Assay פונקציונלי לגאפ junctional בחינה; Electroporation של תאים חסידים על אינדיום הבדיל-אוקסיד

אלקטרופורציה היא טכניקה שבה מופעל זרם חשמלי על תאים חיים על מנת לפתוח נקבוביות חולפות על קרום התא. דרך הנקבוביות הללו, צבעים ומולקולות אחרות שבדרך כלל אינן חוצות את קרום התא יכולים להיכנס לתא, הנקבוביות נסגרות במהירות, ללא נזק לתא. נתאר כיצד ניתן לאלקטרופוטציה של תאי דבק כשהם גדלים על מגלשה המצופה בחלקה בחומר מוליך חשמלי ושקוף.

החומר הוא תחמוצת פח אינדיום, וכשהוא מוליך זרם חשמלי, הוא פותח נקבוביות המאפשרות לצבע להיכנס לתא. אז אפשר לבחון אם לתאים יש צמתים מרווחים או לא, וכמה צמתים מרווחים הם תעלות קטנות שמחברות את החלק הפנימי של תאים שכנים ומאפשרות מעבר של מולקולות קטנות. זה זמן רב מוכר כי לתקשורת צומת פער יש מגוון פונקציות חשובות בתא, כולל טרנספורמציה ניאופלסטית וגרורות.

ברוכים הבאים למצגת זו של פרויקטי תאים על אופן ביצוע אלקטרופורציה של תאים נצמדים באמצעות ה-Insitu. תמונה זו מראה, מה שנוכל לעשות, שהצבע הפלואורסצנטי הרופף לצהוב, הוכנס לתאים הגדלים על זכוכית שקופה ומוליכה. עד לקו זה, קל יותר לראות את הקו תחת ניגודיות פאזה.

הנה זה. אתם יכולים לראות שהצבע התפזר דרך צמתים מרווחים מהתאים משמאל, שהועמסו בצבע על ידי אלקטרופורציה לתאים מימין. כתוצאה מכך שיפוע זה של תאים פלואורסצנטיים הם טריפסים.

לאחר מכן הועבר לצינור בצנטריפוגה. חשוב מאוד שהתאים יתפשטו היטב כשהם גדלים בתא. מסיבה זו, עדיף לצנטריפוגה של התאים כדי להסיר עקבות של טריפסין.

המדיום עם עקבות של טריפסין נשאב מהתאים מושעים מחדש בכמיליליטר אחד של מדיום גידול, ולאחר מכן מצופים בתא. הפיפטה מכילה את תרחיף התאים, הסר את המכסה מהתא והכניס את התאים טיפה לתוך התא כדי להקל על הנשיאה. החדר ממוקם בצלחת פטרי של שישה סנטימטרים.

התא חוזר לאינקובטור כדי שהתאים יגדלו. התאים המצופים יתפשטו היטב והם יגדלו כדי לגעת זה בזה וליצור צמתים מרווחים. כאשר התאים מוכנים למצעד אלקטרו, הגדר את מחולל הדופק הפנימי לתנאים הרצויים.

עיין במדריך לתיאור תהליך ההתקנה הפשוט. כאשר כרךtage במכון מוגדר, הנורית האדומה בלוח המקשים תידלק. הוציאו את שני הבקבוקים המחוממים של DMEM ללא סידן מאמבט המים, אחד הוא DMEM ללא סידן, אבל עם סרום דיאליזה, ואחד הוא DMEM.

ללא סידן, הכינו את הפיפטות להעמיס רופף יותר לצהוב לתוך הצינור. במקום האנחה, הוציאו את התאים מהאינקובטור. הסר את המדיום על ידי היפוכו בכוס הכביסה בהתחלה.

לאחר מכן לטבול אותו על שטיפת הטישו פעם אחת עם DMEM ללא סידן, אל תנסה להסיר לחלוטין את כל ה-DMEM מכיוון שהתאים עלולים להתייבש. הוסיפו את הלוציפר הצהוב בזהירות על המחסום כדי לא להפריע לתאים, אבל מספיק מהר כדי שהתאים לא יתייבשו. השתמש ב -200 מיקרוליטר לכל מחצית החדר.

הנח את המכסה על תא הכניסה ולאחר מכן טען אותו לתוך המחוון. ודא שלשוניות הקצה של החדר מתאימות לחריצים של המחוון על ידי לחיצה על המחוון. הכנס את החדר למחזיק החדר.

לחץ על לחצן הדופק בלוח המקשים של מחולל הדופק. הנורית על מחולל הדופק ועל מחזיק התא תהבהב באדום במהלך תהליך האלקטרופורציה ולאחר מכן תהבהב בירוק כדי לציין שמחזור ההתחלה הושלם. משוך את המחוון לאחור מתחת למחזיק התא והסר את החדר.

שאפו את רוב הלוציפר הצהוב כדי להשתמש בו שוב, אך הקפידו לא לייבש את התאים. הוסף DMEM ללא סידן. עם סרום דיאליזה, הסרום עוזר לנקבובי לסגור את החדר חוזר לאינקובטור כדי להעביר את לוציפר צהוב דרך צמתים מרווחים.

התזמון חייב להיות עקבי מניסוי לניסוי. הסטנדרט הוא שלוש דקות. יוצקים את המדיום לכוס הפסולת.

