Name: ביטוי של רקומביננטי Cellulase Cel5A מ Reesei Trichoderma בצמחים טבק (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-06-13T15:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 5 s
Description: למדו להביע באופן חולף את האנזים Cel5A מ-Trichoderma reesei בצמחי טבק. שיטה זו מאפשרת ייצור מהיר של אנזימים לשימוש בהמרת ביומסה צמחית.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

עבודה זו נתמכה על ידי BMBF Forschungsinitiative &quot;BioEnergie 2021 - Forschung für למות Nutzung פון Biomasse&quot; והאשכול של אקסלנס &quot;דלקים תפורים מביומסה&quot;, אשר ממומן באמצעות יוזמת המצוינות על ידי הממשלות פדרליות ואת המדינה הגרמנית לקידום מדע ומחקר באוניברסיטאות גרמנית.

<ol><li>Garvey, M., Klose, H., Fischer, R., Lambertz, C., Commandeur, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellulases+for+biomass+degradation%3A+comparing+recombinant+cellulase+expression+platforms%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Cellulases for biomass degradation: comparing recombinant cellulase expression platforms.</a> Trends in Biotechnology. 31, 581-593 (2013).</li>
<li>Klose, H., Günl, M., Usadel, B., Fischer, R., Commandeur, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ethanol+inducible+expression+of+a+mesophilic+cellulase+avoids+adverse+effects+on+plant+development%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+for+Biofuels%22%5BJournal%5D)">Ethanol inducible expression of a mesophilic cellulase avoids adverse effects on plant development.</a> Biotechnology for Biofuels. 6, 53 (2013).</li>
<li>Klose, H., Röder, J., Girfoglio, M., Fischer, R., Commandeur, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyperthermophilic+endoglucanase+for+in+planta+lignocellulose+conversion%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+for+Biofuels%22%5BJournal%5D)">Hyperthermophilic endoglucanase for in planta lignocellulose conversion.</a> Biotechnology for Biofuels. 5, 63 (2012).</li>
<li>Sharma, A. K., Sharma, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plants+as+bioreactors%3A+recent+developments+and+emerging+opportunities%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+Advances%22%5BJournal%5D)">Plants as bioreactors: recent developments and emerging opportunities.</a> Biotechnology Advances. 27 (6), 811-832 (2009).</li>
<li>Tremblay, R., Wang, D., Jevnikar, A. M., Ma, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tobacco%2C+a+highly+efficient+green+bioreactor+for+production+of+therapeutic+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+Advances%22%5BJournal%5D)">Tobacco, a highly efficient green bioreactor for production of therapeutic proteins.</a> Biotechnology Advances. 28 (2), 214-221 (2010).</li>
<li>Lee, T. M., Farrow, M. F., Arnold, F. H., Mayo, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+structural+study+of+Hypocrea+jecorina+Cel5A%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Science%22%5BJournal%5D)">A structural study of Hypocrea jecorina Cel5A.</a> Protein Science. 20, 1935-1940 (2011).</li>
<li>Saloheimo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EGIII%2C+a+new+endoglucanase+from+Trichoderma+reesei%3A+the+characterization+of+both+gene+and+enzyme%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">EGIII, a new endoglucanase from Trichoderma reesei: the characterization of both gene and enzyme.</a> Gene. 63, 11-21 (1988).</li>
<li>Davidson, M. W., Campbell, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineered+fluorescent+proteins%3A+innovations+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Engineered fluorescent proteins: innovations and applications.</a> Nature Methods. 6, 713-717 (2009).</li>
<li>Pelham, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+retention+signal+for+soluble+proteins+of+the+endoplasmic+reticulum%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biochemical+Sciences%22%5BJournal%5D)">The retention signal for soluble proteins of the endoplasmic reticulum.</a> Trends in Biochemical Sciences. 15, 483-486 (1990).</li>
<li>Béguin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+cellulase+activity+in+polyacrylamide+gels+using+Congo+red-stained+agar+replicas%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Detection of cellulase activity in polyacrylamide gels using Congo red-stained agar replicas.</a> Analytical Biochemistry. 131, 333-336 (1983).</li>
<li>Jørgensen, H., Mørkeberg, A., Krogh, K. B. R., Olsson, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+and+enzyme+production+by+three+Penicillium+species+on+monosaccharides%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Growth and enzyme production by three Penicillium species on monosaccharides.</a> Journal of Biotechnology. 109, 295-299 (2004).</li>
