, aldehyde, saponin, ו-ammonium per sulfate. הכין ליטר אחד של תמיסת הבהרה (clearing solution) המורכבת מ-4%SDS ו-0.2 molar boric acid, והכן 500 milliliters של 80%glycerol להכנת הרקמה בתוך המנדף. העבר 10 milliliters של תמיסת מונומר הידרוג'ל לתוך מבחנות צנטריפוגה של 15 milliliter.יש לנתח את דגימת הרקמה ולהניח את הרקמה לתוך כל מבחנה של מקבע הידרוג'ל בטמפרטורה של 4 °C למשך יומיים. לאחר הדגירה תחת מ इथे, יש לבצע פולימריזציה של הרקמה המקובעת על ידי הוספת 5 µL של temid. לאחר מכן, יש לערבב היטב ולאפשר לדגימות לעבור דגירה בטמפרטורת החדר למשך שעתיים עד שלוש שעות.לאחר הדגירה, הסירו ביסודיות את שאריות הג'ל כדי לנקות את דגימות הרקמה. העבירו כל דגימה ל-15 milliliters של תמיסת שקיפות (clearing solution) והדגירה בטמפרטורה של 50 °C ובמהירות של 70 RPMs למשך מספר ימים, עד להפיכתן לשקופות. החליפו את תמיסת השקיפות לפחות פעם אחת ביום והסירו כל שארית ג'ל עודפת.העבירו את הדגימות ל-15 milliliters של 0.1 molar PB עם 0.1%Triton X 100 בטמפרטורה של 37 degrees Celsius ובמהירות של 70 RPMs למשך הלילה. חזרו על האינקובציה פעמיים נוספות עם באפר טרי. כעת, לאחר שהרקמה שקופה ונקייה משאריות ג'ל, טבלו את הדגימות בנוגדן ראשוני ב-PB tritton X 100 והדגרימו ב-37 degrees Celsius וב-70 RPMs למשך יומיים. לאחר האינקובציה, השתמשו ב-15 milliliters של PB עם 0.1%tritton X 100 כדי לשטוף את דגימות הרקמה ב-37 degrees Celsius וב-70 RPMs למשך הלילה.חזור על השטיפה שלוש פעמים לאחר הסרת תמיפת השטיפה האחרונה, הוסף תמיסת נוגדן משני פלואורסצנטי ב-PB עם 0.1% Trix 100 וסרום חוסם, והדגר בחושך בטמפרטורה של 37 degrees Celsius ובמהירות של 70 RPMs למשך יום אחד. לאחר שטיפת הדגימות שלוש פעמים ב-10 milliliters של PB tritton X 100 בטמפרטורה של 37 degrees Celsius ובמהירות של 70 RPMs למשך הלילה, בצע שלוש שטיפות למשך הלילה ב-PBS. לבסוף, הדגר את הרקמה המזוכללת ב-80% glycerol בכיסוי של נייר אלומינום למשך הלילה.דימוי במיקרוסקופיה קונפוקאלית מבוצע לאחר מכן באור חשוך או עמום, אם כי בסרטון זה האורות דלוקים לצורכי ויזואליזציה. מספר אירועי התפתחות חשובים מתרחשים במערכת המרה של הכבד במהלך המטמורפוזה של ה-lamprey, לדוגמה, כפי שמוצג כאן, צינור המרה וכיס המרה עוברים אפופטוזיס וניוון. לאחר שימוש בשיטת הבהרה משופרת וצביעה עם הסמן לתאי כבד cytokeratin 19 וסמן אנטי-אפופטוטי BCL two, נעשה שימוש במיקרוסקופיה קונפוקאלית עם סריקה בלייזר לביצוע חיתוך אופטי דרך הכבד השלם.הצביעה חשפה כי התהליך הניווני מתרחש בשלבים המטמורפיים שני עד ארבעה. הפאנלים העליונים הם מהקצה הקדמי והפאנלים התחתונים הם מהקצה האחורי. מוצג כאן עץ המרה וכאן תאים אפופטוטיים בעלי מראה דנדריטי כהה, וסביבם קנליקולי וצינורות בכבד.איור זה מציג תמונות תלת-ממדיות ששוחזרו מסדרת Z קונפוקלית של שלושה כבדים בין שלבי גלגול שני ושלישי, המסומנים בנוגדי גופים נגד cytokeratin 19 ו-BCL two; עץ המבנה המגאלורסי (biliary tree) ותאי אפופטוזה כהים בעלי מראה דנדריטי, וכן קניקולות וצינורות מקיפים מסומנים בחצים לבנים ושחורים בהתאמה. מוצג כאן חיתוך אופטי קונפוקלי של צינורות המרה של דגימה בין שלבי גלגול שני ושלישי עם טיפות מרה בתוך הלומן. לאחר צפייה בסרטון זה, תהיה לכם הבנה טובה לגבי אופן הפיקת כל הרקמה לצורך ניתוחי דימיון נוספים.יש לזכור כי עבודה עם תמיסות של פראפורמאלדהיד ופוליאקרילאמיד עלולה להיות מסוכנת ביותר, ויש לנקוט תמיד באמצעי זהירות, כגון חבישת כפפות ושימוש במנדף, בעת ביצוע פרוטוקול זה.

a-new-clarification-method-to-visualize-biliary-degeneration-during

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

עובר דג הזברה הוא מודל מצוין למחקר בביולוגיה התפתחותית. במהלך עובר, דג הזברה מתפתחת עם מסת חלמון, אשר מציבה אתגרים תלת ממדים לתצפית מדגם וניתוח. פרוטוקול זה מתאר כיצד ליצור הכנות הר שטוחות דו ממדים של הר שלם באתרם דגימות (לוואי) מוכתמות דג הזברה עובר.

