Name: טכני אלמנטים בסיסיים של ההקפאה-בר / הקפאה-לחרוט בביולוגי מיקרוסקופית אלקטרונים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-09-11T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 17 s
Description: למד את טכניקת ההקפאה-בר לעיבוד דגימות ביולוגיות למיקרוסקופיה אלקטרונית. השיטה מייצרת רפליקות פחמן-פלטינה לחשיפת מבני ממברנות תלת-ממדיים בדיוק גבוה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

מצגת זו נתמכה על ידי פרס חדשן קליני ל-JLC מהמכון למחקר רפואי של דיילות ועל ידי הסוכנות להגנת הסביבה של ארצות הברית. למרות שהמחקר המתואר במאמר זה מומן במלואו או בחלקו על ידי הסוכנות להגנת הסביבה של ארצות הברית באמצעות הסכם שיתוף פעולה CR83346301 עם המרכז לרפואה סביבתית, אסתמה וביולוגיה של הריאות באוניברסיטת צפון קרוליינה בצ'אפל היל, הוא לא עבר את סקירת העמיתים והמדיניות הנדרשת של הסוכנות. ולכן אינו משקף בהכרח את עמדות הסוכנות ואין להסיק על תמיכה רשמית. אזכור שמות מסחריים או מוצרים מסחריים אינו מהווה אישור או המלצה לשימוש.

.1 הכנת ביולוגית דוגמאות להקפאה-בר / הקפאה-לחרוט <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בניסוח מקבע EM קונבנציונלי כגון 2% paraformaldehyde glutaraldehyde + 2% במאגר M 0.1 פוספט עבור שעה 1. לבצע קיבוע ראשוני של רקמות ביולוגיות. הערה: למרות שזה עשוי להיות רצוי להקפיא כמה סוגים של דגימות ללא קיבוע לפני, אמצעי זהירות הפתוגן דם נישא אוניברסלי מחייב קיבעון המתאים שבו הדגימה מורכבת מרקמה אנושית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעקבות קיבעון עיקרי, לשטוף את הדגימה באותו החיץ בתוספת 0.2 M סוכרוז לא יותר מ 1 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את הדגימה לפתרון cryoprotectant המורכב מגליצרול 25% ב0.1 חיץ פוספט M לא יותר משעה 1. </li></ol> .2 הקפאה ואחסון של דגימות מראש של הקפאה-שבר <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספחי דגימת זהב או נחושת בחרו בגודל מתאים ובצורה לדגימה בעיבוד (איור 4 </strong&gt;). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת מלקחיים כיתה קנס ו / או שברים קטנים עמדת מד קטנה מחטי מזרק של הדגימה בחלק העליון של בדל דגימת מתכת. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להפחית את תכולת הנוזל של הדגימה לדביקה, מעט דבק כמו עקביות על ידי ציור את הנוזל מקצה הבדל עם נייר סינון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעתקים יחידים, משתמש במחטי מזרק מד קטנות כדי ליצור תלולית של רקמה על הבדל. להעתקים כפולים, להפוך בדל ותפקיד אחר זה בדיוק מעל הבדל ולמקם בקלילות על פני השטח דגימת יצירת כריך (איור 5 א). אל תלחץ על הדגימה מבין שני הספחים. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלא שני כלי דיואר מבודדים עם חנקן נוזלי. הערה: הכלי הראשון להכיל הודעה מתכת המכילה גם קטן המשמש להנזלת נפח קטן של גז פרופן מצילינדר זמין מסחרי (איור 5). הכלי השני הוא אחסון למחיצות / מחזיק כלי לקצרly שמירת דגימות קפואות תחת חנקן נוזלי. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השימוש בנחיר הגליל ממוקם בבאר פרופאן, לפתוח את שסתום הגליל ולאפשר גז לזרום לתוך הבאר של הכלי הראשון שבו הוא נוזל. הערה: זהירות !! PROPANE נפיץ, עלול לגרום להקפאת פציעה במגע, והוא ASPHYXIANT. השתמש פרופאן רק במנדף כימי מאושר לשימוש כזה מטפל גם להימנע ממקורות הצתה זרים, תוך שימוש בבגדי מגן מי טמפרטורות נמוכות, ושמירה על אוורור נאות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מהר ככל האפשר, לאסוף את דגימת הר עם מלקחיים כיתה משובחים ולנעוץ אותה בגז הנוזלי בכלי הראשון לכמה שניות ולאחר מכן להעביר במהירות לכלי מחזיק השני של חנקן נוזלי (איור 5). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברגע שהדגימות קפואות, חנות תחת חנקן נוזלי עד מוכן להעביר למפעל הקפאה שבר. העבר את הספחים למכל דיואר חנקן נוזלי אחסון גדול יותר עבור מורחבאחסון אם תרצה בכך, עם זאת יש להיזהר שלא לאפשר לספחים להפשיר. </li></ol></li></ol> .3 מבצע של ההקפאה-שבר כלי ודגימת עיבוד <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טעינת דגימות על בעל פליז ולתוך התא <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טען את ספחי דגימת זהב לבעל דגימת העתק כפול חוברת סוג או לצבוט מכשיר תחת חנקן נוזלי ולשמור על קיים עד מוכן למצב בתא הדגימה (איור 6). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר התא השיג ואקום גבוה (כ -2 x 10 -6 mbar) והשלב כבר מקורר לטמפרטורה של חנקן נוזלי, לכבות את המשאבה, לפרוק הקאמרית, ומקם את ספחי דגימה רכובים על גבי שולחן הדגימה במהירות אפשרי . </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את המשאבה, להקים מחדש ואקום גבוה, ועושים שימוש בפקדי שלב וטמפרטורת זרוע אלקטרוניים כדי להתאים את טמפרטורת שולחן דגימה ל-100 ° C וחנקן נוזלי ישיר לזרוע microtome וbring אותו לטמפרטורה של חנקן נוזלי. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תהליך שבר <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> על השגת ואקום גבוה, טמפרטורת שלב של -100 ºC וזרוע microtome בטמפרטורה של חנקן נוזלי, מרחוק לפתוח את בעל דגימת העתק הכפול ובכך שבירה הדגימות על mounts הדגימה (בהקפאה fracture_movie1.mov). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במקרה של דגימות מיועדות לבר הבא תחריט, להשתמש בסכין גילוח נשמר במהדק על זרוע microtome לגלח (כלומר, שבר) את פני השטח של הדגימות במקום צעד 3.2.1 (בהקפאת etch_movie2.mov). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם צעד תחריט הקפאה נוסף הוא שיש לבצע, מקם את זרוע microtome המקורר מעל המשטחים הסדוקים לאחד למספר דקות. מים תמרון זה נשגב (כלומר, לחרוט) מהמשטח שבורה: הערה. ההשפעה של המהלך הזה היא לחשוף משטחים אמיתיים תא, מטריצת חוץ תאית, ו / או מכלולים מולקולריים על ידי סובלימציה של מים, בנוסף לfracture פרצופים עובר דרך bilayer השומנים של קרומים. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הצללת מתכת ואידוי תמיכת העתק באמצעות רובי אלקטרונים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את אקדח פלטינה / אלקטרון פחמן או התנגדות ולאפשר לו להתאדות שכבה דקה (כ 2 ננומטר) של פלטינה / פחמן על פני השטח שברים מזווית של 30º - 45º. זה בדרך כלל דורש כ 15 - 20 שניות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את אלקטרון פחמן או אקדח התנגדות כמו בשלב 3.3.1 ולהתאדות שכבה דקה של פחמן אל פני השטח דגימה שבורים מישירות (90 מעלות) מעל לראש לתת תמיכה להעתק. זה בדרך כלל דורש כ 15 - 20 שניות. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שליפה של העתקים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עם השלמת הצללת שכפול וייצוב פחמן, לכבות את משאבת הוואקום, לפרוק הקאמרית, ולהסיר את דגימת הר מהמכשיר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת זוג המלקחיים כיתה קנס להסיר כל בדל דגימת זהב מכפולחוברת העתק / מהדק ולאפשר להפשיר במשך כמה שניות לפני שמעדנים את הבדל על גבי משטח מים בצלחת מקום (איור 7). הערה: העתק פחמן / פלטינה המכיל חומר דגימה חסיד יצוף על פני המים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לתמרן את העתקים או באמצעות לולאת חוט דקה או רשת מיקרוסקופ אלקטרונים קונבנציונלית נחושת המוחזקת על ידי מלקחיים כיתה קנס והעברה לצלחת מקום אחר המכילה 5% dichromate נתרן ב50% חומצה גופרתית לאחד למספר שעות. הערה: אמבטיה זה מעכלת את חומר הדגימה ביולוגי בפועל מההעתק. אקונומיקה ביתית כוח מלא יכולה להחליף dichromate / פתרון החומצה גופרתי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר העיכול יושלם, להעביר ההעתק בחזרה למשטח של מים נקי ולאחזור אל רשת במיקרוסקופ אלקטרונים נחושת סטנדרטית. (הערה: העתקים עשויות לפצל לחתיכות קטנות יותר במהלך עיכול אבל גם העתקים קטנים מאוד עשויים להכיל מידע משמעותי וצריכים להיות retrieved ובדק.) העתק חנות תמיכה רשתות בקופסות רשת זמינות המסחרית שבו הם יישארו יציבים במשך שנים עם טיפול עדין. </li></ol></li></ol> .4 Ultrastructural בחינת להקפיא בר / העתקים לחרוט <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צפו בהעתקים במיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים במתח מאיץ בדרך כלל 50-80 ק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להקליט תמונות רלוונטיות על סרט TEM סטנדרטי או עם מצלמה דיגיטלית ברזולוציה גבוהה. </li></ol>

