במבחנה הלבלב Organogenesis ממפוזר אבות עכבר עובריים

שיטת התרבות תלת ממדים שתוארה בפרוטוקול זה משחזרת פיתוח לבלב מאבות מפוזרים עוברי לבלב של עכבר, כולל הרחבתן משמעותית, בידול והמורפוגנזה לתוך איבר מסועף. שיטה זו ניתנת להדמיה, התערבות ומניפולציה תפקודיות של הנישה.

המטרה הכוללת של הליך זה היא להרחיב את אבות הלבלב הרב-פוטנטיים הקשורים בפיגום מטריג'ל תלת מימדי שבו הם יכולים להתמיין ולארגן את עצמם. זה מושג על ידי בידוד הלבלב מעוברי עכבר ביום העוברי 10.5. השלב השני הוא הסרת המזנכימה וניתוק האפיתל לתאים בודדים וגושים קטנים.

השלב האחרון הוא השעיית התאים במטריג'ל ודגירה של הג'ל הפולימרי להרחבה. בסופו של דבר, זה מוביל לאורגנואידים מסועפים של הלבלב בארגון עצמי, בדומה ללבלב העוברי של העכבר שניתן לדמיין בשידור חי או בנקודת הקצה על ידי מיקרוסקופיה. היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני השיטות הקיימות, כמו כל הלבלב, הוא שמתחילים מאוכלוסיית תאים מוגדרת היטב ופחות מורכבת.

אבות הלבלב נשמרים טוב יותר בתלת מימד מאשר בתרביות תאים דו-ממדיות. שיטה זו יכולה לעזור לנו לענות על כמה שאלות קריטיות בתחום, כגון אינטראקציה בין תאים או אינטראקציה בין תאים למטריצה. זה יוביל בסופו של דבר להבנה כיצד נוצר קיטוב, ולכן גם כיצד נוצר מגוון תאים.

ההשלכות של טכניקה זו משתרעות על טיפול בסוכרת לאחר הסתגלות בבני אדם, מכיוון שאנו יכולים להרחיב את הלבלב שיוליד תאים טובים יותר המייצרים אינסולין. הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית מכיוון ששלב ההסרה של הזמן המדהים קשה לביצוע ושלב הדיסוציאציה חשוב להיווצרות אורגנואידים של איברים. כדי להתחיל, הניחו עובר עכבר שבודד בעבר ביום העוברי 10.5 לתוך צלחת פטרי נקייה של 35 מילימטר ב-PBS.

לאחר מכן, השתמש במלקחיים דקים ברוחב של כ-0.05 מילימטר כדי להסיר את הגפה הקדמית. הכנס בעדינות את המלקחיים לפתח כדי לנתק את מערכת העיכול מאזור חוט השדרה. אתר את הקיבה, הכבד והמעי על העובר.

לאחר מכן השתמש במחטים כדי לבודד את מערכת העיכול מהקיבה למעי. מניחים את מערכת העיכול ב-DMM קר על קרח. חזור על השלב הקודם כדי לבודד כל מערכת עיכול בנפרד.

שמור את דרכי העיכול האישיות בבארות שונות. בצלחת של 24 בארות עם DMM קר על קרח, יש צורך להפריד ביניהם רק אם יש חשיבות לגנוטיפ. הניחו מערכת עיכול אחת בצלחת פטרי נקייה בגודל 33 מילימטר ב-PBS קר ודמיינו במיקרוסקופ דיסקציה באמצעות התאורה מלמטה כשדה בהיר.

לאחר שמערכת העיכול נמצאת במוקד, נתחו את ניצן הלבלב הגבי באמצעות לשון מושחזת אלקטרוליטית במקום מחטים או מחטי מזרק בגודל 20. בודדו את ניצן הלבלב עם כמה שפחות מזנכימה סביב האפיתל. מניחים את הניצן המבודד בצלחת פטרי ודוגרים בקור נקודה אחת של 25 מיליגרם למיליליטר לתמיסת חלל למשך שתיים-שלוש דקות.

מנקודה זו בעת העברת הניצן, השתמש בנימי זכוכית של 50 מיקרוליטר המחוברים לצינור גמיש הנשלט על ידי הפה. הכניסו את הניצן לתמיסה בשליטה מיקרוסקופית. יש להחזיר ניצן לבלב ל-PBS.

