Name: הערכת פעילות אנטי פטרייתי של מבודדים מכתשיים המקרופאגים ידי מיקרוסקופיה confocal (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-07-09T21:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 4 s
Description: למדו להעריך את יכולת המקרופאגים האלוולריים לשלוט בגדילת ספורות פטרייתיות באמצעות מיקרוסקופיית confocal. השיטה כוללת תיוג תאים, איסוף בלוואז' ואתגר פטרייתי לניתוח פגוציטוזה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי המכון הלאומי לאלרגיה והמחלות מדבקות גרנט R01AI079253 (לBHS), ועל ידי המכון הלאומי לסרטן סרטן מרכז תמיכת גרנט CA016056 לRoswell Park Cancer Institute.

כל ההליכים שבוצעו בבעלי חיים במחקר זה אושרו על ידי ועדת הטיפול בבעלי חיים והשימוש בRoswell Park Cancer Institute ועמדו בכל המדינה, הפדרלית, והמכון הלאומי לתקנות בריאות. 1. בvivo Macrophage תיוג הערה: PHK26 הוא צבע lipophilic שיינקט על ידי תאי phagocytic גם במחזור וברקמות, כאשר בהזרקה לווריד (IV). PKH26 שימש לסימון in vivo כדי למזער את הכמות של מניפולציה לאחר הקטיף של מקרופאג. יש PKH-26 היתרון של יציבות צבירה במקרופאגים מכתשיים לאורך תקופות ממושכות. מחכה 10 ימים לאחר מתן מאפשר סליקה של כל התאים שכותרתו ממחזור ומשאירים רק מכתשיים מקרופאג שכותרתו ביציבות עם PKH26 8, 9. PKH26 הוא fluorochrome אדום שיש עירור (551 ננומטר) ופליטת מאפיינים (567 ננומטר) תואמיםעם מערכות rhodamine או זיהוי phycoerythrin. כל הליך תיוג יכול להציג את החפץ, לרבות אובדן יכולת הקיום. עם זאת, מאחר שאנו משתמשים באותה הגישה לתיוג של מקרופאגים בגנוטיפים עכבר שונים (למשל, WT לעומת NADPH אוקסידאז לקוי), את ההשפעות של חפצים אלה יהיו אחידות. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל פתרון מניות של PKH26 (1 x 10 -3 M באתנול) 1:05 ב-C diluent המסופק על ידי יצרן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> של PKH26 דילול עומס 100 μl לתוך מזרק 1/2 מיליליטר אינסולין (29 G x 1/2 &quot;) לכל עכבר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנהל לעכברים בהזרקת IV (או וריד זנב או מסלולית רטרו) 10 ימים לפחות לפני הקציר. </li></ol> 2. קציר מכתשיים המקרופאגים על ידי שטיפה ברונכואלוואולרית (BAL) מספר העכברים לשימוש עבור ניסוי יכול להשתנות. תשואה אופיינית מעכבר unstimulated היא בטווח של 3-5 x 10 5 מקרופאגים מכתשיים, אולם מספר זה יכול להשתנות במידה רבה BASאד בגורמים כגון גודל של העכבר, החוויה של האדם שבצע את שטיפה, ומספר instillations של נוזל שטיפה והנפח נסוג מריאות. בפרוטוקול זה שטיפת ריאות מתבצעת עם חלל בית החזה סגור אשר יחד עם lavages 1 מיליליטר חוזר ונשנה עוזר להגדיל את תשואת תא. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים את עכבר על ידי מתן מנה קטלנית של חומר ההרדמה Avertin (12.5 מ&quot;ג) intraperitoneally (IP) באמצעות תנאים אספטיים כדי לשמור על התמיסה סטרילית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספריי עכבר ביסודיות עם 70% אתנול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את העור מקצה הגולגולת של בעלי חיים וחושפים את בית החזה (איור 1 א). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעשות חתך קטן בעור ממש מתחת לסרעפת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס את האצבע לתוך החתך ולמשוך את עור מקצה הגולגולת של (איור 1 א) לבעלי החיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדחוף את מעט על הראש, המשתרע בצד הגחוני של הצוואר (איור 1 א). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחתוך חור קטן שדרך כלוב הצלעותלצד הימני של בית החזה כדי להוציא את האוויר לריאות וגם לאפשר הדמיה של ריאות במהלך השלבים הבאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אתר את קנה הנשימה, ובזהירות לנתח משם רקמה שמסביב. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את בלוטות רוק, שרירי sternohyoid וגרון, וכו &#39;עם מלקחיים מעוקלים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזהירות להרים עם מלקחיים מעוקלים ולחתוך עם מספריים הרקמה דקה המכסה את קנה הנשימה (adventitia) לחשוף את מבנה סחוס טבעתי שבבסיס. