ביטוי של רקומביננטי Cellulase Cel5A מ

המטרה הכללית של הניסוי הבא היא לבטא חלבונים מטרת באופן זמני בטבק, כדי להעריך את ההיתכנות של ביטוי אנזימים במערכת צמחית בפרק זמן קצר. ביטוי זמני זה מושג על ידי חלחול של זן של Agrobacterium tumefaciens לעלי טבק, המכיל וקטור המטמיע את הגן המבוקש. כשלב שני, לאחר הדגירה, קוצרים את עלי הצמח שחולחלו ומנקים חלקית תמריתי חלבון כדי לקבל תמיסת אנזים פעילה. לאחר מכן, מבוצע ניתוח חלבונים במטרה להעריך את השפעות הביטוי במערכת צמחית על האנזים ולאמת את פעילותו האנזימטית.

התוצאות המתקבלות מראים את גודל החלבון, השפעות אפשריות של גליקוזילציה ואקטיביות אנזימטית, בהתבסס על Western blotting, בדיקות zy ובדיקות פירוק סובסטרט. שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בנוגע להמרה של ביומסה צמחית, וכן לספק תובנות לגבי פעילותם של אנזימים לאחר ביטוי זמני בטבק. הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית, שכן שלבי ההסננה קשים ללמידה עקב נטיית העלים להינזק בקלות על ידי המזרק, והניסויים יבוצעו תחת תנאים סטריליים.

העבר מושבות בודדות של agrobacterium לבקבוק ארלנמאייר המכיל 10 milliliters של תרשומת תמצית שמרים (Yeast extract broth) עם אנטיביוטיקה. לאחר מכן, דגרו את התרשומת המอดูמה למשך 36 עד 40 שעות בטמפרטורה של 26 degrees Celsius עם ניעור במהירות של 180 RPM. בשלב הבא, הפיקו 200 microliters מכל תרבית והוסיפו אותם ל-20 milliliters של תרשומת תמצית שמרים עם אותה אנטיביוטיקה כפי שנעשה קודם, ודגרו באותם תנאים למשך 36 עד 40 שעות.

השרו את התרביות בעזרת 2 µL של acetophenone, 100 µL של תמיסת glucose בריכוז 40% ו-200 µL של MES buffer בריכוז 1 M ב-pH 5.6 והמשיכו לדגירה למשך הלילה. כעת הוציאו את הצמחים מהחממה והשתמשו בקצה של פ pipette כדי לחרוץ את הצד ה-AB axial של העלה השלישי עד החמישי מהחלק העליון של הצמח כדי להקל על החלחול. לאחר מכן, מלאו מזרק בתסריע חלחול והניחו אותו על אחד החריצים שבוצעו קודם לכן.

תמכו את המזרק בעזרת אצבע בצדו של העלה בציר (axio), והזריקו את המצע בזהירות לאזור הוורידי של העלה. כדי להנמיש את הפלואורסצנציה בחתכי העלה המבטאים TR cell 5:00 AM cherry, האירו את הצמחים באמצעות מקור אור נייד הפולט אור ירוק. כאשר צופים דרך פילטר אדום, הפלואורסצנציה של TR cell 5:00 AM cherry תהיה נראית בבירור.

כדי למצות את החלבונים המבטאים, בחרו עלי טבק שהוחדרו ב-AUM המכיל P track ERTR cell five A וחתכו אותם לחתיכות במשקל של 1 g. לאחר מכן, הניחו אותם במכתש שקולל מראש והוסיפו לדגימות כמות מתאימה של חנקן נוזלי. גרסו את העלים לאבקה באמצעות עלי.

חזור על התהליך עם עלי טבק שלא עברו אינפילטרציה כדי לקבל דגימות ביקורת. לאחר מכן, הוסף 2 mL של PBS המכיל 1 mM phenyl methyl suen fluoride לחומר העלה הטחון וערבב עד שמרבית חומר העלה נמצא בתליה. סבב את התמצית בצנטריפוגה ב-15,000 ×g למשך 20 דקות ב-4 °C.

לאחר מכן השליכו את המשקע, וטהרו חלקית את תאי ה-TR cell five A על ידי דגירה של ה-S natin המכיל חלבון בטמפרטורה של 55 °C למשך 10 דקות, ולאחר מכן הניחו לו לנוח בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות נוספות. לאחר מכן, צנטריפוגו את ה-SNAT במהירות של 15,000 ×g למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. השליכו את המשקע והשתמשו ב-snat המכיל חלבון להמשך.

