שיטת צ'יפ (DAP-שבב) מטוהרת-DNA-זיקה לקביעת מטרות גן לחיידקית שתי מערכות רגולטוריות רכיב

המטרה הכללית של הניסוי הבא היא לקבוע את אתרי הקשירה הגנומיים של רגולטורים של תגובה במערכת דו-מרכיבית של חיידקים, באמצעות בדיקת מערך זעיר (microarray) במערכת in vitro. מטרה זו מושגת על ידי שיבוט וניקוי של חלבון רגולטור תגובה מתויג, הפעלתו באמצעות פוספורילציה in vitro וזיהוי יעד גני אחד באמצעות בדיקות הזזה של ניידות אלקטרופורטית (EMSA), כדי שישמש כביקורת חיובית לשלבי המערך הזעיר הבאים. כשלב שני, חלבון רגולטור התגובה המנוקה מערבב עם ה-DNA הגנומי, מה שמאפשר להפריד את ה-DNA הקשור לחלבון מה-DNA שהוכנס (input DNA) באמצעות ניקוי באפיניטי (affinity purification).

בשלב הבא, ה-DNA הקשור לחלבון וה-DNA של הדגימה המקורית (input DNA) עוברים הגברה, אימות באמצעות QPCR להעשרה של יעד הגן של הבקרה החיובית בפרקציית ה-DNA הקשור לחלבון, סימון פלואורסצנטי, איחוד והיברידיזציה למערך מיקרו-שבבים מסוג tiling microarray. כדי לקבוע את אתרי הקישור הגנומיים של רגולטור התגובה, התוצאות מראות את הגנים בעלי הסבירות הגבוהה ביותר להיות מווסתים על ידי רגולטור התגובה הנחקר, וניתן לתקף את התוצאות בהמשך באמצעות בדיקות EMSA (electrophoretic mobility shift assays). היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות אחרות, כגון in vivo chip-chip, הוא שניתן להשתמש בה גם כאשר אותות ההפעלה והתנאים עבור מערכות הדו-רכיביות אינם ידועים.

שיטה זו היא בעלת חשיבות רבה לתחום האותות הבקטריאליים, כיוון שלרוב המכריע של רגולטורי התגובה ישנן מטרות גניות לא ידועות, ושיטה זו מסייעת בחשיפת רשתות רגולטוריות מורכבות. את ההליך תדגים איימי צ'ן, עוזרת מחקר מהמעבדה שלי, לפני תחילתו של הליך זה.

טהרו את ה-rr, ובאופן ספציפי את החלבון DVU 3 0 2 3 שהובע מתערובת גנים cloned DVU 3 0 2 3. ערבבו 0.5 picomoles של חלבון DVU 3 0 2 3 עם 100 fent moles של תשתית DNA שהוכנה מראש על ידי at inated בתוך תמיסה חוצצת לנפח כולל של 20 microliters. לאחר הקמת תגובה ללא חלבון כביקורת, דגרו את התגובות בטמפרטורת החדר על המשטח למשך 20 דקות.

לאחר הדגירה, הוסיפו 5 µL של loading buffer בריכוז 5x לתגובות הקישור. טענו 18 µL מכל תגובה על ג'ל poly acrylamide 6% mini שהוכן מראש ב-0.5 XTBE, והריצו ב-100 V למשך שעתיים. לאחר הרצת הג'ל, גזרו ממברנת ניילון טעונה לגודל הג'ל והשרו אותה ב-0.5 XTBE למשך 10 דקות לפחות. לאחר מכן, הוציאו את הג'ל מהקסטה.

גזרו כל בליטות מהג'ל והניחו את הג'ל והממברנה בין שני ניירות סינון עבים הספוגים ב-0.5 XTBE. הניחו את הג'ל והממברנה בתוך מכשיר blotting חצי-יבש והפעילו במתח של 20 volts למשך 30 דקות. לאחר מכן, הניחו את הממברנה בתוך מכשיר crosslinker מסחרי המבוסס על אור UV והגדירו את הזמן לשלוש דקות; לאחר פיתוח ה-blot באמצעות ערכה לגילוי כימולומינצנטי, דגמו את התמונה באמצעות מחשב המחובר למצלמה מצוידת ב-CCD.

חפש שינוי בניידות של תבנית ה-DNA בנוכחות ה-rr, המעיד על כך שה-RR נקשר ל-DNA הנבדק. לאחר מכן, ערבב שני עד שלושה מיקרוגרמים של DNA גנומי משותף עם 0.5 פיקומול של DVU 3 0 2 3 בתמיסה עם בופר. לאחר דגירה של התגובה ב-25 °C למשך 30 דקות, העבר 10 µL ממנה לשפופרת של 1.5 mL וסמן אותה כ-input DNA.