<li>Lever, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+reaction+for+colorimetric+determination+of+carbohydrates%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">A new reaction for colorimetric determination of carbohydrates.</a> Analytical Biochemistry. 47, 273-279 (1972).</li>
<li>Maclean, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+human+papillomavirus+type+16+%28HPV-16%29+L1+expression+in+plants%3A+comparison+of+the+suitability+of+different+HPV-16+L1+gene+variants+and+different+cell-compartment+localization%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+General+Virology%22%5BJournal%5D)">Optimization of human papillomavirus type 16 (HPV-16) L1 expression in plants: comparison of the suitability of different HPV-16 L1 gene variants and different cell-compartment localization.</a> Journal of General Virology. 88, 1460-1469 (2007).</li>
<li>Munro, S., Pelham, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+C-terminal+signal+prevents+secretion+of+luminal+ER+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A C-terminal signal prevents secretion of luminal ER proteins.</a> Cell. 48, 899-907 (1987).</li>
<li>Laemmli, U. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cleavage+of+structural+proteins+during+the+assembly+of+the+head+of+bacteriophage+T4%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4.</a> Nature. 227, 680-685 (1970).</li>
<li>Burnette, W. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%E2%80%9CWestern+Blotting%E2%80%9D%3A+Electrophoretic+transfer+of+proteins+from+sodium+dodecyl+sulfate-polyacrylamide+gels+to+unmodified+nitrocellulose+and+radiographic+detection+with+antibody+and+radioiodinated+protein+A%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">“Western Blotting”: Electrophoretic transfer of proteins from sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gels to unmodified nitrocellulose and radiographic detection with antibody and radioiodinated protein A.</a> Analytical Biochemistry. 112, 195-203 (1981).</li>
<li>Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elelctrophoretic+transfer+of+proteins+from+polyacrylamide+gels+to+nitrocellulose+sheets+-+procedure+and+some+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Elelctrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets - procedure and some applications.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76, 4350-4354 (1979).</li>
<li>Blake, M. S., Johnston, K. H., Russell-Jones, G. J., Gotschlich, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid%2C+sensitive+method+for+detection+of+alkaline+phosphatase-conjugated+anti-antibody+on+Western+blots%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">A rapid, sensitive method for detection of alkaline phosphatase-conjugated anti-antibody on Western blots.</a> Analytical Biochemistry. 136, 175-179 (1984).</li>
<li>Yamamoto, E., Yamaguchi, S., Nagamune, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+%CE%B2-cyclodextrin+on+the+renaturation+of+enzymes+after+sodium+dodecyl+sulfate%E2%80%93polyacrylamide+gel+electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Effect of β-cyclodextrin on the renaturation of enzymes after sodium dodecyl sulfate–polyacrylamide gel electrophoresis.</a> Analytical Biochemistry. 381, 273-275 (2008).</li>
<li>Fischer, R., Vaquero-Martin, C., Sack, M., Drossard, J., Emans, N., Commandeur, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Towards+molecular+farming+in+the+future%3A+transient+protein+expression+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+and+Applied+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Towards molecular farming in the future: transient protein expression in plants.</a> Biotechnology and Applied Biochemistry. 30 (2), 113-116 (1999).</li>
<li>Sammond, D. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellulase+linkers+are+optimized+based+on+domain+type+and+function%3A+Insights+from+sequence+analysis%2C+biophysical+measurements%2C+and+molecular+simulation%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Cellulase linkers are optimized based on domain type and function: Insights from sequence analysis, biophysical measurements, and molecular simulation.</a> PLoS One. 7, (2012).</li>
<li>Boonvitthya, N., Bozonnet, S., Burapatana, V., O'Donohue, M. J., Chulalaksananukul, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+the+heterologous+expression+of+Trichoderma+reesei+endoglucanase+II+and+cellobiohydrolase+II+in+the+yeasts+Pichia+pastoris+and+Yarrowia+lipolytica%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Comparison of the heterologous expression of Trichoderma reesei endoglucanase II and cellobiohydrolase II in the yeasts Pichia pastoris and Yarrowia lipolytica.</a> Molecular Biotechnology. 54, 158-169 (2013).</li>
</ol>