<ol><li>Steere, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electron+microscopy+of+structural+detail+in+frozen+biological+specimens%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biophysic+and+BiochemCytol%22%5BJournal%5D)">Electron microscopy of structural detail in frozen biological specimens.</a> J Biophysic and BiochemCytol. 3, 45-60 (1957).</li>
<li>Pinto da Silva, P., Branton, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+splitting+in+freeze-etching.+Covalently+bound+ferritin+as+a+membrane+marker%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Membrane splitting in freeze-etching. Covalently bound ferritin as a membrane marker.</a> J Cell Biol. 45, 598-605 (1970).</li>
<li>Friend, D. S., Gilula, N. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Variations+in+tight+and+gap+junctions+in+mammalian+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Variations in tight and gap junctions in mammalian tissues.</a> J Cell Biol. 53, 758-776 (1972).</li>
<li>Branton, D. Fracture faces of frozen membranes. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBranton%2C+D+%22ProcNatlAcadSci+USA%22">ProcNatlAcadSci USA</a>. 55, 1048-1056 (1966).</li>
<li>Heuser, J. E., Reese, T. S., Dennis, M. J., Jan, Y., Jan, L., Evans, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+vesicleexocytosiscaptured+by+quick+freezing+and+correlated+with+quantal+transmitter+release%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Synaptic vesicleexocytosiscaptured by quick freezing and correlated with quantal transmitter release.</a> J Cell Biol. 81, 275-300 (1979).</li>
<li>Goodenough, U. W., Heuser, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Substructure+of+inner+dynein+arms%2C+radial+spokes%2C+and+the+central+pair%2Fprojection+complex+of+cilia+and+flagella%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Substructure of inner dynein arms, radial spokes, and the central pair/projection complex of cilia and flagella.</a> J Cell Biol. 100, 2008-2018 (1985).</li>
<li>Goodenough, U. W., Heuser, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Substructure+of+the+outer+dynein+arm%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Substructure of the outer dynein arm.</a> J Cell Biol. 95, 798-815 (1982).</li>
<li>Hirokawa, N., Heuser, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quick-freeze%2C+deep-etch+visualization+of+the+cytoskeleton+beneath+surface+differentiations+of+intestinal+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Quick-freeze, deep-etch visualization of the cytoskeleton beneath surface differentiations of intestinal epithelial cells.</a> J Cell Biol. 91, 399-409 (1981).</li>
<li>Hirokawa, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quick+freeze%2C+deep+etch+of+the+cytoskeleton%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Quick freeze, deep etch of the cytoskeleton.</a> Methods Enzymol. 134, 598-612 (1986).</li>
<li>Chandler, D. E., Sharp, W. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Freeze+fracture+and+freeze+etching.+Electron+Microscopy%3A+Methods+and+Protocols%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Freeze fracture and freeze etching. Electron Microscopy: Methods and Protocols.</a> Methods in Molecular Biology. Kuo, J. ohn 1117, 95-132 (2014).</li>
<li>Severs, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Freeze-fracture+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Freeze-fracture electron microscopy.</a> Nature Protocols. 2, 547-576 (2007).</li>
<li>Gilula, N. B., Satir, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ciliary+necklace.+A+ciliary+membrane+specialization%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The ciliary necklace. A ciliary membrane specialization.</a> J Cell Biol. 53, 494-509 (1972).</li>
<li>Rohatgi, R., Snell, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ciliary+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22CurrOpin+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The ciliary membrane.</a> CurrOpin Cell Biol. 22, 541-546 (2010).</li>
<li>Fisch, C. F., Dupuis-Williams, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrastructure+of+cilia+and+flagella-back+to+the+future%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Ultrastructure of cilia and flagella-back to the future.</a> Biol Cell. 103, 249-270 (2011).</li>
<li>Carson, J. L., Collier, A. M., Knowles, M. R., Boucher, R. C., Rose, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphometric+aspects+of+ciliary+distribution+and+ciliogenesis+in+human+nasal+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Nat+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Morphometric aspects of ciliary distribution and ciliogenesis in human nasal epithelium.</a> Proc Nat Acad Sci. 78, 6996-6999 (1981).</li>
<li>Carson, J. L., Collier, A. M., Smith, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+observations+on+the+ultrastructure+of+mammalian+conducting+airway+epithelium%3A+Application+of+liquid+propane+freezing+and+rotary+shadowing+techniques+to+freeze-fracture%5BTitle%5D)+AND+%22J+Ultrastr+Res%22%5BJournal%5D)">New observations on the ultrastructure of mammalian conducting airway epithelium: Application of liquid propane freezing and rotary shadowing techniques to freeze-fracture.</a> J Ultrastr Res. 89, 23-33 (1984).</li>
<li>Carson, J. L., Collier, A. M., Gambling, T. M., Leigh, M. W., Hu, S. S., Boat, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+organization%2C+and+function+of+tight+junctional+complexes+in+the+tracheal+epithelium+of+infant+ferrets%5BTitle%5D)+AND+%22Am+Rev+Respir+Dis%22%5BJournal%5D)">Development organization, and function of tight junctional complexes in the tracheal epithelium of infant ferrets.</a> Am Rev Respir Dis. 138, 666-674 (1988).</li>
<li>Coyne, C. B., Gambling, T. M., Boucher, R. C., Carson, J. L., Johnson, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+claudin+interactions+in+airway+tight+junctional+permeability%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Role of claudin interactions in airway tight junctional permeability.</a> Am J Physiol. 285, 1166-1178 (2003).</li>