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס קטטר לתוך קנה הנשימה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות מלקחיים מעוקלים, הנח תפר מאחור (גב ל) קנה הנשימה ולשלוף אורך 10 סנטימטר דרך הפתח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל מעל cricoid (הטבעת המעובה של סחוס) ינחה בזהירות קטטר G 22 המורד קנה הנשימה לעצור בו את קנה הנשימה נעלמת מאחורי עצם החזה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בתוקף לקשור תפר סביב קנה הנשימה וקטטר להתאמה הדוקה. הסר את המחט מקטטר. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרכיב ברזלים 4 כיוונים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למלאאחד 6 מיליליטר המזרק עם DPBS, FBS 1% ולצרף לברזלי 4 כיוונים כפי שמצוין באיור 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צרף מזרק מיליליטר ריק 6 במיקום מצויינים על ברזלים 4-way (איור 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צרף נמל פתוח בברזלים 4-דרך קטטר (איור 1). היזהר שלא לסלק קטטר מקנה הנשימה. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף שטיפת נוזלים מריאות. הערה: חוקרים יכולים לבחור להשתמש בכמויות נמוכות יותר של נוזל שטיפה כדי למזער את האפשרות של נזק לרקמות. זה חשוב כי באותה הגישה יש ליישם באופן עקבי בכל קבוצות העכבר. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סובב את הידית על ברזלים כך המזרק הריק סגור ולאט להזריק DPBS ~ 1 מיליליטר, 1% FBS לנפח את הריאות. שים לב לאינפלצית ריאה דרך החור בשלב 2.4. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> היזהר שלא overinflate הריאות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סובב את הידית על ברזלים, כך שהמזרק המלא סגור, ולסגת בזהירות השפעת<html> id מהריאות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים לב לריאות להוציא את האוויר דרך החור בשלב 1.4. קטטר ייתכן שיצטרך להזיז מעט אחורה או אחורה כדי לקבל הגרלה טובה. לנקוט אמצעי זהירות מיוחדת כדי לשמור את הקטטר בתוך קנה הנשימה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלבים 2.8.1-2.8.4 5-6x עד שכל DPBS, 1% FBS כבר הזריק ונסוג מהריאות. הערה: התאוששות של ריאות נוזל לא תהיה של נוזל מוזרק 100%. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מזרק ריק עם נוזל שטיפה לתוך צינור חרוטי 50 מיליליטר. לשמור על תאים בטמפרטורת חדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גלולה תאים על ידי צנטריפוגה XG 300 5 דקות בטמפרטורת חדר ויוצקים את supernatant. זו ניתן לשמור לניתוח ציטוקינים אם תרצה בכך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend תאים ב1-5 מיליליטר RPMI 1640 עם FBS 10% ולסמוך על hemocytometer. בעכבר unstimulated,&gt; 95% מתאים שנקטפו על ידי BAL צפויים להיות מקרופאגים, אשר יכול להיות מאושר על ידי ציטולוגיה. </li></ol> 3. Culturing וקציר פטרייה &quot;&gt; Fumigatus Aspergillus שימוש בפרוטוקול זה מבטא GFP בכל שלבי מחזור החיים שלו:. נבגים, germlings ועובש פטרייתי זן זה הניתן על ידי ד&quot;ר מרגו מור, אוניברסיטת סיימון פרייזר, Burnaby, BC, קנדה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נבגי צלחת של מתח fumigatus Aspergillus להביע GFP בעירוי לב מוח Sabouraud (BHI) אגר שיפועים עם Chloramphenicol (0.05 גר &#39;/ ל&#39;) וגנטמיצין (0.5 גר &#39;/ ל&#39;). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה בחושך כתרים באופן רופף ל7-10 ימים בטמפרטורת חדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קציר נבגים על ידי אלכסון כביסה עם 10 מיליליטר של 0.01% Tween 20 בDPBS. קל לגרד את הפטרייה עם stripette כדי לשחרר. יש לשטוף את השיפוע מספר פעמים כדי להגדיל את התשואה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עובר השעיה נבגים דרך מסננת תא 100 מיקרומטר ל50 מיליליטר חרוטי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גלולה נבגים על ידי צנטריפוגה ב XG 400 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נבגי resuspend ב 50 DPBS מיליליטר ולספור באמצעות hemocytometer. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף פעמיים עם DPBS ולדלל את ריכוזים רצוייםטיפול במשפחה. </li></ol> 4. פטרייתיים אתגר ומיקרוסקופיה confocal כדי לחקור את התפקיד של מונואמין NADPH מקרופאג בהגנת מארחת, את היכולת של מקרופאגים מכתשיים מבודדים מעכברים של שלושה גנוטיפים לשלוט על הצמיחה של נבגי אספרגילוס phagocytosed הוערכה. גנוטיפים השתמשו במחקר זה כוללים; 1) wild-type עכברים, 2) Ncf1 * / * Mn-עכברים עם מוטציה Ncf1 טבעית (Ncf1 מקודד לphox p47, רכיב הנדרש של מונואמין NADPH תא בלען) ומשאיר אותם חסר מונואמין NADPH, ו3) Ncf1 * / * Mn + עכברים הטרנסגניים (MN מציין transgene מחסה wildtype Ncf1 תחת השליטה של אמרגן CD68 אדם) שבו פעילות מונואמין NADPH כבר מחדש באוכלוסיית מונוציטים / מקרופאג 10, 11. מיקרוסקופיה confocal היא מתאימה ביותר עבור assay זה בשל נוכחותםוצמיחה של נבגים שאינם phagocytosed בשקופיות. מיקרוסקופ confocal יאפשר להדמיה של מטוסים בודדים בתוך ציר ה-Z, ולאפשר הבחנה בין הפטרייה גדלה בסביבה ולא בתוך מקרופאג. כל תמונות confocal נרכשות באמצעות עדשת טבילת שמן 63X. Z-ערימות נרכשות עם גורם הזום אלקטרוני של 2.5. העובי של Z-מחסנית נקבע באמצעות DAPI ותמונות שדה בהירים כדי לאתר את החלק העליון ותחתון של השדה. Z-ערימות נעו 14-24 מיקרומטר עם פרוסות בודדות ~ 1 מיקרומטר עבה. לכימות של מקרופאגים, סריקות יחידה של זום האלקטרוני 1X בוצעו על 10 שדות לכל גנוטיפ. מקרופאגים ללא פגע זוהו מבוסס על PKH26 ומכתים DAPI של הקרום וגרעין בהתאמה. נבגים זוהו מבוסס על ביטוי FITC ותמונת שדה בהיר. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את coverslips וצלחות סטרילי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תחת ארון בטיחות ביולוגית, לספוג 22 x 22 coverslips זכוכית מ&quot;מ בethano 70%l ל5-10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש לשטוף coverslips ב PBS סטרילית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת מלקחיים סטרילית, מניח בעדינות coverslip יחיד בתחתית היטב בכל צלחת 6 היטב ארוזה בנפרד סטרילי. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זרע ~ 1 x 10 6 נקטף PKH26 כותרת מקרופאגים מכתשיים מושעים ב300 μl RPMI 1640, FBS 10% על כל coverslip. המספר המדויק עשוי להשתנות תלוי בתשואת הקציר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאפשר מקרופאג לדבוק ידי דוגרים על 37 ° C עם 5% CO 2 בלילה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למחרת בבוקר, להוסיף ~ 1 x 10 7 א-GFP-לבטא נבגי fumigatus מושעים ב100 μl RPMI 1640, 10% FBS (37 מעלות צלזיוס) מחומם מראש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להחזיר את צלחת לאינקובטור 37 ° C עם 5% CO 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאים צריכים להיות קבועים למשך התקופה מינימאלית של 2 שעות בטמפרטורת חדר או הלילה ב 4 ° C. בבית 3, 7, ו14 תאים לתקן את שעה על ידי הוספת נפח שווה של פורמלדהיד 2% לכל טוב (ריכוז סופי פורמלדהיד 1%). צלחות מקוםנקודות זמן המוקדם ב 4 ° C למשך הלילה. לנקודת הזמן הסופית (14 hr), לתקן את התאים בטמפרטורת חדר למשך 2 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר קיבוע, בעדינות להסיר coverslips באמצעות מלקחיים ולשטוף בDPBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להסיר את הנוזלים עודפים על ידי הצבת קצה coverslip על Kimwipe מקופל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל 6 הרכבה בינונית הקרינה μl עם DAPI לשקופית הזכוכית מיקרוסקופ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח קצה אחד של coverslip בשקופית ובעדינות שחרר עם צד תא למטה להרכבה בינונית. הרכבה בינונית תתפשט ויוצר שכבה אחידה מתחת coverslip. אין צורך ללחוץ על coverslip. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאטום קצוות של coverslip עם לק ברור ולאפשר לאוויר יבש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חנות שקופיות מוכנה בקופסא שקופיות (המוגנת מפני אור) בטמפרטורת חדר עד מוכן לנתח על ידי מיקרוסקופיה confocal. </li></ol>

