זיהוי של שותפי אינטראקציה חלבון בתאי יונקים באמצעות SILAC-immunoprecipitation פרוטאומיקה כמותי

המטרה הכוללת של הליך זה היא לזהות שותפים לאינטראקציה עם חלבונים עבור חלבון נתון מעניין. זה מושג על ידי גידול התאים תחילה במצע תרבית תאים המכיל ארגינין וליזין המסומנים באיזוטופים יציבים שונים של פחמן וחנקן. השלב השני הוא העברה, פלסמידים וציפוי חלבון מעניין או פלסמיד בקרה לתאים המסומנים.

לאחר מכן, התאים עוברים ליזה והדגימות מוזרקות חיסון מהליזטים. לאחר מכן משולבים כמויות שוות של בקרה ומשקעים חיסוניים דגימתיים ומוגשים לניתוח lc MS MS. השלב האחרון הוא ניתוח נתוני ספקטרומטריית המסה כדי לזהות חלבונים המקיימים אינטראקציה עם החלבון המבוקש.

בסופו של דבר, תיוג איזוטופים יציבים של חומצות אמינו בתרבית תאים או משקעי אמינו סילאק מסוגלים לזהות מספר רב של אינטראקציות ישירות ועקיפות עם חלבון מעניין מתאי תרבית רקמות. היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון תיוג הקשה, הוא שהיא מבטלת את הצורך של החוקר לשלוח להקות בודדות מספקטרומטריית מסה. זה מסיר מקור חשוב של הטיה תוך הגברת הרגישות.

למרות שניתן להשתמש בשיטה זו כדי לספק תובנה לגבי חלבון תאי, ניתן ליישם אינטראקציות חלבון גם על מערכות אחרות כגון חקר אינטראקציות מארח פתוגנים. כדי להתחיל לגרד SLAC שכותרתו תאי HEK 2 93 T, המבטאים את החלבון המתויג GFP המעניין או בקרת GFP מצלחת תרבית התא לתוך PBS קר כקרח, ואז לצנטריפוגה את תרחיף התא ב-220 פעמים G למשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס, לשטוף את התאים שלוש פעמים נוספות ב-10 מיליליטר PBS קר כקרח, להשעות מחדש את כדור התא ב-200 מיקרוליטר של מאגר ליזה תאים המכיל קוקטייל מעכב פרוטאז טרי שנוסף שלושה בריכוז X אחד ומוסיפים חמישה מיקרוליטרים של קוקטייל RNA למיליליטר של מאגר ליזה, מדגרים על קרח למשך חמש דקות. לאחר מכן צנטריפוגה של התא ליזאט ב-13,000 פעמים G למשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס ולשמור על הסופרנטנט כליזאט התא המסיס.

מדוד את ריכוז החלבון של ליזאט התא באמצעות בדיקת BCA. לאחר מכן נרמל את ריכוז החלבון בכל ליזאט דגימה בנפח סופי של 500 מיקרוליטר באמצעות מאגר הליזיס המכיל מעכבי פרוטאז. הוסף 500 מיקרוליטר של מאגר דילול המכיל קוקטייל מעכב פרוטאז x אחד שלושה לכל אחד מהליזטים של התאים המנורמלים כדי להתאים את הנפח הכולל למיליליטר אחד.

שמור ליזאטים על קרח בזמן הכנת חרוזים נגד GFP ושמור 50 מיקרוליטר מכל דגימה שתשמש לקלט דגימה. מערבולת את תמיסת החרוזים כדי להשעות מחדש את החרוזים. לאחר מכן השתמש בקצה פיפטה של 200 מיקרוליטר עם חתך הקצה כדי להעביר 25 מיקרוליטר חרוזים לדגימה לצינור טרי.

