מדידת אוסמוטי המים החדירות מקדם (P _F) של תאים כדוריים: Protoplasts צמח מבודד כדוגמה

המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא ללמוד על תפקודם של אקוופורינים על ידי קביעת מקדם חדירות המים האוסמוטי, או PF של פרוטופלסטים צמחיים. גזרו חתיכה מעלה ללא אפידרמיס צירי והניחו אותה על תמיסה איזוטונית. מעבירים את החלקים לתמיסה אנזימטית ודוגרים במשך 20 דקות ב -28 מעלות צלזיוס, ואז לתמיסה איזוטונית טרייה.

לאחר מכן, אוספים את הפרוטופלסטים המכילים תמיסה עם קצה קצוץ. כשלב שני, הכינו תא ניסוי. חבר פתק כיסוי לתחתית השקופית באמצעות שומן סיליקון.

לאחר מכן מצפים את תחתית החדר בדבק נושא מטען חיובי וממלאים את החדר בתמיסה איזוטונית. לאחר מכן מוסיפים לתא, פרוטופלסטים מבודדים, והתא ממוקם בעדינות על במת המיקרוסקופ. לאחר מכן, הפרוטופלסטים נחשפים לתמיסה היפוטונית, בעוד סרטונים מוקלטים כדי ללכוד את מהלך זמן הנפיחות שלהם.

לאחר מכן, מהלך זמן הנפיחות מנותח מספרית על ידי תוכנה הכוללת נהלי התאמת קור על מנת לקבוע את ה-PF של כל פרוטופלסטים על סמך תוצאות הניתוח המספרי המתקבלות המראות הבדלים ב-PF המושרה, למשל, על ידי ביטוי של גנים שונים של אקוופורין. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום הפיזיולוגיה של קרום התא, כגון ויסות תפקוד האקוופורין. למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנה לגבי מים מתמטיים, חדירות של צמחי מים צמחיים שהם מקומיים או מהונדסים גנטית.

ניתן ליישם אותו גם על מערכות אחרות כגון מקור חשוף לעניין. לפני תחילת הליך זה, הכינו את התמיסות האיזוטוניות וההיפרטוניות הנדרשות וודאו את האוסמולריות. באמצעות אוטר OSM, האוסמולריות של כל תמיסה חייבת להיות בטווח של 3% מערך היעד.

ממלאים צלחת פטרי בגודל 10 סנטימטר בכשש טיפות תמיסה איזוטונית. מקלפים את חותם ה- ABBA או מורידים אפידרמיס עלה של ארנב וחותכים את העלה הקלוף לריבועים של כארבעה על ארבעה מילימטרים. הניחו את החלקים הקטנים על טיפות התמיסה האיזוטוניות כשהצד הצירי החשוף פונה כלפי מטה ונוגע בתמיסה.

לאחר מכן, ממיסים 5.7 מיליגרם מתערובת האנזים ב-165 מיקרוליטר של תמיסה איזוטונית בצינור של 1.5 מיליליטר ומערבבים בעדינות על ידי פיפטינג במשך כדקה עד להמסה. מניחים כמה טיפות דומות של התמיסה האנזימטית באותה צלחת פטרי. מעבירים את חתיכות העלים לתמיסה האנזימטית. טיפות.

סוגרים את הכלי ואוטמים את המכסה בסיבוב אחד של פרפיל. צפו את המנה באמבט מים המוגדר ל -28 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות. לאחר 20 דקות מוסיפים למנה עוד כמה טיפות מהתמיסה האיזוטונית בעזרת מלקחיים.

הרם כל חתיכת עלה בקצהו כדי להעביר אותו לתמיסה איזוטונית חדשה טיפה ולאחר מכן ברצף לטיפה שנייה. נענע את חתיכת העלה בטיפה השנייה כדי לשחרר את הפרוטופלסטים באמצעות קצה פיפט קצוץ של 100 מיקרוליטר. אוספים את הטיפות עם הפרוטופלסטים לצינור של 1.5 מיליליטר.

הכן את מערכת השפע על ידי מילוי עמודה אחת בתמיסה האיזוטונית ועמודה נוספת בתמיסה ההיפוטונית. פתח את השסתום כדי לאפשר לתמיסה היפוטונית כלשהי לזרום כדי למלא את הצינור עד לסעפת הכניסה. לאחר שווידאתם שאין בועות אוויר כלואות, סגרו את השסתום.

