Name: שיטת ציפ (DAP-שבב) מטוהרת-DNA-זיקה לקביעת מטרות גן לחיידקית שתי מערכות רגולטוריות רכיב (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-07-21T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 24 s
Description: למדו שיטת צ'יפ מטוהרת-DNA-זיקה לזיהוי אתרי קישור גנומיים של רגולטורים דו-רכיביים בחיידקים. השיטה מאפשרת ניתוח מטרות גן ללא צורך באותות הפעלה ידועים מראש.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים איימי חן על עזרתה בהכנה לצילומי הווידאו ולהפגין את הטכניקה. עבודה זו שנערכה על ידי ENIGMA: מערכות אקולוגיות ורשתות משולבות עם גנים והרכבות מולקולריות (http://enigma.lbl.gov), תכנית אזור המוקד מדעי במעבדה הלאומית לורנס ברקלי, נתמכת על ידי משרד מדע, המשרד הביולוגי ו מחקר סביבתי, של משרד אנרגיה של ארה&quot;ב תחת חוזה מס &#39;DE-AC02-05CH11231.

<ol><li>Galperin, M. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diversity+of+structure+and+function+of+response+regulator+output+domains%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Diversity of structure and function of response regulator output domains.</a> Curr Opin Microbiol. 13, 150-159 (2010).</li>
<li>Casino, P., Rubio, V., Marina, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mechanism+of+signal+transduction+by+two-component+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">The mechanism of signal transduction by two-component systems.</a> Curr Opin Struct Biol. 20, 763-771 (2010).</li>
<li>Aparicio, O., Geisberg, J. V., Struhl, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+immunoprecipitation+for+determining+the+association+of+proteins+with+specific+genomic+sequences+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Chromatin immunoprecipitation for determining the association of proteins with specific genomic sequences in vivo.</a> Curr Protoc Cell Biol. 17 (17), (2004).</li>
<li>McCleary, W. R., Stock, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acetyl+phosphate+and+the+activation+of+two-component+response+regulators%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Acetyl phosphate and the activation of two-component response regulators.</a> J Biol Chem. 269, 31567-31572 (1994).</li>
<li>Novichkov, P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RegPrecise+web+services+interface%3A+programmatic+access+to+the+transcriptional+regulatory+interactions+in+bacteria+reconstructed+by+comparative+genomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">RegPrecise web services interface: programmatic access to the transcriptional regulatory interactions in bacteria reconstructed by comparative genomics.</a> Nucleic Acids Res. 40, 604-608 (2012).</li>
<li>Studholme, D. J., Buck, M., Nixon, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+potential+sigma%28N%29-dependent+promoters+in+bacterial+genomes%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology%22%5BJournal%5D)">Identification of potential sigma(N)-dependent promoters in bacterial genomes.</a> Microbiology. 146 (12), 3021-3023 (2000).</li>
<li>Rajeev, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+mapping+of+two+component+response+regulators+to+gene+targets+in+a+model+sulfate+reducing+bacterium%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Systematic mapping of two component response regulators to gene targets in a model sulfate reducing bacterium.</a> Genome Biol. 12, 99(2011).</li>
<li>Crooks, G. E., Hon, G., Chandonia, J. M., Brenner, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((WebLogo%3A+a+sequence+logo+generator%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">WebLogo: a sequence logo generator.</a> Genome Res. 14, 1188-1190 (2004).</li>
<li>Barbieri, C. M., Mack, T. R., Robinson, V. L., Miller, M. T., Stock, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+response+regulator+autophosphorylation+through+interdomain+contacts%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Regulation of response regulator autophosphorylation through interdomain contacts.</a> J Biol Chem. 285, 32325-32335 (2010).</li>
<li>Bourret, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Receiver+domain+structure+and+function+in+response+regulator+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Receiver domain structure and function in response regulator proteins.</a> Curr Opin Microbiol. 13, 142-149 (2010).</li>
<li>Gao, R., Stock, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+strategies+for+phosphorylation-mediated+regulation+of+response+regulator+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Molecular strategies for phosphorylation-mediated regulation of response regulator activity.</a> Curr Opin Microbiol. 13, 160-167 (2010).</li>
<li>Hung, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oligomerization+of+the+response+regulator+ComE+from+Streptococcus+mutans+is+affected+by+phosphorylation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Oligomerization of the response regulator ComE from Streptococcus mutans is affected by phosphorylation.</a> J Bacteriol. 194, 1127-1135 (2012).</li>
<li>Ladds, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+response+regulator+Spo0A+from+Bacillus+subtilis+is+efficiently+phosphorylated+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiol+Lett%22%5BJournal%5D)">The response regulator Spo0A from Bacillus subtilis is efficiently phosphorylated in Escherichia coli.</a> FEMS Microbiol Lett. 223, 153-157 (2003).</li>
<li>Wen, Y., Feng, J., Scott, D. R., Marcus, E. A., Sachs, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Involvement+of+the+HP0165-HP0166+two-component+system+in+expression+of+some+acidic-pH-upregulated+genes+of+Helicobacter+pylori%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Involvement of the HP0165-HP0166 two-component system in expression of some acidic-pH-upregulated genes of Helicobacter pylori.</a> J Bacteriol. 188, 1750-1761 (2006).</li>
<li>Liu, X., Noll, D. M., Lieb, J. D., Clarke, N. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DIP-chip%3A+rapid+and+accurate+determination+of+DNA-binding+specificity%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">DIP-chip: rapid and accurate determination of DNA-binding specificity.</a> Genome Res. 15, 421-427 (2005).</li>
<li>Gossett, A. J., Lieb, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+Immunoprecipitation+%28DIP%29+for+the+Determination+of+DNA-Binding+Specificity%5BTitle%5D)+AND+%22CSH+Protoc%22%5BJournal%5D)">DNA Immunoprecipitation (DIP) for the Determination of DNA-Binding Specificity.</a> CSH Protoc. 2008, (2008).</li>
<li>Mascher, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Streptococcus+pneumoniae+cia+regulon%3A+CiaR+target+sites+and+transcription+profile+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">The Streptococcus pneumoniae cia regulon: CiaR target sites and transcription profile analysis.</a> J Bacteriol. 185, 60-70 (2003).</li>
<li>Park, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ChIP-seq%3A+advantages+and+challenges+of+a+maturing+technology%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">ChIP-seq: advantages and challenges of a maturing technology.</a> Nat Rev Genet. 10, 669-680 (2009).</li>
<li>Lefrancois, P., Zheng, W., Snyder, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ChIP-Seq+using+high-throughput+DNA+sequencing+for+genome-wide+identification+of+transcription+factor+binding+sites%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">ChIP-Seq using high-throughput DNA sequencing for genome-wide identification of transcription factor binding sites.</a> Methods Enzymol. 470, 77-104 (2010).</li>
<li>Ho, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ChIP-chip+versus+ChIP-seq%3A+lessons+for+experimental+design+and+data+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">ChIP-chip versus ChIP-seq: lessons for experimental design and data analysis.</a> BMC Genomics. 12, 134(2011).</li>
<li>Liu, X., Lee, C. K., Granek, J. A., Clarke, N. D., Lieb, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-genome+comparison+of+Leu3+binding+in+vitro+and+in+vivo+reveals+the+importance+of+nucleosome+occupancy+in+target+site+selection%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Whole-genome comparison of Leu3 binding in vitro and in vivo reveals the importance of nucleosome occupancy in target site selection.</a> Genome Res. 16, 1517-1528 (2006).</li>
</ol>