על כל 25 מיקרוליטר של תמיסת חרוזים, הוסיפו 20 נפחים של מאגר דילול לשטיפה, צנטריפוגה את החרוזים ב -2, 700 פעמים G למשך חמש דקות. שוטפים את החרוזים לפעמים נוספות עם 20 נפחים של מאגר דילול. לאחר מכן, הוסף 100 מיקרוליטר של מאגר דילול לכל 25 מיקרוליטר של תמיסת חרוזים.

לאחר מכן השתמש בקצה פיפטה של 200 מיקרוליטר עם חתך הקצה כדי להעביר 85 מיקרוליטר של תמיסת החרוזים המושעה לכל אחד מהליזטים לדוגמה המסומנים ב-SLAC. דגרו את הדגימות עם חרוזים על מסובב בארבע מעלות צלזיוס למשך שעתיים לאחר הדגירה עם החרוזים, צנטריפוגה את הדגימות ב-2,700 פעמים G למשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס. שמרו 50 מיקרוליטר של הסופרנטנט כדגימה הלא קשורה והשליכו את שארית הסופרנטנט.

השעו מחדש את החרוזים בכל צינור במיליליטר אחד של מאגר דילול, ולאחר מכן צנטריפוגה ב -2, 700 פעמים G למשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס. חזור על שלב הכביסה הזה פעמיים כדי לסלק את החלבון מהחרוזים. הוסף 50 מיקרוליטר של שני מאגר טעינה XSDS לכל דגימה וחמם ב-95 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.

לאחר סיום החימום, צנטריפוגה כל דגימה ב-2, 700 פעמים G למשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס. העבירו את הסופרנטנט לצינורות משומנים מראש ואחסנו בטמפרטורה שלילית של 80 מעלות צלזיוס עד שיהיה מוכן להגשה לניתוח טרשת נפוצה. לאחר מכן מערבבים נפחים שווים של בקרה ומשקעי אמינו דגימה ומגישים את הדגימה המשולבת למתקן ספקטרומטריית מסה לניתוח lc ms MS.

לפני ניתוח נתוני ספקטרומטריית המסה, העתק את הנתונים הגולמיים לגיליון אלקטרוני חדש. לאחר מכן, בגיליון אלקטרוני זה, הסר את כל העמודות למעט העמודות המכילות את מספר ההצטרפות, מספר יחסי הפפטידים הייחודיים, השוואת דגימות, שונות יחס ותיאור החלבון. השתמש בפונקציית המיון של Excel כדי לסדר את הנתונים לפי מספר הפפטידים ולהסיר את הערכים עבור חלבונים שחסרים בהם יותר מפפטיד אחד.

לאחר מכן מיין לפי יחס והסר חלבונים חסרי יחסי SLAC. לאחר מכן, המר יחסי slac כדי לרשום שני ערכים. שימוש בנוסחה שווה לסוגריים של יומן, יחס SLAC שניים וסוגריים שבהם יחס SLAC מוחלף במזהה התא.

לאחר מכן צור עמודה חדשה בקובץ האקסל וחשב רשום שני יחסי SLAC עבור כל העמודות המדומות לדוגמה להמרה של יחס דגימה מדומה ליחס מדומה של מדגם. השתמש בנוסחה שווה לאחד חלקי יחס. פתח את מנסרת GraphPad.

בחר טבלת נתונים וגרף חדשים בחר עמודה מהרשימה בצד שמאל של החלון ובחר הזן נתוני ייבוא. הזן ערכי עותק משוכפל מוערמים באפשרויות עמודות. לחץ על צור.

לאחר מכן בחר והעתק עמודת יחס SLAC מדומה של שני יומן נתון מהגיליון האלקטרוני של Excel לקובץ המנסרה החדש. לאחר מכן, לחץ על התפריט הנפתח ובחר ניתוח חדש. תחת ניתוח עמודות, בחר התפלגות תדירות.