בדיקות נוספות. בצעו גם את תהליך הניקוי החלקי עבור צמחים שלא עברו אינפילטרציה כדי להשיג דגימות ביקורת. בהליך זה, ערבבו ethyl cellulose ומים כדי להגיע לתמיסה בריכוז 1.5% והדגירו עם ערבוב עד להמסה מלאה.

כדי להכין ג'ל A-C-M-C-S-D-S page, החליפו מיליליטר אחד של 1.5%CMC במיליליטר אחד של מים בתוך תמיסת תערובת לג'ל SDS page בנפח 10 מיליליטר, ויצקו את הג'ל כרגיל. לאחר מכן, דנטורו את הדגימות על ידי הרתחתן בנוכחות SDS. בצעו את האלקטרופורזה ב-200 וולט למשך 50 דקות, עד שחזית הצבע תגיע לתחתית הג'ל. כעת בצעו קיפול מחדש של חלבונים בתוך הג'ל (in gel protein refolding) על ג'ל 15%C-M-C-S-D-S page.

השתמשו ב-1.5% beta cyclodextrin בבופר פוספט-ציטראט 20 millimolar ב-pH 6.5. דגרו את הג'ל בתמיסה זו בטמפרטורת החדר עם ניעור עדין למשך 15 דקות. השליכו את תמיסת ה-beta cyclodextrin ושטפו קצרות את הג'ל במים, ולאחר מכן דגרו בטמפר סודיום אצטט 50 millimolar ב-pH 4.8 למשך 15 דקות נוספות בטמפרטורת החדר.

לאחר מכן בצע CMC zy באמצעות ג'ל 15%C-M-C-S-D-S שעבר קיפול מחדש על ידי דגירה של הג'ל בבफर סודיום אצטט 30 millimolar למשך 20 דקות בטמפרטורה של 50 degrees Celsius. כדי להדגים את המקומות שבהם ה-CMC התפרק, צבע את הג'ל למשך 10 דקות באמצעות תמיסת Congo red בריכוז 0.1% ובצע הסרת צבע באמצעות סודיום כלוריד בריכוז one molar למשך 30 דקות או עד להופעת פסים ברורים; בסיום, שטוף את הג'ל עם acetic acid בריכוז 0.3%. לצורך דימות ברור יותר מיד לפני הרצת הבדיקה, הכן תמיסת עבודה דו-פיות (two X) של four MUC; העבר באמצעות פיפטה 100 microliters של תמיסת העבודה four MUC לבארות נפרדות בלוחית 96 well plate.

לאחר מכן, הוסיפו 100 µL מכל דגימה לבארים המתאימות, כאשר כל דגימה מורוצה בשלוש חזרות (triplicate), תוך שימוש באורך גל עירור של 360 nm ובאורך גל פליטה של 465 nm. קבעו את נקודת הזמן של דקה אפס עבור פלואורסצנציית mu באמצעות ספקטרוסקופיה פלואורסצנטית. לאחר מכן, הדגירו את הפלטות כשהן מכוסות במכסים דביקים בטמפרטורה של 50 °C למשך 20 דקות.

לאחר מכן, עצור את התגובה באמצעות הקפאה. לאחר מכן, מדוד את פלואורסצנציית ה-mu בנקודת הסיום תוך שימוש באותם פרמטרים ששימשו עבור נקודת הזמן של דקה אפס. הפחית את ערך הפלואורסצנציה בדקה אפס מערך הפלואורסצנציה לאחר 20 דקות כדי לקבוע את השינוי בפלואורסצנציה שנגרם כתוצאה מפעילות אנזימטית מיד לפני ביצוע הבדיקה.

הכינו תמיסת עבודה בריכוז 2X של A-O-C-M-C. לאחר מכן, ערבבו 50 µL מהדגימה ו-50 µL מתמיסת העבודה במבחנה של 1.5 mL. לאחר מכן, הדגירו את הדגימות למשך 20 דקות בטמפרטורה של 50 °C.

עצרו את התגובה על ידי הוספת 250 µL של תמיסת שקיעה. לאחר מכן, ערבלו כל דגימה ב-vortex בעוצמה למשך 10 שניות כדי להבטיח ערבוב מלא של הדגימה עם תמיסת השקיעה. לאחר מכן, הדגירו את הדגימות בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות וערבלו אותן שוב ב-vortex לפני סבב צנטריפוגה ב-1000 Gs למשך 10 דקות.