יש המחברים אין לחשוף.

ביטוי רקומביננטי של cellulases הוא תחום עניין רב, בשל הרצון למערכות ייצור דלק ביולוגי יעילים יותר 1. צמחים מציעים אפשרויות רבות לייצור cellulase מוצלח, עם תכונות כגון טכניקות קצירה כלכלית ושיטות autohydrolysis להיות תכונות רצויות מאוד לייצור דלק ביולוגי בקנה מידה גדולה. יתר על כן, השימוש בגרסות מגוירים שונות לייצור חלבונים לאפשר, שינויים במידת צורך, posttranslational 20. שינוי צמחים כדי לאפשר ביטוי מכונן של cellulases, תוך שהיא מציעה יתרונות ברורים, היא שיטת ...

<html> השפלה של ביומסה lignocellulosic והמרתו לדלק נוזלי כבר חזתה כשיטת להפחתת תלות בדלקים מאובנים. המשוכה משמעותית אחד בהקמת מערכות לעיבוד ביומסה מבחינה כלכלית היא בשפלה האנזימטית של תאית hemicellulose 1. מערכות ביטוי צמח מראות פוטנציאל גדול לייצור של אנזימים בקנה מידה תעשייתי. מערכות חקלאיות לצמחי יבול מבחינה כלכלית ובנפח כבר הוקמו, כפי שהם היו במשך אלפי שנים. הייצור של cellulases בצמחים רצוי בשל גורמים כמו קלות autohydrolysis 2, ואת הפוטנציאל למקסם את השימוש ברמות אנזים נמוכים יותר על ידי הגדלת הנעכלות של קירות תא צמח 1. לבסוף, מערכות מפעל מאפשרות את המיקוד של חלבונים רקומביננטי לאזורים הספציפיים של תאי צמח והם מסוגלים לשנות posttranslationally אנזימים שבו נדרשו 3. ve_content &quot;&gt; tabacum Nicotiana (טבק) מאוד נפוץ כאורגניזם מודל ללימודי ביטוי חלבון Heterologous בצמחים, בשל תכונותיה צמיחה המהירה וביומסה הצטברות 4. ביטוי חולף של חלבונים רקומביננטיים הוא טכניקה המאפשרת ייצור חלבון בתקופות זמן קצר 5, תוך שמירה על גמישות כמו ללוקליזציה ולכן שינויי posttranslational של החלבונים שנבחרו, כלומר cellulases. זה מאפשר הייצור של cellulase (ים) לניתוח בסיסי, גם בעת הנחת התשתית לאסטרטגיות ביטוי נוספות בצמחים. משתמש באסטרטגית ביטוי חולפת כאלה, endoglucanase ממשפחת glycosyl hydrolase 5, Cel5A, הנגזרת מהמארח פטרייתי Trichoderma reesei (jecorina Hypocrea) 6 מופק (להלן כTrCel5A). TrCel5A הוא חלבון 42 kDa אשר glycosylated באופן מקורי, והוא פעיל מאוד בHYDroylzing רשתות תאית 7. טכניקת הביטוי חולפת המתוארת כאן מבוססת על מערכת יחסית נפוץ, שחדרו לעלי הצמח עם Agrobacteria נושא את הגן של עניין בוקטור ביטוי מתאים. כדי לאפשר ניתוח מהיר של הצלחה בביטוי Planta, TrCel5A יכול גם לבוא לידי ביטוי חלבון היתוך עם mCherry, חלבון פלואורסצנטי monomeric נגזר במקור sp Discosoma. חלבון DsRed 8, עם שאריות נוספות שש היסטידין (שלו תג) התמזגו C-הסופית (TrCel5A-mCherry). ביטוי של חלבון Heterologous ההיתוך, TrCel5A-mCherry, ובכך תוכל להיות במעקב במסגרת גידול הצמחים על ידי שימוש באור ירוק לבחון פיזור mCherry. אם תרצה, סעיפים דקים של החומר הצמחי יכולים להיבחן תחת אור הירוק במיקרוסקופ כדי לקבוע את הלוקליזציה מסוימת של החלבון. לשם כך עבודה, אות וטראןפפטידים לשבת שולבו במבנה, בתרגום יצוא חלבון Heterologous לreticulum endoplasmic 9. כדי לנתח את הפעילות של cellulases הצמח בא לידי ביטוי, ביניהם TrCel5A, מספר בדיקות פעילות cellulase ניתן להפעיל. לאחר המיצוי של החלבונים הצמחיים המסיסים בסך הכל, TrCel5A יכול להיות מטוהר באופן חלקי באמצעות טכניקת דגירה תרמית. גודל חלבון הוקם באמצעות SDS-PAGE ואחריו מערבי סופג. Zymography יכול לשמש גם כדי לנתח את הפעילות נגד מצעים, למשל תאית אשר כבר-מפוגל carboxy (מה שהופך את תאית carboxymethyl: CMC) למסיסות 10. פעילות Cellulase וglucosidase ניתן לנטר באמצעות fluorophore 4-methylumbelliferyl (4-MU) הקשורים β-D-cellobioside (בשילוב: 4-MUC). שיטה נוספת להערכת פעילות endoglucanase כרוכה ניתוח spectrometric של CMC שנקשר עם אזו דאתם (Remazolbrilliant הכחול R) 11. בנוסף, פעילות חלבון של שני endoglucanases ומגוון של cellulases יכולה להיות פיקוח על ידי שימוש במבחן ניתוח סוכר, כגון hydrazide p-הידרוקסי benzoic החומצה (PAHBAH) assay 12. טכניקות אלה יכולים לשמש כדי להבהיר ולכמת את הפעילות של cellulase הביע עניין.