חזור על הפעולה עבור התמיסה האיזוטונית. אטום תלוש כיסוי באמצעות שומן סיליקון כדי ליצור תחתית לתא בתוך מגלשת הפרספקס כדי להפוך את תחתית החדר לדביקה עבור פרוטופלסטים, ציפוי אותו במטען חיובי פרוטאמין סולפט או פולי L ליזין. השתמש בקצה פיפטה כדי לפזר את הדבק הזה על החלקת הכיסוי.

המתן דקה עד שתיים. יש לשטוף שלוש עד ארבע פעמים בתמיסה האיזוטונית ולנער את התמיסה שנותרה. מלאו את החדר בתמיסה האיזוטונית.

לאחר מכן השתמש בקצה פיפטה קצוץ כדי להוסיף טיפה של פרוטופלסטים המכילים תמיסה לתא. והמתן שלוש עד ארבע דקות עד שהפרוטופלסטים יתייצבו. מכסים את החדר בכיסוי שקוף הנוגע במשטח התמיסה.

הימנע מלכידת בועות אוויר מתחת. הנח שקופית בעדינות על שולחן מיקרוסקופ הפוך וחבר מחובר למערכת הזלוף ולמשאבה המגנה מפני בועות אוויר בצינור. הפעל את זרימת התמיסה האיזוטונית לזלוף קבוע במיליליטר אחד לדקה.

כדי להקליט שינויי עוצמת קול, בחר שדה תצוגה עם תאים רבים ככל האפשר בעלי צורה כדורית, ועם מתאר תאים ממוקד היטב בהיקף הגדול ביותר שלהם. הקלט סרטון 62 של פרוטופלסטים נייחים נבחרים בקצב של תמונה אחת לשנייה או הרץ אחד. התחל את ההקלטה בשטיפה של 15 שניות של התמיסה האיזוטונית ועבור לתמיסה ההיפרטונית למשך 45 שניות.

שמור את הסרט בתבנית Tiff ב- כדי לנתח סדרה של תמונות של תא מתנפח, השתמש בסייר התמונות ובתוספי מנתח הפרוטופלסטים בתוכנת imageJ. התחל תמונה J.To פתח את הסרט, לחץ על קובץ בחלונית Image J ולאחר מכן ברצף על התפריטים הנפתחים כשהם פותחים את הייבוא. לאחר מכן סייר התמונות.

הדגש את הסרט הנבחר. לחץ עליו באמצעות לחצן העכבר הימני ולאחר מכן שמאלה. לחץ על מנתח פרוטופלסטים.

בתמונה הראשונה, השתמש בעכבר כדי לצייר עיגולים סביב הפרוטופלסטים שנבחרו. לאחר מכן לחץ על אישור. בטבלת פרמטרי הזיהוי שמופיעה כדי להפעיל את אלגוריתם זיהוי הפרוטופלסטים, לחץ על מקומי בחלונית העליונה של תמונת הפרוטופלסטים.

ואז תהליך. בתפריט הנפתח, בדוק את העיגולים הירוקים סביב הפרוטופלסטים שנבחרו לאורך הסרט. באמצעות המחוון התחתון, שמור את התוצאות בקובץ Excel.

הניתוח נעשה פריים אחר פריים. לכן, במקרה של יותר מתא אחד, יש צורך במיון כדי להפריד בין הקווים השייכים לכל תא כאן. שלושת מסלולי הזמן מוצגים בגיליון אקסל לפני ואחרי המיון עם ערכי השטח שהומרו מפיקסלים למיקרומטר רבוע.

לאחר מכן כל פעם קורס מיוצא לקובץ טקסט נפרד. כדי להתחיל בהליך זה, חבר את החדר למערכת הזלוף ולמשאבה והפעל את זרימת המחוון לקצב זלוף קבוע של מיליליטר לדקה, הקלט סרטון 62 בקצב של הרץ אחד. התחל את ההקלטה עם 15 שניות של תבנית מחוון ולאחר מכן עבור לתמיסה ההיפרטונית למשך 45 שניות, הפסק את ההקלטה.

סומק עם המחוון. למות שוב למשך 30 שניות לפחות. לפני שתתחיל סרט חדש הקלט ושמור חמישה עד שישה סרטים כדי לנתח את הסרטים.

כדי להשיג מהלך זמן ממוצע של שידור המחוון המשתנה, התחל את התמונה J לחץ על קובץ. לאחר מכן פתח את הסרט ואתר אותו. עבור כל סרט, צייר מלבן אנכי ברוחב 10 פיקסלים בכל מקום בתמונה הראשונה של הסרט, לחץ על תמונה בחלונית הראשית של תמונה J.