הוסף 30 µL של שרף nickel NTA aros למבחנה למיקרו-צנטריפוגה בנפח 0.6 mL. צנטריפוג את הדגימה ב-100 ×g למשך דקה אחת כדי לרכז את השרף בתחתית המבחנה לאחר הצנטריפוגה. הסר את הנוזל העליון (supernatant) בשלב זה.

הוסף 100 µL של בופר שטיפה ונער את המבחנה בקיצוץ (flick) כדי לערבב את התוכן. לאחר סרגינג, צנטריפוגה ב-100 Gs למשך שתי דקות והסר את העלייה (supernatant). הוסף את 90 µL הנותרים מתגובת הקישור לשטיפה של שרף nickel NTA.

לאחר מכן, דגרו את הדגימה במנער סיבובי למשך 30 דקות. בסיום, סבבו את הדגימה בצנטריפוגה ב-100 Gs למשך שתי דקות. לאחר הסרת הנוזל העליון (supernatant), חזרו על שלבי השטיפה שלוש פעמים נוספות.

הוסיפו כעת 35 µL של בופר אלוציה (elution buffer) לשרף וערבבו באמצעות וורטקס. דגרו את הדגימה על המשטח בטמפרטורת החדר למשך חמש דקות. לאחר סבוב של הדגימה בצנטריפוגה, העבירו את על-המשקע למבחנה חדשה של 1.5 mL וסמנו אותה כפרקציית ה-DNA הקשור לחלבון.

לאחר מכן, הוסף 35 µL של באפר אלוקוציה (elucian buffer) ל-DNA הקלט, בעקבות טיהור של תאי ה-DNA של הקלט ותאי ה-DNA הקשור לחלבון. הוסף 10 µL מכל אחד למבחנות PCR נפרדות. לאחר מכן, הוסף לכל דגימה מיקרוליטר אחד של 10 x fragmentation buffer, שני מיקרוליטרים של library preparation buffer ומיקרוליטר אחד של library stabilization solution, וערבב היטב את הדגימות באמצעות וורטקס.

חממו את הדגימות במכשיר תרמו-סייקלר (thermal cycler) בטמפרטורה של 95 °C למשך שתי דקות. עם סיום החימום, קררו את הדגימות על קרח. לאחר מכן, הוסיפו לדגימות 1 µL של אנזים להכנת ספרייה וערבבו את התוכן באמצעות פיפוט.

דגרו את הדגימות בטרמיקלר (thermal cycler). לאחר הדגירה, הוסיפו לכל מבחנה 47.5 µL של מים, 7.5 µL של 10 x amplification master mix וחמישה µL של פולימראז. לאחר ערבוב הדגימות, חממו אותן בטרמיקלר.

הכינו תגובות QPCR בשלוש חזרות עבור כל תבנית DNA על ידי הכנת one x master mix עבור כל סט פריימרים שתוכנן קודם לכן, ולאחר מכן העבירו מנה של 18 µL מה-master mix לכל באער בלוח PCR בעל 96 באערים. דללו את דגימות ה-DNA שהועשרו וטוהרו (input ו-protein bound) באמצעות מים לריכוז של 5 ng/µL, והוסיפו 2 µL מכל דגימה לבאערים. לאחר מכן, אטמו את הלוח באמצעות סרט איטום UltraClear QPCR.

סובבו את הפלטה בצנטריפוגה ב-200 GS למשך דקה אחת. לאחר הנחת הפלטה במכונת qPCR בזמן אמת, השתמשו בתנאים הבאים כדי לסמן DNA של קלט עם s si three ו-DNA מועשר עם sci five: ערבבו 1 µg של DNA עם 40 µL של S3 SCI-FI labeled nine mers, והביאו את הנפח ל-80 µL באמצעות מים. דנאטורו את הדגימות ב-98 °C למשך 10 דקות בחושך בתוך תרמוסייקלר.

בסיום, קררו את הדגימות במהירות על קרח למשך שתי דקות, והוסיפו לכל תגובה 2 µL של 3 prime, 5 prime exo polymerase, 5 mM של deoxy nucleotide tric phosphates ו-8 µL של מים. לאחר ערבוב, דגרו את התגובות בטמפרטורה של 37 °C למשך שעתיים בחושך בתוך תרמוציקלר. בנקודה זו, הוסיפו EDTA לריכוז של 50 mM כדי לעצור את התגובות, ומסלוליל של sodium chloride לריכוז של 0.5 M.