<ol><li>Reeves, E. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Killing+activity+of+neutrophils+is+mediated+through+activation+of+proteases+by+K%2B+flux%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Killing activity of neutrophils is mediated through activation of proteases by K+ flux.</a> Nature. 416, 291-297 (2002).</li>
<li>Bianchi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Restoration+of+NET+formation+by+gene+therapy+in+CGD+controls+aspergillosis%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Restoration of NET formation by gene therapy in CGD controls aspergillosis.</a> Blood. 114, 2619-2622 (2009).</li>
<li>Vethanayagam, R. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+NADPH+oxidase+versus+neutrophil+proteases+in+antimicrobial+host+defense%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Role of NADPH oxidase versus neutrophil proteases in antimicrobial host defense.</a> PLoS One. 6, (2011).</li>
<li>Grimm, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monocyte-+and+Macrophage-Targeted+NADPH+Oxidase+Mediates+Antifungal+Host+Defense+and+Regulation+of+Acute+Inflammation+in+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Monocyte- and Macrophage-Targeted NADPH Oxidase Mediates Antifungal Host Defense and Regulation of Acute Inflammation in Mice.</a> The Journal of Immunology. 190, 4175-4184 (2013).</li>
<li>Schaffner, A., Douglas, H., Braude, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+protection+against+conidia+by+mononuclear+and+against+mycelia+by+polymorphonuclear+phagocytes+in+resistance+to+Aspergillus.+Observations+on+these+two+lines+of+defense+in+vivo+and+in+vitro+with+human+and+mouse+phagocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Selective protection against conidia by mononuclear and against mycelia by polymorphonuclear phagocytes in resistance to Aspergillus. Observations on these two lines of defense in vivo and in vitro with human and mouse phagocytes.</a> J Clin Invest. 69, 617-631 (1982).</li>
<li>Philippe, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Killing+of+Aspergillus+fumigatus+by+alveolar+macrophages+is+mediated+by+reactive+oxidant+intermediates%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Killing of Aspergillus fumigatus by alveolar macrophages is mediated by reactive oxidant intermediates.</a> Infect Immun. 71, 3034-3042 (2003).</li>
<li>Cornish, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reduced+nicotinamide+adenine+dinucleotide+phosphate+oxidase-independent+resistance+to+Aspergillus+fumigatus+in+alveolar+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Reduced nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase-independent resistance to Aspergillus fumigatus in alveolar macrophages.</a> J Immunol. 180, 6854-6867 (2008).</li>
<li>Jennings, J. H., Linderman, D. J., Hu, B., Sonstein, J., Curtis, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monocytes+recruited+to+the+lungs+of+mice+during+immune+inflammation+ingest+apoptotic+cells+poorly%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Respir+Cell+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Monocytes recruited to the lungs of mice during immune inflammation ingest apoptotic cells poorly.</a> Am J Respir Cell Mol Biol. 32, 108-117 (2005).</li>
<li>Davidson, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DISCRIMINATION+OF+RESIDENT+AND+INFILTRATED+ALVEOLAR+MACROPHAGES+BY+FLOW+CYTOMETRY+IN+INFLUENZA+A+VIRUS-INFECTED+MICE%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Lung+Research%22%5BJournal%5D)">DISCRIMINATION OF RESIDENT AND INFILTRATED ALVEOLAR MACROPHAGES BY FLOW CYTOMETRY IN INFLUENZA A VIRUS-INFECTED MICE.</a> Experimental Lung Research. 31, 323-339 (2005).</li>
<li>Gelderman, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophages+suppress+T+cell+responses+and+arthritis+development+in+mice+by+producing+reactive+oxygen+species%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Macrophages suppress T cell responses and arthritis development in mice by producing reactive oxygen species.</a> J Clin Invest. 117, 3020-3028 (2007).</li>
<li>Pizzolla, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reactive+oxygen+species+produced+by+the+NADPH+oxidase+2+complex+in+monocytes+protect+mice+from+bacterial+infections%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Reactive oxygen species produced by the NADPH oxidase 2 complex in monocytes protect mice from bacterial infections.</a> J Immunol. 188, 5003-5011 (2012).</li>
<li>Luther, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterisation+of+the+phagocytic+uptake+of+Aspergillus+fumigatus+conidia+by+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Microbes+and+Infection%22%5BJournal%5D)">Characterisation of the phagocytic uptake of Aspergillus fumigatus conidia by macrophages.</a> Microbes and Infection. 10, 175-184 (2008).</li>
<li>Geunes-Boyer, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surfactant+Protein+D+Increases+Phagocytosis+of+Hypocapsular+Cryptococcus+neoformans+by+Murine+Macrophages+and+Enhances+Fungal+Survival%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Surfactant Protein D Increases Phagocytosis of Hypocapsular Cryptococcus neoformans by Murine Macrophages and Enhances Fungal Survival.</a> Infection and Immunity. 77, 2783-2794 (2009).</li>
<li>García-Rodas, R., González-Camacho, F., Rodríguez-Tudela, J. L., Cuenca-Estrella, M., Zaragoza, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Interaction+between+Candida+krusei+and+Murine+Macrophages+Results+in+Multiple+Outcomes%2C+Including+Intracellular+Survival+and+Escape+from+Killing%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">The Interaction between Candida krusei and Murine Macrophages Results in Multiple Outcomes, Including Intracellular Survival and Escape from Killing.</a> Infection and Immunity. 79, 2136-2144 (2011).</li>
<li>Ryan, L. K., Vermeulen, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alveolar+macrophages+from+C3H%2FHeJ+mice+show+sensitivity+to+endotoxin%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Respir+Cell+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Alveolar macrophages from C3H/HeJ mice show sensitivity to endotoxin.</a> Am J Respir Cell Mol Biol. 12, 540-546 (1995).</li>
<li>Redente, E. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+polarization+of+alveolar+macrophages+and+bone+marrow-derived+monocytes+following+chemically+and+pathogen-induced+chronic+lung+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Leukoc+Biol%22%5BJournal%5D)">Differential polarization of alveolar macrophages and bone marrow-derived monocytes following chemically and pathogen-induced chronic lung inflammation.</a> J Leukoc Biol. 88, 159-168 (2010).</li>
<li>Schaffner, A., Douglas, H., Braude, A. I., Davis, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Killing+of+Aspergillus+spores+depends+on+the+anatomical+source+of+the+macrophage%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Killing of Aspergillus spores depends on the anatomical source of the macrophage.</a> Infect Immun. 42, 1109-1115 (1983).</li>
<li>Goodridge, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+use+of+CARD9+by+dectin-1+in+macrophages+and+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Differential use of CARD9 by dectin-1 in macrophages and dendritic cells.</a> J Immunol. 182, 1146-1154 (2009).</li>
</ol>

