טכני אלמנטים בסיסיים של ההקפאה-בר / הקפאה-לחרוט בביולוגי מיקרוסקופית אלקטרונים

מטרת הניסוי הבא היא להפיק רפליקה של דגימה מפחמן ופלטינה של חומרים ביולוגיים או חומרים אחרים לצורך בדיקה באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים חודר (transmission electron microscopy). כדי להשיג זאת, דגימות המוכנות כרפליקות כפולות או בודדות עוברות קצירה אולטרה-מהירה של טמפרטורה כדי להגביל את היווצרות גבישי הקרח. לאחר מכן, הדגימה הקפואה נשברת באמצעות מניפולציה מרחוק בטמפרטורות של חנקן נוזלי תחת ואקום גבוה, פעולה המפצלת את הממברנה דרך השכבה הליפידית הכפולה, ובכך יוצרת פני שטח חיצוניים (extracellular face) ופני שטח הקרובים להיבט הציטופלזמי.

כשלב נוסף רשותי, ניתן לחשוף מאפיינים תשתיים על ידי תססית של מים מפני השטח של הדגימה השבורה, וזאת באמצעות מיקום זרוע המיקרוטום לקירור מעל במת הדגימה ליצירת הפרש טמפרטורות, הגורם לסובלימציה של מים מפני השטח. לאחר מכן, נוצרת רפליקה על ידי אידוי של פחמן ופלטינה מעל המשטח השבור.

הדגימה המקורית מעובדת מהשכבה המועתקת (replica), המועברת אל רשת לדגימה עבור מיקרוסקופ אלקטרונים חודר (transmission electron microscopy). בסופו של דבר, נעשה שימוש בשיטת שבירה בהקפאה ותקיצה בהקפאה (freeze fracture freeze etch) כדי להציג פרטים מבניים תלת-ממדיים של ממברנות תא, מערכים מולקולריים וננו-חומרים בבדיקה באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים חודר. היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון בדיקת חתכים דקים מאוד (ultra thin sections), הוא שניתן לצפות באובייקטים הרלוונטיים בתלת-ממד ברזולוציה של מיקרוסקופ אלקטרונים.

שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בתחומי הביולוגיה התאית והמולקולרית והננוטכנולוגיה, כגון המאפיינים הממדיים והמבניים של קרומי תאים והארגון של מערכים מולקולריים ומערכי ננו-חומרים. הרעיון לשיטה זו עלה לראשונה כאשר זיהיתי שבוצעו מחקרים דומים על פרוטיסטים איקריוטים שהובילו לתגליות חשובות, אך הוקדש תשומת לב מוגבלת לנושאים רלוונטיים לבריאות האדם. התחילו את הפרוצדורה בהכנת דגימות ביולוגיות עבור שבירת הקפאה ושבירת קצוות (freeze fracture freeze edge), כפי שמתואר בפרוטוקול הכתוב.

בחרו בבסיסי דגימה (stubs) מזהב או נחושת בגודל ובצורה המתאימים לדגימה המעובדת, באמצעות פינצטה עדינה ו/או מחטי מזריק בעלות קוטר קטן. מקמו שברים קטנים של הדגימה על חלקו העליון של בסיס הדגימה המתכתי. עבור רפליקות בודדות, הפחיתו את תכולת הנוזל של הדגימה עד להגעה לעקביות דביקה, דמוית דבק, על ידי ספיגת נוזלים מקצה הבסיס באמצעות נייר סינון.

השתמשו במחטי מזרק בעלות קוטר קטן כדי ליצור תלולית של רקמה על הבסיס עבור רפליקות כפולות. הפכו בסיס נוסף, מקמו אותו בדיוק מעל הבסיס והניחו אותו בעדינות על פני השטח של הדגימה. כך נוצר מבנה של "סנדוויץ'".

אין ללחוץ את הדגימה החוצה מבין שני הבסיסים. לאחר מכן, מלאו שני מכלי בידוד כפולים בחנקן נוזלי. הכלי הראשון מכיל מוט מתכת עם באר קטנה, המשמשת להנפקה של נפח קטן של גז פרופאן מבלון מסחרי זמין.