<table><tbody><tr><td>4-methylumbelliferyl &beta;-D-cellobioside</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>M6018</td><td></td></tr><tr><td>חומצה אצטית</td><td>ROTH</td><td>3738</td><td></td></tr><tr><td>אצטוסירינגון (מרוכז)</td> <td>ROTH</td><td>6003</td><td></td></tr><tr><td>אנטיביוטיקה - קנמיצין</td><td>ROTH</td><td>T832</td><td></td></tr><tr><td>אנטיביוטיקה - ריפמפיצין</td><td>ROTH</td><td>4163</td><td></td></tr><tr><td>אנטיביוטיקה - קרבניצילין</td><td>ROTH</td><td>6344</td><td></td></tr><tr><td>נוגדן - ארנב אנטי His(6) pAb</td><td>ROCKLAND</td><td>600-401-382</td><td></td></tr><tr><td>נוגדן - עז אנטי ארנב AP, FC pAb</td><td>DIANOVA</td><td>111-055-008</td><td></td></tr><tr><td>אזו-קרבוקסימתיל צלולוז</td><td>MEGAZYME</td><td>S-ACMC</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-ציקלודקסטרין</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>C4805</td><td></td></tr><tr><td>סידן כלוריד דיהידרט</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>C5080</td><td></td></tr><tr><td>Carboxymethyl cellulose</td><td>ROTH</td><td>3333.1</td><td></td></tr><tr><td>צלולאז מTrichoderma reesei ATCC 26921</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>C2730</td><td></td></tr><tr><td>אדום קונגו</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>75768</td><td></td></tr><tr><td>Coomasie כחול מבריק G 250</td><td>ROTH</td><td>9598.2</td><td></td></tr><tr><td>D(+)-גלוקוז</td><td>ROTH</td><td>8337</td><td></td></tr><tr><td>אתנול</td><td>ROTH</td><td>K928</td><td></td></tr><tr><td>נייר סינון - נייר ספיגה Rotilabo ROTH</td><td></td><td>CL67</td><td></td></tr><tr><td>NBT/BCIP</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>72091</td><td></td></tr><tr><td>MES buffer</td><td>ROTH</td><td>4256</td><td></td></tr><tr><td>מתנול</td><td>ROTH</td><td>8388</td><td></td></tr><tr><td>נתרן ציטראט</td><td>ROTH</td><td>3580</td><td></td></tr><tr><td>נתרן dodecylsulfate</td><td>SERVA</td><td>20765</td><td></td></tr><tr><td>נתרן הידרוקסיד</td><td>ROTH</td><td>6771</td><td></td></tr><tr><td>אדמה, Einheitserde קלאסי&nbsp;</td><td>ספקטרומטר PATZER GMBH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>- אינפיניטי M200</td><td>TECAN</td><td></td><td></td></tr><tr><td>סוכרוז</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>S-5390</td><td></td></tr><tr><td>4-הידרוקסי בנזהידרזיד&nbsp;</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>H9882</td><td></td></tr><tr><td>תמיסת מלח חוצצת פוספט</td><td>ROTH</td><td>1058</td><td></td></tr><tr><td>מקור אור UV - BLAK RAY</td><td>UVP</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vibratome - VT1000S</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