יש המחברים אין לחשוף.

השימוש בגישה זו לניתוח vivo לשעבר של הפעילות נגד פטריות של מקרופאגים יחד עם אתגר פטרייתי in vivo, שהוכחנו בעבר כי מונואמין NADPH במקרופאגים ממלא תפקיד חשוב בהגנה מפני א 4 fumigatus. שימוש במקרופאגים מכתשיים מבודדים מאפשרים לנו להתמקד בפעילות נגד פטריות שלהם בהיעדרם של תאים חיסוניים אחרים (למשל, גייס את הנויטרופילים) שלהתגונן מפני אספרגילוס in vivo. אסטרטגיות...

מקרופאגים מכתשיים הם תאי phagocytic הקו הראשון שנתקלים בחיידקים בשאיפה. המקרופאגים מכירים מוטיבים אספרגילוס על ידי קולטנים זיהוי הפתוגן, לבלוע ולהגביל את הצמיחה של נבגים בשאיפה (נבגים), וליזום תגובות דלקתיות. מונואמין NADPH התא בלען ממיר חמצן מולקולרי לאניון סופראוקסיד ביניים במורד הזרם חמצן מגיבים (ROIs). המחלה granulomatous כרונית (CGD) היא הפרעה תורשתית של מונואמין NADPH מתאפיין בזיהומים חיידקיים ופטרייתיים חמורים ועל ידי תגובות דלקתיות מוגזמות. למרות מונואמין NADPH הוא קריטי להגנה מארחת בתיווך נויטרופילים 3 - 1, את החשיבות של מונואמין NADPH במקרופאגים אינה מוגדרת היטב. מחקרים קודמים הראו כי מקרופאגים מכתשיים לבלוע ולהרוג נבגי אספרגילוס, בעוד שהנויטרופילים בעיקר למקד את שלב hyphal 5. עם זאת, היו resul סותרts כלתפקיד של מונואמין NADPH במקרופאג בשליטה על הצמיחה של א &#39; fumigatus נבגי 6, 7. מטרתה של שיטה זו הייתה להתוות את התפקיד הספציפי של מונואמין NADPH במקרופאגים בתיווך הגנת מארחת נגד א &#39; נבגי fumigatus. מצאנו כי מונואמין NADPH במקרופאגים מכתשיים שולט על הצמיחה של א &#39;phagocytosed fumigatus נבגי 4. למודל תגובת המארח לפטריות בשאיפה באופן הדוק ביותר, השתמשנו מקרופאגים מכתשיים שנקטפו על ידי שטיפה ברונכואלוואולרית מעכברי unstimulated הבא להקריב באופן מיידי. שימוש במקרופאגים מכתשיים מבודדים אפשרו לנו להתמקד בפעילות נגד פטריות שלהם בהיעדרם של תאים חיסוניים אחרים (למשל נויטרופילים שגויסו,) שלהתגונן מפני אספרגילוס in vivo. בשיטה זו, מקרופאגים מכתשיים הוכתמו in vivo לפני קציר, כדי למזער את הכמות של מניפולציה לאחר קטיף. &lt;/ P&gt; יתרון נוסף לפרוטוקול זה הוא השימוש בא-GFP-לבטא זן fumigatus. פטרייה זו מבטאת GFP משלב הנבגים דרך שלב hyphal ואין לו צורך בצביעה נוספת. כדי להשיג תמונות עם פירוט רב יותר, בחרנו מיקרוסקופיה confocal המאפשרת הבנייה מחדש של מבנים תלת ממדיים מהתמונות שהושגו. שחזור תלת ממדי נותן את היכולת להבדיל בין העובש גדל בסביבה ולא באו באמצעות מקרופאג. נבגים יכולים להיות גם בדיוק מכובדים כתאי לעומת תאי.

