Name: הירך מח עצם שאיפה בעכברים חיים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-07-05T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 10 s
Description: למד שאיפת מח עצם מהירך בעכברים חיים ללא הריגתם. שיטה זו מאפשרת מחקרים לאורך זמן של הרכב מח העצם וניתוח תאים המטופואיטיים באמצעות ציטומטריית זרימה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

O.A.-W. נתמך על ידי פרס החוקר הקליני של NIH K08 (1K08CA160647-01), פרס עמית פוסט-דוקטורט של משרד ההגנה האמריקני בחקר אי ספיקת מח עצם (W81XWH-12-1-0041), תוכנית החוקרים של ג'וזי רוברסטון, ופרס החוקר הקליני של דיימון ראניון בתמיכת קרן אוון.

נהלי כל החיה שתוארו בפרוטוקול זה נערכו בהתאם להנחיות לטיפול והשימוש בחי מעבדה ואושרו על ידי ועדת הטיפול בבעלי חיים ושימוש המוסדית (IACUCs) בשעה ממוריאל סלואן קטרינג במרכז הסרטן. 1. שאיפה של מח העצם (BM) תאים מעצם הירך <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים את העכבר שיעבור שאיבת מוח עצם הירך עם isoflurane (1-4%) מנוהל עם מאדה דיוק. עומק ההרדמה צריך להיות במעקב כל דקות 5-10 לאורך כל ההליך על ידי התבוננות, כי אין שינוי בקצב נשימה הקשורים למניפולציה כירורגית ו / או אוזן, בוהן, וקמצוץ זנב. הרדמה מושרה עם isoflurane וגם נשמרה לאורך כל ההליך עם isoflurane. מנה טרום פרוצדורליים מנע של עצירות במינון של 0.05-0.1 מ&quot;ג / קילוגרם תת עורי כל שעות 6-12 יכול לשמש כדי למנוע כאבים הקשורים בהליך כadjunct לCarprofen. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל משחה העיניים לעיניים של האינדוקציה הבאה העכבר של הרדמה כדי למנוע התייבשות של קרנית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפרווה נחתכה בקפידה מתוך שטח של עור כ 150% יותר מאשר באזור של אתר האיפה המיועדת. Loose פרווה מוסרת עם כרית גזה לחה. נא לשמור את העכבר על משטח במחזור מים חם או משטח תרמוסטטית נשלט בטוח אחר כדי למנוע היפותרמיה במהלך ההליך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחטא את הרגל כולה המכילה את עצם הירך שתעבור שאיפה עם שלושה סטים של עלובי לסירוגין (לסירוגין עם שני povidone-יוד (פולידין) או כלורהקסידין (לשפשף Nolvasan) ו70% אלכוהול איזופרופיל או 70% ספוגים גזה ספוגות אתנול). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרטב 0.5 מיליליטר חפת מזרק (נפח: 0.5 סמ&quot;ק; מד: 27.5 G) עם פוספט בופר סליין סטרילי (PBS) לפני aspirating BM. מלא את המזרק עם 200-500 μl של PBS ולגרש מייד את PBS. חזור על הליך זה לא 2-3עורכי שיטות קלט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור כפוף שוקה מעצם הירך על ידי לחיצה על עצם השוק עם או הקמיצה או האצבע החמישית. לאשר כי מטוס הרדמה מתאים הושג. המזרק מוחזק באמצעות האגודל והאצבע המורה. זה מאפשר condyles להיחשף ומקל על החדרת המחט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הרטבת המזרק, להכניס את המחט דרך גיד הפיקה, כך שהמחט נתקעה באופן מאובטח בין שני condyles של עצם הירך. על ידי החזקת diaphysis הקרוב לepiphysis של עצם הירך עם האגודל ואצבע המורה, המחט מוחדרת לתוך הפיר של עצם הירך בקלות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לסובב את המחט החוצה וכלפי מעלה, כך שהוא