Name: Assay פונקציונלי לגאפ junctional בחינה; Electroporation של תאים חסידים על אינדיום הבדיל-אוקסיד (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-10-18T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 2 s
Description: למדו שיטת אלקטרופורציה לתאים מודבקים על זכוכית אינדיום-בדיל-אוקסיד לבחינת תקשורת תאית בין תאים. שיטה זו מאפשרת הערכת פונקציונליות של מפרקי גאפ בתאים חיים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים ללואל קוקרן על סיוע מומחה בצילום וידאו. הסיוע הכספי של המכונים הקנדיים לחקר הבריאות (CIHR), הקרן הקנדית לסרטן השד (CBCF, סניף אונטריו), מועצת המחקר למדעי הטבע וההנדסה של קנדה (NSERC), הברית הקנדית לחקר סרטן השד, מרכזי המצוינות של אונטריו, הפעולה לסרטן השד בקינגסטון וקרן העיזבון של קלייר נלסון באמצעות מענקים ל-LR זוכה להכרת תודה. SG זכתה במלגת סטודנטים של NSERC. MG נתמכה על ידי מלגת פוסט-דוקטורט מהתוכנית לסרטן השד של צבא ארה"ב, משרד המחקר והחדשנות של מחוז אונטריו וועדת המחקר המייעצת של אוניברסיטת קווינס.

1 ציפוי התאים בלשכות Electroporation <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במינרית זרימת מכסה המנוע, trypsinize התאים באמצעות טכניקה סטרילית כרגיל. הערה: חשוב מאוד לחסל על ידי צנטריפוגה כל העקבות של טריפסין, משום שהם עלולים לעכב התפשטות התאים על הזכוכית, ומכאן ההיווצרות של adherens וצמתים פער. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 1 פיפטה מ&quot;ל של ההשעיה התא בתאי electroporation סטרילי מסופקים עם בelectroporator אתרו (איור 1), ומקום בC 37 o, CO 2 באינקובטור. הערה: הידבקות תא ניתן לשפר על ידי ציפוי על פיברונקטין, קולגן, פולי ליזין או דבק תאים ורקמות (ראה לוח חומרים). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר התאים יצרו שכבה ומחוברות הם מוכנים לבחינת GJIC. </li></ol> .2 Electroporation נוהל Electroporation לבדיקת GJIC יכולה להתנהל מחוץ למינרית זרימת מכסה המנוע,מאז זה לוקח רק כמה דקות. אם פעמים דגירה ארוכות יותר נדרשות לניסוי ספציפי, אז זה יכול להיות שנערך כולו בעלעלי זרימת מכסה המנוע. בכל המקרים, התאים שבו התאים גדלים חייבים להיות סטרילי. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן / פתרון צהוב לוציפר 5 מ&quot;ג מ&quot;ל: ממיסים אבקת 10 מ&quot;ג LY (מסופקת עם electroporator) ב2 מ&quot;ל מדיום גידול ללא סידן. בניסויים שדורש פעמים דגירה ארוכות יותר, מסנן לעקר את הפתרון ולאחסן ב 4 מעלות צלסיוס </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב את מדיום הגידול ולשטוף את התאים עם מדיום ללא סידן, נזהר שלא לשרוט את monolayer או לייבש את התאים. אם התאים מיובשים יש להם בדרך כלל גרעינים כהים יותר ולהרים LY ללא electroporation. ההשפעה בולטת יותר באמצע השקופית שיותר חשופה לטיוטות אוויר (איור 4F). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עם pipettor אפנדורף, פיפטה פתרון הצבע לתאים (400 μl לכל התא), בקצה של החדר, being נזהר שלא לגעת בשכבת התאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את החדר בבעל שסופק עם electroporator ולהחיל דופק של הכוח המתאים (ראה דיון). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זהירות לשאוב חלק מפתרון LY. זה ניתן לעשות שימוש חוזר בפעם שנייה לניסויים פחות חשובים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף ללא DMEM סידן המכיל סרום 10% dialysed. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה התאים עבור 3-5 דק &#39;בחממה על מנת לאפשר העברת צבע דרך צמתים פער. הערה: ההכללה של סרום dialysed בשלב זה מסייעת סגירה נקבובית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף את הצבע מאוגדים עם ללא DMEM סידן להתבוננות תא חי. לחלופין, ניתן לתקן תאים בשלב זה, באמצעות התוספת של פורמלין 4% לטובים, ואז שטף עם PBS (פוספט שנאגרו מלוח). בכל המקרים הכביסה חייבת להסיר את כל הרקע. הערה: בניסויים ראשוניים כדי לקבוע את התנאים אופטימליים, אם המתח נמוך מדי, אז זה אפשרי לתת לתאים להתאושש בincubator לכמה דקות וelectroporate אותה השקופית פעם שנייה, כדי להציל את בעלות של שקופיות. </li></ol> .3 מיקרוסקופי בדיקה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים לב לתאים תחת תאורת הקרינה, שימוש במיקרוסקופ הפוך מצויד במסנן המתאים לצבע בשימוש. לוציפר הצהוב, עירור הוא 423nm, 555nm פליטה, מסנן WBV למיקרוסקופ Nikon IX70. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחסל את השפעות המניסקוס על ידי הצבת כיסוי להחליק זכוכית על גבי הפלסטיק היטב, לאחר המילוי אותו לחלק העליון עם נוזל, לבחון מורפולוגיה של תאים תחת ניגוד שלב. לתמונות טובות יותר, גם יכול להיות מנותק מהשקופית, וcoverslip מונח על המסגרת. לתאים קבועים, גם יכול להיות מלא עם גליצרול להסתכלות מיקרוסקופית, ואילו לתאים חיים הוא חייב להיות מלא במדיום גידול. הערה: כביסה וצילום הוא קלה יותר אם התאים קבועים עם פורמלדהיד בעקבות ההעברה של הצבע (שלב 2.7 לעיל). אם התאים לאt קבוע, הקרינה מסולקת מהתאים בתוך כ 60 דקות בהתאם לסוג התא, המתח וכמות LY הציג ואילו בתאים קבועים הקרינה נשמרת למשך מספר שעות. עם זאת, הקרינה דועכת או מתפוגגת לאחר הדגירה O / N, אפילו בתאים קבועים. מסיבה זו, צילומים חייבים להיות מצולמים בקרוב לאחר electroporation (איור 2). </li></ol> .4 Quantitation של תקשורת בין תאית <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לצלם את התאים עם מטרת 20x תחת הקרינה וניגוד שלב (איור 3). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לזהות ולסמן בכוכב את תאי electroporated בגבול עם האזור-electroporated שאינו (איור 2, חץ, קצה electroporation). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> (איורים 3 א ו 3 ב) לזהות ולסמן עם נקודת תאי fluorescing בצד הלא electroporated, שבו הצבע העביר דרך צמתים פער. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחלקים את המספר הכולל שלfluorescing תאים באזור-electroporated שאינו במספר תאי electroporated לאורך הקצה (איורים 3 א ו 3 ב). הערה: ההעברה מלפחות 200 תאי גבול electroporated רציפים מחושבת עבור כל ניסוי. המספר שהתקבל הוא ערך GJIC. </li></ol>

