Assay פונקציונלי לגאפ junctional בחינה; Electroporation של תאים חסידים על אינדיום הבדיל-אוקסיד

אלקטרופורציה היא טכניקה שבה מופעל זרם חשמלי על תאים חיים במטרה לפתוח נקבים זמניים בממברנת התא. דרך נקבים אלו יכולים להיכנס לתא צבעים ומולקולות אחרות שבדרך כלל אינן חוצות את ממברנת התא; הנקבים נסגרים במהירות, ללא נזק לתא. אנו נתאר כיצד ניתן לבצע אלקטרופורציה לתאים נצמדים בעודם גדלים על זכוכית המצופה בחלקה בחומר מוליך חשמלית ושקוף.

החומר הוא אינדיום-בדיל-תחמוצת (indium tin oxide), ומכיוון שהוא מוליך זרם חשמלי, הוא פותח נקבים המאפשרים לצבע לחדור לתא. לאחר מכן ניתן לבחון האם לתאים יש צממדי gap junctions או לא, וכמה; gap junctions הם תעלות קטנות המחברות בין פנימיהם של תאים סמוכים ומאפשרות מעבר של מולקולות קטנות. כבר מזמן מוכר כי לתקשורת באמצעות gap junctions יש מגוון תפקידים חשובים בתא, כולל טרנספורמציה נאופלסטית וגרורות.

ברוכים הבאים למצגת פרויקטים של תאים העוסקת באופן ביצוע אלקטרופורציה של תאים דבקים באמצעות ה-Insitu. תמונה זו מראה את מה שנוכל להשיג: צבע פלואורסצנטי בצהוב הוכנס לתאים הגדלים על זכוכית שקופה ומוליכה. עד לקו זה; הקו נראה בבירור יותר תחת ניגודיות פאזה (phase contrast).

הנה התוצאה. ניתן לראות כי הצבע התפשט דרך צממתי פער (gap junctions) מהתאים שמימין, שהוטען בצבע באמצעות אלקטרופורציה, אל התאים שמימין. הדבר התוצאה היא מדרג של פלואורסצנציה בתאים שטורפסו.

לאחר מכן הועברו לשפופרת עבור צנטריפוגה. חשוב מאוד שהתאים יתפזרו היטב בעת גדילתם בתא. מסיבה זו, מומלץ לבצע צנטריפוגה לתאים כדי להסיר כל שאריות של trypsin.

שואבים את המצע המכיל עקבות של trypsin, מרחפים מחדש את התאים בכ-1 mL של Growth medium, ולאחר מכן זורעים אותם בתא. הפ pipette מכילה את תרחיף התאים; מסירים את המכסה מהתא וטפטף את התאים לתוכו באמצעות pipette כדי להקל על הניוד. את התא מניחים בתוך Petri dish בקוטר 6 cm.

התא חוזר לאינקובטור כדי לאפשר לתאים לגדול. התאים שנזרעו יתפשטו היטב, יגדלו עד שייגעו זה בזה וייצרו צמתי פער (gap junctions). כאשר התאים יהיו מוכנים להולכה חשמלית, הגדירו את מחולל הפולסים (in situ pulse generator) לתנאים הרצויים.

עיין במדריך לקבלת תיאור של תהליך ההגדרה הפשוט. כאשר המתח ב-insitu נקבע, הנורה האדומה במקלדת תידלק. הוצא את שני הבקבוקים המחוממים של DMEM ללא סידן מאמבט המים; אחד הוא DMEM ללא סידן, אך עם סרום שעבר דיאליזה, והשני הוא DMEM.

ללא סידן, הכינו את הפ pipetteטים וטענו אותם ברופפות עבור הצבע הצהוב אל תוך ה-pipetter. במקום הנשיפה, הוציאו את התאים מהאינקובטור. הסירו את המצע על ידי הפיכתו לכלי השטיפה בשלב הראשון.

לאחר מכן, טפיחו את הרקמה פעם אחת עם DMEM ללא סידן; אין לנסות להסיר את כל ה-DMEM כיוון שהתאים עלולים להתייבש. הוסיפו בזהירות את ה-Lucifer yellow על המחסום (Barrier) כדי לא להפריע לתאים, אך במהירות מספיקה כדי שהתאים לא יתייבשו. השתמשו ב-200 µL עבור כל חצי של התא.

הניחו את המכסה על תא ה-insitu, ולאחר מכן הכניסו אותו למסילה. ודאו שלשוניות הקצה של התא נכנסות לחריצי המסילה על ידי דחיפת המסילה. הכניסו את התא למחזיק התאים.

לחצו על כפתור הפעימה (pulse) במקלדת מחולל הפעימות. נורית ה-LED במחולל הפעימות ובתושבת התא יהבהבו באדום במהלך תהליך האלקטרופורציה, ולאחר מכן יהבהבו בירוק כדי לציין שסבב ההפעלה הסתיים. משכו את המחוון חזרה אל מתחת לתושבת התא והוציאו את התא.

שאבו את רוב ה-Lucifer yellow כדי להשתמש בו שוב, אך היזהרו לא לייבש את התאים. הוסיפו DMEM ללא סידן. עם סרום שעבר דיאליזה, הסרום מסייע לסגירת הנקבים, והתא חוזר לאינקובטור כדי שתתרחש העברת ה-Lucifer yellow דרך צמתי פער (gap junctions).

התזמון חייב להיות עקבי בין ניסוי לניסוי. הסטנדרט הוא שלוש דקות. שפכו את המצע לכלי הפסולת.