מקביל לפיר של עצם הירך. פעולה זו מאפשרת שליפה של תכני מח עצם מן פיר עצם הירך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את השעון ונגד כיוון שעון בזמן שהמחט דוחף אותו לאט לתוך חלל מח עצם הירך. לאשר את המיקום הנכון של המחט בעדינות על ידי נע סאיringe רוחבי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> משוך בעדינות את בוכנת המחט לאחור, יוצר לחץ שלילי, ואילו הזזת המחט קדימה ואחורה בתוך חלל BM. הערה: הנפח של BM aspirated יהיה כ 5 μl אשר בדרך כלל מתאים ל0.4-0.8 x 10 6 תאים חד גרעיניים. שאיפה מוצלחת תאושר מבחינה ויזואלית על ידי הופעתו של דם בחלק העליון של המחט בבסיס של המזרק. אם אין דם נראה במזרק סביר להניח כי שבר עצם או רקמה קטן תקוע במחט. זו ניתן להסיר את המחט על ידי הזזת הבוכנה למעלה ולמטה ב-PBS (זו אחת סיבות למה המזרק צריך להיות prefilled עם PBS לפני aspirating BM). אם הרקמה לא ניתן וחילצה מן המזרק, להשתמש במחט ומזרק (שוב להרטיב את המזרק עם 200-500 μl של PBS) חדשות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברגע שBM הוא להישאף בהצלחה מעצם הירך, להוציא את המחט והמזרק מעצם הירך והעכבר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הזז aspirated BM ליחסי ציבור צינור microfugeefilled עם 500 μl של PBS. עבור רוב היישומים, תאי BM אז צריכים להיות כל הזמן על קרח עד עיבוד נוסף במידת האפשר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר השלמת ההליך, לנהל משכך כאבים עם carprofen 5 מ&quot;ג / קילוגרם תת עורי. לאחר מכן להסיר את העכבר מההרדמה ומניח על משטח לוהט עד התאושש באופן מלא. הערה: לא צריך להיות שום סיבוך או מצוקה חווה בעקבות הליך השאיפה אם נעשה כראוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני החזרת עכברים לאזור המגורים, לוודא שהם מסוגלים ambulate ולהגיע למזון ומים. שימו לב לעכברים סימנים של מצוקה או לאחר זיהום הליך בשעה 24 הבאה. סימנים כוללים: דימום בלתי פוסק, אנמיה, עייפות. אם כל אחד מהסימנים הללו נראים שלאחר הליך, בעלי החיים (ים) צריכים להיות מורדמים. הערה: שאיפת BM / דגימה ניתן לחזור אך ההליך חוזר צריכה להתבצע על הירך הנגדית כדי למנוע טראומה חוזרת ונשנית באותה הרגל. אין מידע זמין קטן לגבי frequency ניתן לבצע שאיפת BM. שאיבת מוח עצם הירך היא בדרך כלל חוזרת ונשנית לא בתדירות גבוהה יותר מאשר כל 2 שבועות. </li></ol> 2. הערכה של תוכן סלולארי בתאים להישאף BM <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גלולה תאים נאספו מאיפה בע&quot;מ ומקום בצינור microfuge על ידי צנטריפוגה XG 300 5 דקות בC o 4 או RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב supernatant ואז resuspend את הכדור ב500 μl של חיץ תמוגה תא דם אדום ACK (מאגר תמוגה &quot;אמוניום כלוריד, אשלגן&quot;). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה התאים במאגר תמוגה התא אדום עבור 10 דקות ולאחר מכן להוסיף 1 מיליליטר של PBS ומסובב את התערובת שוב XG 300 5 דקות בC o 4 או RT. הערה: גלולה lysed תאי דם האדומים עם החברה מורכבת מתאים מונונוקלארים BM. אלה יכולים להיות מושעים עבור מכתים FACS, ספירת תאים, השתלה, ניתוח cytospin ו / או כל שימוש אחר (בדיוק כמו תאי BM שנקטפו מעכברים הקריבו יהיו בשימוש). </li></ol>

