ביטוי של רקומביננטי Cellulase Cel5A מ Reesei Trichoderma בצמחים טבק

המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא לבטא חלבוני מטרה באופן זמני בטבק כדי לקבל מושג לגבי ההיתכנות של ביטוי אנזימים על בסיס צמחי במסגרת זמן קצרה. ביטוי חולף זה מושג על ידי חדירת עלי טבק עם זן של גידול אגרובקטריום פאין, המכיל וקטור המשלב את הגן המעניין כשלב שני לאחר הדגירה נקצרים עלי צמח חודרים ותמציות חלבון מטוהרות חלקית לקבלת תמיסת אנזים עובדת. בשלב הבא מבוצע ניתוח חלבון על מנת להעריך את השפעות הביטוי הצמחי על האנזים ולוודא את פעילותו האנזימטית.

מתקבלות תוצאות המראות גודל חלבון, השפעות גליקוזילציה אפשריות ופעילות אנזימטית על סמך מבחני Western Blotting, zy ופירוק סובסטרט. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח לגבי המרת ביומסה צמחית ויכולה גם לספק תובנה לגבי פעילות האנזימים לאחר ביטוי חולף בטבק. הדגמה ויזואלית של שיטה זו היא קריטית מכיוון שקשה ללמוד את שלבי ההסתננות בגלל שהעלים ניזוקים בקלות מבגדי המזרק ואני אבצע את הניסויים בתנאים סטריליים.

העבירו מושבות בודדות של agrobacterium toan לבקבוק ארלנמאייר המכיל 10 מיליליטר. מרק תמצית שמרים עם אנטיביוטיקה. לאחר מכן דגרו את המרק המחוסן למשך 36 עד 40 שעות בטמפרטורה של 26 מעלות צלזיוס עם ניעור של 180 סל"ד לאחר מכן, חסנו 200 מיקרוליטר מכל תרבית ב-20 מיליליטר של מרק תמצית שמרים עם אותה אנטיביוטיקה כמו קודם, ודגרו באותם תנאים לאחר 36 עד 40 שעות.

השרה את התרביות עם שני מיקרוליטרים של אצטופנון, 100 מיקרוליטר של תמיסת גלוקוז של 40% ו-200 מיקרוליטר של מאגר MES מולארי אחד ב-pH 5.6 והמשיכו לדגור למשך הלילה. כעת קחו את הצמחים מהחממה והשתמשו בקצה פיפטה כדי לחתוך את הצד הצירי AB של העלה השלישי עד החמישי מראש הצמח כדי להקל על החדירה. לאחר מכן מלאו מזרק במדיום הסתננות והניחו אותו על אחד החתכים שנעשו בעבר.

תמכו במזרק באצבע בצד עלה האקסיו והזריקו את המדיום בזהירות לאזור העלים התוך ורידי. כדי לדמיין את הקרינה בקטעי העלים המבטאים תא TR 5:00 בבוקר, דובדבן מאיר את הצמחים עם מקור אור נייד הפולט אור ירוק. במבט דרך מסנן אדום, הקרינה מתא TR 5:00 בבוקר דובדבן תיראה בבירור.

כדי לחלץ את החלבונים המבוטאים, בחר עלי טבק שחדרו עם AUM המכיל P מסלול תא ERTR חמש A וחתך אותם לחתיכות גרם אחד. לאחר מכן, הניחו אותם במכתש קירור מראש והוסיפו כמות מתאימה של חנקן נוזלי לדגימות. טוחנים את העלים לאבקה בעזרת עלי.

חזור על התהליך עם עלי טבק שלא הסתננו כדי לקבל דגימות בקרה. לאחר מכן הוסיפו שני מיליליטר של PBS המכילים מילי-מולרית אחת פניל מתיל סואן פלואוריד לחומר העלים הטחון וערבבו עד שרוב חומר העלים נמצא בתרחיף. צנטריפוגה את התמצית ב-15,000 GS למשך 20 דקות בארבע מעלות צלזיוס.

לאחר מכן השליכו את הגלולה, תא TR מטוהר חלקית 5 A על ידי דגירה של החלבון המכיל S natin ב-55 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות והניחו לו לנוח בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות נוספות. ואז צנטריפוגה SNAT ב -15, 000 GS למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. השליכו את הגלולה והשתמשו בחלבון המכיל סנאט לכולם.