ביטוי של רקומביננטי cellulase cel5a מ<em&gt; reesei trichoderma</em&gt; בצמחים טבק

Expression of Recombinant Cellulase Cel5A from Trichoderma reesei in Tobacco Plants

אנזימים משפילים תאית, cellulases, הם מטרות של שניהם אינטרסים תעשייתיים מחקר ו. העליונות של אנזימים אלה באורגניזמים קשים לתרבות, כגון פטריות העובש בנייה וחיידקים אנאירוביים, שהחישה את השימוש בטכנולוגיות רקומביננטי בתחום זה. שיטות ביטוי צמח הן מערכת רצויה לייצור בקנה מידה גדולה של אנזימים וחלבונים באופן תעשייתי שימושיים אחרים. בזאת, שיטות לביטוי החולף של endoglucanase פטרייתי, Trichoderma reesei Cel5A, בNicotiana tabacum הם הפגינו. ביטוי חלבון מוצלח מוצג, פיקוח על ידי הקרינה באמצעות חלבון היתוך mCherry-אנזים. בנוסף, סדרה של בדיקות בסיסיות המשמשות לבחון את הפעילות של ט &#39;הביע transiently reesei Cel5A, כולל-SDS, מערבי סופג, zymography, כמו גם הקרינה ומבחני השפלה מצע מבוסס צבען. המערכת המתוארת כאן יכולה לשמש לייצור תא פעילulase בתקופת זמן קצר, על מנת להעריך את הפוטנציאל לייצור נוסף במפעלים באמצעות מערכות ביטוי מכוננות או מושרה.

TrCel5A וTrCel5A-mCherry באו לידי ביטוי בהצלחה בצמחי טבק באמצעות מערכת חולפת הביטוי (איורים 1 א ו 1 ב &#39;). בחינה של דפוס הביטוי של חלבון היתוך TrCel5A-mCherry חשפה עלים בריאים (איור 1 ג), אשר הראה ביטוי חלבון נרחב תחת אור הירוק (1D איור). מיצוי של החלבונים המסיסים בסך הכל בוצע בצמחי טבק שהיו עלים שהכילו הביע transiently חלבון TrCel5A ו- SDS הר...

צמחי טבק ששימשו להפקת cellulase פטרייתי, TrCel5A, באמצעות מערכת ביטוי חולפת. הביטוי יכול להיות במעקב באמצעות חלבון היתוך ניאון, ופעילות החלבון התאפיינה הודעה ביטוי.