<ol><li>Sundberg, R., Hodgson, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aspiration+of+bone+marrow+in+laboratory+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Aspiration of bone marrow in laboratory animals.</a> Blood. 4, 557-561 (1949).</li>
<li>Schmitz, M., Bourquin, J. -P., Bornhauser, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternative+technique+for+intrafemoral+injection+and+bone+marrow+sampling+in+mouse+transplant+models%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia+%26+lymphoma%22%5BJournal%5D)">Alternative technique for intrafemoral injection and bone marrow sampling in mouse transplant models.</a> Leukemia & lymphoma. 52, 1806-1808 (2011).</li>
<li>Warner, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+evidence+for+cooperating+genetic+events+in+the+leukemic+transformation+of+normal+human+hematopoietic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia%22%5BJournal%5D)">Direct evidence for cooperating genetic events in the leukemic transformation of normal human hematopoietic cells.</a> Leukemia. 19, 1794-1805 (2005).</li>
<li>Chiu, P. P., Jiang, H., Dick, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leukemia-initiating+cells+in+human+T-lymphoblastic+leukemia+exhibit+glucocorticoid+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Leukemia-initiating cells in human T-lymphoblastic leukemia exhibit glucocorticoid resistance.</a> Blood. 116, 5268-5279 (2010).</li>
<li>Guan, Y., Gerhard, B., Hogge, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection%2C+isolation%2C+and+stimulation+of+quiescent+primitive+leukemic+progenitor+cells+from+patients+with+acute+myeloid+leukemia+%28AML%29%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Detection, isolation, and stimulation of quiescent primitive leukemic progenitor cells from patients with acute myeloid leukemia (AML).</a> Blood. 101, 3142-3149 (2003).</li>
<li>Nolta, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+gold+standard+improves%3A+a+better+assay+for+HSCs%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">The gold standard improves: a better assay for HSCs.</a> Blood. 106, 1141-1142 (2005).</li>
<li>Kiel, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SLAM+family+receptors+distinguish+hematopoietic+stem+and+progenitor+cells+and+reveal+endothelial+niches+for+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">SLAM family receptors distinguish hematopoietic stem and progenitor cells and reveal endothelial niches for stem cells.</a> Cell. 121, 1109-1121 (2005).</li>
<li>Purton, L., Scadden, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Limiting+factors+in+murine+hematopoietic+stem+cell+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+stem+cell%22%5BJournal%5D)">Limiting factors in murine hematopoietic stem cell assays.</a> Cell stem cell. 1, 263-270 (2007).</li>
<li>Dykstra, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+propagation+of+distinct+hematopoietic+differentiation+programs+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+stem+cell%22%5BJournal%5D)">Long-term propagation of distinct hematopoietic differentiation programs in vivo.</a> Cell stem cell. 1, 218-229 (2007).</li>
<li>Jordan, C., Lemischka, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clonal+and+systemic+analysis+of+long-term+hematopoiesis+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+development%22%5BJournal%5D)">Clonal and systemic analysis of long-term hematopoiesis in the mouse.</a> Genes & development. 4, 220-232 (1990).</li>
<li>Challen, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dnmt3a+is+essential+for+hematopoietic+stem+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+genetics%22%5BJournal%5D)">Dnmt3a is essential for hematopoietic stem cell differentiation.</a> Nature genetics. 44, 23-31 (2012).</li>
<li>Hess, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selection+based+on+CD133+and+high+aldehyde+dehydrogenase+activity+isolates+long-term+reconstituting+human+hematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Selection based on CD133 and high aldehyde dehydrogenase activity isolates long-term reconstituting human hematopoietic stem cells.</a> Blood. 107, 2162-2169 (2006).</li>
<li>Mazurier, F., Doedens, M., Gan, O. I., Dick, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+myeloerythroid+repopulation+after+intrafemoral+transplantation+of+NOD-SCID+mice+reveals+a+new+class+of+human+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Rapid myeloerythroid repopulation after intrafemoral transplantation of NOD-SCID mice reveals a new class of human stem cells.</a> Nat Med. 9, 959-963 (2003).</li>
</ol>