יש הסופרים שאין ניגוד עניינים לחשוף.

שיטת DAP-השבב שתוארה כאן הייתה הצלחה בשימוש כדי לקבוע את מטרות הגן במשך כמה RRs בDesulfovibrio vulgaris 7 Hildenborough של איזה מהם מוצג כאן כתוצאה נציג. לDVU3023 RR, בחירת יעד גן מועמד הייתה פשוטה. DVU3025 ממוקם מייד במורד הזרם של גן RR, וגני RR והיעד הם נשמרים בכמה מיני Desulfovibrio, ובנוסף יש DVU3025 אמרגן sigma54 תלוי חזה. EMSA מספק שיטה פשוטה לבדיקת מהירות RR לכריכה לגן יעד המועמד, וגם מאפשר ההערכה של הפעילות של מדגם החלבון מטוהר, כמו גם לקבוע תנ...

היכולת של חיידקים לשרוד ולשגשג תלויה באופן קריטי על כמה טוב הם מסוגלים לקלוט ולהגיב להפרעות בסביבתם, וזה בתורו הוא תלוי במערכות העברת אותותיהם. מספר מערכות אזעקת encodes חיידק כבר נקרא &quot;IQ של חיידקים&quot; שלה ויכול להיות אינדיקציה של שתי השתנות של סביבתו ואת יכולתו לחוש אותות מרובים ולכוונן את תגובתה 1. שתי מערכות רכיב אות התמרה (TCS) הן מערכות האיתות הנפוצות ביותר בשימוש על ידי חיידקים, והם מורכבים מקינאז היסטידין (HK) שחש את האות החיצונית ומעביר באמצעות זירחון לרגולטור תגובת מפעיל (RR) 2. RRs יכול להיות מגוון של תחומים פלט ומצבים שונים ובכך מפעיל, אבל התגובה הנפוצה ביותר היא תקנת תעתיק באמצעות DNA מחייב תחום 1. האותות חשו ופונקציות המקבילה vasלא רוב TCSs אינו ידוע. למרות in vivo שיטות כגון שבב שבב משמשות באופן שיגרתי לקביעת אתרי קישור הגנומי של שעתוק גורמי 3, הם יכולים לשמש רק לRRs שתי מערכת מרכיב חיידקים אם התנאים להפעלה או אותות ידועים. לעתים קרובות הרמזים הסביבתיים המפעילים TCS הם יותר קשים לקבוע ממטרות הגן שלהם. במבחנה microarray assay המבוסס המתואר כאן ניתן להשתמש ביעילות ובמהירות כדי לקבוע את מטרות הגן ולחזות פונקציות של TCSs. assay זה מנצל את העובדה שניתן phosphorylated RRs וכך הופעל במבחנה באמצעות תורמי מולקולה קטנים כמו פוספט אצטיל 4. בשיטה זו, בשם DAP-שבבים עבור ה-DNA זיקה מטוהר שבב (איור 1), גן RR של עניין הוא משובט עם התג שלו בE. coli, וטהר לאחר מכן חלבון מתויג מותר דוnd לטעון הדנ&quot;א הגנומי. ה-DNA חייב החלבון מועשר לאחר מכן על ידי זיקה לטיהור, ה-DNA המועשר וקלט הם מוגברות, שכותרתו fluorescently, אספו יחד והכלאה למגוון ריצוף כי הוא עשה מותאם אישית לאורגניזם של עניין (איור 1). ניסויי microarray כפופים לחפצים, ולכן צעדים נוספים מועסקים כדי לייעל את assay. צעד אחד כזה הוא לנסות ולקבוע יעד אחד לRR תחת מחקר באמצעות מבחני משמרת ניידות electrophoretic (EMSA) (ראה זרימת עבודה באיור 2). לאחר מכן, בעקבות מחייב הדנ&quot;א הגנומי וצעדי DAP, ה-DNA חייב החלבון והקלט נבדקים על ידי qPCR כדי לראות אם היעד החיובי הוא מועשר בשבריר מאוגד החלבון