<li>Carson, J. L., Collier, A. M., Hu, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrastructural+studies+of+hamster+tracheal+epithelium+in+vivo+and+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22J+Ultrastr+Res%22%5BJournal%5D)">Ultrastructural studies of hamster tracheal epithelium in vivo and in vitro.</a> J Ultrastr Res. 70, 70-81 (1979).</li>
<li>Carson, J. L., Collier, A. M., Knowles, M. R., Boucher, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrastructural+characterization+of+epithelial+cell+membranes+in+normal+human+conducting+airway+epithelium%3A+A+freeze-fracture+study%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Anat%22%5BJournal%5D)">Ultrastructural characterization of epithelial cell membranes in normal human conducting airway epithelium: A freeze-fracture study.</a> Am J Anat. 173, 257-268 (1985).</li>
<li>Charles, A. C., Naus, C. C. G., Zhu, D., Kidder, G. M., Dirksen, E. R., Sanderson, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intercellular+calcium+signaling+via+gap+junctions+in+glioma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Intercellular calcium signaling via gap junctions in glioma cells.</a> J Cell Biol. 118, 195-201 (1992).</li>
<li>Sanderson, M. J., Charles, A. C., Dirksen, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+stimulation+and+intercellular+communication+increases+intercellular+CA2%2B+in+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Regul%22%5BJournal%5D)">Mechanical stimulation and intercellular communication increases intercellular CA2+ in epithelial cells.</a> Cell Regul. 1, 585-596 (1990).</li>
<li>Welsch, F., Stedman, D., Carson, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+a+teratogen+on+%5B3H%5Duridine+nucleotide+transfer+between+human+embryonal+cells+and+on+gap+junctions%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Effects of a teratogen on [3H]uridine nucleotide transfer between human embryonal cells and on gap junctions.</a> Exp Cell Res. 159, 91-102 (1985).</li>
<li>Carson, J. L., Willumsen, N. J., Gambling, T. M., Hu, S. S., Collier, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+intercellular+communication+and+differentiation+in+a+rapidly+developing+mammalian+airway+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Respir+Cell+%26+Molec+Biol%22%5BJournal%5D)">Dynamics of intercellular communication and differentiation in a rapidly developing mammalian airway epithelium.</a> Am J Respir Cell & Molec Biol. 1, 385-390 (1989).</li>
<li>Carson, J. L., Collier, A. M., Clyde, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ciliary+membrane+alterations+occurring+in+experimental+Mycoplasma+pneumoniae+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Ciliary membrane alterations occurring in experimental Mycoplasma pneumoniae infection.</a> Science. 206, 349-351 (1979).</li>
<li>Carson, J. L., Collier, A. M., Hu, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrastructural+observations+on+cellular+and+subcellular+aspects+of+experimental+Mycoplasma+pneumoniae+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+%26+Immun%22%5BJournal%5D)">Ultrastructural observations on cellular and subcellular aspects of experimental Mycoplasma pneumoniae disease.</a> Infect & Immun. 29, 1117-1124 (1980).</li>
<li>Henshaw, N. G., Carson, J. L., Collier, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrastructural+observations+of+Pneumocystis+carinii+attachment+to+rat+lung%5BTitle%5D)+AND+%22J+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Ultrastructural observations of Pneumocystis carinii attachment to rat lung.</a> J Infect Dis. 151, 181-186 (1985).</li>
<li>Carson, J. L., Collier, A. M., Hu, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+appearance+of+compound+cilia+in+the+nasal+mucosa+of+normal+human+subjects+in+response+to+acute%2C+low+level+sulfur+dioxide+exposure%5BTitle%5D)+AND+%22Environ+Res%22%5BJournal%5D)">The appearance of compound cilia in the nasal mucosa of normal human subjects in response to acute, low level sulfur dioxide exposure.</a> Environ Res. 42, 155-165 (1987).</li>
<li>Carson, J. L., Collier, A. M., Gambling, T. M., Knowles, M. R., Boucher, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrastructure+of+airway+epithelial+cell+membranes+among+patients+with+cystic+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Pathol%22%5BJournal%5D)">Ultrastructure of airway epithelial cell membranes among patients with cystic fibrosis.</a> Hum Pathol. 21, 640-647 (1990).</li>
<li>Carson, J. L., Brighton, L. E., Collier, A. M., Bromberg, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlative+ultrastructural+investigations+of+airway+epithelium+following+experimental+exposure+to+defined+air+pollutants+and+lifestyle+exposure+to+tobacco+smoke%5BTitle%5D)+AND+%22InhalToxicol%22%5BJournal%5D)">Correlative ultrastructural investigations of airway epithelium following experimental exposure to defined air pollutants and lifestyle exposure to tobacco smoke.</a> InhalToxicol. 25, 134-140 (2013).</li>
<li>Boonstra, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunocytochemical+demonstrations+of+cytoplasmic+and+cell-surface+EGF+receptors+in+A431+cells+using+cryo-ultramicrotomy%2C+surface+replication%2C+freeze-etching+and+label+fracture%5BTitle%5D)+AND+%22J+Microscopy%22%5BJournal%5D)">Immunocytochemical demonstrations of cytoplasmic and cell-surface EGF receptors in A431 cells using cryo-ultramicrotomy, surface replication, freeze-etching and label fracture.</a> J Microscopy. 140, 119-129 (1985).</li>
<li>Fujimoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Freeze-fracture+replica+electron+microscopy+combined+with+SDS+digestion+for+cytochemical+labeling+of+integral+membrane+proteins.+Application+to+the+immunogold+labeling+of+intercellular+junctional+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Freeze-fracture replica electron microscopy combined with SDS digestion for cytochemical labeling of integral membrane proteins. Application to the immunogold labeling of intercellular junctional complexes.</a> J. Cell Sci. 108, 3443-3449 (1995).</li>
<li>Quinn, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+tocopherol+on+the+structure+and+permeability+of+phosphatidylcholine+liposomes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Control+Release%22%5BJournal%5D)">The effect of tocopherol on the structure and permeability of phosphatidylcholine liposomes.</a> J Control Release. 160, 158-163 (2012).</li>
</ol>