<ol><li>Raptis, L., et al. Electroporation of Adherent Cells in Situ for the Study of Signal Transduction and Gap Junctional Communication. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRaptis%2C+L+%22Electroporation+protocols%22">Electroporation protocols</a>. , The Humana Press Inc. edited by S Li 167-183 (2008).</li>
<li>Giorgetti-Peraldi, S., Ottinger, E., Wolf, G., Ye, B., Burke, T. R., Shoelson, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+effects+of+phosphotyrosine-binding+domain+inhibitors+on+insulin+receptor+signalling+and+trafficking%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Cellular effects of phosphotyrosine-binding domain inhibitors on insulin receptor signalling and trafficking.</a> Mol Cell Biol. 17, 1180-1188 (1997).</li>
<li>Boccaccio, C., Ando, M., Tamagnone, L., Bardelli, A., Michielli, P., Battistini, C., Comoglio, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+epithelial+tubules+by+growth+factor+HGF+depends+on+the+STAT+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Induction of epithelial tubules by growth factor HGF depends on the STAT pathway.</a> Nature. 391, 285-288 (1998).</li>
<li>Bardelli, A., Longati, P., Gramaglia, D., Basilico, C., Tamagnone, L., Giordano, S., Ballinari, D., Michieli, P., Comoglio, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Uncoupling+signal+transducers+from+oncogenic+MET+mutants+abrogates+cell+transformation+and+inhibits+invasive+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Nat+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Uncoupling signal transducers from oncogenic MET mutants abrogates cell transformation and inhibits invasive growth.</a> Proc Nat Acad Sci USA. 95, 14379-14383 (1998).</li>
<li>Gambarotta, G., Boccaccio, C., Giordano, S., Ando, M., Stella, M. C., Comoglio, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ets+up-regulates+met+transcription%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Ets up-regulates met transcription.</a> Oncogene. 13, 1911-1917 (1996).</li>
<li>Arulanandam, R., Vultur, A., Raptis, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transfection+techniques+affecting+Stat3+activity+levels%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Transfection techniques affecting Stat3 activity levels.</a> Anal Biochem. 338 (1), 83-89 (2005).</li>
<li>Boussiotis, V. A., Freeman, G. J., Berezovskaya, A., Barber, D. L., Nadler, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maintenance+of+human+T+cell+anergy%3A+blocking+of+IL-2+gene+transcription+by+activated+Rap1%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Maintenance of human T cell anergy: blocking of IL-2 gene transcription by activated Rap1.</a> Science. 278 (5335), 124-128 (1997).</li>
<li>Brownell, H. L., Firth, K. L., Kawauchi, K., Delovitch, T. L., Raptis, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+technique+for+the+study+of+Ras+activation%3B+electroporation+of+%5Balpha-32%5DGTP%5BTitle%5D)+AND+%22DNA+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">A novel technique for the study of Ras activation; electroporation of [alpha-32]GTP.</a> DNA Cell Biol. 16, 103-110 (1997).</li>
<li>Tomai, E., Vultur, A., Balboa, V., Hsu, T., Brownell, H. L., Firth, K. L., Raptis, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+electroporation+of+radioactive+compounds+into+adherent+cells%5BTitle%5D)+AND+%22DNA+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">In situ electroporation of radioactive compounds into adherent cells.</a> DNA Cell Biol. 22, 339-346 (2003).</li>
<li>Raptis, L., Vultur, A., Tomai, E., Brownell, H. L., Firth, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+electroporation+of+radioactive+nucleotides%3A+assessment+of+Ras+activity+and+32P-labelling+of+cellular+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Biology+A+Laboratory+Handbook%2C+Celis%2C+Ed%22%5BJournal%5D)">In situ electroporation of radioactive nucleotides: assessment of Ras activity and 32P-labelling of cellular proteins.</a> Cell Biology A Laboratory Handbook, Celis, Ed. 43, 329-339 (2006).</li>
<li>Nakashima, N., Rose, D., Xiao, S., Egawa, K., Martin, S., Haruta, T., Saltiel, A. R., Olefsky, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+functional+role+of+crk+II+in+actin+cytoskeleton+organization+and+mitogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">The functional role of crk II in actin cytoskeleton organization and mitogenesis.</a> J Biol Chem. 274, 3001-3008 (1999).</li>
<li>Raptis, L., Firth, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electroporation+of+adherent+cells+in+situ%5BTitle%5D)+AND+%22DNA+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Electroporation of adherent cells in situ.</a> DNA Cell Biol. 9, 615-621 (1990).</li>