הכלי השני הוא כלי אחסון עם מחיצה המיועד לשמירה קצרת מועד של דגימות קפואות תחת חנקן נוזלי. השתמשו בפרופאן אך ורק במכנסת כימית המאושרת לשימוש זה. הקפידו להימנע ממקורות הצתה חיצוניים, להשתמש בביגוד מגן לטמפרטורות נמוכות ולהבטיח אוורור נאות, שכן פרופאן הוא חומר נפיץ.

עלול לגרום לפגיעת קיפאון במגע והוא חומר מחנק. בעזרת פיית הגליל הממוקמת בתוך הפרופאן, פתח את שסתום הגליל ואפשר לגז לזרום אל תוך בור הכלי הראשון, שם הוא יהפוך לנוזל במהירות המרבית. הרם את תושבת הדגימה בעזרת פינצטה עדינה וטבול אותה בתוך הגז הנוזלי בכלי הראשון למשך מספר שניות.

לאחר מכן, העבירו במהירות לכלי האיסוף השני המכיל חנקן נוזלי. ברגע שהדגימות קפאו, אחסנו אותן תחת חנקן נוזלי עד להעברתן למתקן השבירה בהקפאה (freeze fracture plant). טענו את תומכי הדגימות מזהב לתוך מחזיק דגימות מסוג חוברת עם שכפול כפול או למכשיר תפס תחת חנקן נוזלי, והשאירו אותם שם עד למיקומם בתא הדגימות.

כאשר התא הגיע לוואקום גבוה והבמה קוררה לטמפרטורת חנקן נוזלי, כבה את המשאבה, פתח את התא ומקם את בסיסי הדגימות המורכבים על שולחן הדגימות במהירות האפשרית. לאחר מכן, הפעל שוב את המשאבה כדי להשיב את הוואקום הגבוה והשתמש בבקרת הטמפרטורה האלקטרונית של הבמה והזרוע כדי לכוונן את טמפרטורת שולחן הדגימות ל-100- °C. כמו כן, הזרם חנקן נוזלי לזרוע המיקרוטום כדי להביאה לטמפרטורת חנקן נוזלי.

לאחר השגת ואקום גבוה, טמפרטורת במה של 100- מעלות צלזיוס וזרוע מיקרוטום בטמפרטורת חנקן נוזלי, פתח מרחוק את מחזיק הדגימות הכפול, ובכך שבור את הדגימות על תושבות הדגימה. כשלב נוסף אופציונלי, ניתן לבצע תגית (etching) לדגימות כדי לחשוף מאפיינים תת-קרקעיים לאחר השבירה. כדי לבצע תגית, השתמש בלהב תער המוחזק בסבך על זרוע המיקרוטום כדי לגלח את פני השטח של הדגימות. מקם את זרוע המיקרוטום הקרה מעל המשטחים השבורים למשך דקה אחת עד מספר דקות כדי לבצע סובלימציה של המים, ובכך לחשוף משטחי תאים אמיתיים, מטריצה חוץ-תאית ו/או מכלולים מולקולריים.

בשלב הבא, הפעילו את תותח האלקטרונים או תותח ההתנגדות של הפלטינה-פחמן ואפשרו לו לאיד לכיסוי של שכבת פלטינה-פחמן דקה מעל המשטח השבור מזווית של 30 מעלות עד 45 מעלות. פעולה זו דורשת בדרך כלל כ-15 עד 20 שניות; הפעילו את תותח האלקטרונים או תותח ההתנגדות של הפחמן באותו אופן, ואיידו שכבת פחמן דקה על פני השטח של הדגימה השבורה ישירות מלמעלה בזווית של 90 מעלות כדי לספק תמיכה לשכבה המועתקת (replica). גם פעולה זו דורשת בדרך כלל כ-15 עד 20 שניות עם השלמת ההעתקה, ההצללה (shadowing) וייצוב הפחמן.