ביחס לשבריר הקלט, ובכך אישרה תנאים אופטימליים מחייב עבור RR (איור 2). לאחר הכלאת מערך, הנתונים מנותחים למצוא פסגות של אות בעוצמה גבוהה המעידות על לוקוסים הגנומי שבו שעות החלבוןמודעה קשורה. פונקציות יכולות להיות חזויה עבור RR מבוסס על מטרות הגן שהושגו. הלוקוסים הגנומי היעד משמשים כדי לחזות מוטיבים אתר מחייב, אשר לאחר מכן בניסוי תוקף באמצעות EMSAs (איור 2). התחזיות פונקציונליות ומטרות גן לRR יכולים אז להיות מורחבות למינים קשורות באופן הדוק המקודדים RRs orthologous ידי סריקת הגנום אלה למוטיבים המחייבים דומים (איור 2). שיטת DAP-השבב יכולה לספק שפע של מידע לTCS בהם בעבר לא היה כלום. גם השיטה יכולה לשמש לכל רגולטור תעתיק אם החלבון יכול להיות מטוהרת וניתן לקבוע תנאים המחייבים DNA, ולכל אורגניזם של עניין עם רצף הגנום זמין. <img alt="איור 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51715/51715fig1highres.jpg" width="500" /> איור 1. מטוהר-DNA-זיקת השבב (DAP-אסטרטגית שבב) 7. גן RR מהאורגניזם של עניין הוא משובט עם התג שלו carboxy-מסוף לE. זן ביטוי coli. חלבון שלו מתויג מטוהר מופעל על ידי זירחון עם פוספט אצטיל, ומעורבב עם הדנ&quot;א הגנומי טעון. Aliquot של התגובה מחייבת נשמר כDNA קלט, ואילו השאר הוא נתון לטיהור זיקה באמצעות שרף Ni-נ.ת. ע. הקלט ואת ה-DNA הנכנס RR הוא הגנום כולו מוגבר, ושכותרתו עם Cy3 וCy5, בהתאמה. ה-DNA שכותרתו היא אספו יחד והכלאה למגוון ריצוף, אשר לאחר מכן נותח על מנת לקבוע מטרות הגן. איור שונה והודפס מחדש באמצעות הרישיון של Creative Commons מ7. <img alt="איור 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51715/51715fig2highres.jpg" width="500" /> איור 2. סיכום של זרימת עבודה. לכל מטוהר protei מתויגn, להתחיל על ידי קביעת יעד באמצעות EMSA. אפשר לחלבון לקשור הדנ&quot;א הגנומי ולאחר מכן ה-DNA זיקה לטהר (DAP) והגנום כולו להגביר את ה-DNA והקלט המועשר (WGA). אם יעד גן ידוע, השתמש qPCR כדי להבטיח כי היעד הידוע הוא מועשר בשבריר מאוגד החלבון. אם לא ניתן לקבוע יעד, להמשיך ישירות לתיוג ה-DNA וכלת מערך. אם העשרה על ידי qPCR לא יכולה להיות שנצפתה, ולאחר מכן לחזור על החלבון מחייב-gDNA וצעדי DAP-WGA המשתמשים בכמויות חלבון שונות. השתמש בניתוח מערך למצוא פסגות ולמפות אותם כדי למקד את הגנים. השתמש באזורים במעלה הזרם של גנים המטרה לחזות מוטיבים אתר קישור. לאמת את המוטיבים בניסוי באמצעות EMSAs. השתמש במוטיב לסרוק את הגנום של מינים קרובים קידוד orthologs של RR תחת מחקר, ולחזות גנים ממוקדים במינים אלה גם כן. בהתבסס על מטרות הגן השיגו, התפקוד הפיזיולוגי של RR וorthologs ניתן לחזות. איור שונה והודפס מחדש באמצעות ג יצירתייםommons רישיון מ7.