לאחר מכן לחץ על חתוך בתפריט הנפתח. כדי ליישר את 60 המסגרות בשורה אחת, לחץ על תמונה ולאחר מכן לחץ ברצף בתפריטים הנפתחים כשהם פותחים ערימות ויוצרים מונטאז'. ציירו מלבן אופקי בגובה פיקסל אחד בכל מקום לאורך כל שורת התמונות ולחצו על ניתוח בחלונית הראשית של Image J.

לאחר מכן, לחץ על פרופיל עלילה. בתפריט הנפתח, העתק את רשימות נתוני השידור לקובץ Excel. ממוצע קורסי זמן השידור המתקבלים מסרטי Sero של המחוון למות שטיפה.

צור בסיס בזמן אמת על ידי הכפלת המספר הרציף של התמונה ב-0.1. שמור את קורס הזמן הממוצע בקובץ טקסט כדי לחשב את הפרמטרים השונים של קורס זמן האוסמולריות. השתמש בתוכנית ההתאמה של MATLAB PF fit, הזמינה לשימוש.

ללא תשלום. פרטים על הורדה ושימוש בתוכנית זו זמינים בטקסט הפרוטוקול. בלוח התאמת המחוון.

ייבא את הנתונים של מהלך הזמן הממוצע של העברת צבע המחוון. הזן ידנית את פרמטרי הניסוי הנוכחיים, הניחושים הראשוניים של הפרמטרים עם נמלה H.תיאור מהלך הזמן של ריכוז הצבע של האינדיקטור עשוי להשתנות גם כן. לחץ על הפעלה כדי להציג את העלילה של מסלולי הזמן של ריכוז ה-DAI של האינדיקטור ושל אוסמולריות האמבטיה המעוצבת.

התאמה טובה לנתונים חיונית לקביעת מקדם חדירות המים. עבור ללוח התאמת עוצמת הקול. בחר לייבא את קובץ הנתונים של האזור.

בחר התאמת מחוון אחרון כמקור הפרמטר. בחר את מחלקת הדגם. התחילו עם שניים.

יש לאתחל את פרמטרי ה- PF האיטי והעיכוב, למשל, כפי שמוצג, אך קיימים גם ערכים אחרים. סמן בודק את כל שלושת הפרמטרים שיש להתאים. לחץ על הפעל.

לאחר מכן גלגל את העין של נתון הביניים והתאם את פרמטר העיכוב ואת אורך הרשומה במידת הצורך. בדוק את גרף התוצאות כדי להעריך את ההתאמה, האיכות ולתעד את שגיאת ההתאמה. שנה את פרמטרי האתחול כמה פעמים כל אחד והפעל מחדש.

חזור על הליך זה מספר פעמים, החל משילובים שונים של פרמטרי אתחול, במטרה לקבל את הערך הנמוך ביותר של שגיאת ההתאמה על מנת לקבוע את מקדם חדירות המים או pf, והשווה את הפעילות של אקוופורינים שונים Mesil Protoplasts מעלה של ארנב בודדו ועברו טרנספורמציה בנפרד עם שלושה מבני גנים עם גנים אקוופורינים מארנב, אופסיס ומבוך. הפרוטופלסטים סומנו על ידי שיתוף פעולה עם וקטור המקודד חלבון פלואורסצנטי ירוק משופר. מהלכי הזמן של שינויים בנפח התא עם חשיפה לאתגר ההיפוטוני התקבלו עבור כל תא וכן מהלך הזמן של שינוי האוסמולריות באמבטיה במהלך האתגר ההיפוטוני, ערכי ה-PF נגזרו עבור כל תא.

באמצעות תוכנית PF FIT, נצפה כי ערכי ה-PF של ה-PROTOPLASTS שעברו טרנספורמציה עם כל אחד משלושת האקוופורינים היו גבוהים משמעותית מה-PF של תא הביקורת שעבר טרנספורמציה עם GFP בלבד. לאחר שליטה, טכניקה זו יכולה לספק ניתוח של כמה עשרות תאים בכמה ימי ניסוי אם היא מבוצעת כראוי. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לקבוע את חדירות המים של SMO בפרוטופלסטים מבודדים או בתאים מוקדיים אחרים הנתונים לבדיקה היפוטונית.

לכל שאלה שנותרה, אנא אל תהססו לפנות אלינו.