למחבר אין מה לחשוף.

בשנים שלאחר השקתו וזמינות מסחרית, הקפאה שבר / נהלים לחרוט נוצלו באופן נרחב לחקירות של מבנה קרום ביולוגי. ואכן, נקודות המבט הטובות ביותר של חלק מההתמחויות המבניות של קרומים התקבלו בהכנות להקפיא בר / לחרוט. מחקרים אלה לא רק תרמו להבנה של המבנה הארגוני של ממברנות אלא גם סיפקו תובנות כיצד מבנה והתפקוד קשורים. כניסתו של מיקרוסקופ אלקטרונים ביולוגי שיגרתי הביאה למודעות לכך שטיפולים כימיים עם fixatives אלדהיד, כימיקלים ...

הרעיון והיישום מעשי של עיבוד הקפאה שבר של דגימות ביולוגיות הוצג על ידי 1 סטיר יותר ממחצית לפני מאה שנה. המנגנון המוקדם ניכס רכיבים שונים ליחידה עצמאית עובדת 1. המנגנון המקורי שונה ומעודן לתוך מכשירים זמינים באופן מסחרי במטרה לענות על הצורך הקריטי במניפולציה מרחוק, תחזוקה של ואקום גבוה, והאידוי של פחמן ומתכות כדי לייצר העתק מתאים לבדיקה על ידי מיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים (איור 1 ואיור 2). המכשיר הטיפוסי מורכב של תא ואקום גבוה עם שולחן דגימה וזרוע microtome יש תפוקת חנקן נוזלית regulable (איור 1). התא כולל גם שני רובי אלקטרונים, אחד לייצוב אידוי פחמן ממוקם בזווית 90 מעלות לשלב דגימה והאחרת לPlatinum / פחמן הצללה בזווית מתכווננת, בדרך כלל 15º - 45º (איור 2). כוח ליחידה מוחל לתפעול משאבת הוואקום ולוחות אלקטרוניים לווסת שליטת התאמת הטמפרטורה ואלקטרון אקדח. הגה במקור כאמצעי להשגת הדמיה משופרת של וירוסים, להקפיא-שבר זכה לפופולריות עוד יותר כטכניקה לבחינה והניתוח של קרום תא וההתמחויות שלהם 2, 3. ואכן, הליך זה היה בלתי נפרד מהבהרת יחסי מבנה / תפקוד בתאים וברקמות ורבים מהמחקרים האלה עומדים כמו תרומות קלאסיות לביולוגיה מולקולרית של תא 4-9. המטרה העיקרית והרציונל לפיתוח של טכניקת הקפאה-השבר היה להגביל חפצים נצפים ברזולוציה מיקרוסקופית אלקטרונים הנובעות מקיבעון כימי והעיבוד השתמש במיקרוסקופ אלקטרונים ביולוגי קונבנציונלי. כאן המטרה היא להגביל כימיקיבעון ולהקפיא את הדגימה במהירות מספקת, ולעתים קרובות בנוכחות cryoprotectant כדי להגביל את היווצרות גבישי קרח וחפצי הקפאה אחרות. לאחרונה, בטכניקה זו מצאה התעוררות מחודשת של עניין מביולוגים מולקולריים וחוקרי מדע חומרים לבדיקה של חלקיקים וננו. תמונות בהקפאה שבר ולהקפיא לחרוט מפגינות אופי תלת ממדים ולעתים טועים לmicrographs אלקטרונים הסורקים. עם זאת, הכנות להקפיא בר נבחנות על ידי מיקרוסקופי אלקטרונים הולכה והתרומה הגדולה שלהם ללימודים מורפולוגיים ברזולוציה גבוהה היא הייצוג הייחודי שלהם של אלמנטי מבנה / תפקוד של קרום תא. עיבוד בהקפאה שבר הוא ביוזמת הקפאת תאים ורקמות במהירות מספיקה כדי להגביל את התגבשות קרח ו / או בשימוש בסוכנים cryoprotectant כגון גליצרול. לאחר מכן הדגימות שבר תחת ואקום ונציגLica מופק על ידי אידוי של פחמן ופלטינה על פני השטח שהברים. הדגימה המקורית מתעכלת מההעתק שמאוחזר על רשת דגימת EM סטנדרטית. עוד פירוש מוטעה נפוץ של תמונות להקפיא בר הוא שהם מתארים משטחי תא. עם זאת ההנחה הבסיסית של הקפאה שבר היא שקרומים ביולוגיים מפוצלים דרך bilayer השומנים על ידי תהליך שבר (איור 3). תהליך בקרומים ביולוגיים זה מניב שני פרצופים שבר, אחד החושף את הארגון של מחצית מהקרום הסמוך אל הציטופלסמה,-PF הפנים, ואחד אשר חושף את מחצית עלון bimolecular של הקרום שנמצאה בסמוך לתאי הסביבה,-EF הפנים. משטחי תא אמיתיים אינם מיוצגים בתמונות להקפיא בר אך מופיעים רק כאשר הצעד שנוסף לאחר הקפאת תחריט ביצוע הליך שבר משמש. כדי לחרוט ביעילות דגימות שבר בעבר כדי לחשוף detai משטחl, דגימות חייבות להיות קפוא בקצב מהיר וללא unetchablecryoprotectant. תחריט של מים מפני השטח של הדגימה שבר חושפת תכונות הבסיסיות מושגת על ידי הצבת זרוע קירור microtome מעל הבמה דגימת יצירת ההפרש טמפרטורה בין השלב מחזיק את הדגימה וזרוע microtome הקירור אשר גורמת למים נשגבים מהמשטח. כאשר מים בסובלימציה מפני השטח של הדגימה שבר במהלך תמרון תחריט ההקפאה, אז היבטים של משטחים בפועל תא, מטריצת חוץ תאית, מבני cytoskeletal, והרכבות מולקולריות עשויים להתגלות ברזולוציה גבוהה. כך בהקפאה שבר ולהקפיא לחרוט אינן תנאים להחלפה, אלא משקף את תהליך צעד חכם האחרונה שבם לא עשוי להיות נחוץ או רצוי בהתאם לצרכים של מחקר המסוים. בעקבות ההקפאה-הבר / להקפיא לחרוט נהלים, המשטחים הסדוקים חשופים לevapora המכווןtive שכבות של פחמן ופלטינה על מנת לספק תמיכה והדמיה ניגוד להעתק. אידוי ההדמיה / פחמן הפלטינה יכול להיות חד כיווני או סיבובי, והוא נעשה על ידי או התנגדות או רובי אלקטרונים. הצללה חד כיווני מזווית ידועה, בדרך כלל 30º - 45º, היא שימושית בביצוע חישובי morphometric מסוימים. דגימות שהיו נתונים לעמוקים תחריט בדרך כלל הן סיבוביות מוצל והתמונות כתוצאה של דגימות אלה מתהפכות photographically להערכה. ההיסטורי, כמו גם מטרה הנוכחית של הקפאה שבר טכניקת ההקפאה לחרוט / היא להגביל קיבעון כימי ועיבוד דגימת ממצאים הקשורים ליותר נהלים במיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים קונבנציונליים. עם זאת, טכניקה זו מספקת יתרון מהותי ביכולתה להעניק פירוט תלת ממדים ובכך להקל על רכישה של נתונים morphometric במדע ביולוגי, חומר, וnדגימות anotechnology. נהלי ההקפאה שבר ולהקפיא לחרוט הם מורכבים ורבי פנים והיבטים מסוימים של היישום שלה מותאמים אישית. מצגת זו מציעה נוף סקר של התכונות העיקריות של התהליך והקורא מופנה לפרוטוקולים שפורסמו מקיפים 10, 11 על מנת לתת מענה לפרטים ולהתאמה אישי של התהליך לצרכי מחקר ספציפיים.