כבה את משאבת הוואקום ואת התא והוצא את תושבת הדגימה מהמכשיר. באמצעות פינצטה עדינה, הוצא כל בסיס דגימה מוזהב ממלקחי חוברת השכבה הכפולה (double replica booklet clamp) ואפשר להם להימס למשך מספר שניות לפני הורדה עדינה של הבסיס על פני שטח מים בלוחית דגימה (spot plate). תמרן את השכבות באמצעות לולאת חוט דקה או רשת נחושת רגילה של מיקרוסקופ אלקטרונים המוחזקת בפינצטה עדינה, והעבר אותן ללוחית דגימה אחרת המכילה 5% sodium dichromate ב-50% sulfuric acid למשך שעה עד מספר שעות. אמבט זה מעכל את חומר הדגימה הביולוגי בפועל מהשכבה.

עם השלמת העיכול, העבירו את הרפליקה בחזרה למשטח מים נקי ואספו אותה על רשת נחושת סטנדרטית למיקרוסקופיה אלקטרונית. אחסנו את רשמי התמיכה של הרפליקה בקופסאות רשת זמינות מסחרית, שבהן הן יישמרו יציבות למשך שנים. עם טיפול עדין או בבדיקה אולטרה-מבנית של שבר קיפאון או רפליקות תחקיר, צפו ברפליקות במיקרוסקופ אלקטרונים חודר (TEM) במתח האצה, בדרך כלל בין 50 ל-80 kilovolts.

הקליטו את התמונות הרלוונטיות על סרט TEM סטנדרטי או באמצעות מצלמה דיגיטלית ברזולוציה גבוהה השוכנת בממברנה התאית בבסיסו של כל איבר תאי אוקריוטי. הריסון והשוט הם מערך של חלקיקים הקשורים לממברנה המאורגנים לגדילים ENC המקיפים את מוט הריסון ומוכרים כשרשרת הריסונים. מערכי חלקיקי ממברנה ייעודיים מופיעים בגבול הלומנלי של תאים אפיתליאליים העוברים Clio Genesis.

מערכי חלקיקים אלו מייצגים מחנקים שוטים (ciliary necklaces) ראשוניים, השוכנים בבסיסן של שוטים בשלבי התפתחות או שוטים בוגרים. מחקרים שונים של שבירת קיפאון (freeze fracture) ברקמות אפיתליאליות חושפים ארגון מורכב של מבני חריצים וחוטים העוברים אנסטומוזיס (anastomosing) ומקיפים את ההיבט האפיקלי של הגבולות הבזולטרליים. שבירה דרך ממברנות של תאי אפיתל חושפת פני שבירה של פלזמה של צמתים הדוקים (tight junctions) המופיעים כחוטים, בעוד שפני השבירה החוץ-תאיים מראים חריצים משלימים.

צממתי פערים (Gap junctions) מופיעים בדגימות שבירה בהקפאה של מגוון רקמות, והם מיוצגים על ידי מערכים דחוסים של חלקיקים על פני השבירה של הפלסמה ובגומחות משלימות בשבירה החוץ-תאית. הפנים המוצגים כאן משמשים כדוגמה להקפאה מהירה עם תגריעה עמוקה (deep etching) והצללה סיבובית (rotary shadowing). התא האפיתלי נשבר דרך הציטופלסמה, וניתן לראות פני שבירה של הפלסמה מאחורי ראשי החצים.

פני תא אמיתיים שנחשפו באמצעות תגירה עוקבת. לאחר השליטה בטכניקה, ניתן לבצע אותה במחזור הנמשך כשלוש שעות ומניב דגימה אחת עד שלוש, במידה והיא מבוצעת כראוי. בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור כי השלבים הבודדים תלויים זה בזה באופן הדוק, וכי טעות בשלב אחד עלולה להוביל לתוצאה שאינה מתאימה לבדיקה ולהערכה לאחר פיתוחה.

טכניקה זו סללה את הדרך עבור חוקרים בתחום הביולוגיה התאית והמולקולרית לבחון כיצד מוטציות גנטיות גורמות לאנומליות מבניות בתאים, בדרכים שמעוררות מצבים פתולוגיים ומחלות.