לימוד ה-DNA Looping ידי סריג Single-מולקולה

המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא לחקור כיצד דינמיקת הלולאה של DNA דו-גדילי מושפעת מהצורה הפנימית של ה-DNA ללא שימוש בחלבונים קושרי DNA. זה מושג על ידי שילוב מולקולות צבע בשברי DNA דו-גדיליים בעלי עקמומיות שונות, כך שניתן לנטר את לולאת ה-DNA על ידי תהודה פלואורסצנטית, העברת אנרגיה או שריג. לאחר מכן ניתן לצפות באירועי הלולאה והלולאה ההפיכים ממולקולות ה-DNA הבודדות על ידי מיקרוסקופ השתקפות פנימי כולל.

לאחר מכן ניתן להסיק את קצב הלולאה של ה-DNA ממסלולי הזמן של כל פלואורסצנציה של מולקולה בודדת. בסופו של דבר, ניתן למדוד את ההסתברות הלולאה של ה-DNA ביחס לצורה הפנימית של השבר. היתרון העיקרי של בדיקת לולאת DNA זו הוא שהיא אינה מסתמכת על חלבון קושר DNA, מה שעשוי להשפיע על קינטיקה הלולאה של DNA A.

הפרוטוקול הפשוט עוסק בשימוש בטכניקה הנקראת העברת אנרגיה בתהודה פלואורסצנטית, וסינתזת DNA מבוססת PCR. כדי למדוד את ההסתברות למראה של DNA, התחל על ידי תכנון DNA מעוקל גלובלי על ידי חזרה על רצף של 10 MER. לדוגמה, רצף מייצג זה הוא DNA מעוקל של 186 זוגות בסיסים, כאשר X הוא בסיס נוסף אקראי והרצפים המאגפים את רצף 10 ה-mers החוזר הם רצפי מתאם.

לאחר מכן, בצע PCR עם פריימרים 1 ו-2 עם SI 3 תורם תיוג של פריימר שניים בקצה החמישי. לאחר מכן בצע PCR עם פריימרים 3 ו-4 עם תיוג SCI 5 מקבל שריגים דרך עמוד השדרה ומקשר הביוטין בקצה החמישי של פריימר שלוש. לאחר טיהור מוצרי ה-PCR באמצעות ערכת ניקוי PCR, ערבבו את שלושת המוצרים המסומנים ב-SCI ואת חמשת המוצרים המסומנים ב-SCI במאגר להחלפת גדיל בריכוזים סופיים של 0.4 מיקרו-מולרי ו-0.1 מיקרומולר בהתאמה.

לאחר מכן דגרו על הגדילים ב-98.5 מעלות צלזיוס למשך שתי דקות, התקררו בהדרגה לחמש מעלות צלזיוס בקצב רמפה של 0.1 מעלות צלזיוס לשנייה, ולאחר מכן דגרו בחמש מעלות צלזיוס למשך שעתיים. כדי להחליף את הגדילים להכנת תא הזרימה, השתמש במקדחה ובמקדחי יהלום כדי ליצור שישה עד שבעה זוגות חורים לאורך שני הקצוות המנוגדים של מגלשת זכוכית בגודל שלושה אינץ' על אינץ' אחד. לאחר שנקדחו כל החורים, שפשפו את המגלשה מתחת למים זורמים כדי להסיר אבקת זכוכית גלויה.

מניחים את המגלשות זקופות בצנצנת זכוכית וממלאים אותה במים מזוקקים. סוניקציה של הצנצנת למשך 15 דקות ולאחר מכן העבירו את השקופיות לצנצנת זכוכית המיועדת לניקוי אצטון. מלאו את הצנצנת באצטון והפכו את השקופיות לאצטון למשך 15 דקות נוספות.

לאחר מכן, רססו את השקופיות באתנול ולאחר מכן במים כדי לשטוף אותן ואז העבירו את השקופיות לצנצנת פוליפרופילן. מלאו את צנצנת הפוליפרופילן בחמישה אשלגן הידרוקסיד מולארי ולאחר מכן סוניקציה של השקופיות למשך 15 דקות נוספות לאחר הכביסה האחרונה, שטפו את המגלשות במים מזוקקים, ולאחר מכן 15 דקות נוספות. סוניקציה לאחר ניקוי הכיסוי מחליק.

באותו אופן, חלקו 80 מיקרוליטר של תמיסת PEG טרייה שהוכנה על כל שקופית, ולאחר מכן הורידו בעדינות את החלקת הכיסוי מעל היתד. לאחר 45 דקות, השתמש בפינצטה כדי להסיר את החלקות הכיסוי מהמגלשות, שטוף את השקופיות והכיסוי מחליק בכמות גדולה של מים מזוקקים. לאחר מכן יבש אותם בייבוש כאשר הכיסוי מחליק והמגלשות יבשות, הנח רצועות דקות של סרט מקל כפול על פני השקופית ליצירת תעלות, קו כיסוי מחליק מעל הרצועות ולחץ בחוזקה על החלקת הכיסוי ליצירת תעלות אטומות לנוזל.

לאחר מכן השתמש באפוקסי של חמש דקות כדי לאטום את שולי התעלות כדי לשתק את המולקולות למיקרוסקופיה. ראשית, הזרקו 15 מיקרוליטר של תמיסת נוי טרדין לתעלה אחת. לאחר שתי דקות, שטפו את התעלה עם 100 מיקרוליטר של מאגר T 50 ולאחר מכן הזריקו 50 מיקרוליטר של דגימת DNA לתעלה.

