טיהור מרקר פני תא בתיווך של התשומות לייצור תאי iPS מדגם אפשר לתכנת עכבר

המטרה הכוללת של הליך זה היא לבודד את תוצרי הביניים הנדירים של תכנות מחדש מתרביות של פיברובלסטים עובריים של עכברים. זה מושג על ידי הפקת פיברובלסטים עובריים של עכברים מעוברי E 13.5 של זן עכבר הניתן לתכנות מחדש. בשלב השני, הפיברובלסטים העובריים של עכברי המעבר הנמוך נזרעים בגזע פלוריפוטנטי מושרה או במדיה של תאי IPS בתוספת דוקסיציקלין כדי להתחיל את תהליך התכנות מחדש.

לאחר מכן, התאים נקצרים בנקודות זמן נבחרות במהלך תכנות מחדש ומסומנים בנוגדנים כנגד סמנים ספציפיים על פני התא. בסופו של דבר, ניתן לבודד את חומרי הביניים הנדירים המתכנתים מחדש על ידי עובדות לצורך ניתוח ניסיוני נוסף. היתרון העיקרי של טכניקה זו של השיטות הקיימות הוא שניתן לבצע מחקרים מכניסטיים על תוצרי הביניים הנדירים בתכנות מחדש בהיעדר תאים עמידים לתהליך התכנות מחדש, המהווים את עיקר האוכלוסייה כדי ליצור עוברי עכבר, פיברובלסטים או mes מתחילים בהעברת קרן רחם עוברית ביום 13.5 לתוך צלחת תרבית רקמה של 10 סנטימטר המכילה 10 מיליליטר PBS סטרילי.

לאחר מכן השתמש במספריים מעוקרים בדרגה כירורגית כדי לחתוך את הקרן לחתיכות בודדות שכל אחת מהן מכילה עובר אחד. לאחר מכן, תחת מיקרוסקופ דיסקציה במכסה המנוע של תרבית רקמות, השתמש במלקחיים מעוקרים כדי להסיר בזהירות את מעטפת הרחם ואת הממברנה העוברית הנוספת המקיפה כל עובר ולהעביר כל עובר שנחבט לצלחות בודדות של 10 סנטימטרים עם 10 מיליליטר PBS טרי. לאחר מכן המשך על ידי הסרת הראש, הגפיים, הזנב והאיברים הפנימיים של כל עובר בעזרת מלקחיים.

הקפיאו את הראשים בצינורות בודדים של 1.5 מיליליטר לגנוטיפ לפי הצורך. העבירו כל פלג גוף עליון לצלחות בודדות חדשות של 10 סנטימטרים והשתמשו בשני להבים כירורגיים כדי לטחון כל עובר למשך שתי דקות. עכל את חתיכות הרקמה ב-200 מיקרוליטר של טריפסין EDTA במשך שלוש עד חמש דקות בטמפרטורת החדר, ולאחר מכן שתי דקות נוספות של טחינה.

לאחר מכן השביתו את הניסיון עם שני מיליליטר של מדיה מת' והעבירו את תמיסת התא לצינור של 15 מיליליטר באמצעות פיפטה של 1000 מיקרוליטר. יש לנתק את הרקמה באופן מכני עם פיפטינג עדין ולאחר מכן להעביר את תמיסת התא לצלחת מצופה ג'לטין בגודל 10 סנטימטרים. הוסף עוד 10 מיליליטר של מדיה מת' לתרבות.

לאחר 24 עד 48 שעות, הצלחת צריכה להיות מכוסה בצפיפות ב-MEFs כדי לתכנת מחדש את ה-MEFs להפשיר תחילה תרבית מת' קפואה במעבר נמוך באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס, ולאחר מכן להעביר את התוכן לתוך צינור המכיל 10 מיליליטר של חומר מת' חם מראש. לאחר סיבוב התאים, השעו מחדש את הגלולה ב-12 מיליליטר של חומר מת' טרי והעבירו את תרחיף התא לתוך כלי תרבית T 75 מצופה ג'לטין. לאחר תקופת התאוששות של 24 עד 48 שעות, שטפו את ה-MEFs עם PBS ולאחר מכן נתקו את התאים עם שלושה מיליליטר של טריפסין EDTA למשך שלוש עד חמש דקות ב-37 מעלות צלזיוס.

לאחר מכן עצור את העיכול האנזימטי עם חמישה מיליליטר של מדיה מת' ונתק עוד יותר את התאים על ידי ערבוב עדין עם פיפטה של 10 מיליליטר. לאחר מכן, תכנתו מחדש את המטס על ידי זריעת התאים על גבי ג'לטין חדש, מצופה צלוחיות T 75 ב-6.7 כפול 10 עד התאים השלישיים לסנטימטר רבוע ב-12 מיליליטר של מדיה IPSC המכילה שני מיקרוגרם למיליליטר דוקסיציקלין במשך ששת הימים הראשונים. החלף את המדיה כל יומיים במדיית IPSE טרייה בתוספת דוקסיציקלין הקוצרת את חומרי הביניים לתכנות מחדש בנקודות הזמן הנדרשות על ידי ניתוק טריפסין EDTA כפי שהודגם זה עתה עבור כל תרחיף ביניים שנקטף.