<table><tbody><tr><td>ערכת קישור תאים פלואורסצנטיים אדומים PKH26 לתיוג קרום תא כללי</td><td>Sigma</td><td>PKH26GL-1KT</td><td></td></tr><tr><td>2,2,2 Tribromoethanol</td><td>Sigma</td><td>T48402</td><td>משמש לייצור AvertinAnesthetic</td></tr><tr><td>2-methyl-2-butanol</td><td>Sigma</td><td>A-1685</td><td>משמש לייצור AvertinAnesthetic</td></tr><tr><td>Dulbecco&#039; s פוספט חוצץ מלח (ללא סידן ומגנזיום)</td> <td>קורנינג</td><td>21-031-CV</td><td></td></tr><tr><td>NH4Cl</td><td>Sigma</td><td>A0171</td><td>משמש לייצור מאגר ליזה של תאים אדומים ACK</td></tr><tr><td>KHCO3</td><td>Sigma</td><td>P91444</td><td>משמש לייצור מאגר ליזה של תאים אדומים ACK</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma</td><td>E6758</td><td>משמש לייצור מאגר ליזה של תאים אדומים ACK</td></tr><tr><td>22 G x 1.00 אינץ' i.v. קטטר</td><td>BD</td><td>381523</td><td>Insyte Autoguard</td></tr><tr><td>מזרקי אינסולין מכונפים</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>6 מ"ל מזרקים</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>4 כיוונים Fisher</td><td>Scientific</td><td>50-700-077</td><td></td></tr><tr><td>חוט</td><td></td><td></td><td></td>תפר</tr><tr><td>50 מ"ל צינורות צנטריפוגה חרוטיים</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ספוגי גזה (4 אינץ' מרובע)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 עם L-גלוטמין</td><td>קורנינג</td><td>10-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי</td><td>Hyclone</td><td>SH30396.03</td> סט Hema 3 כתמים <td>מושבת בחום</td></tr><tr><td></td><td>Fisher Scientific</td><td>22-122-911</td><td></td></tr><tr><td>Cytoseal 60</td><td>Thermo Scientific</td><td>8310-4</td><td></td></tr><tr><td>Sabouraud מוח עירוי לב אגר עם כלורמפניקול וג'נטמיצין סלנטים</td><td>BD</td><td>297252</td><td></td></tr><tr><td>Aspergillus fumigatous זן המבטא חלבון</td><td></td><td></td> פלואורסצנטי ירוק <td>המסופק על ידי ד"ר מרגו מור, אוניברסיטת סיימון פרייזר, ברנבי, קולומביה הבריטית, קנדה</td></tr><tr><td>100 &mu; m מסנני תאים</td><td>BD Falcon</td><td>64753-00</td><td></td></tr><tr><td>מספריים</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>מלקחיים</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ארון בטיחות ביולוגי Class II</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sorval ST40 צנטריפוגה עם רוטור</td><td></td><td></td><td></td>דלי נדנדה</tr><tr><td>Leica DM1000 מיקרוסקופ</td><td></td><td></td><td></td>אור</tr><tr><td>Hemocytometer</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>צנטריפוגה ציטוספין 2</td><td></td> חממת תרמו-סיינטיפיק <td></td><td></td></tr><tr><td>תרבית תאים</td> 37 מעלות ו-37 מעלות;<td></td><td></td><td> C, 5%&nbsp; CO2</td></tr><tr><td>22 x 22 מ"מ זכוכית כיסוי מיקרו</td><td>VWR</td><td>48366-227</td><td>כיסויי זכוכית</td></tr><tr><td>6 בארות לוחות תרבית תאים</td><td>Corning</td><td>3506</td><td></td></tr><tr><td>10% ניטרלי חוצץ פורמלין</td><td>VWR</td><td>BDH0502-1LP</td><td></td></tr><tr><td>Vectashield מדיום הרכבה עם DAPI</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1200</td><td></td></tr><tr><td>Leica TCS SP2 מערכת עם סורק נקודת לייזר</td><td></td><td></td><td>מותקן על מיקרוסקופ פלואורסצנטי DMIRE2</td></tr></tbody></table>

הערכת פעילות אנטי פטרייתי של מבודדים מכתשיים המקרופאגים ידי מיקרוסקופיה confocal

Assessing Anti-fungal Activity of Isolated Alveolar Macrophages by Confocal Microscopy

הריאות היא ממשק שבו תאי מארח נחשפים באופן שיגרתי לחיידקים ומוצרים של חיידקים. מקרופאגים מכתשיים הם תאי phagocytic הקו הראשון שנתקלים בפטריות בשאיפה וחיידקים אחרים. המקרופאגים ותאים אחרים של מערכת חיסון לזהות את המוטיבים אספרגילוס על ידי קולטנים זיהוי הפתוגן וליזום תגובות דלקתיות במורד הזרם. מונואמין NADPH תא בלען מייצר ביניים חמצן מגיבים (ROIs) והוא קריטי להגנה מארחת. למרות מונואמין NADPH הוא קריטי להגנה מארחת בתיווך נויטרופילים 3 - 1, את החשיבות של מונואמין NADPH במקרופאגים אינה מוגדרת היטב. מטרת המחקר הנוכחי הייתה להתוות את התפקיד הספציפי של מונואמין NADPH במקרופאגים בתיווך הגנת מארחת נגד א &#39; fumigatus. מצאנו כי מונואמין NADPH במקרופאגים מכתשיים שולט על הצמיחה של א &#39;phagocytosed fumigatus נבגי 4. כאן אנו מתארים שיטה להערכת היכולת של עכברמקרופאגים lveolar (AMS) לשלוט על הצמיחה של נבגי phagocytosed אספרגילוס (נבגים). מקרופאגים מכתשיים הם מוכתמים בvivo ועשרה ימים לאחר מכן בודדו מעכברים על ידי שטיפה ברונכואלוואולרית (BAL). המקרופאגים הם מצופים על coverslips זכוכית, ולאחר מכן זורעים עם חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) להביע א נבגי fumigatus. בזמנים שצוינו, תאים הם קבועים ומספר מקרופאגים שלמים עם נבגי phagocytosed נבחנים על ידי מיקרוסקופיה confocal.

