שיטת Immunofluorescent לאפיון של תאי הוושט של בארט
20 ביולי 2014
יש צורך ניכר למידע משופר על נהגים מולקולריים של ושט בארט. מכתים Immunofluorescent הוא טכניקה שימושית להבנת ההשפעות של תא איתות במורפולוגיה של תאים. אנו מציגים פרוטוקול פשוט, יעיל לשימוש בצביעת immunofluorescent להעריך טיפול רפואי בתאי הוושט של בארט.
המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא להעריך את ההשפעות של טיפול תרופתי על מבנה התא ולוקליזציה של חלבונים בתאי BE. זה מושג על ידי דגירה של תאי ה-BE הגדלים על החלקות כיסוי הזכוכית עם תרופה נבחרת בתנאי תרבית תאים סטנדרטיים. כשלב שני דגירה על התאים המטופלים עם קיבוע, המשמר את מבנה החלבון ולוקליזציה.
לאחר מכן, תאי be קבועים מודגרים ברצף עם נוגדנים משניים ראשוניים ומתויגים פלואורסצנטית על מנת לדמיין שינויים בחלבון המטרה שנבחר באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית מתקבלות תוצאות המראות כיצד טיפול תרופתי בתאי be משנה את לוקליזציה של חלבון ומבנה התא על סמך הדמיה של צביעה אימונו-פלואורסצנטית. למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנה לגבי הוושט של בארט, ניתן ליישם אותה גם על מערכות אחרות כולל סרטן ותאים נורמליים. התחל הליך זה על ידי הנחת החלקות הכיסוי בגודל 18 מילימטר בצלחת פטרי מזכוכית וחיטוי אותן.
לאחר מכן העבירו את החלקות כיסוי החיטוי לצלחת תרבית רקמות של 12 בארות באמצעות פיפטת זכוכית סטרילית המחוברת לצינור ואקום. לאחר הכביסה הזו, הכיסוי מחליק עם PBS ומדיה סטריליים. הטריפסין הבא.
התאים האימורטליים סופרים את התאים באמצעות מונה תאים אוטומטי או ציטומטר המו לאחר מכן מדללים את התאים במצע תרבית לריכוז של 20,000 עד 40,000 תאים למיליליטר. לאחר מכן הניחו מיליליטר אחד של תאים בכל באר המכילה פתק כיסוי. לספירת תאים כוללת של 20,000 עד 40,000 תאים לבאר השתמש בקצה פיפטה סטרילי כדי לדחוף בעדינות את החלקת הכיסוי לתחתית הבאר כדי להבטיח שהתאים יתחברו להחלקת הכיסוי.
כדי לטפל בתאי BE, יש לדלל את התרופה שנבחרה ב-37 מעלות צלזיוס מדיה לתערובת הריכוז הרצויה היטב על ידי היפוך הצינור שוב ושוב או שימוש במערבל מערבולת. התחל בטיפול 24 שעות לאחר הישיבה הראשונית של תאי ה-BE כדי לאפשר חיבור תאים לכיסוי החלקה כעת תווית מראש של לוחות דגימה שטופלו בתרופות וברכב עם עט מעבדה כדי להבחין בין השוואה לבקרה. טפל בהחלקת כיסוי נוספת של תאי be עם 0.1% רכב מדולל במצע התרבית.
לאחר מכן, הניחו את התאים באינקובטור תרבית תאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, 5% פחמן דו חמצני ו-98% לחות. כעת לאחר זמן הדגירה הרצוי של הטיפול התרופתי, שאפו את המדיה ושטפו את הכיסוי מחליק במהירות עם XPBS אחד בטמפרטורת החדר. לאחר מכן שאפו את ה-PBS והוסיפו מיליליטר אחד של PBS המכיל 4% PFA לכל באר ודגרו בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות.
לאחר מכן, שאפו את ה-4% P-F-A-P-B-S שטפו את החלקות הכיסוי שלוש פעמים חמש דקות בכל פעם עם PBS בטמפרטורת החדר. אחסן את פתקי הכיסוי למשך שבוע ב-PBS ו-0.1% PFA בארבע מעלות צלזיוס אם תרצה. כדי לחדור עיניים לתאי ה-PFA הקבועים על מנת לאפשר לנוגדנים לגשת למטרות התוך-תאיות, דגרו על התאים עם אמוניום כלוריד של 50 מילי-מולרי מדולל ב-PBS למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.