<li>Marais, R., Spooner, R. A., Stribbling, S. M., Light, Y., Martin, J., Springer, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cell+surface+tethered+enzyme+improves+efficiency+in+gene-directed+enzyme+prodrug+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">A cell surface tethered enzyme improves efficiency in gene-directed enzyme prodrug therapy.</a> Nat Biotechnol. 15, 1373-1377 (1997).</li>
<li>Nielsen, M. S., Nygaard, A. L., Sorgen, P. L., Verma, V., Delmar, M., Holstein-Rathlou, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gap+junctions%5BTitle%5D)+AND+%22Compr+Physiol%22%5BJournal%5D)">Gap junctions.</a> Compr Physiol. 2 (3), 1981-2035 (2012).</li>
<li>Geletu, M., Trotman-Grant, A., Raptis, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mind+the+gap%3B+regulation+of+gap+junctional%2C+intercellular+communication+by+the+SRC+oncogene+product+and+its+effectors%5BTitle%5D)+AND+%22Anticancer+Res%22%5BJournal%5D)">Mind the gap; regulation of gap junctional, intercellular communication by the SRC oncogene product and its effectors.</a> Anticancer Res. 32 (10), 4245-4250 (2012).</li>
<li>Vinken, M., Vanhaecke, T., Papeleu, P., Snykers, S., Henkens, T., Rogiers, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Connexins+and+their+channels+in+cell+growth+and+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Signal%22%5BJournal%5D)">Connexins and their channels in cell growth and cell death.</a> Cell Signal. 18 (5), 592-600 (2006).</li>
<li>Fouly, M. H., Trosko, J. E., Chang, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scrape-loading+and+dye+transfer%3A+A+rapid+and+simple+technique+to+study+gap+junctional+intercellular+communication%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Scrape-loading and dye transfer: A rapid and simple technique to study gap junctional intercellular communication.</a> Exp Cell Res. 168, 430-442 (1987).</li>
<li>Raptis, L., Brownell, H. L., Firth, K. L., MacKenzie, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+technique+for+the+study+of+intercellular%2C+junctional+communication%3B+electroporation+of+adherent+cells+on+a+partly+conductive+slide%5BTitle%5D)+AND+%22DNA+%26+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">A novel technique for the study of intercellular, junctional communication; electroporation of adherent cells on a partly conductive slide.</a> DNA & Cell Biol. 13, 963-975 (1994).</li>
<li>Anagnostopoulou, A., Cao, J., Vultur, A., Firth, K. L., Raptis, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Examination+of+gap+junctional%2C+intercellular+communication+by+in+situ+electroporation+on+two+co-planar+indium-tin+oxide+electrodes%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Oncol%22%5BJournal%5D)">Examination of gap junctional, intercellular communication by in situ electroporation on two co-planar indium-tin oxide electrodes.</a> Mol Oncol. 1, 226-231 (2007).</li>
<li>Tomai, E., Brownell, H. L., Tufescu, T., Reid, K., Raptis, S., Campling, B. G., Raptis, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+functional+assay+for+intercellular%2C+junctional+communication+in+cultured+human+lung+carcinoma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Invest%22%5BJournal%5D)">A functional assay for intercellular, junctional communication in cultured human lung carcinoma cells.</a> Lab Invest. 78, 639-640 (1998).</li>
<li>Tomai, E., Brownell, H. L., Tufescu, T., Reid, K., Raptis, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gap+junctional+communication+in+lung+carcinoma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Lung+Cancer%22%5BJournal%5D)">Gap junctional communication in lung carcinoma cells.</a> Lung Cancer. 23, 223-231 (1999).</li>
<li>Geletu, M., Chaize, C., Arulanandam, R., Vultur, A., Kowolik, C., Anagnostopoulou, A., Jove, R., Raptis, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stat3+activity+is+required+for+gap+junctional+permeability+in+normal+epithelial+cells+and+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22DNA+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Stat3 activity is required for gap junctional permeability in normal epithelial cells and fibroblasts.</a> DNA Cell Biol. 28, 319-327 (2009).</li>
<li>Geletu, M., Arulanandam, R., Greer, S., Trotman-Grant, A., Tomai, E., Raptis, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stat3+is+a+positive+regulator+of+gap+junctional+intercellular+communication+in+cultured%2C+human+lung+carcinoma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cancer%22%5BJournal%5D)">Stat3 is a positive regulator of gap junctional intercellular communication in cultured, human lung carcinoma cells.</a> BMC Cancer. 12, 605(2012).</li>
<li>Brownell, H. L., Narsimhan, R., Corbley, M. J., Mann, V. M., Whitfield, J. F., Raptis, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ras+is+involved+in+gap+junction+closure+in+mouse+fibroblasts+or+preadipocytes+but+not+in+differentiated+adipocytes%5BTitle%5D)+AND+%22DNA+%26+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Ras is involved in gap junction closure in mouse fibroblasts or preadipocytes but not in differentiated adipocytes.</a> DNA & Cell Biol. 15, 443-451 (1996).</li>