הוסיפו תמיסת קיבוע של 4% formaldehyde באמצעות פסטור או פפיטה, והמתינו בטמפרטורת החדר למשך שתי דקות לפחות. שפכו את ה-formaldehyde ושטפו את התאים מספר פעמים ב-PBS; התאים מקובעים לזכוכית, ולכן קיים סיכון מועט להDetach שלהם במהלך השטיפה.

כדי שניתן יהיה לראות את התאים תחת ניגודיות פאזה (phase contrast), חשוב להניח כיסוי זכוכית על גבי התא. מלאו את התא ב-PBS כך שייווצר מניסקוס בולט. הניחו את כיסוי הזכוכית תוך הימנעות מבועות אוויר.

אל תדאגו אם ה-PBS גולש; פשוט ספגו את עודפי ה-PBS באמצעות טישיו. עליכם להשתמש במיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוך, רצוי עם ניגודיות מופע (phase contrast) ועם בלוק פילטרים עבור Lucifer yellow. תחת ניגודיות מופע, חפשו את קצה האזור שעבר אלקטרופורציה.

תראו שני קווים תחת פלואורסצנציה של תאים. מחצית מהסלייד תפלוורסנס בעוצמה. הקו הקרוב ביותר לתאים הזוהרים הוא קצה האזור שעבר אלקטרופורציה.

כל פלואורסצנציה מעבר לכך נובעת מהעברה של lucer yellow דרך צמתי פער (gap junctions). לדוגמה, תמונה זו של תאי אפיתל מראה תאים שעברו אלקטרופורציה בצד שמאל של התמונה, המעבירים Lucifer yellow לתאים שכנים שלא עברו אלקטרופורציה, ובכך יוצרים מדרג של תאים זוהרים מקצה הציפוי המוליך לכיוון ימין. תמונה זו מראה את אותו פריים של תאים תחת ניגודיות פאזה (phase contrast).

שימו לב שניתן לראות את קו ה-X בצורה ברורה מאוד. ניתן לבצע מדידה כמותית של מידת המעבר דרך צומתי הפערים (gap junctions) באופן ידני, על ידי עבודה עם תמונות הפלואורסצנציה וניגודיות הפאזה של התאים שעברו אלקטרופורציה. הכוכבים לאורך קצה האזור המוליך נחשבים לתאי תורם.

הם עברו אלקטרופורציה וספגו צבע צהוב חופשי. הם מעבירים את ה-luc הצהוב לתאים שכנים מימין, אשר מעבירים אותו הלאה. כך זה ממשיך למרחקים רחוקים יותר בכמויות פוחתות.

היחס בין הנקודות לכוכבים, 41 לשמונה במקרה זה, יכול להניב מספר להשוואת מידת ההרחבה של המעבר דרך צמתי פער (gap junctional transfer) במקרה זה. 5.1 הוא מדד צמתי הפער. חלופה לסימון וספירה ידנית של תאים היא שימוש בתוכנה לניתוח תמונות כדי למדוד את הכמויות היחסיות של הזוהר לאורך הצד הלא-נבחר של גבול תא שעבר אלקטרופורציה.

תאים אלו אינם בעלי צמתי פער (gap junctions). כאן נראה הקצה הימני של האזור שעבר אלקטרופורציה. שימו לב כי אין מדרג של פלואורסצנציה, מה שמעיד על היעדר צמתי פער תחת מיקרוסקופ ניגודיות פאזה.

ניתן לראות בבירור את כל התאים. שימו לב שגם קו ה-X נראה בבירור בדוגמה זו.

כל התאים בתא הגידול עוררו באמצעות גורם גדילה אפידרמלי EGF, ו10 דקות לאחר מכן קובעו ונבדקו לנוכחות של phospho arc. שימו לב כי התאים הצבועים מימין לא עברו אלקטרופורציה, והתאים משמאל עד לקו זה עברו אלקטרופורציה. התאים שלא עברו אלקטרופורציה מראים צביעה חומה עם נוגדן phospho irk ואימונו-פרוקסידאז.

התאים שעברו אלקטרופורציה אינם מראים צביעה, מכיוון שהפספו-פפטיד שעבר אלקטרופורציה חסם את דומיין ה-SSH two של grab two ועכב את הפספורילציה של EGF. שימו לב לאזור באורך של שלושה עד ארבעה תאים מימין לקו, שבו תאים שלא עברו אלקטרופורציה אינם מראים צביעה. אלו הם תאים שרכשו את הפפטיד החוסם משכניהם שעברו אלקטרופורציה באמצעות צמתי פער (gap junctions).

זוהי ההדגמה החזקה ביותר האפשרית לכך שעכבון האות חייב לנבוע מהפפטיד ולא יכול להיות תוצר לוואי של אלקטרופורציה. מכיוון שתאים אלה לא עברו אלקטרופורציה, זהו אותו פריים שהוצג בניגודי פאזה. שימו לב להיעדר כל שינוי במורפולוגיה לאחר האלקטרופורציה.

בחלק מהמטופלים ניתן למדוד באופן כמותי ומדויק את התקשורת באמצעות צומת פערים (gap junctional communication) במגוון רחב של תאים בתרבית. הכנסת פפטידים להפרעה של מסלולי איתות ספציפיים היא גישה רבת עוצמה להערכת הרלוונטיות בתאים חיים של חלבונים ואינטראקציות בין חלבונים שזוהו באמצעות חלבונים מנוקים. זה יכול להוות את השלב החשוב הראשון בפיתוח תרופות מבוססות פפטידום.