יש המחברים אין לחשוף.

שאיפת BM סידורי היא הליך שגרתי קריטי לחקירה קלינית של הפרעות המטולוגיות בבני אדם. היכולת לבצע דגימה סידורי מקבילה של BM בעכברים לאפיון של ההרכב התאי ומרכיבים של BM לאורך כל ניסויים ממושכים היא גם יקר מאוד. הליך זה שימושי לאפיון של HSPC של מבלי להקריב את העכבר, אלא גם לגילוי הנוכחות של סוגים נוספים של תאים בBM במקרים שבם התוכן של הדם ההיקפי לא יכול להיות שיקוף של התאים המתגוררים בBM. שאיפת BM סידורי נעשתה שימוש יעיל מאוד למטרה מאוחר יותר בניטור נוכחותם של תאים אנושיים xenografted ל...

כל תאי הדם נגזרים מתאי גזע המטופויאטיים (HSCs). נהלים המאפשרים גישה למח העצם (BM), האתר של הרוב המכריע של HSC בעכברים ובני אדם, מבלי לדרוש הקרבה של בעלי חיים, מספקים משאב לניטור מקור ההמטופואיזיס באופן סדרתי. המטרה הכוללת של ההליך המתואר כאן היא לספק פרוטוקול מפורט לדגימת תאי BM מעצם הירך של עכברים חיים, המספק חומר המייצג את התאים אשר יוחזרו על ידי קציר קונבנציונאלי של תאי BM באמצעות הקרבת העכברים. היתרון של הליך זה על פני קציר קונבנציונאלי של תאי BM הוא שהליך זה אינו דורש הקרבה של עכברים ולכן מאפשר מחקר אורך של תא מח העצם של עכברים לאורך זמן. 
למרות שהליך שאיבת מח עצם זה של עכברים שימש במספר מחקרים ותואר בעבר (ראה Sundberg et al. לסקירה היסטורית1), נהלים רשמיים צעד-אחר-צעד הממחישים טכניקה זו לא פורסמו בעבר. פרוטוקול זה מאפשר דגימה סדרתית שגרתית של ה-BM למטרות כגון הערכת השתלה ב-BM של תאים שהוחדרו באופן אקסוגני לעכבר (כפי שנעשה במחקרי קסנוגרפט למשל2,3), ניתוח כימריזם ב-BM להשוואה לזה של הדם ההיקפי (כאשר התוצאות אינן בהכרח חופפות), ניטור שפע של סוגי תאים ספציפיים המועשרים בדרך כלל במח העצם כגון גזע המטופויאטי ותאי אב, ואחזור תאי BM לתרבית ex vivo ו/או השתלה. בנוסף, הערכת תכולת מח העצם עשויה להיות שימושית מאוד במודלים עכבריים של מחלה המטולוגית מכיוון ששאיפה מועילה בהערכת נטל המחלה ההמטולוגית בנקודות זמן בהן המחלה עשויה שלא להיות ניכרת בדם ההיקפי3-5. יתר על כן, ניתן להשתמש בטכניקה זו כדי להעריך את התגובה של מחלה המטולוגית במח העצם לתרופות הניתנות במחקרים טיפוליים. לפיכך, ההליך המתואר כאן אידיאלי עבור חוקרים המעוניינים לקבל גישה לתאים המטופויאטיים של מח עצם מעכברים לצורך ניתוח ציטולוגי, ניתוח זרימה ציטומטרי, תרבית חוץ גופית ו/או מחקרי השתלה in vivo מבלי לדרוש הקרבה או פגיעה בעכברים. 
פרוטוקול הדגימה של BM המתואר כאן דומה למדי לטכניקה המשמשת להזרקה תוך-ירכית של חומר ישירות לחלל מח העצם3,6. ההבדל העיקרי הוא שפרוטוקול זה מפרט את הליך הוצאת התאים מהמח בניגוד להחדרת חומר ישירות לחלל חלל מח העצם כפי שנעשה בהזרקה תוך ירך.