לאחר מכן נקו את ניצן הלבלב המבודד מהמזנכימה באמצעות המחטים ושאיפה עדינה עם נימי הזכוכית. לאחר הסרת המזנכימה כולה, שטפו את ניצן הלבלב ב-PBS קר והעבירו כל ניצן לבארות נפרדות. בצלחת 60 באר המכילה 10 מיקרוליטר DMM קר לבאר.

כדי לשטוף את ניצני הלבלב המנותחים, פיפטה כל ניצן לבארות חרוטיות בודדות ומגש מיני של 60 בארות המכיל 10 מיקרוליטר PBS לכל אחד. ובכן, לאחר מכן העבירו את ניצן הלבלב לבאר המכילה 10 מיקרוליטר של 0.05% טריפסין ודגרו למשך ארבע דקות. בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, השביתו את הטריפסין על ידי העברת הניצן לבאר המכילה 10 מיקרוליטר של DMM עם סרום עגל עוברי של 10% צינור את תרחיף התא דרך נימים דקים הנמשכים עם מושך פיפטה כדי לנתק את התאים.

דיסוציאציה חלקית מומלצת מכיוון שאורגנואידים בלבלב מתחילים בצורה אופטימלית מקבוצות קטנות של חמישה עד 15 תאים. אסוף את התאים ממספר עוברים לתוך צינור איינור כדי למזער את ההבדלים הנובעים מעיבוד אינדיבידואלי. יש לדלל את תרחיף התאים ביחס של אחד לשלושה במטריגל מקורר.

הציגו את מתלה התא המדולל לצלחת ארבע בארות, או צלחת 96 בארות על ידי פיפטינג. שמונה מיקרוליטר לבאר. דגרו את הצלחת בחום של 37 מעלות צלזיוס למשך חמש דקות כדי לאפשר לג'ל המטרי להסמיך.

מלאו את באר המיקרו במדיום תרבית והניחו את הצלחת בסביבה לחה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס המכילה 5% CO2 ו-95% אוויר. החלף את המדיום כל ארבעה ימים ועקוב אחר מושבות הלבלב הגדלות מדי יום. תעד את תהליך הגידול באמצעות מיקרוסקופ זמן-lapse, תאי אב לבלב גבי מעכברים בעובר.

יום 10.5, שגדל במדיום אורגנואידי, הראה התרחבות של אשכולות תאים לאורך שבעת ימי התרבית והחל להסתעף לאחר ארבעה ימים. תאים בודדים לא התרחבו ואיבדו ביטוי אחד של PDX. בעוד שהאשכולות הגדולים שמרו על pdx.

ביטוי אחד, תאי אב לבלב הגדלים בכדור. מדיום התרחב בתדירות גבוהה יותר מאשר באורגנואיד. בנוסף, אילומינה זוהתה ביום השני עד השלישי והתרחבות נוספת הובילה לכדורים חלולים חד-שכבתיים עם אזורים רב-שכבתיים מקומיים מדי פעם.

ניתוח היסטולוגי של אורגנואיד אישר הרכב של אבות הלבלב בשבעה ימים, כפי שהוצג על ידי צביעה חיובית עבור H, NF, תאים מובחנים אחד, B ו-PDX, זוהו גם על ידי צביעה לסמן האקסוקריני, עמילאז ואינסולין הסמן האנדוקריני. הכדורים באו לידי ביטוי בצורה הומוגנית יותר. סמני האב של הלבלב hnf אחד B ו-PDX אחד והבדיל פחות מאורגנואידים.

בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור לא לנתק לחלוטין את התאים בעקבות הליך זה. אתה יכול להתייחס לאורגנואידים האלה בדיוק כמו שזה היה איבר קטן. לכן, אתה יכול לבצע QPCR רגיל.

אתה יכול לבצע QPCR של תא בודד, לעשות הדמיה חיה. אתה יכול לעשות אימונוהיסטוכימיה, ועל ידי ביצוע כל השיטות הללו, אתה יכול לקבל הבנה של הדינמיקה התאית המתרחשת בזה, במבנה דמוי איבר קטן זה, אתה יכול לדגור עם כימיקלים קטנים ולכן לקיים אינטראקציה עם המסלולים השונים המעניינים. טכניקה זו תסלול את הדרך לחוקרים לזהות את מנגנוני התפתחות הלבלב ויצירת תאים טובה יותר כרגע בעכבר, אך בעתיד, החל מתאי ESL אנושיים או IP S.

לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד ליצור לבלב קטן המחקה את התפתחות הלבלב הרגילה מכמה אבות בסביבה תרבותית תלת מימדית.