<li>Weber, P. A., Chang, H. C., Spaeth, K. E., Nitsche, J. M., Nicholson, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+permeability+of+gap+junction+channels+to+probes+of+different+size+is+dependent+on+connexin+composition+and+permeant-pore+affinities%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">The permeability of gap junction channels to probes of different size is dependent on connexin composition and permeant-pore affinities.</a> Biophys J. 87 (2), 958-973 (2004).</li>
<li>Graham, F. L., vander Eb, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+technique+for+the+assay+of+infectivity+of+human+Adenovirus+5+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">A new technique for the assay of infectivity of human Adenovirus 5 DNA.</a> Virology. 52, 456-467 (1973).</li>
<li>Arulanandam, R., Vultur, A., Cao, J., Carefoot, E., Truesdell, P., Elliott, B., Larue, L., Feracci, H., Raptis, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cadherin-cadherin+engagement+promotes+survival+via+Rac%2FCdc42+and+Stat3%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cancer+Res+7%22%5BJournal%5D)">Cadherin-cadherin engagement promotes survival via Rac/Cdc42 and Stat3.</a> Mol Cancer Res 7. , 1310-1327 (2009).</li>
<li>Williams, E. J., Dunican, D. J., Green, P. J., Howell, F. V., Derossi, D., Walsh, F. S., Doherty, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+inhibition+of+growth+factor-stimulated+mitogenesis+by+a+cell-permeable+Grb2-binding+peptide%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Selective inhibition of growth factor-stimulated mitogenesis by a cell-permeable Grb2-binding peptide.</a> J. Biol. Chem. 272, 22349-22354 (1997).</li>
<li>Raptis, L., Brownell, H. L., Vultur, A. M., Ross, G., Tremblay, E., Elliott, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+inhibition+of+Growth+Factor-stimulated+ERK1%2F2+activation+in+intact+cells+by+electroporation+of+a+Grb2-SH2+binding+peptide%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Growth+Differ%22%5BJournal%5D)">Specific inhibition of Growth Factor-stimulated ERK1/2 activation in intact cells by electroporation of a Grb2-SH2 binding peptide.</a> Cell Growth Differ. 11, 293-303 (2000).</li>
<li>Meda, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assaying+the+molecular+permeability+of+connexin+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Assaying the molecular permeability of connexin channels.</a> Methods Mol Biol. 154, 201-224 (2001).</li>
<li>Hofgaard, J. P., Mollerup, S., Holstein-Rathlou, N. H., Nielsen, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+gap+junctional+intercellular+communication+based+on+digital+image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Regul+Integr+Comp+Physiol%22%5BJournal%5D)">Quantification of gap junctional intercellular communication based on digital image analysis.</a> Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 297 (2), R243-R247 (2009).</li>
<li>Raptis, L., Lamfrom, H., Benjamin, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+cellular+phenotype+and+expression+of+polyomavirus+middle+T+antigen+in+rat+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Regulation of cellular phenotype and expression of polyomavirus middle T antigen in rat fibroblasts.</a> Mol Cell Biol. 5, 2476-2486 (1985).</li>
<li>Raptis, L., Marcellus, R. C., Whitfield, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+membrane-associated+protein+kinase+C+activity+correlates+to+tumorigenicity+but+not+anchorage-independence+in+a+clone+of+mouse+NIH+3T3+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">High membrane-associated protein kinase C activity correlates to tumorigenicity but not anchorage-independence in a clone of mouse NIH 3T3 cells.</a> Exp Cell Res. 207, 152-154 (1993).</li>
<li>Vultur, A., Cao, J., Arulanandam, R., Turkson, J., Jove, R., Greer, P., Craig, A., Elliott, B. E., Raptis, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+to+cell+adhesion+modulates+Stat3+activity+in+normal+and+breast+carcinoma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Cell to cell adhesion modulates Stat3 activity in normal and breast carcinoma cells.</a> Oncogene. 23, 2600-2616 (2004).</li>
<li>Vultur, A., Arulanandam, R., Turkson, J., Niu, G., Jove, R., Raptis, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stat3+is+required+for+full+neoplastic+transformation+by+the+Simian+Virus+40+Large+Tumor+antigen%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Stat3 is required for full neoplastic transformation by the Simian Virus 40 Large Tumor antigen.</a> Mol Biol Cell. 16, 3832-3846 (2005).</li>
</ol>