הוסף תמיסת קיבוע פורמלדהיד 4% בעזרת משחה או פיפטה, המתן בטמפרטורת החדר לפחות שתי דקות. שופכים את הפורמלדהיד ושוטפים כמה פעמים. עם PBS, התאים מקובעים לזכוכית, כך שיש מעט סכנה שהם יתנתקו במהלך הכביסה.

כדי להיות מסוגל לראות את התאים תחת ניגודיות פאזה, חשוב להניח החלקת כיסוי על גבי החדר. מלאו את החדר ב-PBS היוצר מניסקוס גאה. הימנע מבועות אוויר, הנח את החלקת הכיסוי.

אל תדאג אם ה-PBS עולה על גדותיו פשוט ספוג את ה-PBS הנוסף על הרקמה. אתה צריך מיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוך, רצוי עם ניגודיות פאזה ועם בלוק פילטר לצהוב לוציפר. תחת ניגודיות שלבים, חפש את קצה האזור האלקטרופורטי.

תראה שני קווים מתחת לתאים פלואורסצנטיים. במחצית מהמגלשה יהיה זוהר בעוצמה. הקו הקרוב ביותר לתאים הזוהרים הוא קצה האזור האלקטרופוט.

כל פלואורסצנטיות מעבר לכך נובעת מהעברת צהוב לוסר דרך צמתים מרווחים. לדוגמה, תמונה זו של תאי אפיתל מציגה תאים שהיו אלקטרו בצד שמאל של התמונה, מעבירים צהוב לוציפר לתאים שכנים שאינם אלקטרופוטים, ויוצרים שיפוע של תאים זוהרים מקצה הציפוי המוליך לכיוון ימין. תמונה זו מציגה את אותה מסגרת של תאים תחת ניגודיות פאזה.

שים לב שאתה יכול לראות את קו ה-X בצורה ברורה מאוד. מדידה כמותית של כמה פער התרחשה העברת צומת יכולה להיעשות באופן ידני על ידי עבודה עם תמונות ניגודיות פלואורסצנטיות וניגודיות פאזה של תאים אלקטרופורטיים. הכוכבים לאורך קצה האזור המוליך נחשבים לתאים תורמים.

הם עברו אלקטרופורטציה ונלקחו לחופשי לצהוב. הם מעבירים לוק לצהוב לתאים שכנים מימין, שמעבירים אותו הלאה. עוד יותר בכמויות הולכות ופוחתות.

היחס בין הנקודות לכוכבים 41 לשמונה במקרה זה יכול לייצר מספר להשוואת כמה נרחבת העברת צומת הפער במקרה זה. 5.1 הוא מדד צומת הפער. חלופה לסימון וספירת תאים באופן ידני היא שימוש בתוכנת ניתוח תמונה כדי למדוד את הכמויות היחסיות של זוהר לאורך הצד הלא נבחר של גבול תא אלקטרופורט.

לתאים אלה אין צמתים מרווחים. הנה הקצה הימני של האזור החשמלי. שימו לב, אין שיפוע של פלואורסצנטיות, מה שמעיד על היעדר צמתים בפער תחת ניגודיות פאזה.

אתה יכול לראות בבירור את כל התאים. שימו לב שגם קו ה-X נראה בבירור. בדוגמה זו.

כל התאים בתא עוררו עם גורם גדילה אפידרמיס EGF, ו-10 דקות לאחר מכן תוקנו ונבדקו לקשת פוספו. שימו לב שהתאים המוכתמים מימין לא עברו אלקטרופורציה, והתאים משמאל עד לקו זה עברו אלקטרופורציה. התאים הלא אלקטרופורטיים מראים צביעה חומה עם נוגדן IRK פוספו ואימונופרוקסידאז.

התאים האלקטרופורטיים אינם מראים צביעה מכיוון שפפטיד הפוספו האלקטרופוטי חסם את תחום ה-SSH השני של אחיזה שתיים ועיכב זרחון IRK של EGF. שימו לב לאזור של שלושה עד ארבעה תאים מימין לקו שבו התאים לא היו אלקטרו, אך עדיין אינם מראים צביעה. אלה תאים שרכשו פפטיד חוסם משכניהם האלקטרופוטיים באמצעות צמתים מרווחים.

זוהי ההדגמה החזקה ביותר האפשרית לכך שעיכוב האות חייב לנבוע מהפפטיד ואינו יכול להיות תוצר של אלקטרופורציה. מכיוון שתאים אלה אינם אלקטרופורים, זוהי אותה מסגרת המוצגת תחת ניגודיות פאזה. שימו לב להיעדר כל שינוי במורפולוגיה לאחר אלקטרופורציה.

אצל חלק מהמטופלים פער תקשורת צומת יכולה להיות כמותית בדיוק במגוון גדול של תאים מתורבתים. הכנסת פפטידים כדי להפריע למסלולי איתות ספציפיים היא גישה רבת עוצמה להערכת הרלוונטיות בתאים חיים של חלבון, אינטראקציות חלבון שזוהו עם חלבונים מטוהרים. זה יכול להיות הצעד החשוב הראשון בפיתוח תרופות כיפה פפטיד.