בידוד מהיר וטיהור של מיטוכונדריה להשתלה על ידי דיסוציאציה רקמות ודיפרנציאל סינון

המטרה הכוללת של פרוצדורה זו היא בידוד מהיר של מיטוכונדריה טהורות בעלות יכולת נשימה מרקמת חולדה. דבר זה מושג תחילה על ידי איגוד והומוגניזציה של דגימות רקמה. השלבים הבאים כוללים ערבוב של subin A לתוך ההומוגנאט ודגירה על קרח.

לאחר מכן מסננים את ההומוגנאט תוך ערבוב עם BSA ומסננים אותו שוב. השלבים הסופיים הם סבוב (spin down) של התסנין והשעייה מחדש של משקעי המיטוכונדריה בתמיפת נשימה. לבסוף, ניתן להראות באמצעות ניתוח נשימה ובדיקת לומנסנס של ATP כי המיטוכונדריה המבודדות חיות ובעלות יכולת נשימה.

היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, המדווחות על זמני בידוד של מיטוכונדריה הנעים בין 60 למאה דקות, הוא שניתן לבודד מיטוכונדריה חיונית בעלת יכולת נשימה בפחות מ-30 דקות. אליסון מקיי, טכנאית ממעבדה שותפה, תדגים את בדיקת הלומנסנציה של ATP רגע לפני התחלת העבודה. המסו את ה-subin A ב-1 mL של בופר הומוגניזציה והמסו גם את ה-BSA ב-1 mL של בופר הומוגניזציה.

כעת התחילו באיסוף של שתי דגימות רקמה טריות באמצעות מחורר ביופסיה של ששה מילימטרים, ואחסנו אותן ב-XPBS אחד על קרח בתוך מבחנת צנטריפוגה של 50 ליטר. כאשר תהיו מוכנים, העבירו את הרקמה למבחנת דיסוציאציה C המכילה חמישה מיליליטרים של בופר הומוגניזציה קר מאוד. לאחר מכן, בצעו הומוגניזציה לרקמה על ידי התאמת המבחנה למכשיר הדיסוציאציה של הרקמה ובחירה במחזור מוגדר מראש לבידוד מיטוכונדריה.

בסיום הפעולה, החזירו את המבחנה לקרח והוסיפו 250 µL של תמיסת stock של sub to lyin. ערבבו על ידי הפיכה. כאשר התערובת נראית מפוזרת באופן אחיד, דגרו את ההומוגנאט על קרח למשך 10 דקות.

בשלב הבא, מקמו מסנן רשת של 40 מיקרון על מבחנת צנטריפוגה קונית של 50 מיליליטר והניחו אותה על קרח. הרטיבו את המסנן עם בופר הומוגניזציה והשליכו את הבופר למכל פסולת. לאחר שהכל מוכן, שפכו את ההומוגנאט דרך המסנן אל תוך התסנן.

הוסף 250 µL של תמיסת מלאי BSA וערבב באמצעות היפוך. עם זאת, יש לדלג על שלב זה עבור אנליזה של חלבונים מיטוכונדריאליים. כעת הכן שתיים נוספות.

הניחו מבחנות צנטריפוגה קוניות בנפח 50 milliliter על קרח, כאשר אחת מצוידת במסנן של 40 micron והשנייה במסנן של 10 micron. הרטיבו את שני המסננים בכמות קטנה של באפר הומוגניזציה והשליכו באפר זה. לאחר מכן, שפכו את ההומוגנאט תחילה דרך מסנן ה-40 micron, ולאחר מכן דרך מסנן ה-10 micron.

שלבי סינון אלו משפרים באופן משמעותי את טהרת המיטוכונדריה. כעת חלק את התסנין בין שני מבחנות מיקרו-צנטריפוגה של 1.5 milliliter שקוללו מראש, וסובב אותן בצנטריפוגה ב-9,000 Gs למשך 10 דקות בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס. לאחר מכן הסר את עליון הנוזל (supernatant), ושחזר לתמיסה ואחד את שני משקעי המיטוכונדריה המזוקקים.

במיליליטר אחד של בופר נשימה קר מאוד, חיוני כי כל הפרוצדורה תתבצע בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס. כעת ניתן לבחון את המיטוכונדריה המופרשות כדי לקבוע את הפעילות המטבולית שלהן. ניתן לבצע בדיקת לומניסנציית ATP באמצעות ערכה לבדיקת ATP.

ראשית, יש להביא את ריאגנטים של הערכה לטמפרטורת החדר. לאחר מכן, הכין את תמיסת המלאי של HT P והנח אותה על קרח. השלב הבא הוא הוספת 5 mL של בופר סובסטרט לתמיסת הסובסטרט הליופיליזית.