<html> איסוף מקרופאג מכתשיים ידי BAL מעכברי unstimulated יגרום&gt; 95% מאוכלוסייה טהורה המבוססת על ציטולוגיה. 3 ו 7 שעות (איור 2) נקודות זמן להקדים את שלב hyphal של פטרייתי צמיחה ולאפשר השוואה של יעילות phagocytic של נבגים בין גנוטיפים. נקודת הזמן 14 שעות היא שבו ניתן להשוות גנוטיפים בכל קשור ליכולת לעכב את המעבר של נבגי phagocytosed לבמה hyphal רקמות פולשנית (איור 3). מקרופאג השלם יכול להיות מזוהה על ידי מיקרוסקופיה confocal המבוסס על כתמי PKH26 ו...

שיטה כדי להעריך את יכולתם של מקרופאגים מכתשיים עכבר בודדים לשלוט על הצמיחה של נבגי אספרגילוס phagocytosed ידי מיקרוסקופיה confocal.

The lung is an interface where host cells are routinely exposed to microbes and microbial products. Alveolar macrophages are the first-line phagocytic ...

המטרה הכוללת של פרוצדורה זו היא להשוות את יכולתם של מקרופאגים לבקר את הצמיחה של הפטרייה candia ex vivo. הדבר מושג תחילה על ידי סימון של מקרופאגים אלבולאריים in vivo באמצעות הצבע ליפופילי PKH 26. השלב השני של הפרוצדורה הוא איסוף מקרופאגים אלבולאריים מהעכברים המוחדרים באמצעות שטיפה ברונכואלבולארית.השלב השלישי הוא גידול ואיסוף של נבגי פטריות חיוביים ל-GFP. השלבים הסופיים הם חשיפת מקרופאגים ל-candida חיובית ל-GFP ותיבון תאים בנקודות זמן שנקבעו מראש. בסופו של דבר, באמצעות מניפולציה מינימלית של תאים ex vivo, מיקרוסקופיה קונפוקלית יכולה לחשוף את יכולתם של מקרופאגים אלבולריים לשלוט בצמיחה של הפגוציטוזה.נבגים ראשית, יש לדלל את הצבע הליפופילי P HK 26 ביחס של 1 ל-5 בתוך Diluent C; הצבע ייספג על ידי תאי ה-FOC החומציים. טענו 100 µl של P HK 26 מדולל למזרק של 0.5 cc והזריקו את הצבע באופן תוך-ורידי דרך הרטרו-אורביטלית, או דרך וריד הזנב.העריכו כי כל עכבר יספק בין שלושה ל-500,000 מקרופאגים מסומנים לאחר 10 ימים. בצעו דה-אוטנזיה לעכברים והכינו את פתיחת חלל החזה החל מהסרעפת. חתכו חור קטן בכלוב הצלעות מימין לבית החזה כדי לרוקן את הריאות ולצורך צפייה מאוחרת בניפוחן.בשלב הבא, אתרו ובודדו את הקנה (trachea) מהרקמות שסביבו. לאחר מכן, באמצעות פינצטה מעוקלת, הסִירו בזהירות את האדוונטיציה (adventitia) שכיסתה את

assessing-anti-fungal-activity-isolated-alveolar-macrophages-confocal

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

במסמך זה אנו מתארים פרוטוקולים קצירת מקרופאגים מכתשיים Murine, אשר תושבי תאים חיסוניים מולדים בריאה, ובדיקת ההפעלה שלהם כתגובה לתרבות בשיתוף עם חלקיקים polyanhydride.

הפעלת נייד קציר המקרופאגים מכתשיים Murine והערכת בהשפעת חלקיקים Polyanhydride

מקור: ברברו, א. מ., et.al. בדיקות פלואורסצנציה למחקר האינטראקציה בין מיקובקטריום טוברקולוזיס לבין קולטני החיסון SLAMF1. J. Vis. Exp. ( (2025)הסרטון הזה מדגים בדיקה מבוססת פלואורסצנציה לחקר האינטראקציה בין קולטן מקרופאגים לאנטיגנים של מיקובקטריום טוברקולוזיס . אנטיגנים מסומנים פלואורסצנטית על כיסוי נעים עם תמציות חלבון מקרופאג', מקושרים בהצטלבות, מסומנים בנוגדנים, ומוצגים באמצעות אותות פלואורסצנציה חופפים.