הר הכנה שטוחה לתצפית וניתוח של עובר דג הזברה דוגמאות ויטראז בהר שלם<em&gt; באתרו</em&gt; הכלאה

כדי לעזור להעריך את המנגנונים המולקולריים העומדים בבסיס התחדשות הכבד המונעת על ידי דג הזברה, הקמנו מודל פגיעה בכבד שבו הפטוציטים המבטאים ניטרורודוקטאז מבוטלים גנטית בטיפול במטרונידזול.  בפרוטוקול זה, אנו מתארים כיצד לתמרן במיומנות, לנטר ולנתח אבלציה של הפטוציטים והתחדשות כבד מונעת מרה.

אבלציה Hepatocyte הספציפי בדג הזברה לחקר התחדשות כבד מונע מרה

השלד המסועף, כולל מגרפות זימים, שיני לוע ועצמות מסועפות, משמש כאתר העיקרי לעיבוד מזון ברוב הדגים. כאן אנו מתארים פרוטוקול לניתוח והרכבה שטוחה של השלד הפנימי הזה בסטיקלבק תלת-שדרתי. שיטה זו ישימה גם למגוון מיני דגים אחרים.

Dissection ו-הרכבה שטוחה של שלד Threespine קוצן branchial

דג הזברה מתגלה כמודל רב ערך של עיבוד שומנים תזונתי ומחלות מטבוליות. מתוארים פרוטוקולים של הזנת זחלים עשירה בשומנים, הדמיה חיה של אנלוגים של שומנים פלואורסצנטיים תזונתיים וכימות צריכת מזון. ניתן ליישם טכניקות אלו במגוון טכניקות סינון, הדמיה וחקירה מונעת השערות.

עתירי שומן האכלה פרדיגמה דג הזברה הזחל: האכלה, הדמיה חיה, וכימות של צריכת המזון

כאן, אנו מציגים פרוטוקול כדי לבודד ולאפיין את המבנה, חוש הריח, והכוחות תגובה התנהגותית של תרכובות פרומון בשם של הים lampreys.

הזיהוי של פרומונים ים עגולי הפה באמצעות מונחה Bioassay Fractionation

כאן, אנו מציגים סדרה סטנדרטית של פרוטוקולים להתבונן sulcus עינית, נעלה את מבנה שזוהתה לאחרונה, והתפאורה אבולוציונית בעיניים חוליות. באמצעות רימות דג זברה, נדגים טכניקות הדרושות כדי לזהות גורמים שתורמים היווצרות וסגירת sulcus עינית מעולה.

ויזואליזציה של Sulcus עינית הממונה במהלך מופרה רזבורה rerio

אנו מציגים שיטה פשוטה למדי ורגיש לקוונפיקציה מדויקת של צפיפות צינור המרה בכבד העכבר. שיטה זו יכולה לסייע בקביעת ההשפעות של מכפילי גנטי וסביבתי ואת האפקטיביות של טיפולים פוטנציאליים מודלים העכבר של מחלות המרה.

קביעת צפיפות צינור המרה בכבד העכבר

כאן אנו להפגין שיטה לכמת את גודל הכבד בזחל zebrafish, מתן דרך להעריך את ההשפעות של מניפולציות גנטיות ופרמקולוגית על גידול בכבד ופיתוח.

בדיקת גודל הכבד בזחל זברה באמצעות מיקרוסקופ ברייטפילד

התחדשות שרירי השלד מונעת על ידי תאי גזע שריריים תושב רקמות, אשר לקויים במחלות שרירים רבות כגון ניוון שרירים, וזה גורם לחוסר היכולת של השריר להתחדש. כאן, אנו מתארים פרוטוקול המאפשר בדיקה של התחדשות שרירים במודלים של דגי זברה של מחלת שרירים.

בחינת התחדשות שרירים במודלים של דגי זברה של מחלת שרירים

פרוטוקול זה מתאר את ההליך להסרת האונה הגחונית של הכבד בדגי זברה בוגרים כדי לאפשר את המחקר של התחדשות הכבד.

כריתת הפטקטומיה חלקית בדגי זברה למבוגרים

פרוטוקול זה מתאר את הקציר וההדמיה של קשקשים אלסמואידים של דגי זברה במהלך התחדשות in vivo . בנוסף, תרבות ex vivo של קשקשים אלה עד 7 ימים לאחר הקציר מוצג.

התחדשות סולם דגי זברה בתרבות הקשקשים של טוטו ואקס ויוו

למד שיטת CLARITY מותאמת לחקר ניוון מערכת המרה בדג-נרוק Petromyzon marinus במהלך מטמורפוזה. השיטה מאפשרת הדמייה תלת-ממדית של מבני כבד שקופים באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית.

הבהרת שיטה חדשה למדמיין המרה ניוון בכבד מטמורפוזה בים צמד הים ( Petromyzon מרינוס)

גלה סרטונים נוספים