ערבב זאת בעדינות והנח במקום חשוך. לאחר מכן, הוסף 100 µL של תמיפת נשימה (respiration buffer) לכל באר בלוחית 96 באערים שחורה ואטומה. הוסף 10 µL של המיטוכונדריה שהוכנו לבאערים שמתחת לתקני ה-A TP.

יש להעביר כל דגימה מיטוכונדריאלית ייחודית ללוח בשלוש חזרות; יש להכין שלוש בארות עם תמיסת בופר לנשימה בלבד כביקורת שלילית. לאחר הטענה, יש להוסיף 50 µL של תמיסת ליזיס לתאי יונקים לכל בארה. יש להדגיר את הלוח בטמפרטורה של 37 °C למשך חמש דקות על מנער אורביטלי במהירות של 120 RPM.

במהלך האינקובציה, הכין דלולות של סטנדרט ה-A TP בטווח שבין 0.1 millimolar ל-0.1 micromolar. לאחר האינקובציה, הוסף 10 µL מכל אחד מסטנדרטי ה-A TP לבארים המתאימות המצוינות במפת הפלטה. לאחר מכן, הוסף לכל אחת 50 µL מתמיסת הסובסטרט ששוחזרה.

כעת דגרו את הפלטה שוב, כפי שנעשה קודם לכן, למשך חמש דקות. המשיכו בבדיקת הפלטות באמצעות קורא הפלטות. פתחו את התוכנה תחת

צרו פריט חדש. לחצו על experiment. לאחר מכן לחצו על default protocol ולחצו על okay.

בעמודה השמאלית, בחרו ב-protocol. לאחר מכן, תחת procedure, בחרו ב-delay והגדירו אותו ל-10 minutes. לאחר מכן, אשרו (okay) את ההקלדה.

כעת בחרו, קראו ובחרו בלומינסצנציה (luminescence) מתוך התפריט הנפתח. הגדירו את ההגדרות האחרות באופן הבא: סוג קריאה (Read type), נקודת סיום (endpoint), זמן אינטגרציה (integration time).

שנייה אחת. הגדרות המסנן קובעות מיקום אופטיקה של חור פליטה אחד, רגישות עליונה 100, והיסט ורטיקלי עליון של הפרוב של 1 mm. לאחר ביצוע שינויים אלו בהגדרות, לחץ על אישור.

לחצו על פריסת המשטח (plate layout) והגדירו אותה בהתאם. לחצו על אישור. כעת, כאשר הכל מוגדר, לחצו על סמל קריאת המשטח בשורה העליונה ולחצו על קריאה (read).

בעת פתיחת הספקטרופוטומטר, הניחו את הפלטה במגש כך שבאער A1 יהיה בפינה השמאלית העליונה. כעת תיפתח תיבה המציגה את הטמפרטורה; לחצו על אישור, ולאחר מכן המשיכו בניתוח הנתונים. דגימות של שריר שלד במשקל של כ-0.18 גרם (משקל רטוב) הניבו כ-24 מיליארד מיטוכונדריה על סמך ספירת גודל חלקיקים.

דגימות כבד בגודל זהה הניבו כמה מיליארדים נוספים. קריאות המיטוכונדריה במד-תאים (hemocytometer) היו נמוכות מהערך האמיתי בשימוש במונה החלקיקים. התקבל עקבה מייצגת, המראה כי מיטוכונדריה מבודדות ממוקמות תחת שיא אחד עם קוטר ממוצע של כ-0.4 micron.

ממצאים אלו תואמים לדיווחים קודמים שהשתמשו בבדיקת ה-bi acid. רמת החלבון המיטוכונדריל נמדדה בכמה מיליגרמים לגרם רקמה משריר שלד ומכבד. המוצר היה חיוני ובעל יכולת נשימה.

מיטוכונדריה שבודדו בלוח זמנים התואם להתערבות טיפולית קלינית וכירורגית. מיקרוגרפים של מיקרוסקופ אלקטרונים בשיטת תמסורת העידו כי כל המיטוכונדריה שבודדו היו דניות לאלקטרונים (electron dense), כאשר הנזק היה בפחות מאחת מתוך 10,000, והזיהום היה פחות מאחד מתוך מאה אלף. תוצאות בדיקת ATP גילו כי המיטוכונדריה היו חיוניות וכי תכולת ה-ATP הייתה סביב 11 עד 15 nanomoles למיליגרם של חלבון מיטוכונדריאלי.

ניתוח נשימה מיטוכונדריאלית בוצע באמצעות אלקטרודת מסוג Clark וגילה כי צריכת החמצן הייתה כ-180 MLEs של חמצן לדקה עבור כל מיליגרם של חלבון מיטוכונדריאלי, בעוד שערכי ה-RCI היו כל אחד כ-2.5, עם ציון מעט גבוה יותר בכבד. לאחר רכישת המיומנות, ניתן לבצע טכניקה זו בפחות מ-30 דקות אם היא מבוצעת כראוי.I.