<table><tbody><tr><td>טור HisTrapFF (עמוד Ni-Sepharose)</td><td>GE Lfe Sciences, פיטסבורג, פנסילבניה, ארה"ב</td><td>17-5255-01</td><td></td></tr><tr><td>Akta explorer (מכשיר FPLC)</td><td>GE Lfe Sciences, פיטסבורג, פנסילבניה, ארה"ב</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HiPrep 26/10 עמוד התפלה</td><td>GE Lfe Sciences, פיטסבורג, פנסילבניה, ארה"ב</td><td>17-5087-01</td><td></td></tr><tr><td>ערכת מיצוי ג'ל Qiaquick</td><td>Qiagen Inc, ולנסיה, קליפורניה, ארה"ב</td><td>28704</td><td></td></tr><tr><td>אוליגונוקלאוטידים עם תווית ביוטין</td><td>טכנולוגיות DNA משולבות</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>6% פוליאקרילאמיד-0.5x TBE מיני ג'ל עיכוב DNA טרומי</td><td>Life Technologies, גרנד איילנד, ניו יורק, ארה"ב</td><td>EC63652BOX</td><td>לחלופין, אתה יכול למזוג ג'ל משלך.</td></tr><tr><td>קרום ניילון</td><td>EMD Millipore, Billerica, MA, ארה"ב</td><td>INYC00010</td><td></td></tr><tr><td>Trans-Blot SD תא העברה אלקטרופורטי חצי יבש</td><td>Biorad, הרקולס, קליפורניה, ארה"ב</td><td>170-3940</td><td></td></tr><tr><td>נייר כתמים עבה במיוחד, 8 x 13.5 ס"מ</td><td>Biorad, הרקולס, קליפורניה, ארה"ב</td><td>170-3967</td><td></td></tr><tr><td>UV crosslinker דגם XL-1000</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>11-992-89</td><td></td></tr><tr><td>ערכת זיהוי כימילומינסנט של חומצות גרעין (פירס)</td><td>תרמו פישר סיינטיפיק, רוקפורד, אילינוי, ארה"ב</td><td>89880</td><td></td></tr><tr><td>Ni-NTA שרף אגרוז</td><td>Qiagen Inc, ולנסיה, קליפורניה, ארה"ב</td><td>30210</td><td></td></tr><tr><td>ערכת הגברת גנום שלם של GenomePlex (מאגר פיצול, מאגר הכנת ספרייה, תמיסת ייצוב ספרייה, אנזים הכנת ספרייה, תערובת מאסטר הגברה פי 10, פולימראז WGA)</td><td>סיגמא-אולדריץ', סנט לואיס, מיזורי, ארה"ב</td><td>WGA2-50RXN</td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop ND-1000</td><td>Thermo Scientific, ווילמינגטון, DE, ארה"ב</td><td>לכימות DNA</td><td></td></tr><tr><td>Perfecta Sybr Green SuperMix, עם ROX</td><td>Quanta biosciences</td><td>95055-500</td><td>ניתן להשתמש בכל תערובת Sybr Green PCR</td></tr><tr><td>PlateMax סרט איטום חום שקוף במיוחד עבור qPCR</td><td>Axygen</td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">[header]</td></tr> <tr><td>96-well ברור פרופיל נמוך PCR microplate</td><td>Life Technologies, גרנד איילנד, ניו יורק, ארה"ב</td><td>PCR-96-LP-AB-C</td><td></td></tr><tr><td>Applied Biosystems StepOne Plus מערכת PCR בזמן אמת</td><td>Life Technologies, גרנד איילנד, ניו יורק, ארה"ב</td><td>4376600</td><td>ניתן להשתמש בכל מערכת PCR בזמן אמת</td></tr><tr><td>ערכת טיהור PCR Qiaquick</td><td>Qiagen Inc, ולנסיה, קליפורניה, ארה"ב</td><td>28104</td><td>ניתן להשתמש בכל ערכת ניקוי PCR Cy3</td></tr><tr><td>/Cy5 nonamers</td><td>Trilink biotechnologies, סן דייגו, קליפורניה, ארה"ב</td><td>N46-0001, N46-0002</td><td></td></tr><tr><td>Klenow polymerase 50,000 U/ml, 3'-5' exo-</td><td>New England Biolabs, Ipswich, MA</td><td>M0212M</td><td></td></tr><tr><td>מערכת היברידיזציה</td><td>Roche-Nimblegen, Madison, WI, USA</td><td>N/A</td><td>חברה זו כבר לא מייצרת מערכים או פריטים קשורים, ולכן יהיה צורך להשתמש במקורות חלופיים כגון Agilent או Affymetrix.</td></tr><tr><td>מיקרו-מערכים ומיקסרים מודפסים בהתאמה אישית</td><td>Roche-Nimblegen, Madison, WI, USA</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>ערכת הכלאה (2x מאגר היברידיזציה, רכיב הכלאה A, Alignment oligo)</td> <td>Roche-Nimblegen, Madison, WI, USA</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>ערכת מאגר כביסה (10x מאגר כביסה I, II, III, 1 M DTT)</td> <td>Roche-Nimblegen, Madison, WI, ארה"ב</td><td></td><td></td></tr><tr><td>GenePix 4200A microarray scanner</td><td>מכשירים מולקולריים, Sunnyvale CA, ארה"ב</td><td>מודל זה הוחלף על ידי מעולים</td><td></td></tr><tr><td>GenePix Pro microarray software</td><td>Molecular Devices, Sunnyvale CA, ארה"ב</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nimblescan v.2.4, תוכנת ניתוח שבב ChIP</td><td>Roche-Nimblegen, מדיסון, WI, ארה"ב</td><td>N/A</td><td></td></tr></tbody></table>

שיטת צ&#39;יפ (dap-שבב) מטוהרת-dna-זיקה לקביעת מטרות גן לחיידקית שתי מערכות רגולטוריות רכיב

DNA-affinity-purified Chip (DAP-chip) Method to Determine Gene Targets for Bacterial Two component Regulatory Systems