שוטפים את התאים ב- PBS. ואז החייאה. השעו את הכדורים במדיה בפקס לתיוג נוגדנים כדי ליצור תרביות IPSC מתוכנתות מחדש במלואן.

גדל את התאים באמצעי IPSC נטול דוקסיציקלין למשך ארבעה עד שבעה ימים נוספים כדי לתייג את התאים שתוכנתו מחדש. סמן את חומרי הביניים שנקטפו עם הנוגדנים המתאימים המעניינים. לאחר 10 דקות, הקש בעדינות על הצינורות כדי להשעות מחדש את התאים ולאחר מכן הנח את הצינורות על קרח למשך 10 דקות נוספות.

לאחר הדגירה השנייה יש לשטוף את התאים ב -10 מיליליטר PBS קר לכל צינור. לאחר מכן שאפו בזהירות את הסופרנטנט ותלו מחדש את הכדורים בנפח מתאים של אמצעי תיוג בתוספת סיכת P בגודל שבע על קרח. לאחר 20 דקות, שטפו את התאים ב-10 PBS קרים נוספים והשעו מחדש את כדורי התאים באמצעי תיוג בתוספת פרופידיום יודיד.

סנן את כל גושי התאים על ידי העברת התרחיף דרך מסננת של 70 מיקרומטר ולאחר מכן העבר את התאים לצינורות הפקס המתאימים על קרח. לבקרות השכר. Resus משהה בקבוקון קריו של תאי IPS הנשמר על mes מוקרן ב-800 מיקרוליטר של מאגר תיוג.

הקצאת 200 מיקרוליטר תאים לבקרת הבקרה ללא תווית. לאחר מכן פצל את תרחיף התאים הנותר בין שלושה צינורות של 15 מיליליטר עבור בקרות הצבע הבודד וסמן את הדגימות כפי שהודגמו זה עתה כדי לנתח את חומרי הביניים על ידי ציטומטריית זרימה. התחל בהגדרת שער בתרשים הפיזור קדימה לצד זה כדי לא לכלול פסולת.

לאחר מכן השתמש בגובה הפיזור קדימה לעומת אזור הפיזור קדימה כדי לא לכלול את האגרגטים ואת ערוץ ה-PI לעומת הפיזור קדימה. לשער על התאים החיים השליליים של PI. השתמש בתאים ללא תווית כדי לכוונן את כרךtages עבור שבעת ערוצי ה-FITC וה-PSI הכחולים של האוקיינוס השקט.

מיקום אידיאלי של אוכלוסיית התאים בקצה התחתון של הערוץ המתאים. לאחר מכן, הגדר את השערים עם תאי הבקרה הלא מסומנים כדי לחלק את תרביות התכנות מחדש ליום השלישי, השישי והתשיעי. אוכלוסיות של SSEA, תאים חיוביים TH 1.2 שליליים, תאים שליליים אחד, תאים שליליים, TH 1.2 ותכנות מחדש, תאים שליליים, SSEA, תאים שליליים TH 1.2 חיוביים.

לאחר מכן חלקו עוד יותר את היום התשיעי SSEA שבר שלילי חיובי אחד TH 1.2 עם תרשים SSEA אחד לעומת EPAM. באמצעות הבקרה הלא מסומנת צייר שערים סביב התאים החיוביים של EPAM והתאים השליליים של EPAM כפי שמוצג כאן. לבסוף, אסוף את התאים במיליליטר אחד עד שניים של מדיה סלולרית IPS.

עם אינדוקציה של דוקסיציקלין, מיתוסים עוברים שינויים מורפולוגיים ברורים בסביבות היום השישי. מתחילים להופיע טלאים דמויי מושבות מוקדמים שממשיכים לגדול בגודלם עם תרבית נוספת. ניסוי תכנות מחדש טוב יביא ליותר מ-500 מושבות לכל T 75 שנזרעו בתחילה עם חמישה פעמים 10 עד חמישית תאים ותרביות IPS מבוססות יהיו בעלות מושבות אופייניות בצורת כיפה ויהיו ברובן נטולות תאים מובחנים.

שינויים מורפולוגיים ומולקולריים במהלך תכנות מחדש באים לידי ביטוי בביטוי פני התא של ירך 1.2 SSEA one, ובסופו של דבר epca. בעוד ש-MES חיובי בעיקר לירך 1.2 ושלילי לסמנים האחרים, ביום השלישי, חלק גדול מהתאים החלו לווסת את הביטוי של ירך 1.2, ותת-קבוצה קטנה מאוד הפכה ל-SSEA חיובית אחת. ניתן לזהות את התכנות מחדש בפועל לנקודת זמן זו בימים 6 ו-9, אחוז מוגבר של תאים חיוביים ל-SSEA, בדרך כלל הרבה מעל 10%, בסביבות היום ה-12.

ניתן לזהות תת-קבוצה של תאים חיוביים ל-SSEA 1 שהם גם חיוביים. עבור epca. תרביות תאי IPS מבוססות יהיו חיוביות מאוד.

עבור SSEA one ו-EPCA בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור להשתמש רק במפות מעבר נמוכות שעברו גנוטיפ נכון לפני כן.