בדיקה מבוססת פלואורסצנציה לחקר אינטראקציות בין קולטני מאקרופאגים לאנטיגנים חיידקיים

סרטון זה מדגים הדמיה חיה של תאים לניתוח פעילות אנטי-פטרייתית בנויטרופילים אנושיים באמצעות קונידיה פלואורסצנטית של כתב אספרגילוס. בתחילה, הן פלואורסצנטיות אדומה והן מגנטה מזוהות בתוך נויטרופילים, בעוד פלואורסצנטיות אדומה פוחתת עם הזמן, מה שמצביע על השפלה של קונידיה ומאשר את הפעילות האנטי פטרייתית של נויטרופילים.

הערכה בזמן אמת של הפעילות האנטי-פטרייתית של תאי חיסון אנושיים ראשוניים

אנו מתארים שיטות למיקרוסקופיה וידאו חי...

מיקרוסקופיה וידאו חי מתא phagocytosis הפתוגן פטרייתיים

הנה, אנחנו מדגימים כיצד ניתן להשתמש בcytometry תמונה לכימות של פטריות פתוגניים בשיתוף עם תאי מארח בתרבות. טכניקה זו יכולה לשמש כאלטרנטיבה לספירת CFU.

שימוש cytometry תמונה לכימות של פטריות פתוגניים בשיתוף עם תאי מארח

כאן, אנו מתארים פרוטוקול להעריך פעילות אנטי-פטרייתית של תאי מערכת חיסון אנושיים עיקריים בזמן אמת באמצעות נבגי כתב ניאון אספרגילוס בשיתוף עם מיקרוסקופ וידאו חי התאים cytometry זרימה. נתונים המופקים לספק תובנה אינטראקציות אספרגילוס cell- מארח כגון פעילות קוטלת פטריות, phagocytosis, נדידת תאים ועיכוב של גידול פטרייתי.

הדמיה חיה של פעילות אנטי פטרייתי על ידי אדם מן המעלה הראשונה נויטרופילים ומונוציטים בתגובה<em&gt; A. fumigatus</em

תקשורת זו מתארת מתודולוגיות בידוד ותרבות של מקרופאגים מכתשי מבני ומודלים מאתר למטרות ניסוי.

בידוד והתרבות במבחנה של מקרופאגים מכתשי מאתר ואנושי

אנו מתארים שיטה לעיבוד מכתשיים נוזל ששטיפה בהתאמה דם היקפי מאנשים כרוניים הנגועים באיידס על טיפול תרופתי להערכת מאגרי HIV ריאתי. שיטות אלה תוצאה של רכישת תאים CD4 T טהור מאוד מכתשי מקרופאגים שעשויים להיגרם לאחר מכן עבור immunophenotyping קלדה ו-DNA האיידס/RNA כימות על ידי תגובת שרשרת באולטרסאונד.

עיבוד של ברונמכתשיים נוזלים ומתאימים דם עבור מכתשיים מקרופאג ו CD4+ T-Cell Immunophenotyping קלדה ומאגר HIV הערכה

פרוטוקול זה מספק שיטה מהירה ואמינה כדי לכמת את phagocyציטוזה של אספגינוס באמצעות הפגוציטים הגוף האנושי באמצעות הזרימה cy, try ולהפלות את הפגוציטוזה של המחט מתוך הדבקה ללוקוציטים בלבד.

מדידת פאיגוציטוזה של אספרגייוס מחטאים מחט על ידי האדם לוקיולוציטים באמצעות זרם ציטוטוטרי

אנו מתארים את השיטה לניתוח כמותי של ההתפלגות של אספרגילוס פומיגאטוס קונידיה (3 מיקרומטר בגודל) דרכי הנשימה של עכברים. השיטה יכולה לשמש גם לניתוח של חלקיקים מיקרו חלקיקים וחלוקת ננו-חלקיקים בדרכי הנשימה במודלים שונים של מצב פתולוגי.

קונפוקלית לייזר סריקה מיקרוסקופיה מבוסס ניתוח כמותי של אספרגילוס פומיגטוס קונידיה ריאות עכבר נקי לחלוטין

הטכניקה המערבת פאגוציטוזה של קונידיה פטרייתית על ידי מקרופאגים נמצאת בשימוש נרחב למחקרים המעריכים את אפנון התגובה החיסונית נגד פטריות. מטרת כתב היד היא להציג שיטה להערכת יכולות הפאגוציטוזה והפינוי של מקרופאגים חד-גרעיניים מדם היקפי אנושי המגורות באמצעות Trichoderma stromaticum conidia.

בדיקת כדאיות של Trichoderma stromaticum conidia בתוך מקרופאגים חד-גרעיניים בדם היקפי אנושי

למדו להעריך את יכולת המקרופאגים האלוולריים לשלוט בגדילת ספורות פטרייתיות באמצעות מיקרוסקופיית confocal. השיטה כוללת תיוג תאים, איסוף בלוואז' ואתגר פטרייתי לניתוח פגוציטוזה.

הערכת פעילות אנטי פטרייתי של מבודדים מכתשיים המקרופאגים ידי מיקרוסקופיה confocal

גלה סרטונים נוספים