<table><tbody><tr><td>Balzers צמח הקפאה-שבר/הקפאה-תחריט</td><td>Balzers</td><td>BAF400T</td><td></td></tr><tr><td>מאגרים סטנדרטיים</td><td>ספקים</td><td></td><td></td>שונים</tr><tr><td>מקבעי אלדהיד</td><td>סטנדרטיים ספקים</td><td></td><td></td>שונים</tr><tr><td>נתרן דיכרומט</td><td>ספקים</td><td></td><td></td>שונים</tr><tr><td>חומצה גופרתית</td><td>ספקים</td><td></td><td></td>שונים</tr><tr><td>אספקה חד פעמית לאידוי פלטינה / פחמן</td><td>טכנוטרייד בינלאומי</td><td></td><td></td></tr><tr><td>חנקן נוזלי</td><td>ספקים</td><td></td><td></td>שונים</tr><tr><td>פרופאן</td><td>ספקים</td><td></td><td></td>שונים</tr><tr><td>אספקה חד פעמית למיקרוסקופ</td><td>אלקטרונים מיקרוסקופ אלקטרונים מדעי</td><td></td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ אלקטרונים שידור</td><td>קארל זייס בע"מ</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

טכני אלמנטים בסיסיים של ההקפאה-בר / הקפאה-לחרוט בביולוגי מיקרוסקופית אלקטרונים

Fundamental Technical Elements of Freeze-fracture/Freeze-etch in Biological Electron Microscopy

להקפיא בר / להקפיא לחרוט מתאר תהליך שבו דגימות, בדרך כלל ביולוגי או nanomaterial בטבע, הם קפואים, שבר, ומשוכפל ליצירת פחמן / פלטינה &quot;להפיל&quot; המיועד לבדיקה על ידי מיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים. דגימות נתונים לשיעורי הקפאת ultrarapid, לעתים קרובות בנוכחות סוכני cryoprotective להגביל היווצרות גבישי קרח, עם השבירה הבאה של הדגימה בחנקן נוזלי מקוררת טמפרטורות תחת ואקום גבוה. המשטח סדוק התוצאה משוכפל והתייצב על ידי אידוי של פחמן ופלטינה מזווית שמקנה משטח פירוט תלת ממדי לשחקנים. טכניקה זו הוכיחה מאיר עיניים במיוחד לחקירה של קרום תא וההתמחויות שלהם ותרמה במידה ניכרת להבנה של צורה סלולרית לתפקוד תא קשור. בדוח זה, נסקור את דרישות המכשיר ופרוטוקול טכני לביצועהקפאה שבר, המינוח ומאפיינים של מטוסי שבר הקשורים, וריאציות על ההליך המקובל, וקריטריונים לפרשנות של תמונות להקפיא בר. טכניקה זו נמצאת בשימוש נרחב לחקירת ultrastructural בתחומים רבים של ביולוגיה של תא וטומנת בחובו הבטחה כטכניקת הדמיה המתעוררות למולקולרית, ננוטכנולוגיה, ולימודי מדע חומרים.

הנחת היסוד המרכזית של פרשנות תמונת הקפאה שבר הוא שמטוסי שבר עוברים דרך bilayer השומנים של קרומים המקנים שני פרצופים שבר, שנקרא על ידי אמנה-PF הפנים (שבר פנים פלזמה) וEF פנים (שבר פנים תאיים) (איור 3). -PF הפנים הוא מחצית מbilayer השומנים הקרום הסמוך לציטופלסמה של התא ו- EF הפנים היא מחצית מbilayer השומנים הקרום הסמוך לסביבה תאית. טכניקת ההקפאה שבר היא שימושית במיוחד לחקירת מבנה קרום ושני הפרצופים הם בדרך כלל שונים במובהק עם PF-פרצופי אכלוס עם חלקיקי קרום רבים הקשו...