בשיטות vivo כגון שבב שבב טכניקות מבוססות היטב המשמשות לקביעת מטרות גן הגלובליות לגורמי שעתוק. עם זאת, הם של שימוש מוגבל בחקר שתי מערכות רגולציה מרכיב חיידקים עם תנאי הפעלת uncharacterized. מערכות כאלה להסדיר שעתוק רק כאשר מופעלים בנוכחות אותות ייחודיים. מאז האותות הללו הם לעתים קרובות לא ידועים, חוץ גופית בשיטה microarray מבוססת שבתוארה במאמר זה וידאו יכול לשמש כדי לקבוע מטרות גן ואתרי קישור לרגולטורי תגובה. שיטה מטוהרת-DNA-זיקת שבב זה עשויה לשמש לכל רגולטור מטוהר בכל אורגניזם עם הגנום רצף. הפרוטוקול כרוך מאפשר מטוהר החלבון מתויג להיקשר הדנ&quot;א הגנומי טעון ולאחר מכן טיהור זיקת DNA הנכנס החלבון, ואחריו ניאון תיוג של ה-DNA וכלאה למערך ריצוף מותאם אישית. שקדמו לצעדים שעשויים לשמש כדי לייעל את assay לספציפיהרגולטורים ג גם מתוארים. הפסגות שנוצרו על ידי ניתוח נתוני מערך משמשות כדי לחזות מוטיבים אתר קישור, אשר לאחר מכן הם תוקף באופן ניסיוני. תחזיות המוטיב יכולות לשמש נוספת כדי לקבוע מטרות גן של רגולטורים תגובת orthologous במינים קרובים. אנו מדגימים את תחולתה של שיטה זו על ידי קביעת מטרות הגן ומחייב מוטיבים אתר ובכך לחזות את הפונקציה עבור DVU3023 רגולטור תגובת sigma54 תלוי בחיידק הסביבתי Desulfovibrio vulgaris Hildenborough.

השיטה הנ&quot;ל יושמה כדי לקבוע את מטרות הגן הגלובליות של RRs בסולפט מודל הפחתת חיידק Desulfovibrio vulgaris 7 Hildenborough. יש אורגניזם זה מספר גדול של TCSs מיוצג על ידי מעל 70 RRs, המעיד על המגוון הרחב של אותות אפשריים שהוא חש ומגיב ל. בvivo מנתח על הפונקציות של מערכות אזעקה אלה הם קשים לביצוע שכן האותות שלהם ובכך התנאים להפעלתם אינם ידועים. הנה שיטת DAP-השבב שימשה כדי לקבוע את מטרות גן ובכך לחזות פונקציות אפשריות עבור DVU3023 RR נציג. <p class=...

מאמר וידאו זה מתאר שיטת microarray מבוסס במבחנה כדי לקבוע את מטרות הגן ואתרי קישור לשני רגולטורים תגובת מערכת רכיב.

שיטת צ&#39;יפ (DAP-שבב) מטוהרת-DNA-זיקה לקביעת מטרות גן לחיידקית שתי מערכות רגולטוריות רכיב

In vivo methods such as ChIP-chip are well-established techniques used to determine global gene targets for transcription factors. However, they are of ...