<table><tbody><tr><td>PBS</td><td>PAA</td><td>H15-002</td><td></td></tr><tr><td>אלבומין סרום בקר</td><td>PAA</td><td>K41-001</td><td></td></tr><tr><td>ACK מאגר ליזה</td><td>תוצרת בית</td><td></td><td>ב-1 ליטר. התאם את ה-pH 7.2 ~ 7.4 ומסנן סטרילי עם 0.22 &mu; מסנן ואקום מ '.</td></tr><tr><td>8.3 גרם אמוניום כלוריד</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>A661-500</td><td></td></tr><tr><td>1 גרם אשלגן ביקרבונט</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>P184-500</td><td></td></tr><tr><td>200 &mu; l 0.5 M EDTA pH 8</td><td>Gibco</td><td>15575-038</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>PAA</td><td>E15-842</td><td></td></tr><tr><td>0.5 מ"ל מזרק טוברקולין 27.5 גרם</td><td>Becton Dickinson</td><td>305620</td><td></td></tr><tr><td>מסננת תאים סטרילית 70 &mu; m</td><td>Fisher Scientific</td><td>22363548</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane, USP</td><td>Attane</td><td>NDC: 66794-014-25</td><td></td></tr><tr><td>מחט קהה</td><td>Stemcell Technologies</td><td>28110</td><td></td></tr><tr><td>מחט PrecisionGlide 23 גרם</td><td>בקטון דיקינסון</td><td>305193</td><td></td></tr><tr><td>3 מ"ל מזרק Luer-Lok tip</td><td>Becton Dickinson</td><td>309657</td><td></td></tr><tr><td>צלחת מטופלת בתרבית רקמות, 6 באר</td><td>בקטון דיקינסון</td><td>351146</td><td></td></tr><tr><td>שפופרות 12 x 75 מ"מ 5 מ"ל&nbsp;</td><td>Becton Dickinson</td><td>352054</td><td>FACS מכתים</td></tr><tr><td>12 x 75 מ"מ צינורות 5 מ"ל עם מכסה מסננת תאים</td><td>Becton Dickinson</td><td>352235</td><td>FACS מכתים</td></tr><tr><td>NK1.1 APC-Cy7</td><td>Biolegend</td><td>108723</td><td></td></tr><tr><td>CD11b APC-Cy7</td><td>Biolegend</td><td>101225</td><td></td></tr><tr><td>CD45R (B220) APC-Cy7</td><td>Biolegend</td><td>103223</td><td></td></tr><tr><td>CD3 APC-Cy7</td><td>Biolegend</td><td></td><td></td>100222</tr><tr><td>Ly-6G ו-Ly-6C (Gr-1) APC-CY7</td><td>Biolegend</td><td>108423</td><td></td></tr><tr><td>Ter119 APC-CY7</td><td>Biolegend</td><td>116223</td><td></td></tr><tr><td>CD19 APC-CY7</td><td>Biolegend</td><td>302217</td><td></td></tr><tr><td>CD4 APC-Cy7</td><td>BioLegend</td><td>317417</td><td></td></tr><tr><td>CD117 (c-KIT) PE</td><td>BioLegend</td><td>105808</td><td></td></tr><tr><td>Ly-6A/E (Sca-1) PE-Cy7</td><td>Biolegend</td><td></td><td></td>122513</tr><tr><td>CD34 APC</td><td>Biolegend</td><td>128612</td><td></td></tr><tr><td>CD16/32 e450</td><td>eBioscience</td><td>48-0161-82</td><td></td></tr><tr><td>DAPI (4&prime;,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>32670</td><td></td></tr><tr><td>MethoCult GF M3434</td><td>STEMCELLTECHNOLOGIES</td><td>3434</td><td>לתרבית מתוצלולוזה</td></tr><tr><td>קרפרופן</td><td>סהר כימי חברה</td><td>C11045850</td><td>מנה אחת (5 מ"ג/ק"ג)&nbsp;</td></tr><tr><td>ציטומטר זרימה, LSRמשחה וטרינרית</td> של <td>Dickinson Dickinson</td><td></td><td></td></tr><tr><td>(משחת עיניים סטרילית של פטרולאטום)</td><td>Dechra-US</td><td>17033-211-38</td><td></td></tr></tbody></table>

הירך מח עצם שאיפה בעכברים חיים

Femoral Bone Marrow Aspiration in Live Mice

דגימה סדרתית של ההרכב התאי של מח העצם (BM) היא הליך שגרתי קריטי להמטולוגיה קלינית. פרוטוקול זה מתאר נוהל טכני מפורט שלב אחר שלב להליך אנלוגי בעכברים חיים המאפשר אפיון סדרתי של תאים הקיימים ב-BM. הליך זה מקל על מחקרים שמטרתם לזהות נוכחות של תאים הניתנים באופן אקסוגני בתוך ה-BM של עכברים, כפי שנעשה במחקרי קסנוגרפט למשל. יתר על כן, הליך זה מאפשר שליפה ואפיון של תאים מועשרים ב-BM כגון תאי גזע ואב המטופויאטיים (HSPCs) ללא הקרבה של עכברים. בהתחשב בכך שההרכב התאי של הדם ההיקפי אינו משקף בהכרח את הפרופורציות והסוגים של תאי גזע ואב הנמצאים במח, הליכים המספקים גישה לתא זה מבלי לדרוש הפסקת עכברים מועילים מאוד. השימוש בשאיבת מח עצם עצם הירך מודגם כאן לניתוח ציטולוגי של תאי מח עצם, אפיון ציטומטרי זרימה של תא הגזע / האב ההמטופויאטי ותרבית של HSPCs ממוינים המתקבלים על ידי שאיבת BM עצם הירך בהשוואה לקציר מח עצם קונבנציונלי.

שאיפת הירך BM של עכבר C57/B6 חי נוצלה להשיג תאים מונונוקלארים BM אחרי קציר BM הקונבנציונלי של אותו העכבר לאחר הקרבה. תאים מונונוקלארים BM מתקבלים על ידי שתי השיטות נותחו לאחר מכן על ידי (1) ניתוח ציטולוגית של תאי BM, (2) קביעת השכיחות היחסית של תאי גזע / אבות היווצרות הדם (HSPCs), ו (3) לשעבר vivo תרבות של HSPCs הממוין. בניסוי, Sca1 השושלת שלילית האחרון + c-KIT + תאים (LSK) מוינו מהתאים חד גרעיניים שהושגו על ידי שאיפה BM כמו גם מקציר BM קונבנציונלי. 150 תאי LSK מתקבלים על...