ביטוי של רקומביננטי Cellulase Cel5A מ<em&gt; Reesei Trichoderma</em&gt; בצמחים טבק

Cellulose degrading enzymes, cellulases, are targets of both research and industrial interests. The preponderance of these enzymes in difficult-to-culture ...

המטרה הכללית של הניסוי הבא היא לבטא חלבונים מטרת באופן זמני בטבק, כדי להעריך את ההיתכנות של ביטוי אנזימים במערכת צמחית בפרק זמן קצר. ביטוי זמני זה מושג על ידי חלחול של זן של Agrobacterium tumefaciens לעלי טבק, המכיל וקטור המטמיע את הגן המבוקש. כשלב שני, לאחר הדגירה, קוצרים את עלי הצמח שחולחלו ומנקים חלקית תמריתי חלבון כדי לקבל תמיסת אנזים פעילה. לאחר מכן, מבוצע ניתוח חלבונים במטרה להעריך את השפעות הביטוי במערכת צמחית על האנזים ולאמת את פעילותו האנזימטית.התוצאות המתקבלות מראים את גודל החלבון, השפעות אפשריות של גליקוזילציה ואקטיביות אנזימטית, בהתבסס על Western blotting, בדיקות zy ובדיקות פירוק סובסטרט. שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בנוגע להמרה של ביומסה צמחית, וכן לספק תובנות לגבי פעילותם של אנזימים לאחר ביטוי זמני בטבק. הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית, שכן שלבי ההסננה קשים ללמידה עקב נטיית העלים להינזק בקלות על ידי המזרק, והניסויים יבוצעו תחת תנאים סטריליים.העבר מושבות בודדות של agrobacterium לבקבוק ארלנמאייר המכיל 10 milliliters של תרשומת תמצית שמרים (Yeast extract broth) עם אנטיביוטיקה. לאחר מכן, דגרו את התרשומת המอดูמה למשך 36 עד 40 שעות בטמפרטורה של 26 degrees Celsius עם ניעור במהירות של 180 RPM. בשלב הבא, הפיקו 200 microliters מכל תרבית והוסיפו אותם ל-20 millilit

expression-recombinant-cellulase-cel5a-from-trichoderma-reesei

Research

JoVE Journal

Environment

סביבה

אנו מתארים עלות נמוכה, גבוה שיטת התפוקה למסך לפעילות endoglucanase פטרייתי...

הקרנת תפוקה גבוהה של פעילות Endoglucanase פטרייתיים ב Escherichia coli</em

צמחים מציעים מערכת חדשנית לייצור של חלבוני תרופות בהיקף מסחרי, כי הוא יותר ניתן להרחבה, יעיל וחסכונית ובטוחה יותר מפרדיגמות ביטוי הנוכחיות. במחקר זה, אנו מדווחים גישה פשוטה ונוחה, אך ניתן להרחבה להציג את היעד של גן...

Agroinfiltration היעילה של צמחים לביטוי חולף ברמה גבוהה של חלבונים רקומביננטי

ייצור חלוף חלבון בצמחי Nicotiana מבוססים על חדירת אבק עם Agrobacteria ביצוע וקטורי השקה (מבוסס נגיף פסיפס טבק) הוא גישה מהירה וכלכלית להפקת אנטיגנים חיסון וחלבונים טיפוליים. אנחנו פישטנו את ההליך ושיפור בהצטברות יעד על ידי אופטימיזציה של תנאי גידול חיידקים, בחירת מין מארח, ושיתוף מציג מדכאי RNA השתקה.

אופטימיזציה וניצול<em&gt; Agrobacterium</emייצור חלבון חלוף&gt; בתיווך ב<em&gt; Nicotiana</em

אנו מתארים עיצוב של גישת ניסויים שיכולים לשמש כדי לקבוע ולעצב את ההשפעה של אלמנטי transgene רגולציה, פרמטרים גדילה והתפתחות צמח, ותנאי דגירה על הביטוי החולף של נוגדנים חד שבטיים וחלבונים כתב בצמחים.