המטרה הכללית של הניסוי הבא היא לקבוע את אתרי הקשירה הגנומיים של רגולטורים של תגובה במערכת דו-מרכיבית של חיידקים, באמצעות בדיקת מערך זעיר (microarray) במערכת in vitro. מטרה זו מושגת על ידי שיבוט וניקוי של חלבון רגולטור תגובה מתויג, הפעלתו באמצעות פוספורילציה in vitro וזיהוי יעד גני אחד באמצעות בדיקות הזזה של ניידות אלקטרופורטית (EMSA), כדי שישמש כביקורת חיובית לשלבי המערך הזעיר הבאים. כשלב שני, חלבון רגולטור התגובה המנוקה מערבב עם ה-DNA הגנומי, מה שמאפשר להפריד את ה-DNA הקשור לחלבון מה-DNA שהוכנס (input DNA) באמצעות ניקוי באפיניטי (affinity purification).בשלב הבא, ה-DNA הקשור לחלבון וה-DNA של הדגימה המקורית (input DNA) עוברים הגברה, אימות באמצעות QPCR להעשרה של יעד הגן של הבקרה החיובית בפרקציית ה-DNA הקשור לחלבון, סימון פלואורסצנטי, איחוד והיברידיזציה למערך מיקרו-שבבים מסוג tiling microarray. כדי לקבוע את אתרי הקישור הגנומיים של רגולטור התגובה, התוצאות מראות את הגנים בעלי הסבירות הגבוהה ביותר להיות מווסתים על ידי רגולטור התגובה הנחקר, וניתן לתקף את התוצאות בהמשך באמצעות בדיקות EMSA (electrophoretic mobility shift assays). היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות אחרות, כגון in vivo chip-chip, הוא שניתן להשתמש בה גם כאשר אותות ההפעלה והתנאים עבור מערכות הדו-רכיביות אינם ידועים.שיטה זו היא בעלת חשיבות רבה לתחום האותות הבקטריאליים, כיוון שלרוב המכריע של רגולטורי התגובה ישנן מטרות גניות לא ידועות, ושיטה זו מסייעת בחשיפת רשתות רגולטוריות מורכבות. את ההליך תדגים איימי צ'ן, עוזרת מחקר מהמעבדה שלי, לפני תחילתו של הליך זה.טהרו את ה-rr, ובאופן ספציפי את החלבון DVU 3 0 2 3 שהובע מתערובת גנים cloned DVU 3 0 2 3. ערבבו 0.5 picomoles של חלבון DVU 3 0 2 3 עם 100 fent moles של תשתית DNA שהוכנה מראש על ידי at inated בתוך תמיסה חוצצת לנפח כולל של 20 microliters. לאחר הקמת תגובה ללא חלבון כביקורת, דגרו את התגובות בטמפרטורת החדר על המשטח למשך 20 דקות.לאחר הדגירה, הוסיפו 5 µL של loading buffer בריכוז 5x לתגובות הקישור. טענו 18 µL מכל תגובה על ג'ל poly acrylamide 6% mini שהוכן מראש ב-0.5 XTBE, והריצו ב-100 V למשך שעתיים. לאחר הרצת הג'ל, גזרו ממברנת ניילון טעונה לגודל הג'ל והשרו אותה ב-0.5 XTBE למשך 10 דקות לפחות. לאחר מכן, הוציאו את הג'ל מהקסטה.גזרו כל בליטות מהג'ל והניחו את הג'ל והממברנה בין שני ניירות סינון עבים הספוגים ב-0.5 XTBE. הניחו את הג'ל והממברנה בתוך מכשיר blotting חצי-יבש והפעילו במתח של 20 volts למשך 30 דקות. לאחר מכן, הניחו את הממברנה בתוך מכשיר crosslinker מסחרי המבוסס על אור UV והגדירו את הזמן לשלוש דקות; לאחר פיתוח ה-blot באמצעות ערכה לגילוי כימולומינצנטי, דגמו את התמונה באמצעות מחשב המחובר למצלמה מצוידת ב-CCD.חפש שינוי בניידות של תבנית ה-DNA בנוכחות ה-rr, המעיד על כך שה-RR נקשר ל-DNA הנבדק. לאחר מכן, ערבב שני עד שלושה מיקרוגרמים של DNA גנומי משותף עם 0.5 פיקומול של DVU 3 0 2 3 בתמיסה עם בופר. לאחר דגירה של התגובה ב-25 °C למשך 30 דקות, העבר 10 µL ממנה לשפופרת של 1.5 mL וסמן אותה כ-input DNA.הוסף 30 µL של שרף nickel NTA aros למבחנה למיקרו-צנטריפוגה בנפח 0.6 mL. צנטריפוג את הדגימה ב-100 ×g למשך דקה אחת כדי לרכז את השרף בתחתית המבחנה לאחר הצנטריפוגה. הסר את הנוזל העליון (supernatant) בשלב זה.הוסף 100 µL של בופר שטיפה ונער את המבחנה בקיצוץ (flick) כדי לערבב את התוכן. לאחר סרגינג, צנטריפוגה ב-100 Gs למשך שתי דקות והסר את העלייה (supernatant). הוסף את 90 µL הנותרים מתגובת הקישור לשטיפה של שרף nickel NTA.לאחר מכן, דגרו את הדגימה במנער סיבובי למשך 30 דקות. בסיום, סבבו את הדגימה בצנטריפוגה ב-100 Gs למשך שתי דקות. לאחר הסרת הנוזל העליון (supernatant), חזרו על שלבי השטיפה שלוש פעמים נוספות.הוסיפו כעת 35 µL של בופר אלוציה (elution buffer) לשרף וערבבו באמצעות וורטקס. דגרו את הדגימה על המשטח בטמפרטורת החדר למשך חמש דקות. לאחר סבוב של הדגימה בצנטריפוגה, העבירו את על-המשקע למבחנה חדשה של 1.5 mL וסמנו אותה כפרקציית ה-DNA הקשור לחלבון.לאחר מכן, הוסף 35 µL של באפר אלוקוציה (elucian buffer) ל-DNA הקלט, בעקבות טיהור של תאי ה-DNA של הקלט ותאי ה-DNA הקשור לחלבון. הוסף 10 µL מכל אחד למבחנות PCR נפרדות. לאחר מכן, הוסף לכל דגימה מיקרוליטר אחד של 10 x fragmentation buffer, שני מיקרוליטרים של library preparation buffer ומיקרוליטר אחד של library stabilization solution, וערבב היטב את הדגימות באמצעות וורטקס.