המחבר המקביל הוא הממציא בפטנט המוחזק על ידי אוניברסיטת קווינס, שקיבלה רישיון ל-Cell Projects Inc. לחברה או לאוניברסיטה לא הייתה כל השפעה על תוכן העיתון.

שלבים קריטיים בפרוטוקול חומר Electroporated טוהר של החומר המיועד לelectroporated הוא מאוד חשוב. אם התאים מאוד שטוחים, ריכוזים אז גבוהים יותר של צבע המעקב חייבים להיות בשימוש (עד 20 מ&quot;ג / מ&quot;ל לLY) ובמקרים כאלה, טוהר חשוב עוד יותר מאשר בתאים עם צורה כדורית יותר 1. חוץ LY מגוון גדול של צבעים אחרים או מולקולות nonpermeant להיות מועסק, כגון סדרה של צבעי Alexa להשתמש כמו בדיקו...

היישום של זרם חשמלי לתא גורם להיווצרות של נקבוביות על קרום התא, על ידי electroporation תהליך המכונה. הנקבוביות לאפשר המעבר של מגוון רחב של מולקולות nonpermeant דרך הממברנה. השדה החשמלי ניתן לשלוט במדויק, כך שנקבובי שנוצרו הם קטנים מאוד וreclose במהירות, עם הפרעה מינימאלית לפיסיולוגיה התאית. מעניין, ניתן לגדל תאים חסיד בשקופית זכוכית מצופה בתחמוצת מוליך ושקופה אינדיום פח (איטו) וelectroporated באתר, שעל פני השטח שבו הם גדלים, ללא ניתוק להיות electroporated בהשעיה. תאים יכולים לגדול היטב על פני השטח זה, וכפי שהם מחוברים והאריכו, התצפית מיקרוסקופית מפורטת אפשרית. שימוש בטכניקה זו, יכולה להיות הציגו מולקולות nonpermeant קטנות באופן מיידי ולמהות 100% מהתאים, מה שהופך את הטכניקה זו מתאימה במיוחד למחקרים על ההפעלה של components של מסלול בעקבות הגירוי ליגנד של קולט (שנסקר ב1). Electroporation כבר בשימוש בעיקר עבור כניסתה של DNA (electrotransfection המכונה גם). עם זאת, electroporation באתר יכול להיות בעל ערך עבור כניסתה של מגוון רחב של מולקולות, כגון פפטידים 2-4, oligonucleotides, כגון RNA antisense, oligonucleotides פעמיים תקועים דמה DNA לעכב גורם שעתוק מחייב, או siRNA 3,5, 6 נוקלאוטידים, רדיואקטיבי 7-10, חלבוני 11 12 או בעד סמים 13. בעקבות electroporation, ניתן lysed תאים עבור ניתוחים ביוכימיים או קבוע ומוכתם עם נוגדנים. ציפוי איטו המוליך הוא דק מאוד, 800-1,000Å, כך שצמיחת תאים אינה מופרעת על ידי ההבדל בגובה של שני משטחים, כתאים לגדול מעבר לקצה של ציפוי המוליך. זו מציעה את היתרון שאינו electropניתן לגדל תאים נאמו לצד אלה electroporated, שישמשו כבקרה. אותה הגישה יכולה לשמש לבחינת הפער junctional, תקשורת בין תאית (GJIC), כפי שמתוארת בווידאו. צמתים פער הם ערוצים המחברים את הפנים של תאים סמוכים 14. פער junctional, תקשורת בין תאית משחקת תפקיד חשוב בהיווצרות גידולים וגרור, ואילו אונקוגנים כגון Src לדכא GJIC 15,16. כדי לבחון GJIC צבע ניאון כגון צהוב לוציפר (LY) הוא הציג לעתים קרובות לתוך תאים בתרבית באמצעות microinjection או לגרד טעינה 17 ודיפוזיה של הצבע לתוך תאים שכנים הוא ציינה מיקרוסקופי תחת תאורת פלואורסצנטי. טכניקות אלו אולם תמיד לגרום נזק לתאים. עכשיו אנו מתארים טכניקה שבה תאים גדלים בשקופית זכוכית שמצופית בחלקו עם איטו 18. דופק חשמלי היה מוחל בנוכחות LY (או צבעים אחרים) caבאמצעות החדירה שלה לתאי גידול בחלק המוליך של השקופית, ואילו הגירת צבע לתאים הסמוכים, שאינו electroporated נצפתה מיקרוסקופית באמצעות תאורת פלואורסצנטי. כדי להימנע מתאים רגישים מטרידים שעשויות נוטים להתנתק מmonolayer, הרכבה תוכננה שלא דורשת אלקטרודה שממוקמת על גבי התאים ליישם את 19 הזרם החשמלי. גישה זו מציעה את היכולת לכמת GJIC במספר גדול של תאים, ללא כל הפרעה לגילוי לחילוף חומרים תאיים, כפי שצוינה על ידי בהעדר השפעה על אורכו של שלב G1 בעקבות גירוי סרום 12, להגדיל ברמות של FOS חלבון protooncogene (Raptis, לא פורסם) או שני קינאז הקשורים ללחץ סלולארי, חזיר p38 או JNK / SAPK קינאז 1. גישה זו התאפשרה הבדיקה של הקשר בין רמות ביטוי אונקוגן, השינוי וGJ18 IC, כמו גם את ההשפעה של Src וSTAT3 על GJIC במגוון רחב של סוגי תאים, כולל תאים טריים תרבותיים מדגימות גידול ריאות 20-23. בנוסף, באתרו electroporation עם ההתקנה תוארה שאין בו אלקטרודה עליונה כבר מועסק בהצלחה להפגנה של סגירת צומת פער על בידול adipocytic, למרות שקובץ מצורף סלולארי למצע מצטמצם בשלב ש19,24.