טכניקות וחידודים של עיבוד הקפאה שבר של דגימות ביולוגיות וננו לבדיקה על ידי מיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים בסיסיים מתוארות. טכניקה זו היא שיטה מועדפת לחשיפת תכונות והתמחויות של ממברנות ביולוגיות ultrastructural ולקבלת נתונים ממדיים ומרחבי רמת ultrastructural במדעי חומרים ומוצרי ננוטכנולוגיה.

Freeze-fracture/freeze-etch describes a process whereby specimens, typically biological or nanomaterial in nature, are frozen, fractured, and replicated ...

מטרת הניסוי הבא היא להפיק רפליקה של דגימה מפחמן ופלטינה של חומרים ביולוגיים או חומרים אחרים לצורך בדיקה באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים חודר (transmission electron microscopy). כדי להשיג זאת, דגימות המוכנות כרפליקות כפולות או בודדות עוברות קצירה אולטרה-מהירה של טמפרטורה כדי להגביל את היווצרות גבישי הקרח. לאחר מכן, הדגימה הקפואה נשברת באמצעות מניפולציה מרחוק בטמפרטורות של חנקן נוזלי תחת ואקום גבוה, פעולה המפצלת את הממברנה דרך השכבה הליפידית הכפולה, ובכך יוצרת פני שטח חיצוניים (extracellular face) ופני שטח הקרובים להיבט הציטופלזמי.כשלב נוסף רשותי, ניתן לחשוף מאפיינים תשתיים על ידי תססית של מים מפני השטח של הדגימה השבורה, וזאת באמצעות מיקום זרוע המיקרוטום לקירור מעל במת הדגימה ליצירת הפרש טמפרטורות, הגורם לסובלימציה של מים מפני השטח. לאחר מכן, נוצרת רפליקה על ידי אידוי של פחמן ופלטינה מעל המשטח השבור.הדגימה המקורית מעובדת מהשכבה המועתקת (replica), המועברת אל רשת לדגימה עבור מיקרוסקופ אלקטרונים חודר (transmission electron microscopy). בסופו של דבר, נעשה שימוש בשיטת שבירה בהקפאה ותקיצה בהקפאה (freeze fracture freeze etch) כדי להציג פרטים מבניים תלת-ממדיים של ממברנות תא, מערכים מולקולריים וננו-חומרים בבדיקה באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים חודר. היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון בדיקת חתכים דקים מאוד (ultra thin sections), הוא שניתן לצפות באובייקטים הרלוונטיים בתלת-ממד ברזולוציה של מיקרוסקופ אלקטרונים.שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בתחומי הביולוגיה התאית והמולקולרית והננוטכנולוגיה, כגון המאפיינים הממדיים והמבניים של קרומי תאים והארגון של מערכים מולקולריים ומערכי ננו-חומרים. הרעיון לשיטה זו עלה לראשונה כאשר זיהיתי שבוצעו מחקרים דומים על פרוטיסטים איקריוטים שהובילו לתגליות חשובות, אך הוקדש תשומת לב מוגבלת לנושאים רלוונטיים לבריאות האדם. התחילו את הפרוצדורה בהכנת דגימות ביולוגיות עבור שבירת הקפאה ושבירת קצוות (freeze fracture freeze edge), כפי שמתואר בפרוטוקול הכתוב.בחרו בבסיסי דגימה (stubs) מזהב או נחושת בגודל ובצורה המתאימים לדגימה המעובדת, באמצעות פינצטה עדינה ו/או מחטי מזריק בעלות קוטר קטן. מקמו שברים קטנים של הדגימה על חלקו העליון של בסיס הדגימה המתכתי. עבור רפליקות בודדות, הפחיתו את תכולת הנוזל של הדגימה עד להגעה לעקביות דביקה, דמוית דבק, על ידי ספיגת נוזלים מקצה הבסיס באמצעות נייר סינון.השתמשו במחטי מזרק בעלות קוטר קטן כדי ליצור תלולית של רקמה על הבסיס עבור רפליקות כפולות. הפכו בסיס נוסף, מקמו אותו בדיוק מעל הבסיס והניחו אותו בעדינות על פני השטח של הדגימה. כך נוצר מבנה של "סנדוויץ'".אין ללחוץ את הדגימה החוצה מבין שני הבסיסים. לאחר מכן, מלאו שני מכלי בידוד כפולים בחנקן נוזלי. הכלי הראשון מכיל מוט מתכת עם באר קטנה, המשמשת להנפקה של נפח קטן של גז פרופאן מבלון מסחרי זמין.הכלי השני הוא כלי אחסון עם מחיצה המיועד לשמירה קצרת מועד של דגימות קפואות תחת חנקן נוזלי. השתמשו בפרופאן אך ורק במכנסת כימית המאושרת לשימוש זה. הקפידו להימנע ממקורות הצתה חיצוניים, להשתמש בביגוד מגן לטמפרטורות נמוכות ולהבטיח אוורור נאות, שכן פרופאן הוא חומר נפיץ.עלול לגרום לפגיעת קיפאון במגע והוא חומר מחנק. בעזרת פיית הגליל הממוקמת בתוך הפרופאן, פתח את שסתום הגליל ואפשר לגז לזרום אל תוך בור הכלי הראשון, שם הוא יהפוך לנוזל במהירות המרבית. הרם את תושבת הדגימה בעזרת פינצטה עדינה וטבול אותה בתוך הגז הנוזלי בכלי הראשון למשך מספר שניות.לאחר מכן, העבירו במהירות לכלי האיסוף השני המכיל חנקן נוזלי. ברגע שהדגימות קפאו, אחסנו אותן תחת חנקן נוזלי עד להעברתן למתקן השבירה בהקפאה (freeze fracture plant). טענו את תומכי הדגימות מזהב לתוך מחזיק דגימות מסוג חוברת עם שכפול כפול או למכשיר תפס תחת חנקן נוזלי, והשאירו אותם שם עד למיקומם בתא הדגימות.כאשר התא הגיע לוואקום גבוה והבמה קוררה לטמפרטורת חנקן נוזלי, כבה את המשאבה, פתח את התא ומקם את בסיסי הדגימות המורכבים על שולחן הדגימות במהירות האפשרית. לאחר מכן, הפעל שוב את המשאבה כדי להשיב את הוואקום הגבוה והשתמש בבקרת הטמפרטורה האלקטרונית של הבמה והזרוע כדי לכוונן את טמפרטורת שולחן הדגימות ל-100- °C. כמו כן, הזרם חנקן נוזלי לזרוע המיקרוטום כדי להביאה לטמפרטורת חנקן נוזלי.