חממו את הדגימות במכשיר תרמו-סייקלר (thermal cycler) בטמפרטורה של 95 °C למשך שתי דקות. עם סיום החימום, קררו את הדגימות על קרח. לאחר מכן, הוסיפו לדגימות 1 µL של אנזים להכנת ספרייה וערבבו את התוכן באמצעות פיפוט.דגרו את הדגימות בטרמיקלר (thermal cycler). לאחר הדגירה, הוסיפו לכל מבחנה 47.5 µL של מים, 7.5 µL של 10 x amplification master mix וחמישה µL של פולימראז. לאחר ערבוב הדגימות, חממו אותן בטרמיקלר.הכינו תגובות QPCR בשלוש חזרות עבור כל תבנית DNA על ידי הכנת one x master mix עבור כל סט פריימרים שתוכנן קודם לכן, ולאחר מכן העבירו מנה של 18 µL מה-master mix לכל באער בלוח PCR בעל 96 באערים. דללו את דגימות ה-DNA שהועשרו וטוהרו (input ו-protein bound) באמצעות מים לריכוז של 5 ng/µL, והוסיפו 2 µL מכל דגימה לבאערים. לאחר מכן, אטמו את הלוח באמצעות סרט איטום UltraClear QPCR.סובבו את הפלטה בצנטריפוגה ב-200 GS למשך דקה אחת. לאחר הנחת הפלטה במכונת qPCR בזמן אמת, השתמשו בתנאים הבאים כדי לסמן DNA של קלט עם s si three ו-DNA מועשר עם sci five: ערבבו 1 µg של DNA עם 40 µL של S3 SCI-FI labeled nine mers, והביאו את הנפח ל-80 µL באמצעות מים. דנאטורו את הדגימות ב-98 °C למשך 10 דקות בחושך בתוך תרמוסייקלר.בסיום, קררו את הדגימות במהירות על קרח למשך שתי דקות, והוסיפו לכל תגובה 2 µL של 3 prime, 5 prime exo polymerase, 5 mM של deoxy nucleotide tric phosphates ו-8 µL של מים. לאחר ערבוב, דגרו את התגובות בטמפרטורה של 37 °C למשך שעתיים בחושך בתוך תרמוציקלר. בנקודה זו, הוסיפו EDTA לריכוז של 50 mM כדי לעצור את התגובות, ומסלוליל של sodium chloride לריכוז של 0.5 M.לאחר מכן, העבירו למבחנות של 1.5 milliliter המכילות 0.9 נפח של isopropanol, ואחרי דגירה בחושך למשך 10 דקות, סבבו את הדגימות בצנטריפוגה במהירות 12,000 GS למשך 10 דקות. איספו יחד ששה micrograms של DNA המסומן ב-S3 וב-sci-fi למבחנה אחת של 1.5 milliliter, ויבשו בוואקום בצנטריפוגה בטמפרטורה נמוכה ובחושך, על ידי כיסוי מכסה הצנטריפוגה אם הוא שקוף.לאחר שהמשקעים יבשים, נשעה אותם בחמישה µL של מים. לאחר מכן, נוסיף לדגימות 13 µL של תערובת מאסטר (master mix) של תמיסת היברידיזציה בריכוז 1x שהוכנה מראש, לאחר ערבוב ב-vortex למשך 15 שניות, ונדגיר את הדגימות ב-95 °C במכשיר חימום יבש (dry bath) למשך חמש דקות. נוציא את הדגימות מהחימום היבש ונניח אותן במערכת היברידיזציה ב-42 °C עד למועד ההטענה.בשלב הבא, מקמו את מכלול שקופית הערבוב שהוכן קודם לכן בתוך מערכת ההיברידיזציה. טענו 16 µL של דגימה לתוך פתח המילוי. לאחר מכן, אטמו את הפתחים באמצעות סרט דביק והפעילו את הערבוב במערכת. לאחר ביצוע היברידיזציה למשך 16 עד 20 שעות בטמפרטורה של 42 °C.החלק את המערבל, החלק לתוך כלי פירוק והנח אותו בתוך צלחת המכילה בופר חמים. אחד. קלף את המערבל תוך כדי ניעור נמרץ של כלי הפירוק. הנח את השקופית בתוך מכל עם 50 milliliters של בופר שטיפה 1 ונער בנמרצות במשך שתי דקות.לאחר מכן חזור על השלב הקודם עם 50 milliliters של בופר שטיפה שתיים ו-50 milliliters של בופר שטיפה שלוש RRR DVU 3 0 2 3 shifted. ה-QPCR של האזור שמעלה (upstream) של DVU 3 0 2 5 הראה כי האזור שמעלה של DVU 3 0 2 5 מועשר בפרקציית החלבון הקשור ביחס ל-DNA הקלט (input DNA), מה שמעיד על כך שתנאי הקישור היו מתאימים עבור DVU 3 0 2 3. DVU 0 0 1 3 שימש כביקורת שלילית. ארבעת השיאים העליונים שהתקבלו לאחר ניתוח DAP chipp נבחרו כמטרות הסבירות ביותר עבור DV 3 0 2 3.המטרה החיובית DVU 3 0 2 5 הייתה הפסגה הראשונה שהתקבלה עם הניקוד הגבוה ביותר. שתי מטרות הגנים הן שתיים אחרות המקודדות ללקטט פרמיאז (lactate permease). מטרה הגן הרביעית אינה נמצאת באזור המעלה (upstream region), אלא באזור הבין-גני שבין שני גנים המתעתקים באופן קונוורגנטי; נעשה שימוש באזורי המעלה של מטרות שהתקבלו על ידי DAP chip meme כדי לחזות מוטיב של אתר קישור.המוטיב תוקף עוד יותר על ידי ביצוע החלפות בבסיסים השמורים בתוך המוטיב, דבר שביטל את הסטה של הקישור. המוטיב המתוּקף שימש לסריקת גנומים של חיידקים אחרים המפחיתים סולפטים שבהם נמצאו לוקוסים אורתולוגיים ל-DVU 3 0 2 3; אלו נבחרו כמטרות גנים אפשריות כאשר המוטיב מוקם באזורים שמעלה למסגרות קריאה פתוחות, תוך שימוש ברצפי מוטיב שנחזו עבור rs אוטולוגיים. נוצר מוטיב של אתר קישור קונסנזוס, אשר דמה מאוד לזה של Divo Garris Hilton Burrow.לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה באופן השימוש בשיטת ה-Daptive לקביעת מטרות גניות עבור חלבונים רגולטוריים. ניתן להשתמש בשיטה זו כדי לנתח את גודל הקישור של כל חלבון רגולטורי, בתנאי שניתן לטהר את החלבון ורצף הגנום ידוע.