לאחר מכן, העבירו למבחנות של 1.5 milliliter המכילות 0.9 נפח של isopropanol, ואחרי דגירה בחושך למשך 10 דקות, סבבו את הדגימות בצנטריפוגה במהירות 12,000 GS למשך 10 דקות. איספו יחד ששה micrograms של DNA המסומן ב-S3 וב-sci-fi למבחנה אחת של 1.5 milliliter, ויבשו בוואקום בצנטריפוגה בטמפרטורה נמוכה ובחושך, על ידי כיסוי מכסה הצנטריפוגה אם הוא שקוף.

לאחר שהמשקעים יבשים, נשעה אותם בחמישה µL של מים. לאחר מכן, נוסיף לדגימות 13 µL של תערובת מאסטר (master mix) של תמיסת היברידיזציה בריכוז 1x שהוכנה מראש, לאחר ערבוב ב-vortex למשך 15 שניות, ונדגיר את הדגימות ב-95 °C במכשיר חימום יבש (dry bath) למשך חמש דקות. נוציא את הדגימות מהחימום היבש ונניח אותן במערכת היברידיזציה ב-42 °C עד למועד ההטענה.

בשלב הבא, מקמו את מכלול שקופית הערבוב שהוכן קודם לכן בתוך מערכת ההיברידיזציה. טענו 16 µL של דגימה לתוך פתח המילוי. לאחר מכן, אטמו את הפתחים באמצעות סרט דביק והפעילו את הערבוב במערכת. לאחר ביצוע היברידיזציה למשך 16 עד 20 שעות בטמפרטורה של 42 °C.

החלק את המערבל, החלק לתוך כלי פירוק והנח אותו בתוך צלחת המכילה בופר חמים. אחד. קלף את המערבל תוך כדי ניעור נמרץ של כלי הפירוק. הנח את השקופית בתוך מכל עם 50 milliliters של בופר שטיפה 1 ונער בנמרצות במשך שתי דקות.

לאחר מכן חזור על השלב הקודם עם 50 milliliters של בופר שטיפה שתיים ו-50 milliliters של בופר שטיפה שלוש RRR DVU 3 0 2 3 shifted. ה-QPCR של האזור שמעלה (upstream) של DVU 3 0 2 5 הראה כי האזור שמעלה של DVU 3 0 2 5 מועשר בפרקציית החלבון הקשור ביחס ל-DNA הקלט (input DNA), מה שמעיד על כך שתנאי הקישור היו מתאימים עבור DVU 3 0 2 3. DVU 0 0 1 3 שימש כביקורת שלילית. ארבעת השיאים העליונים שהתקבלו לאחר ניתוח DAP chipp נבחרו כמטרות הסבירות ביותר עבור DV 3 0 2 3.

המטרה החיובית DVU 3 0 2 5 הייתה הפסגה הראשונה שהתקבלה עם הניקוד הגבוה ביותר. שתי מטרות הגנים הן שתיים אחרות המקודדות ללקטט פרמיאז (lactate permease). מטרה הגן הרביעית אינה נמצאת באזור המעלה (upstream region), אלא באזור הבין-גני שבין שני גנים המתעתקים באופן קונוורגנטי; נעשה שימוש באזורי המעלה של מטרות שהתקבלו על ידי DAP chip meme כדי לחזות מוטיב של אתר קישור.

המוטיב תוקף עוד יותר על ידי ביצוע החלפות בבסיסים השמורים בתוך המוטיב, דבר שביטל את הסטה של הקישור. המוטיב המתוּקף שימש לסריקת גנומים של חיידקים אחרים המפחיתים סולפטים שבהם נמצאו לוקוסים אורתולוגיים ל-DVU 3 0 2 3; אלו נבחרו כמטרות גנים אפשריות כאשר המוטיב מוקם באזורים שמעלה למסגרות קריאה פתוחות, תוך שימוש ברצפי מוטיב שנחזו עבור rs אוטולוגיים. נוצר מוטיב של אתר קישור קונסנזוס, אשר דמה מאוד לזה של Divo Garris Hilton Burrow.

לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה באופן השימוש בשיטת ה-Daptive לקביעת מטרות גניות עבור חלבונים רגולטוריים. ניתן להשתמש בשיטה זו כדי לנתח את גודל הקישור של כל חלבון רגולטורי, בתנאי שניתן לטהר את החלבון ורצף הגנום ידוע.