פרוטוקול זה מתאר הליך לדגימה סדרתית של מח עצם הירך (BM) מבלי לדרוש הקרבה של עכברים. הליך זה מקל על מחקרי אורך של הרכב ה-BM של עכברים לאורך זמן ומספק גישה סדרתית לתאים בתוך ה-BM למחקרי ex vivo והשתלות.

Serial sampling of the cellular composition of bone marrow (BM) is a routine procedure critical to clinical hematology. This protocol describes a detailed ...

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא לשאוב בבטחה את תאי ההמטופוייז של מח העצם מחלל מח העצם בירך של עכבר חי. הדבר מבוצע תחילה על ידי שטיפת מזרק טוברקולין ב-PBS. בשלב השני, רגלו של העכבר מסודרת בזהירות בזווית האופטימלית להוצאת מח העצם.לאחר מכן שואבים את התאי ההמטופואטיים מחלל מוח העצם בירך ומסירים את תאי הדם האדומים. בסופו של דבר, ניתן להמחיש את השאיבה המוצלחת של תכני מוח העצם באמצעות אנליזות של ציטומטריה זרימתית וציטולוגיה. את הפרוצדורה ידגים Rock Chung הצעיר, טכנאי מוכשר מאוד מהמעבדה שלנו.היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון קציר מוח עצם קונבנציונלי, הוא שטכניקה זו מאפשרת שליפת חלק מהתאים ההמטופויטיים של מוח העצם תוך השארת החיה בחיים לצורך תצפית מתמשכת ואנליזות סדרתיות. לאחר אישור הסדציה באמצעות צביטה בבהו, יש למרוח משחה אופטלמית על עיני העכבר המורדם כדי למנוע התייבשות של הקרנית ולגלח את הרגל כדי לחשוף את העור. לאחר מכן מבוצעת הכנה כירורגית סטרילית של העור על ידי קרצוף של האזור עם חומר חיטוי כלורהексиדין, ולאחריו ניגוב עם סמרטוט אלכוהול.תהליך זה מבוצע שלוש פעמים, ועבור כל חיה נעשה שימוש במזרק ובמחט סטריליים, חדשים ולא פתוחים. יש לוודא שהושגה רמת הרדמה מתאימה. לאחר מכן, הרטב מזרק טוברקולין של 0.5 milliliter ב-PBS סטרילי, ואז שאב ורוקן מיד 200 עד 500 milliliters של תמיסת המלח שתיים עד שלוש פעמים.לאחר מכן, השתמש באחת משתי האצבעות האחרונות של יד אחת כדי להביא בעדינות את הטיביה (tibia) להטיה הרחק מהפמור (femur), כדי להקל על חשיפת המרווח הקונדילרי של הפמור ועל הכנסת המחט. כעת, הכנס את המחט דרך הגיד הפטלארי כך שתהיה מקובעת בבטחה בין שני הקונדילים של הפמור. השתמש באגודל ובאצבע המורה של היד השנייה כדי להחזיק את הדיאפיזה (diaphysis) קרוב לאפיפיזה (epiphysis) של הפמור, כדי לאפשר הכנסה קלה של המחט אל תוך גוף העצם.אם לא נראה דם במזרק, סביר להניח ששבב קטן של עצם או רקמה תקוע במחט. ניתן להסיר אותו מהמחט על ידי הנעת הבוכנה מעלה ומטה ב-PBS. אם לא ניתן להוציא את הרקמה מהמזרק, יש להשתמש במחט ובמזרק חדשים.שוב, הרטב את המזרק עם 200 עד 500 µL של PBS. לאחר מכן, סובב את המחט עם כיוון השעון ונגד כיוון השעון תוך כדי דחיפתה אל תוך החלל הקונדילרי, כך שתהיה מקבילה לציר ה-femur. זאת כדי להקל על הוצאת תכני מחית העצם מציר ה-femur.