לאחר חמש דקות, שטפו את ה-DNA הלא קשור ב-100 מיקרוליטר של מאגר T 50, ולאחר מכן מלאו את התעלה במאגר הדמיה המכיל את מערכת ניקוי החמצן. כעת הנח שמן טבילה על מטרת המיקרוסקופ, ולאחר מכן השתמש בקליפס דגימה כדי להצמיד את תא הזרימה לשלב המיקרוסקופ. הפעל את הלייזר 532 ננומטר.

השתמש בתצוגה חיה של תמונות הפלורסנט על הצג כדי לעדן. כוונן את המיקוד. התחל את איסוף הנתונים עם לייזר 532 ננומטר מופעל.

עצור את רכישת הנתונים כאשר לרוב המולקולות יש צילום מולבן כדי לעבד ולנתח את התמונות, השתמש בסקריפט MATLAB כדי להסתכל על כל עקבות הזמן של מולקולה בודדת המציגות מעברים מרובים בין אותות השריג הגבוהים והנמוכים. זהה את המצבים הלולאים והלא-לולאה, ולאחר מכן מצא את הסף המפריד בין שתי ההתפלגויות על ידי קביעת ההצטלבות בין שתי עקומות גאוס המותאמות. לאחר מכן, חשב את יעילות חזית F על ידי חלוקת עוצמת המדע הבדיוני בסכום של שלוש SCI ועוצמות מדע בדיוני.

הקצאת מצבי לולאה עם ערכי סריגים גבוהים ומצבי ביטול לולאה עם ערכי סריגים נמוכים. לאחר מכן, באמצעות סקריפט MATLAB, נתח את המספר המצטבר של מולקולות או NFT שהגיעו למצב השריג הגבוה במרווחי זמן שונים. מאז תחילת רכישת הנתונים, ניתן לחלץ את לולאת המשנה K של קצב הלולאה על ידי התאמת ה-NFT לפונקציה מעריכית.

אם NFT מגדיל את ה-bi, בעצם ניתן לצייד אותו בפונקציה מעריכית כפולה כפי שמוצג במשוואה. במקרה זה, תת-לולאת K מתקבלת ממשוואה זו כדי לקבוע את זרימת גורם J. 20 מיקרוליטר של 30 עד 50 פיקה-מולר ביוטין sci חמש אוליגו או פריימר שלוש לתוך אחת מהתעלות המצופות באגוז טראווין כפי שהודגם זה עתה.

לאחר מכן, שטפו את התעלה ב-100 מיקרוליטר של T 50 כדי לשטוף אוליגואים לא קשורים, ולאחר מכן הזרימו לתוך התא מאגר הדמיה טרי שהוכן בתוספת PS 3 oligo. השאר את הלייזר של 532 ננומטר דולק ולאחר מכן הפעל לזמן קצר את הלייזר של 640 ננומטר כדי לזהות את המיקומים של כל אוליגו מדע בדיוני הקשור לפני השטח. לאחר מכן כבה את הלייזר של 640 ננומטר והתחל לנטר את אות השריג.

השתמש בסקריפט MATLAB כדי לנתח את מספר המולקולות שמתחילות במצב לא מאוגד. זה בעוצמה נמוכה של מדע חמש, אבל מאוחר יותר הופך למצב IL. כלומר עם עוצמת scifi גבוהה כפונקציה של זמן מעקבות עוצמת ה-scifi מתווה את המספר הזה של מולקולות ane לעומת זמן התאמת העקומה עם פונקציה מעריכית אחת כדי להשיג את קצב האילינג.

K sub anil, חזור על הניסוי בריכוזי SI שונים של שלושה אוליגו כדי לאשר את הליניאריות בין קצב הכריעה לריכוז המגיב. חלץ את הסדר השני קבוע קצב כריעה K ראשוני תת-איל מהמדרון. לבסוף, חשב את גורם J כאשר תת-לולאת K היא קצב הלולאה הנמדד באותם תנאי חיץ כדי לבדוק את השפעת העקמומיות הפנימית של DNA דו-גדילי על לולאה.

בניסוי זה, זוג בסיסים אחד ישר ואחד מעוקל 186. כל אחד מהם נבנה דנ"א דו-גדילי בהשוואה לדנ"א ישר. DNA מעוקל נקבע לייצר אירועי שריג גבוהים יותר באותה תקופת זמן.

ה-DNA המעוקל גם חזר לולאה בתדירות גבוהה פי ארבעה מה-DNA הישר באותו זמן רכישה, מה שמדגים שהעקמומיות הפנימית של ה-DNA יכולה להשפיע באופן משמעותי על הדינמיקה הלולאה. בשלב ניתוח אחרון זה, גורם J חושב על ידי חלוקת קצב הלולאה בסדר הראשון, קבוע קצב כריעה, ונקבע כ-61 פלוס או מינוס שלוש אנו-מולר עבור ה-DNA הישר ו-265 פלוס או מינוס 48 ננו-מולרי עבור ה-DNA העקומה בהסכמה עם ממצאים קודמים. בעקבות הליך זה, ניתן ללמוד את ההשפעות של גורם התאונה על ניידות הלולאה כגון טמפרטורה, לא מתוח וצמיגות.

פרוטוקול זה יהיה שימושי לא רק לחקר הפיזיקה הפולימרית של ה-DNA, אלא גם להדגמת כוחה של הקרינה של מולקולה בודדת לתלמידי מחקר מתחילים או לקהל הדיוטות.