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>Cellgro http://www.cellgro.com/</td> <td>50-013-PB</td><td></td></tr><tr><td>DMEM ללא סידן</td><td>היקלון (תרמו מדעי: http://www.thermoscientific.com)</td><td>SH30319-01</td><td></td></tr><tr><td>סרום עגל תורם&nbsp;</td><td>PAA: http://www.paa.com/</td> <td>Cat.# B15-008</td><td></td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי</td><td>PAA: http://www.paa.com/</td> <td>Cat.# A15-751</td><td></td></tr><tr><td>מכשירי אלקטרופורציה</td><td>Cell Projects Ltd בריטניה: http://www.cellprojects.com/</td> <td>ACE-100</td><td></td></tr><tr><td>Chambers</td><td>Cell Projects Ltd בריטניה</td><td>ACE-04-CC</td><td>4-בארות</td></tr><tr><td>Chambers</td><td>Cell Projects Ltd בריטניה</td><td>ACE-08-CC</td><td>8-בארות</td></tr><tr><td>לוציפר פרויקטי תאים צהובים</td><td>בע"מ בריטניה</td><td>ACE-25-LY</td><td>טוהר גבוה</td></tr><tr><td>CelTak</td><td>BD Biosciences</td><td>354240</td><td>דבק תאים ורקמות</td></tr><tr><td>פיברונקטין</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>F1141</td><td></td></tr><tr><td>קולגן</td><td>BD Biosciences</td><td>354236</td><td></td></tr><tr><td>פולי-ליזין</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>P8920</td><td></td></tr></tbody></table>

assay פונקציונלי לגאפ junctional בחינה; electroporation של תאים חסידים על אינדיום הבדיל-אוקסיד

A Functional Assay for Gap Junctional Examination; Electroporation of Adherent Cells on Indium-Tin Oxide

בטכניקה זו, תאים מתורבתים על מגלשת זכוכית המצופה בחלקה בתחמוצת אינדיום-בדיל (ITO), חומר שקוף ומוליך חשמלית. ניתן להחדיר מגוון מולקולות, כגון פפטידים או אוליגונוקלאוטידים ל-100% מהתאים באופן לא טראומטי. כאן, אנו מתארים כיצד ניתן להשתמש בו כדי לחקור תקשורת צומת בין-תאית עם פערים. צהוב לוציפר חודר לתאים כאשר פולס חשמלי, המופעל על המשטח המוליך עליו הם גדלים, גורם להיווצרות נקבוביות דרך קרום התא. זוהי אלקטרופורציה. תאים הגדלים על משטח הזכוכית הלא-מוליך הסמוך לאזור האלקטרופורטי אינם קולטים את צהוב לוציפר על ידי אלקטרופורציה, אך כן רוכשים את הצבע הפלואורסצנטי כאשר הוא מועבר אליהם דרך צמתים מרווחים המקשרים אותם לתאים האלקטרופוטיים. ניתן לראות את תוצאות העברת הצבע מתא לתא באופן מיקרוסקופי תחת תאורה פלואורסצנטית. טכניקה זו מאפשרת כימות מדויק של תקשורת צומת פערים. בנוסף, הוא יכול לשמש להחדרת פפטידים או מולקולות אחרות שאינן קבועות, והעברת פפטידים אלקטרופוטיים קטנים דרך צמתים מרווחים כדי לעכב את האות בתאים הסמוכים והלא אלקטרופוטיים היא הדגמה רבת עוצמה של עיכוב אותות.