סובבו את המחט עם כיוון השעון ונגדו תוך כדי דחיפתה באיטיות אל תוך חלל מח העצם הפמורלי. ודאו את מיקומה הנכון של המחט על ידי הזזת המזרק בעדינות לצדדים. לאחר מכן, משכו בעדינות את בוכנת המחט לאחור כדי ליצור לחץ שלילי, תוך כדי הנעת המחט קדימה ואחורה בתוך חלל מח העצם.שאיבה מוצלחת תאושר על ידי הופעת דם בחלקו העליון של המחט בבסיס המזרק. לאחר ששאיבת מח העצם מהפמור הושלמה בהצלחה, הוצא את המחט מהעצם והעבר את מח העצם שנשאב למבחנת מיקרו-צנטריפוגה המכילה מראש 500 µl של PBS על קרח. לאחר מתן משכך כאבים, אפשר לעכבר להתאושש תחת מנורת חימום לפני החזרת העכברים לאזור הכלובים.וודאו שהם מסוגלים להתנייד ולהגיע למזון ולמים. לאחר מכן, החזירו את העכבר לכלובו ועקבו אחר בעל החיים כדי לזהות סימני מצוקה או זיהום לאחר הפרוצדורה במהלך 24 השעות הבאות. בינתיים,בצעו ספינטציה לתאי מחית העצם, שאבו את ה-PBS בזהירות והשביו את המשקע לתמיסה.לאחר 10 דקות ב-500 µL של תמיסת ליזיס לתאי דם אדומים, שטוף את התאים ב-1 mL של PBS. המשקע מכיל תאי מחולל (mononuclear cells) של מח העצם שניתן להשתמש בהם לניתוח ניסויי. דמויות ראשונות אלו ממחישות כיצד ניתן להבחין בסוגים ובפרופורציות דומות של תאי bulk ותאי גזע ופרוגניטורים המטופואטיים באמצעות ניתוחים מורפולוגיים וניתוחי ציטומטריה עם זרימה, תוך שימוש בשאיבת מח עצם מהפמור או באיסוף שגרתי של מח עצם.כאן מוצג האחוז של תתי-האוכלוסיות של תאי lineage negative SKA one positive C kit positive ותאי myeloid progenitor כתדירות מתוך סך התאים החיים בשלוש שאיבות עצם עצמאיות ובקציר מח עצם קונבנציונלי. נתונים אלו חושפים ירידה בתתי-האוכלוסיות של lineage negative SKA one positive C kit positive ותאי myeloid progenitors ממח עצם שנאסף על ידי שאיבה פמורלית בהשוואה לקציר מח עצם קונבנציונלי. הבדל זה לא היה מובהק סטטיסטית עבור האוכלוסייה.עם זאת, מיון של תאים שליליים לסוכה (lineage negative), חיוביים ל-ska one וחיוביים ל-cki, ולאחריו תרבית ex vivo ב-Methylcellulose, מביאים למספרי מושבות ולסוגי תאים דומים לאלו המתקבלים בשאיבת מח עצם מהעצם הירך. בדומה לאספת מח עצם קונבנציונלית, סוגי המושבות שנצפו ונספרו בשתי התרביות כוללים יחידות יוצרות מושבות של גרנולוציטים, אריתרוציטים, מונוציטים ומגקריוציטים, יחידות יוצרות מושבות של גרנולוציטים ומונוציטים, ויחידות יוצרות התפרצות אריתרואידיות One master. ניתן לבצע טכניקה זו בתוך 10 דקות לעכבר אם היא מבוצעת כהלכה בהתאם להליך זה.ניתן לבצע שיטות אחרות, כגון הזרקה תוך-פמורלית של מחית עצם, כדי לענות על שאלות נוספות, למשל: מהי השפעת השתלת קסנוגרפט של תאי המטופויזים אנושיים בעכברים עם מערכת חיסונית מדוכאת?