לאחר מכן, העבירו 200 µL של ה-SNAT מכל דגימה לצלחת 96 בארות מבלי להפריע למשקע. הפעילות האנזימטית של המשקע באה לידי ביטוי ברמות גבוהות יותר של צבע מומס. מדדו זאת באמצעות ספקטרוסקופיית בליעה באורך גל של 590 nm.

בשלב זה, יש להניח עיגולי נייר סינון לתוך מבחנות של 1.5 או 2 מיליליטר. יש להוסיף לעיגולי נייר הסינון 100 µL של sodium acetate בריכוז 60 mM ו-100 µL של דגימות, ולדגור למשך 20 שעות בטמפרטורה של 50 °C תוך ניעור במהירות של 300 RPM.

בנוסף, דגרו את הדגימות הבודדות ללא נייר סינון כביקרות מיד לפני ביצוע הבדיקה. הכינו תמיסת עבודה של 1.5 x PABA המכילה מיליליטר אחד של תמיסת PABA A ותשעה מיליליטרים של תמיסת PABA B. שמרו על קרח עד לשימוש. לאחר מכן, הכינו את הדגימות באנבונות עמידות לחום בנפח 0.5 מיליליטר.

הדגימות מורכבות מ-45 µL מים, חמישה µL מכל תמיסה שדגרה עם נייר מסנן ו-100 µL של תמיסת עבודה של PABA. לאחר מכן, הרץ את בקרות הדגימה וחמישה סטנדרטים שהוכנו באופן דומה. לאחר מכן דגור את הדגימות, הבקרות והסטנדרטים למשך 10 דקות בדיוק ב-100 °C וקרר בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות נוספות.

העבירו בפיפטה 100 µL מהתמיסה ללוח 96 בארות ובצעו מדידה בספקטרופוטומטר באורך גל של 410 nm. החסירה את ערכי הבקרה של כל דגימה מהערכים של דגימות נייר המסנן כדי לקבוע את כמות הסוכרים המפריזרים ששוחררו. להלן תמונה המציגה את קסטות הביטוי וכן את ביטוי החלבון בצמחי טבק.

כך נראה עלה טבק שעבר חדירה תחת תאורה רגילה ותחת אור ירוק עם פילטר אדום, כאשר ביטוי של TR cell 5:00 AM cherry, המצוין על ידי הצבע האדום, נראה כאן בבירור. ג'ל SDS page, Western blot ו-CMC zymograph המראים את הגודל והפעילות של T cell five A. החלבונים המסיסים הכוללים הופרדו וניתן להדמיותם באמצעות צביעת kumasi blue; Western blotting נגד אזור ה-hist tag של T cell five A מאשר את גודל החלבון, ובנוסף, הפעילות של ה-cellulase נגד CMC מוצגת על ידי zymograph שנצבע ב-Congo red. מה שניתן לראות כאן הם החלבונים המסיסים הכוללים מעלי צמח הטבק שבהם TR cell five A בוטא באופן זמני, לפני ואחרי טיהור באמצעות thermal precipitation, כאשר TR cell five A הוא הפס הגדול ביותר הנראה לעין, והוא נראה גם ב-Western blot וב-CMC zymograph.

אנו רואים גם את סך החלבונים המסיסים מצמחי טבק שבהם Tcell five A לא הובע, לאחר שיקום תרמי, ואת החלבונים מתערובת מסחרית זמינה של tresa cellulase. דמות זו מציגה את כימות הפעילות האנזימטית של TR cell five A; TR cell five A הודגרה עם 4 MUC Azo CMC או נייר מסנן, ופירוק הסובסטרט נמדד על ידי שחרור של fluoro four four mu, הצבע האזו, או על ידי כימות הסוכרים החמצוניים באמצעות שינוי הצבע של PBA בעקבות הליך זה. שיטות אחרות, כגון מיקוד חלבונים, יכולות לשמש כדי לספק מידע נוסף על האופן שבו לוקליזציית החלבון עשויה להשפיע על יציבות האנזים ופעילותו.

לאחר צפייה בסרטון זה, צריכה להיות לכם הבנה ברורה לגבי האופן שבו מבצעים ביטוי זמני של חלבונים בטבק, וכן ידע מעמיק על הדרכים להערכת פעילות אנזימטית להמרת ביומסה של תאית.