לאחר מכן שטפו אותם עם PBS בטמפרטורת החדר פעם אחת למשך חמש דקות. זה יצמצם את הרקע כדי למנוע קשירה לא ספציפית של נוגדנים לחלבונים התאיים. דגרו את תאי ה-BE למשך 30 דקות ב-100 עד 300 מיקרוליטר של PBS המכילים 0.1% טרופונין ו-0.5% BSA.
לאחר מכן הכינו צלחת ביולוגית מרובעת על ידי שכבת תחתית החדר במגבות נייר רטובות והנחת שכבת בושם מעל. סמן את הפרפיום בעט מעבדה כדי לזהות את פתקי הכיסוי. העבירו בעדינות את הכיסוי מחליק תאים הפונים כלפי מעלה אל הפראם באמצעות מלקחיים ומחט מזרק.
כעת יש לדלל את הנוגדן העיקרי ב-PBS המכיל גם 0.5% BSA וגם 0.1% ספונין ולמחוק בעדינות את תמיסת החסימה. בעזרת רקמת מעבדה, הוסף 100 מיקרוליטר מתמיסת הנוגדנים העיקרית ודגר את תאי ה-be למשך הלילה בארבע מעלות צלזיוס. למחרת.
שטפו את השקופיות שלוש פעמים עם PBS המכיל 0.5% BSA ו-0.1% טרופונין במשך חמש דקות בכל פעם בטמפרטורת החדר. לאחר מכן יש לדלל את הנוגדן המשני המצומד עם תג פלואורסצנטי ב-PBS המכיל 0.5% BSA ו-0.1% פוננט. הוסף 100 מיקרוליטר נוגדן מדולל לכל החלקת כיסוי ודגר את התאים למשך שעתיים בטמפרטורת החדר לאחר שעתיים.
שטפו את הכיסוי שלוש פעמים חמש דקות בכל פעם ב-PBS המכיל 0.5% BSA ו-0.1% טרופונין. הסר את מאגר הכביסה והוסף 100 עד 300 מיקרוליטר PBS להחלקות הכיסוי. הרם בעדינות את פתק הכיסוי בעזרת מלקחיים ומחק את ה-PBS באמצעות טישו מעבדה או מגבת נייר.
לאחר מכן הוסף 15 מיקרוליטר של מדיית הרכבה מתאימה של אנטיפה המכילה DPI להחלקת הכיסוי. הנח את החלקה של הכיסוי ההפוך על שקופית מיקרוסקופ זכוכית כשהתאים פונים כלפי מטה. לאחר מכן הנח את השקופיות בתיקיית שקופיות והרחיק אותן מאור ישיר למשך הלילה בטמפרטורת החדר כדי לאפשר למדיום האנטיפה להתרפא.
לאחר שמדיום האנטיפה התייצב, ניתן לאחסן את השקופיות בארבע מעלות צלזיוס או ב-20 מעלות צלזיוס עד להדמיה מיקרוסקופית. בשלב זה, הסר את שקופיות האחסון מ-20 מעלות צלזיוס שליליות או ארבע מעלות צלזיוס ואפשר להן להתחמם לטמפרטורת החדר. הפעל את המיקרוסקופ ואת מנורת קשת הכספית.
הנח שקופית מיקרוסקופ כשהחלקת הכיסוי פונה לכיוון המטרה על המיקרוסקופtagה. לאחר מכן, בחר את מסנן ה-DAPI ופתח את התריס. מקד את המטרה תוך התבוננות דרך חלקי העיניים עד להופעת התמונה.
מכיוון שכל התאים נצבעו ב- dpi, יש לצפות בקלות בגרעינים . אסוף תמונות באמצעות תוכנת עיבוד תמונה מתאימה באיור זה, כריכה תלושים עם CPC ו-CPD טופלו ברכב או במיקרו-טולר אחד של מעכב SRC. SKI 6 0 6 למשך 24 שעות להיות התאים תוקנו ונצבעו.
על פי הפרוטוקול המתואר, בטא קטנין המסומן בירוק הודגם באמצעות נוגדן ספציפי ונוגדנים משניים המחוברים ל-LOR 4 88 בעוד שהגרעין נצבע ב-DPI המסומן בכחול. שימו לב לשינוי במיקום של בטא-קטנין מהגרעין לקרום התא. לאחר טיפול ב-SKI 6 0 6.
לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לצבוע את הוושט של בארט באופן פלואורסצנטי כדי לחקור לוקליזציה של חלבון או מבנה תא.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מאמר זה מציג פרוטוקול לצביעה אימונופלואורסצנטית לבחינת תאים של ושט ברט (Barrett's Esophagus). השיטה מאפשרת לחוקרים להעריך את השפעות הטיפול התרופתי על מבנה התא ועל לוקליזציה של חלבונים.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדע
- ביולוגיה של התא
- מדעי המוח
- אונקולוגיה
רקע
- ואזופגוס ברט (Barrett's Esophagus) הוא מצב רפואי הדורש הבנה טובה יותר של המניעים המולקולריים שלו.
- צביעה אימונופלואורסצנטית היא טכניקה בעלת ערך להדמיית שינויים תאיים.
- טיפול תרופתי עלול לשנות את לוקליזציית החלבונים ואת מורפולוגיית התאים.
- ניתן להחיל שיטה זו גם על סוגי תאים אחרים, כולל תאי סרטן.
מטרת המחקר
- להערכת השפעת טיפול תרופתי על תאי ושט של ברט (Barrett's Esophagus).
- להדמיית שינויים במיקום החלבונים באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית.
- לספק פרוטוקול פשוט וישיר לחוקרים בתחום.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- דגירה של תאי BE עם תרופה בתנאי תרבית סטנדרטיים.
- קיבוע של התאים המטופלים כדי לשמר את מבנה החלבון.
- דגירה רצפתית עם נוגדנים ראשוניים ונוגדנים שניוניים המסומנים בתווית פלואורסצנטית.
- ויזואליזציה של שינויים בלוקליזציה של החלבון באמצעות מיקרוסקופיית פלואורסצנציה.
תוצאות עיקריות
- הטיפול התרופתי הוביל לשינויים ניתנים לצפייה בלוקליזציה של החלבון.
- שינויים במבנה התא תועדו באמצעות צביעה אימונופלורסצנטית.
- השיטה הוכחה כיעילה להערכת התערבויות טיפוליות.
- ניתן ליישם את התובנות שהתקבלו על מערכות ביולוגיות אחרות.
מסקנות
- הפרוטוקול מהווה כלי בעל ערך לחקר של Barrett's Esophagus.
- צביעה אימונופלואורסצנטית יכולה לשפר את ההבנה של התגובות התאיות לטיפול.
- ניתן להחיל את השיטה ביישומים נוספים במחקר הסרטן.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
שיטת סמימה אימונופלואורסצנטית זו מאפשרת לצוותי מו"פ בתחום הביופארמה להעריך שינויים הנגרמים על ידי תרופות בלוקליזציה של חלבונים ובמבנה התא במודלים של ושט ברט (Barrett's esophagus), ובכך לתמוך בתיקוף מטרות (target validation) ובהפחתת סיכונים מכניסטיים בתהליך גילוי תרופות לאדנוקרצינומה של הוושט. על ידי אספקת קריאה כמותית הניתנת לשחזור של השפעות תרכובות טיפוליות על מסלולי איתות, הטכניקה מגבירה את הביטחון החזוי בסריקה פרה-קלינית ובהחלטות של תעדוף תיקי פיתוח.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של היפותזות טיפוליות באמצעות ויזואליזציה של שינויים המושרים על ידי תרופות בחלבוני איתות מרכזיים כגון beta-catenin.
- ערך תפעולי: מספק בדיקה סטנדרטית מבוססת מיקרוסקופיה לתיקוף פונקציונלי של מטרה בתאי וווריאנטים של Barrett's esophagus המומתים.
- ערך אסטרטגי: תומך בהפחתת סיכונים ביולוגיים ובביטחון חיזוי בבחירת מטרה על ידי קישור הטיפול בתרכובת לארגון מחדש תת-תאי שניתן לצפייה.
סריקה ופיתוח בדיקה (Assay)
- ערך מדעי: מייצר קריאות פלואורסצנציה כמותיות המאפשרות סריקת תרכובות לאיתור מודולטורים של לוקליזציה של חלבונים וארכיטקטורה תאית.