איור 2 מראה תאי כבד החולדה T51B אפיתל 22, electroporated עם LY וצילמו מתחת לקרינה (פנל וארוחת בוקר), או שלב בניגוד תאורה (C), הבאים קיבעון וכביסה. בפנל, בקצה אזור electroporated מסומן באדום. השיפוע של הקרינה בצד הימין של הקו האדום מציין העברה דרך צמתים פער. באיור 3 א ו 3 ב, לכמת את תקשורת junctional הפער מוצג: התאים בקצה אזור electroporated זוהו וסומנו בכוכב, ואילו תאים שבהם הצבע העביר היו מסומנים בנקודה. היחס מציג את ה...

מצגת זו מדגימה שיטה לפיה אלקטרופורציה של תאים דבקים ומתורבתים משמשת לחקר תקשורת בין-תאית, צומתית, בעוד התאים גדלים על שקופית המצופה בתחמוצת אינדיום-בדיל מוליכה ושקופה.

Assay פונקציונלי לגאפ junctional בחינה; Electroporation של תאים חסידים על אינדיום הבדיל-אוקסיד

In this technique, cells are cultured on a glass slide that is partly coated with indium-tin oxide (ITO), a transparent, electrically conductive material. ...

אלקטרופורציה היא טכניקה שבה מופעל זרם חשמלי על תאים חיים במטרה לפתוח נקבים זמניים בממברנת התא. דרך נקבים אלו יכולים להיכנס לתא צבעים ומולקולות אחרות שבדרך כלל אינן חוצות את ממברנת התא; הנקבים נסגרים במהירות, ללא נזק לתא. אנו נתאר כיצד ניתן לבצע אלקטרופורציה לתאים נצמדים בעודם גדלים על זכוכית המצופה בחלקה בחומר מוליך חשמלית ושקוף.החומר הוא אינדיום-בדיל-תחמוצת (indium tin oxide), ומכיוון שהוא מוליך זרם חשמלי, הוא פותח נקבים המאפשרים לצבע לחדור לתא. לאחר מכן ניתן לבחון האם לתאים יש צממדי gap junctions או לא, וכמה; gap junctions הם תעלות קטנות המחברות בין פנימיהם של תאים סמוכים ומאפשרות מעבר של מולקולות קטנות. כבר מזמן מוכר כי לתקשורת באמצעות gap junctions יש מגוון תפקידים חשובים בתא, כולל טרנספורמציה נאופלסטית וגרורות.ברוכים הבאים למצגת פרויקטים של תאים העוסקת באופן ביצוע אלקטרופורציה של תאים דבקים באמצעות ה-Insitu. תמונה זו מראה את מה שנוכל להשיג: צבע פלואורסצנטי בצהוב הוכנס לתאים הגדלים על זכוכית שקופה ומוליכה. עד לקו זה; הקו נראה בבירור יותר תחת ניגודיות פאזה (phase contrast).הנה התוצאה. ניתן לראות כי הצבע התפשט דרך צממתי פער (gap junctions) מהתאים שמימין, שהוטען בצבע באמצעות אלקטרופורציה, אל התאים שמימין. הדבר התוצאה היא מדרג של פלואורסצנציה בתאים שטורפסו.לאחר מכן הועברו לשפופרת ע

a-functional-assay-for-gap-junctional-examination-electroporation

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

אנו מדגימים כיצד ללמוד את ההשפעה של מוטציה נקודה אחת על התפקוד של ערוץ יון.

Mutagenesis וניתוח פונקציונלי של תעלות יונים הביעו Heterologously בתאי יונקים

Transfection אסטרטגיה אופטימיזציה עבור הביטוי הקלטה של ​​אלקטרו Voltage-מגודרת ערוצי רקומביננטי יון ב HEK-293T תאים

תדירות הדבקה assay למדידת קולטן ליגנד קינטיקה אינטראקציה כאשר הן מולקולות מעוגנים על פני השטח של התאים אינטראקציה מתוארת. Assay זה מכני מבוסס מודגמת באמצעות micropipette-בלחץ דם אנושי תא אדום כמו חיישן הידבקות integrin αLβ2 ו מולקולה-1 הדבקה אינטר כמו אינטראקציה קולטנים ligands.