בדיקות נוספות. בצע גם את תהליך הטיהור החלקי עבור צמחים שאינם חודרים כדי להשיג דגימות בקרה. בהליך זה מערבבים אתיל תאית ומים לקבלת תמיסה של 1.5% ודוגרים תוך ערבוב עד להמסה.

כדי להכין ג'ל עמוד A-C-M-C-S-D-S, החלף מיליליטר אחד של 1.5% CMC במיליליטר אחד של מים בתמיסת תערובת ג'ל של 10 מיליליטר SDS ושפוך את הג'ל כרגיל, לאחר מכן, דנטור את הדגימות על ידי הרתחתן בנוכחות SDS. בצע את האלקטרופורזה ב -200 וולט למשך 50 דקות עד שחזית הצבע מגיעה לתחתית הג'ל. כעת לבצע בקיפול חלבון ג'ל על הנקודה 15% C-M-C-S-D-S דף ג'ל.

שימוש ב-1.5% בטא ציקלודקסטרין במאגר פוספט ציטראט של 20 מילי-מולרי ב-pH 6.5. דגרו את הג'ל בתמיסה זו בטמפרטורת החדר עם ניעור עדין למשך 15 דקות. השליכו את תמיסת הבטא ציקלודקסטרין ושטפו לזמן קצר את הג'ל במים שהודגרו בטמפרטורת החדר במאגר נתרן אצטט של 50 מילי-מולרי ב-pH 4.8 למשך 15 דקות נוספות.

לאחר מכן בצע CMC zy באמצעות ג'ל הדף המקופל מחדש 15%C-M-C-S-D-S על ידי דגירה של הג'ל במאגר נתרן אצטט של 30 מילי-מולרי למשך 20 דקות ב-50 מעלות צלזיוס. כדי לדמיין היכן ה-CMC התכלה, יש לצבוע את הג'ל למשך 10 דקות באמצעות תמיסה אדומה של 0.1% קונגו ולעכב אותו באמצעות נתרן כלורי מולארי אחד למשך 30 דקות או עד שנצפו רצועות שקופות בסוף, שטפו את הג'ל עם 0.3% חומצה אצטית. להדמיה ברורה יותר מיד לפני הפעלת הבדיקה, הכן פיפטה של ארבעה MUC שני X של תמיסת עבודה של 100 מיקרוליטר של ארבעה תמיסת עבודה MUC לבארות נפרדות של צלחת 96 בארות.

לאחר מכן הוסף 100 מיקרוליטר מכל דגימה לבארות המתאימות תוך הפעלת כל דגימה בשלוש עותקים באמצעות אורך גל עירור של 360 ננומטר ואורך גל פליטה של 465 ננומטר. קבע את נקודת הזמן של דקה אפס של ארבע פלואורסצנטיות mu באמצעות ספקטרוסקופיה פלואורסצנטית. לאחר מכן, דגרו את הצלחות המכוסות במכסי דבק בטמפרטורה של 50 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות.

לאחר מכן, עצור את התגובה על ידי הקפאה. לאחר מכן, מדוד את הקרינה של נקודת הקצה באמצעות אותם פרמטרים כמו עבור נקודת הזמן של דקה אפס. הפחיתו את ערך הקרינה בדקה אפס מערך הקרינה ב-20 דקות כדי לקבוע את השינוי בקרינה הנגרם על ידי פעילות אנזימטית מיד לפני הפעלת הבדיקה.

הכן את פתרון העבודה A-O-C-M-C שני X. לאחר מכן שלבו 50 מיקרוליטר מהדגימה ו -50 מיקרוליטר מתמיסת העבודה בצינור של 1.5 מיליליטר. לאחר מכן, דגרו את הדגימות למשך 20 דקות בחום של 50 מעלות צלזיוס.

עצור את התגובה על ידי הוספת 250 מיקרוליטר תמיסת משקעים. לאחר מכן, מערבולת כל דגימה במרץ למשך 10 שניות כדי להבטיח ערבוב מלא של הדגימה עם תמיסת המשקעים. לאחר מכן דגרו את הדגימות בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות ומערבלו אותן שוב לפני שצנטריפוגה ב-1000 גרם למשך 10 דקות.