אפיון של מערכות מורכבות באמצעות העיצוב של גישת ניסויים: ביטוי חלבון חלוף בטבק כמקרה מבחן

עבודה זו מתארת ​​את שיטה חדשה למיקוד סלקטיבי אברונים subcellular בצמחים, assayed באמצעות BioRad ג'ין האקדח.

ביטוי גנים חולף בטבק באמצעות גיבסון הרכבה והאקדח הגן

היווצרות של קומפלקסי חלבוני in vivo ניתן דמיינו ידי שלמת הקרינה bimolecular. שותפי אינטראקציה הם התמזגו לחלקי משלימים של תגי ניאון והביעו transiently בי טבק, וכתוצאה מכך אות ניאון מחדש על סמיכות של שני חלבונים.

חלבונים אינטראקציות דמיינו ידי bimolecular הקרינה complementation בProtoplasts הטבק ועלים

במחקר זה הושווה ביטוי של חלבון רקומביננטי אנושי מטרה בפלטפורמות ייצור שונות. התמקדנו בתרבויות מסורתיות מבוססות תסיסה ובצמחים, תיארנו את ההגדרה של כל מערכת והדגשנו, על בסיס התוצאות המדווחות, את המגבלות והיתרונות הגלומים בכל פלטפורמה.

ניתוח השוואתי של ביטוי חלבון רקומביננטי בBiofactories שונה: חיידקים, תאי חרקים וצמחי מערכות

ברמה התת-תאית, אירועי איתות מווסתים באופן דינמי על ידי רמזים התפתחותיים וסביבתיים. כאן אנו מתארים פרוטוקול המשתמש במערכת הביטוי החולפת של הטבק כדי לנטר אינטראקציה דינמית של חלבון-חלבון ולחשוף ארגון מרחבי של העברת אותות בתאי צמחים.

הדמית ארגון מחדש מרחבית של מסלול איתות MAPK שימוש במערכת הביטוי החולפת הטבק

פיתחנו שיטה לביטוי בשיתוף מספר חלבונים chimeric פיוז'ן פלורסנט בצמחים כדי להתגבר על הקשיים של שיטות קונבנציונליות. זה לוקח את היתרון שבשימוש של פלסמיד ביטוי יחיד המכיל מספר חלבון פונקציונלית עצמאית המבטאת קלטות כדי להשיג חלבון ביטוי משותף.

ביטוי משותף של מספר חלבונים Chimeric פיוז'ן פלורסנט בדרך יעילה בצמחים

הביטוי heterologous ארעי של אנזימים biosynthetic הוחלף נגזר benthamiana טבק העלים להסיט אספקה אנדוגני של 2, 3-oxidosqualene לעבר הייצור של מוצרים בעלי ערך גבוה טריטרפן חדשים. בזאת הוא תיאר נוהל מפורט לייצור מיכשור וציוד בקנה מידה מהירה (5 ימים) של triterpenes, תחליפי ניצול פלטפורמה חזקה זו מבוססת על צמחים.

ארעי ביטוי טבק Benthamiana משאיר לייצור טריטרפן בקנה מידה מפוח

כאן, אנו מציגים את הפרוטוקולים עבור ניצול של חרקים תא baculovirus חלבון ביטוי ומערכת לייצר כמויות גדולות של חלבונים צמח מופרש על התגבשות חלבון. וקטור ביטוי baculovirus השתנה עם GP67 או hemolin חרקים פפטיד אות לביטוי הפרשת חלבון צמחי בתאי חרקים.

שינוי Baculovirus וקטורים ביטוי לייצר מופרש צמח חלבונים בתאי חרקים

למדו להביע באופן חולף את האנזים Cel5A מ-Trichoderma reesei בצמחי טבק. שיטה זו מאפשרת ייצור מהיר של אנזימים לשימוש בהמרת ביומסה צמחית.

ביטוי של רקומביננטי Cellulase Cel5A מ

גלה סרטונים נוספים