שמור את אפשרויות ברירת המחדל ולחץ על אישור. בתיקיית התוצאות, ייווצר מקטע היסטוגרמה חדש. בחר את קטע התפלגות התדרים ולאחר מכן לחץ על תפריט ההוספה הנפתח ובחר התאמת עקומת רגרסיה לא ליניארית חדשה של ניתוח XY.

לחץ על התפלגות גאוס ולחץ על אישור. בחלון התוצאות שמופיע ניתנים הממוצע וסטיית התקן. צור סף על-ידי הוספת סטיות תקן של 1.96 לתשואה הממוצעת לקובץ ה- Excel.

צור כרטיסייה חדשה בשם עמודת תווית משולבת A והעתק את כל מספרי הכניסה מכל אחד מהניסויים הבודדים לעמודה בודדת זו. לאחר מכן, בחר בכרטיסיית הנתונים ולאחר מכן באפשרות הסר כפילויות. לאחר מכן צור עמודות עבור יחסי SLAC ושונות היחס מכל ניסוי וכן עבור עמודת תיאור שם החלבון.

בכרטיסיה תיאור, השתמש בנוסחה VLOOKUP כדי לאסוף את התיאור של כל מספר רישום. גרור את הנוסחה במורד העמודה כדי למלא את תיאור החלבון, ולאחר מכן השתמש בנוסחה זו כדי לקבל את נתוני היחס והשונות מהניסויים הבודדים. כדי להדגיש חלבונים המקיימים אינטראקציה במערך הנתונים המשולב, שימו לב לערך הסף עבור ניסוי מסוים.

בחר את עמודת היחס ולחץ על הכרטיסיה בית. לאחר מכן עיצוב מותנה, הדגש תאים כללים כללים נוספים ולאחר מכן בחר סגנון פורמט קלאסי נמכר רק המכיל ערך מכירה גדול או שווה ל. בתיבה, הקלד את ערך סטיית התקן של 1.96 ולחץ על אישור.

העריכו את שונות היחס עבור כל אינטראקציה חיובית. אם הפחתת השונות באחוזים תוריד פגיעה מתחת לערך הסף. יש להתייחס לכך בזהירות.

חזור על זה עבור כל אחת מעמודות התוצאות והשווה בין ניסויים חלבונים מודגשים שזוהו בשני ניסויים או יותר מייצגים אינטראקציה ברמת ביטחון גבוהה. ניתוח כתמים מערביים אישר את טיהור החלבון המתויג GFP המעניין. היעדר פס DH פער בדגימות הקשורות מצביע על כך שחלבונים שאינם מקיימים אינטראקציה התרוקנו מהדגימות בשלב המשקעים החיסוניים, בעוד שנוכחות של פס EIF 4G בדגימות אלה מצביעה על כך שנשמרו שותפים מקשרי אינטראקציה ידועים.

כמה מחלבוני הקישור EIF 4 A שזוהו נשמרו בין שני האיזופורמים. החלבונים המקיימים אינטראקציה עם EIF 4 A מזוהים על ידי יחס LAC גבוה, בעוד שלחלבונים שאינם קשורים ספציפית בניסוי זה יש יחסים מתחת ל-0.96. בתרשים זה של קומפלקס גורם ההתחלה, חלבוני הקישור EIF ארבעה A שזוהו בניסוי משקעי האמינו SLAC מוצללים באדום עד לבן.

על פי יחס ה-SLAC של לוג שניים, הכיסוי הגבוה של שותפי קשירה ישירים ועקיפים של קומפלקסי EIF ארבעה A אחד ושני ממחיש את היעילות של גישה זו לזיהוי אינטראקציות חלבון תוך כדי ניסיון הליך זה, חשוב לזכור שבעוד שניתן לפצות על שונות מסוימת ברמות החלבון בשלב ניתוח הנתונים, עדיף להימנע מכך על ידי הבטחת נורמליזציה מדויקת של רמות קלט החלבון ועל ידי הימנעות מאובדן חרוזי AROS במהלך שלבי הכביסה.