לאחר השגת ואקום גבוה, טמפרטורת במה של 100- מעלות צלזיוס וזרוע מיקרוטום בטמפרטורת חנקן נוזלי, פתח מרחוק את מחזיק הדגימות הכפול, ובכך שבור את הדגימות על תושבות הדגימה. כשלב נוסף אופציונלי, ניתן לבצע תגית (etching) לדגימות כדי לחשוף מאפיינים תת-קרקעיים לאחר השבירה. כדי לבצע תגית, השתמש בלהב תער המוחזק בסבך על זרוע המיקרוטום כדי לגלח את פני השטח של הדגימות. מקם את זרוע המיקרוטום הקרה מעל המשטחים השבורים למשך דקה אחת עד מספר דקות כדי לבצע סובלימציה של המים, ובכך לחשוף משטחי תאים אמיתיים, מטריצה חוץ-תאית ו/או מכלולים מולקולריים.בשלב הבא, הפעילו את תותח האלקטרונים או תותח ההתנגדות של הפלטינה-פחמן ואפשרו לו לאיד לכיסוי של שכבת פלטינה-פחמן דקה מעל המשטח השבור מזווית של 30 מעלות עד 45 מעלות. פעולה זו דורשת בדרך כלל כ-15 עד 20 שניות; הפעילו את תותח האלקטרונים או תותח ההתנגדות של הפחמן באותו אופן, ואיידו שכבת פחמן דקה על פני השטח של הדגימה השבורה ישירות מלמעלה בזווית של 90 מעלות כדי לספק תמיכה לשכבה המועתקת (replica). גם פעולה זו דורשת בדרך כלל כ-15 עד 20 שניות עם השלמת ההעתקה, ההצללה (shadowing) וייצוב הפחמן.כבה את משאבת הוואקום ואת התא והוצא את תושבת הדגימה מהמכשיר. באמצעות פינצטה עדינה, הוצא כל בסיס דגימה מוזהב ממלקחי חוברת השכבה הכפולה (double replica booklet clamp) ואפשר להם להימס למשך מספר שניות לפני הורדה עדינה של הבסיס על פני שטח מים בלוחית דגימה (spot plate). תמרן את השכבות באמצעות לולאת חוט דקה או רשת נחושת רגילה של מיקרוסקופ אלקטרונים המוחזקת בפינצטה עדינה, והעבר אותן ללוחית דגימה אחרת המכילה 5% sodium dichromate ב-50% sulfuric acid למשך שעה עד מספר שעות. אמבט זה מעכל את חומר הדגימה הביולוגי בפועל מהשכבה.עם השלמת העיכול, העבירו את הרפליקה בחזרה למשטח מים נקי ואספו אותה על רשת נחושת סטנדרטית למיקרוסקופיה אלקטרונית. אחסנו את רשמי התמיכה של הרפליקה בקופסאות רשת זמינות מסחרית, שבהן הן יישמרו יציבות למשך שנים. עם טיפול עדין או בבדיקה אולטרה-מבנית של שבר קיפאון או רפליקות תחקיר, צפו ברפליקות במיקרוסקופ אלקטרונים חודר (TEM) במתח האצה, בדרך כלל בין 50 ל-80 kilovolts.הקליטו את התמונות הרלוונטיות על סרט TEM סטנדרטי או באמצעות מצלמה דיגיטלית ברזולוציה גבוהה השוכנת בממברנה התאית בבסיסו של כל איבר תאי אוקריוטי. הריסון והשוט הם מערך של חלקיקים הקשורים לממברנה המאורגנים לגדילים ENC המקיפים את מוט הריסון ומוכרים כשרשרת הריסונים. מערכי חלקיקי ממברנה ייעודיים מופיעים בגבול הלומנלי של תאים אפיתליאליים העוברים Clio Genesis.מערכי חלקיקים אלו מייצגים מחנקים שוטים (ciliary necklaces) ראשוניים, השוכנים בבסיסן של שוטים בשלבי התפתחות או שוטים בוגרים. מחקרים שונים של שבירת קיפאון (freeze fracture) ברקמות אפיתליאליות חושפים ארגון מורכב של מבני חריצים וחוטים העוברים אנסטומוזיס (anastomosing) ומקיפים את ההיבט האפיקלי של הגבולות הבזולטרליים. שבירה דרך ממברנות של תאי אפיתל חושפת פני שבירה של פלזמה של צמתים הדוקים (tight junctions) המופיעים כחוטים, בעוד שפני השבירה החוץ-תאיים מראים חריצים משלימים.צממתי פערים (Gap junctions) מופיעים בדגימות שבירה בהקפאה של מגוון רקמות, והם מיוצגים על ידי מערכים דחוסים של חלקיקים על פני השבירה של הפלסמה ובגומחות משלימות בשבירה החוץ-תאית. הפנים המוצגים כאן משמשים כדוגמה להקפאה מהירה עם תגריעה עמוקה (deep etching) והצללה סיבובית (rotary shadowing). התא האפיתלי נשבר דרך הציטופלסמה, וניתן לראות פני שבירה של הפלסמה מאחורי ראשי החצים.פני תא אמיתיים שנחשפו באמצעות תגירה עוקבת. לאחר השליטה בטכניקה, ניתן לבצע אותה במחזור הנמשך כשלוש שעות ומניב דגימה אחת עד שלוש, במידה והיא מבוצעת כראוי. בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור כי השלבים הבודדים תלויים זה בזה באופן הדוק, וכי טעות בשלב אחד עלולה להוביל לתוצאה שאינה מתאימה לבדיקה ולהערכה לאחר פיתוחה.טכניקה זו סללה את הדרך עבור חוקרים בתחום הביולוגיה התאית והמולקולרית לבחון כיצד מוטציות גנטיות גורמות לאנומליות מבניות בתאים, בדרכים שמעוררות מצבים פתולוגיים ומחלות.

fundamental-technical-elements-freeze-fracturefreeze-etch-biological

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

מקור: Schönherr, S., et. al. תיוג אימונולוגי משולב של העתק אופטוגנטי ושבר הקפאה כדי לבחון סידור ספציפי לקלט של קולטני גלוטמט באמיגדלה של העכבר. J. Vis. exp. (2016)סרטון זה מדגים את התיוג החיסוני של העתקים שבורים בהקפאה של רקמת מוח עכבר למיקרוסקופ אלקטרונים. ההעתקים השבורים והמצופים מתעכלים כדי לחשוף קולטנים. נוגדנים משניים ראשוניים ובעלי תווית זהב מתווספים כדי לסמן קולטנים ספציפיים של ממברנה עצבית. ההעתק מותקן על רשת ומוצג תחת מיקרוסקופ אלקטרונים.