femoral-bone-marrow-aspiration-in-live-mice

Research

JoVE Journal

Medicine

רפואה

מודלים של בעלי חיים לעתים קרובות מנוצלים כדי ללמוד גרורות סרטן העצם. בפרוטוקול זה יתאר שתי שיטות נפוצות של חיסון ללימודי גידול גרור בעצמות ומתארים בקצרה כמה מהניתוחים מנוצלים כדי לעקוב ולכמת דגמים אלה.

מודלים של גרורות עצם

סרטון זה מתאר פרוטוקול מפורט לבידוד מח עצם שלם טרי מגפיו האחוריות של העכבר כדי לחקור פגמים שלמים ב- BM עבור חולים עם הפרעות דם כגון לוקמיה.

קציר מח עצם מגפה אחורית של עכבר

מונוציטים הם מווסתים מרכזיים של חסינות מולדת וממלאים תפקיד קריטי בחידוש המערכת הפגוציטית החד-גרעינית ההיקפית ובמקרה של דלקת. כתב יד זה מתאר את הליך ההדמיה בזמן אמת של מח העצם של קלווריה של העכבר כדי לחקור את מנגנון הגיוס של המונוציטים.

מעקב עכבר מח עצם המונוציטים<em&gt; In vivo</em

מוצגת אסטרטגיה לניתוח כמותי של נתונים היסטולוגיים במח העצם. מיקרוסקופיה קונפוקלית של תאים המסומנים באופן פלואורסצנטי בקטעי רקמה מביאה לתמונות דו-ממדיות, המנותחות אוטומטית. ניתוחי לוקליזציה משותפת של סוגי תאים שונים מושווים לנתונים מתמונות מדומות, ונותנים מידע כמותי על אינטראקציות תאיות.

אוטומטי כימות של תא המטופואטיות - אינטראקציות תא סטרומה בתמונות היסטולוגית של עצם Undecalcified

הפרוטוקול מתאר מודל חדש של תא חלון עצם הירך של עכברים שניתן להשתמש בו כדי לעקוב אחר תנועת תאים במח עצם הירך in vivo. מיקרוסקופיה פלואורסצנטית רב-פוטונית תוך-חיונית משמשת להדמיית שלושה מרכיבים של מח עצם הירך (כלי דם, מטריצת קולגן ונויטרופילים) לאורך זמן.

חלון ירך דגם קאמרי<em&gt; In vivo</em&gt; מעקב תא Murine מח עצם

מיקרוסקופ זריחה intravital (IVFM) של החילונית מוחל בשילוב עם דגמים גנטיים בעלי חיים כדי ללמוד את יונת ואת engraftment של תאים hematopoietic גומחות מח עצם (מוניטור).

שילוב של מיקרוסקופ פלואורסצנטי Intravital (IVFM) עם דגמים גנטיים בחקר דינמיקה Engraftment Hematopoietic תאים במח העצם נישות

המודל מאתר סגור בשביליאתה לא רואה שיש הוא כלי עוצמתי ללמוד ריפוי השבר ואסטרטגיות טיפוליים חדשניים כדי להאיץ התחדשות העצם. המטרה של פרוטוקול כירורגי זה היא לייצר חד צדדית שברי הירך סגור בעכברים באמצעות של פלדה מוט. לייצב את עצם הירך.

הדור של שברי הירך סגור בעכברים: מודל ללמוד ריפוי עצם

כאן, אנו מציגים פרוטוקול כדי לעבד מח עצם טרי (BM) מבודד מעכבר או בן אדם עבור cy, מימדי המונית ההמוני (Cy, Try על ידי זמן הטיסה, Cy,) ניתוח של תאי השושלת של נויטרופילים.

הכנת מח עצם שלם לניתוח המוני Cy, לטיפול בניופיל-תאי השושלת

אנו מתארים שלוש שיטות של השתלת מח עצם (BMT): BMT עם הקרנת גוף כוללת, BMT עם הקרנה מוגנת, ושיטת BMT ללא מיזוג מראש (BMT מאמץ) לחקר המטופוזיס שיבוטים במודלים של עכבר.

הליכים השתלת מח עצם בעכברים ללמוד Hematopoiesis שיבוט

פרוטוקול זה מתאר הזרקה תוך-פמורלית של כמה תאי גזע המטופויטיים או לוקמיים, כולל תאים ערוכים גנטית, במודלים של קסנוגרפט מורין, אשר לא רק יאפשרו השתלה מהירה ובטוחה של תאים אלא גם ניתוחים סדרתיים של מח העצם.

הזרקות תוך עצם הירך הפשוטות באמצעות עכברים חיים מאפשרות ניתוח רציף של מח עצם

כאן מוצג פרוטוקול מפורט לבידוד ואפיון אוכלוסיות מיקרו-סביבתיות של מח עצם ממודלים של תסמונות מיאלודיספלסטיות ולוקמיה מיאלואידית חריפה. טכניקה זו מזהה שינויים בנישת מח העצם הלא המטופויטית, כולל תאי האנדותל והסטרומה המזנכימליים, עם התקדמות המחלה.

זיהוי אוכלוסיות מיקרו-סביבתיות של מח עצם בתסמונת מיאלודיספלסטית ובלוקמיה מיאלואידית חריפה

למד שאיפת מח עצם מהירך בעכברים חיים ללא הריגתם. שיטה זו מאפשרת מחקרים לאורך זמן של הרכב מח העצם וניתוח תאים המטופואיטיים באמצעות ציטומטריית זרימה.

הירך מח עצם שאיפה בעכברים חיים

גלה סרטונים נוספים