- ערך תפעולי: מבסס תהליך עבודה של אימונופלואורסצנציה סטנדרטי וניתן לשחזור, התואם פורמטים של פלטות רב-בארים ומערכות דימות אוטומטיות.
- ערך אסטרטגי: מקל על הגדלת קנה המידה של הבדיקה ושימוש חוזר במגוון פלטפורמות עבור קמפיינים לזיהוי מולקולות מובילות (lead identification) המכוונות למסלולים של אדנוקרצינומה של הוושחת.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- ערך מדעי: שומר על הרלוונטיות למחלה על ידי מידול מנגנוני ההתקדמות של ושט ברט (Barrett's esophagus) לאדנוקרצינומה in vitro.
- ערך תפעולי: מבטיח רצף תרגומי משלב הגילוי ועד לתיקוף פרה-קליני באמצעות קריאות עקביות של לוקליזציית חלבונים.
- ערך אסטרטגי: מספק בסיס להחלטות קידום מותאמות סיכון על ידי מתן תובנות מכניסטיות לגבי השפעות התרכובות על מעבר אפיתל-מזנכימלי (epithelial-mesenchymal transition) ונתיבים תומאורגניים.
שילוב בצינור עיבוד ובזרימת עבודה
השיטה משתלבת ברצף הגילוי, החל מאימות מוקדם של מטרה, דרך זיהוי תרכובות מובילות ועד למחקרים מכניסטיים פרה-קליניים, ובכך מאפשרת הערכה איטרטיבית של השפעות התרכובות על הביולוגיה התאית של ושט ברט (Barrett's esophagus).
- ביולוגיה של גילוי: תומך בבדיקת השערות ובהבהרת מסלולים על ידי ויזואליזציה של שינויים בחלבונים של איתות אונקוגני המושרים על ידי תרופות.
- סריקה: מספק מוכנות של בדיקה (assay) ותוצרים כמותיים להערכת ספריות תרכובות מול מטרות הרלוונטיות לוושח Barrett.
- אנליטיקה: מייצר מדידות מבוססות פלואורסצנציה ומדדי לוקליזציה המאפשרים השוואה ראש בראש של תנאי טיפול.
- מחקר תרגומי: מקשר בין ממצאי הגילוי לרציפות פרה-קלינית על ידי מידול תגובות תאיות הרלוונטיות למחלה אנושית להתערבות טיפולית.
- שימוש חוזר ארגוני: משמש כפלטפורמת דימוג רב-פעמית הישמה במערכות של תאי סרטן ותאים נורמליים לצורך מאמצים נרחבים של תיקוף מטרות.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החיזוי בתיקוף המטרה על ידי הפחתת העמימות המכניסטית באמצעות ויזואליזציה ישירה של שינויים בלוקליזציה של חלבונים.
- ערך תפעולי: משפר את הסטנדרטיזציה, השחזוריות והסקילביליות של בדיקות דימוי תאי בקרב צוותי הגילוי והצוותים הפרה-קליניים.
- ערך אסטרטגי: משפר את איכות קבלת ההחלטות לגבי המשך הפיתוח (go/no-go) ואת יעילות ההון על ידי מתן אפשרות לגילוי מוקדם של תרכובות פעילות ביולוגית.
- השפעה על פורטפוליו המוצרים: תומך בתעדוף מבוסס סיכון ובהחלטות קידום על ידי קישור תוצאות סריקה פנוטיפית למסלולים מכניסטיים ב-esophageal adenocarcinoma.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בתרביות תאים, מיקרוסקופיית אימונופלואורסצנציה וטכניקות זיהוי מבוססות נוגדנים.
- תלוי בגישה למערכות מיקרוסקופיית פלואורסצנציה, לכיסויי זכוכית (cover slips) ולערכות ריאגנטים סטנדרטיות לקיבוע וחדירות (fixation and permeabilization).
- מצריך סטנדרטיזציה בין-צוותית של פרוטוקולי צביעה, הגדרות דימוי ונתיבי ניתוח להשגת תוצאות הדירות.
- כולל שיקולי התאמה בעת העברת השיטה למודלים תאיים שונים או לתנאים שונים של מטריקס חוץ-תאי.
- מוגבל על ידי זמינותם של נוגדנים ראשוניים מתוקפים הספציפיים למטרות העניין במסלולי האיתות של ושט ברט (Barrett's esophagus).