dna-affinity-purified-chip-dap-chip-method-to-determine-gene-targets

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

כאן אנו מציגים immunoprecipitation הכרומטין (שבב) נוהל לניתוח הגנום כולו מיקום isoforms חלבונים שונים בתחום היסטון מחייב. אנו מיישמים אותו לניתוח שבב Seq לזהות מטרות demethylase היסטון KDM5A/JARID1A/RBP2.

הגנום כולו ניתוח באמצעות שבב זיהוי איזופורם ספציפי מטרות ג&#39;ין

סרטון זה מדגים בדיקת in vivo בחיידקים כדי לחקור את האינטראקציה של חלבונים קושרי RNA (RBPs) עם RNA. תאי החיידק מותמרים באמצעות שני מבני פלסמיד – פלסמיד באתר קשירה המקודד mRNA המכיל גן כתב פלואורסצנטי במורד הזרם של אתר קשירת RBP – בעוד פלסמיד RBP מבטא את חלבוני RBP תחת שליטתו של משרה. עם עלייה בתיווך המושרה בייצור RBP, ה-RBPs נקשרים ל-mRNA, וכתוצאה מכך דיכוי תרגומי של הכתב באמצעות עיכוב של קשירת ריבוזום.

כתב בדיקת דיכוי גנים לחקר רגולציה תרגומית של גן מטרה

סרטון זה מדגים שיטה לזיהוי זני ציאנובקטריה בדגימה סביבתית באמצעות שבב מיקרו-מערך נוגדנים. דגימות הנושאות חיידקים שונים מקיימות אינטראקציה עם נוגדנים מודפסים, והצבעה חיסונית עם נוגדנים אנטי-ציאנובקטריאליים המסומנים כפלואורופורים חושפת את נוכחותם של זנים ציאנובקטריאליים ספציפיים באמצעות פלואורסצנטיות בנקודות שונות.

טכניקה לזיהוי זנים ציאנובקטריאליים באמצעות שבב מיקרו-מערך נוגדנים

פיתחנו פלטפורמה מיקרופלואידית לבדיקות רגישות לאנטיביוטיקה במהירות. נוזל מועבר במהירויות גבוהות על חיידקים משותקים בתחתית ערוץ מיקרופלואידי. בנוכחות מתח ואנטיביוטיקה, זנים רגישים של חיידקים מתים במהירות. עם זאת, חיידקים עמידים יכולים לשרוד את התנאים מלחיצים אלה.

בדיקת רגישות אנטיביוטית הנגרמת על ידי מתח על שבב

אנו מתארים זאת assay על ידי צימוד זיהוי methyltransferase אדנין DNA (DamID) לרצף תפוקה גבוה (DamID-seq). שיטה משופרת זה מספקת רזולוציה גבוהה יותר וטווח דינמי רחב יותר, ומאפשרת ניתוח נתונים DamID-seq בשיתוף עם נתונים רצף אחרים תפוקה גבוהה כגון שבב seq, RNA-seq, וכו '...

DamID-seq: מיפוי הגנום של אינטראקציות החלבון-DNA על ידי תפוקה גבוהה רצף של קטעי DNA-מפוגל אדנין

אנו מציגים תוכנית אסטרטגית ופרוטוקול לזיהוי וריאנטים גנטיים לא מקודדים המשפיעים על קשירת ה-DNA של גורם השעתוק (TF). פרוטוקול ניסיוני מפורט מסופק לבדיקת משמרת ניידות אלקטרופורטית (EMSA) וניתוח משקעים של זיקה ל-DNA (DAPA) של קשירת TF DNA תלויה בגנוטיפ.

הקרנה עבור וריאנטים גנטיים ללא קידוד תפקודיים באמצעות ניידות Electrophoretic Shift Assay (Emsa) ו Assay משקע זיקת DNA (DAPA)

לוקמיה לימפוציטית כרונית (CLL) הוא הלוקמיה הנפוץ ביותר בעולם המערבי. גורמי שעתוק NFAT הן הרגולטורים חשוב של פיתוח והפעלה סוגי תאים רבים. כאן, אנו מציגים את פרוטוקול לשימוש של כרומטין immunoprecipitation (ChIP) בתאי CLL אדם לזיהוי גנים היעד הרומן של NFAT2.

כרומטין Immunoprecipitation Assay לזיהוי NFAT2 הרומן גנים היעד בלוקמיה לימפוציטית כרונית

בשיטה זו, אנו מכמת את הזיקה המחייב של מאגד כריכת RNA (rbps) כדי קנצוני ואתרי כריכה שאינם קנצוני באמצעות שיטה פשוטה, לחיות, העיתונאי בתאי חיידקי. השיטת היסוד מבוססת על דיכוי של גן עיתונאי.

שיטת בדיקת מעטפת חלבון-RNA כריכת חיידקים

כרומטין immunoprecipitation בשילוב עם רצף הדור הבא (שבב-seq) היא שיטה המשמשת ליצירת אינטראקציות בין גורמי שעתוק ואת רצפי גנומי הם שולטים. פרוטוקול זה מתאר טכניקות עבור ביצוע שבב-seq עם ביומאמים חיידקיים, באמצעות סלמונלה בידור החיידק Typhimurium בקטריות כדוגמה.

גילוי מטרות רגולטוריות של CsgD באמצעות כרומטין Immunoprecipitation ורצף של תפוקה גבוהה (שבב-seq)

הפעולה הרדיאלית הרדיאלית של Ligand Assay (DRaCALA) יכולה לשמש לזיהוי חלבונים קטנים מחייבים ליגנד של אורגניזם באמצעות ספריית ORFeome.

זיהוי החלבונים המחייבים של ליגנדים קטנים עם הפעולה הרדיאלית הרדיאלית הדיפרנציאלית של ליגנד אסאי (DRaCALA)

ננו-מכונות מבוססות DNAzyme יכולות לשמש לזיהוי סלקטיבי ורגיש ביותר של חומצות גרעין. מאמר זה מתאר פרוטוקול מפורט לתכנון ננו-מכונות מבוססות DNAzyme עם ליבה של 10-23 המשתמשות בתוכנה חופשית ויישומן בזיהוי מקטע וירוס אפשטיין-בר כדוגמה.

DNAzyme 10-23 - ננו-מכונות מבוססות לזיהוי חומצות גרעין

למדו שיטת צ'יפ מטוהרת-DNA-זיקה לזיהוי אתרי קישור גנומיים של רגולטורים דו-רכיביים בחיידקים. השיטה מאפשרת ניתוח מטרות גן ללא צורך באותות הפעלה ידועים מראש.

שיטת צ'יפ (DAP-שבב) מטוהרת-DNA-זיקה לקביעת מטרות גן לחיידקית שתי מערכות רגולטוריות רכיב

גלה סרטונים נוספים