תיוג חיסוני של חלבוני ממברנה עצבית בדגימה שסועה בהקפאה של רקמת מוח של עכבר

כדי לשמר את התהליכים עצביים לניתוח ultrastructural, אנו מתארים פרוטוקול לציפוי של נוירונים העיקרי ברשתות במיקרוסקופ אלקטרונים ואחרי הבזק הקפאה, מניב דגימות טהורים בשכבה של קרח זגוגי. ניתן לבחון דגימות אלה עם מיקרוסקופ אלקטרונים cryo-לדמיין מבנים בקנה המידה ננומטרי.

הכנת ראשונית לנוירונים חזותי neurites במצב קפוא-התייבשות באמצעות Cryo-אלקטרונים טומוגרפיה

אנו מציגים פרוטוקול של איך לאסוף ואלקטרון תהליך cryo-tomograms של כל המיטוכונדריה. הטכניקה מספקת מידע מפורט לגבי המבנה, תפקוד, והארגון של קומפלקסי חלבוני קרום גדולים בקרומים ביולוגיים מקומיים.

ויזואליזציה של הדימרים synthase ATP במיטוכונדריה על ידי אלקטרונים קריו טומוגרפיה

Cryo אלקטרונים מיקרוסקופים, או סורק (SEM) או הילוכים (TEM), נמצא בשימוש נרחב לאפיון של דגימות ביולוגיות או חומרים אחרים עם תכולת מים גבוהה 1. SEM / אלומת יונים ממוקדת (FIB) משמשת לזיהוי תכונות של עניין בדגימות ולחלץ lamella להעברה לcryo-TEM דק, אלקטרונים שקופים.

Cryo-אלקטרון מתכוון בהכנה מיקרוסקופית דגימה של אלומת יונים ממוקדת

השגת תמונות מיקרוסקופ אלקטרונים באיכות גבוהה היא מאתגרת, במיוחד במקרה של תאי צמחים, שיש להם שפע של ואקואולים גדולים מלאים במים וחללים מאווררים. הקפאה בלחץ גבוה טנדם והחלפת הקפאה מהירה מפחיתים מאוד את זמן ההכנה של דגימות צמחים ל-TEM תוך הפקת דגימות עם שימור אולטרה-מבני מעולה.

הקפאה בלחץ גבוהה טנדם ומהיר הקפאת חילוף של צמח רקמות למיקרוסקופים אלקטרונים חודרים

כתב יד זה מתאר שיטה קלה לשימוש בעלות הנמוכה cryofixation המאפשרת הדמית תאי השעיה ידי מיקרוסקופי אלקטרוני הילוכים.

מקפיא פלאנג: כלי עבור מחקרי ultrastructural ו Immunolocalization של תאי השעית הילוכים מיקרוסקופים אלקטרונים

פתחנו שיטה חדשנית במיקרוסקופ אלקטרונים, "פלאש-ו-הקפאה," המאפשרת ויזואליזציה של דינמיקה הממברנה עם רזולוצית ms זמנית. טכניקה זו משלבת את גירוי optogenetic של נוירונים עם מקפיא בלחץ גבוה. הנה, אנחנו מדגימים את הנהלים לתאר את הפרוטוקולים בפירוט.

פלאש-ו-Freeze: שיטה חדשנית לכידה Dynamics ממברנה עם מיקרוסקופית אלקטרונים

כאן אנו מציגים פרוטוקול לשילוב שני דוגמת עיבוד טכניקות, בלחץ גבוה מקפיא מדגם בסיוע מיקרוגל עיבוד, ואחריו שרף מינימלי הטבעה לרכישת נתונים עם מיקרוסקופ אלקטרונים סריקה קרן (שיקרתי-SEM) יון ממוקד. הוכח באמצעות העכבר העצב הטיביאלי מדגם Caenorhabditis elegans.

הכנת הדוגמא ביולוגית על ידי הקפאת בלחץ גבוה, שיפור ניגודיות בסיוע מיקרוגל, ושרף מינימלי הטמעה של אמצעי הדמיה

כאן אנו מראים כיצד להשתמש במכשיר הקפאת הכריך להקפאה מהירה של דגימות ביולוגיות, כולל חיידקים, שמרים, תאים בתרבית, תאים מבודדים, רקמות בעלי חיים ובני אדם, ווירוסים. אנו גם מראים כיצד להכין דגימות לחתך אולטרה-דק לאחר הקפאה מהירה.

הקפאה מהירה באמצעות מכשיר הקפאת כריך לשימור אולטרה-מבני טוב של דגימות ביולוגיות במיקרוסקופיית אלקטרונים

כתב יד זה מתאר את שיטת הכתם וצלילה להקפאה ידנית של דגימות ביולוגיות עבור מיקרוסקופיית אלקטרונים קריוגנית של חלקיק יחיד.

הקפאה ידנית של דגימות ביולוגיות למיקרוסקופיית אלקטרונים קריוגנית של חלקיק יחיד

אנו מציגים פרוטוקול לבידוד ולשבירת הקפאה של שלפוחיות חוץ-תאיות (EVs) שמקורן בתאי אורותל סרטניים. טכניקת ההקפאה-שבר חשפה את הקוטר והצורה של כלי הרכב החשמליים וכמאפיין ייחודי - את הארגון הפנימי של ממברנות ה-EV. אלה הם בעלי חשיבות עצומה בהבנת האופן שבו כלי רכב חשמליים מתקשרים עם הממברנות המקבלות.

מיקרוסקופיית אלקטרונים של שברים קפואים לניתוח שלפוחית חוץ-תאית

למד את טכניקת ההקפאה-בר לעיבוד דגימות ביולוגיות למיקרוסקופיה אלקטרונית. השיטה מייצרת רפליקות פחמן-פלטינה לחשיפת מבני ממברנות תלת-ממדיים בדיוק גבוה.

טכני אלמנטים בסיסיים של ההקפאה-בר / הקפאה-לחרוט בביולוגי מיקרוסקופית אלקטרונים

גלה סרטונים נוספים