תדירות הדבקה Assay עבור באתרו קינטיקס ניתוח חוצה Junctional אינטראקציות מולקולריות על ממשק Cell-Cell

אנו מתארים כאן כיצד לבצע microinjection מתחיל מתא בודד הצהוב לוציפר לדמיין תקשורת סלולרית באמצעות-צומת פער בתאים חיים, ולספק כמה עצות שימושיות. אנו מצפים כי מסמך זה יעזור לכולם להעריך את מידת צימוד הסלולר בשל צומת פער פונקציונליים. הכל המתואר כאן יכול להיות, באופן עקרוני, מותאמי צבעי ניאון אחרים עם משקל מולקולרי להלן 1,000 Daltons.

Microinjection מתא בודד לניתוח תקשורת נייד

פרוטוקול זה מסוקר Cell-מצע חשמלי עכבת חישה, שיטה להקליט ולנתח את ספקטרום העכבה של תאי חסיד לכימות של התקשרות סלולרי, התפשטות, תנועתיות, ותגובות תאיות לגירויים תרופתיים ורעילים. זיהוי של חדירות האנדותל והערכה של קשרים בין תאים ותא מצע מודגשים.

חשמל Cell-מצע עכבת חישה לכימות של האנדותל למניעת הפצת נשק, תפקוד מחסום, ותנועתיות

פרוטוקול זה מתאר טכניקה העברה לצבוע אזמל-ניאון טעינת מודד תקשורת בין תאית בערוצי צומת פער. תקשורת בין תאית גאפ junctional היא תהליך הסלולר עיקרי שבאמצעותו הומאוסטזיס רקמות מתוחזק שיבוש איתות התא הזה יש השפעות בריאותיות שליליות.

גאפ junctional אינטר תקשורת: ביומרקר פונקציונלית להערכת תופעות לוואי של toxicants ורעלים, ואת היתרונות הבריאותיים של מוצרים טבעיים

התאמנו תוספת ממברנה מיקרו-נקבובית חדירה כדי לחקות את המיקרו-סביבה של הגידול (TME). המודל מורכב מתרבית תאים מעורבת, מאפשר יצירה פשוטה של אוכלוסיות תאים בודדות מועשרות מאוד ללא שימוש בתיוג פלואורסצנטי או מיון תאים, ומאפשר לחקור תקשורת בין-תאית בתוך ה-TME בתנאים רגילים או בתנאי עקה.

חקיין של microenvironment הגידול: שיטה פשוטה ליצירת אוכלוסיות תאים מועשרות חוקרים אינטר תקשורת

כאן, אנו מציגים עבור הרומן הפער צומת תקשורת המערכת assay המיועד להקרנה תפוקה גבוהה של הפער להתכוונן צומת כימיקלים גילוי תרופות רעילות הערכת פרוטוקול.

Assay תקשורת צומת-המערכת יודיד-צהוב הניאון חלבון-Gap

אפיתל מעיים מעניק לא רק ספיגה תזונתיים אלא הגנה מפני חומרים מזיקים. הצומת הבין-תאי האפיתל ביותר אפיתל, כלומר, הצומת ההדוק, מווסת חדירה פרה-תאית וחדירות יונים. כאן מתואר פרוטוקול להכנת יריעות הרירית והערכה של הסלקטיביות היונית של צמתים הדוקים באמצעות טכניקת תא ברית המועצות.

הערכה פונקציונלית של מחסום צומת הדוק מעיים וחדירות יון ברקמה המקומית על ידי טכניקת הקאמרית של ברית המועצות

כאן אנו מציגים פרוטוקול לביטוי חלבוני צומת פערים בביציות קסנופוס ורישום זרם צומתי בין שתי ביציות באמצעות מגבר מסחרי המיועד לרישומי מהדק מתח ביציות כפול במצב מדידת זרם צד גבוה.

הקלטת זרם צומת גאפ מביציות קסנופוס

אלקטרופורציה של מצע נקבובי (PSEP) משלבת אספקה עקבית בתפוקה גבוהה עם כדאיות תאים גבוהה. הכנסת מדידות עכבה חשמלית טרנסאפיתל (TEEI) מספקת תובנה לגבי תהליכי הביניים של PSEP ומאפשרת אספקה ללא תוויות. מאמר זה דן בשיטה לביצוע ניסויי העברת PSEP וניתוח מדידת TEEI בו-זמנית.

אלקטרופורציה מבוססת מצע נקבובי עם ניטור עכבה חשמלית טרנסאפיתל

למדו שיטת אלקטרופורציה לתאים מודבקים על זכוכית אינדיום-בדיל-אוקסיד לבחינת תקשורת תאית בין תאים. שיטה זו מאפשרת הערכת פונקציונליות של מפרקי גאפ בתאים חיים.

Assay פונקציונלי לגאפ junctional בחינה; Electroporation של תאים חסידים על אינדיום הבדיל-אוקסיד

גלה סרטונים נוספים