לאחר מכן העבירו 200 מיקרוליטר של ה- SNAT מכל דגימה לצלחת של 96 בארות מבלי להפריע. הפעילות האנזימטית של הגלולה מוצגת על ידי רמות גבוהות יותר של צבע מסיס. מדוד זאת באמצעות ספקטרוסקופיה סופגת באורך גל של 590 ננומטר.

בשלב זה. מניחים עיגולי נייר סינון בצינורות של 1.5 או 2 מיליליטר. הוסף 100 מיקרוליטר של נתרן אצטט 60 מילי-מולרי ו-100 מיקרוליטר דגימות לעיגולי נייר הסינון ודגירה למשך 20 שעות ב-50 מעלות צלזיוס עם טלטול של 300 סל"ד.

בנוסף, דגרו את הדגימות הבודדות ללא נייר סינון כבקרות מיד לפני הפעלת הבדיקה. הכן תמיסת עבודה של 1.5 x PABA המכילה מיליליטר אחד של תמיסת PBA A ותשעה מיליליטר של תמיסת PABA B.Store על קרח עד לשימוש. לאחר מכן, הכינו את הדגימות בצינורות תרמו יציבים של 0.5 מיליליטר.

הדגימות מורכבות מ-45 מיקרוליטר מים, חמישה מיקרוליטר מכל תמיסה מודגרת בנייר סינון ו-100 מיקרוליטר תמיסת עבודה PABA. לאחר מכן, הפעל את בקרות המדגם וחמישה תקנים שהוכנו באותו אופן. לאחר מכן דגרו את הדגימות, הבקרות והתקנים למשך 10 דקות בדיוק בחום של 100 מעלות צלזיוס ומצננים בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות נוספות.

פיפטה 100 מיקרוליטר של התמיסה לצלחת של 96 בארות בדיקה עם ספקטרופוטומטר באורך גל של 410 ננומטר. הפחיתו את ערכי בקרת הדגימה הבודדים מערכי דגימת נייר הסינון כדי לקבוע את כמות הסוכרים המפחיתים המשתחררים. הנה תמונה המציגה את קלטות הביטוי כמו גם את ביטוי החלבון בצמחי טבק.

כך נראה עלה טבק שחדר באור רגיל ותחת אור ירוק עם פילטר אדום שבו ביטוי של דובדבן תא TR 5:00 בבוקר המסומן על ידי הצבע האדום נראה כאן בבירור. עמוד SDS ג'ל מערבי ו- CMC zy המראים את הגודל והפעילות של תא T חמש A. סך החלבונים המסיסים הופרדו ואנו יכולים לדמיין אותם עם כתמים מערביים של כחול קומאסי כנגד אזור תג היסט של תא T 5 A מאשר את גודל החלבון ובנוסף פעילות הצלולאז כנגד CMC מוצגת על ידי קסנוגרפט צבוע באדום קונגו. מה שניתן לראות כאן הוא סך החלבונים המסיסים מעלי צמח הטבק שבהם תא TR 5 A התבטא באופן זמני לפני ואחרי טיהור משקעים תרמיים, כאשר תא TR 5 A הוא הפס הגדול ביותר הנראה לעין, והוא נראה גם במגרש המערבי ובגרף CMC.

אנו רואים גם את סך החלבונים המסיסים מצמחי טבק שבהם Tcell 5 A לא היה גם לאחר משקעים תרמיים ואת החלבונים מתערובת זמינה מסחרית של tresa cellulase. איור זה מציג את כימות פעילות האנזים של תא TR חמש A תא TR חמש A הודגר עם ארבעה MUC Azo CMC או נייר סינון, ופירוק המצע נמדד על ידי שחרור הפלואורו ארבע ארבע mu צבע האזו, או על ידי כימות הסוכרים המפחיתים משינוי הצבע של PBA בעקבות הליך זה. ניתן להשתמש בשיטות אחרות כמו מיקוד חלבון כדי לספק מידע נוסף על האופן שבו לוקליזציה של החלבון יכולה להשפיע על יציבות האנזים ופעילותו.

לאחר שצפית בסרטון זה, כעת אמורה להיות לך הבנה ברורה כיצד לבטא חלבונים באופן זמני לטבק, כמו גם ידע טוב כיצד להעריך פעילות אנזימטית. המרת ביומסה של תאית.