Name: שיטת Immunofluorescent לאפיון של תאי הוושט של בארט (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-07-20T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 54 s
Description: למדו שיטת צביעת immunofluorescent לאפיון תאי הוושט של בארט. הפרוטוקול מאפשר הערכת השפעות טיפול תרופתי על מבנה תאים ולוקליזציה של חלבונים במיקרוסקופ פלואורסצנטי.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מסנט, קרנו של יוסף (AJF, LJI) ואיגוד ריאות האמריקאי, RG-224,607-N (LJI).

1. תחזוקת קו סלולרי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אדם הנציח BE שומות בדרגה גבוהה (CP-B, CP-C, CP-D) וmetaplastic (CP-) שורות תאים על ידי transfection היציב של טלומראז האנושי להפוך חלבון טרנסקריפטאז (טרט) 11. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשמור BE שורות תאים בתקשורת keratinocyte בתוספת תמצית שור יותרת המוח (BPE), גורם אפידרמיס צמיחה (EGF), 5% בסרום שור העובר (FBS), חומצות אמינו חיוניות (NEAA), פניצילין, סטרפטומיצין, ניאומיצין (PSN), וסטנדרטי תנאי תרבית רקמה (37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2, לחות 98%). </li></ol> 2. להיות נייד ציפוי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנת הצלחת / coverslips 12 היטב. הנח 18 coverslips מ&quot;מ לתוך צלחת פטרי זכוכית וחיטוי. העברת autoclaved 18 coverslips זכוכית מ&quot;מ לתוך צלחת תרבית רקמת 12 גם באמצעות פיפטה זכוכית סטרילית מחוברת לצינור ואקום. שטוף את coverslip עם PBS ותקשורת סטרילית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Trypsinize ולספור תאים להיות מונצחים. ספירת תאי USIng דלפק תא אוטומטי או hemocytometer. לדלל תאים בתקשורת והתרבות לריכוז של 20,000-40,000 תאים / מיליליטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקום 1 מיליליטר של תאים לתוך כל המכיל coverslip לספירת תאים כולל של 20,000-40,000 תאים / היטב היטב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בקצה פיפטה סטרילית לדחוף בעדינות את coverslip לתחתית הבאר, כדי להבטיח שתאים לצרף coverslip. </li></ol> 3. הטיפול התרופתי של תאים להיות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל תרופה שנבחרה בתקשורת חמה (37 מעלות צלזיוס) לריכוז רצוי ומערבבים היטב על ידי צינור היפוך שוב ושוב או בעזרת מערבל מערבולת. ריכוזי תרופה נקבעו באופן אמפירי. להתחיל טיפול 24 שעות הבאות הזריעה הראשונית של התאים יהיה לאפשר התקשרות תאים לcoverslip </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשם השוואה ובקרה, טיפול בcoverslip נוסף של תאים להיות עם רכב 0.1% (sulfoxide דימתיל [DMSO] או סוכן המשמש לsolubilize מתחם) בדילול מלא בתקשורת והתרבות. צלחת תווית עם עט מעבדה לזיהוי סמים וvehicle טופל דגימות. מקום תאים לתרבית תאי חממה מוגדרת 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2, לחות 98% ודגירה של נקודות זמן רצויים. </li></ol> 4. Immunofluorescent מכתים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קבעון <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעקבות זמן דגירה רצויה של טיפול תרופתי, לשאוב התקשורת לשטוף coverslips במהירות עם פוספט שנאגרו מלוח 1x (PBS) בטמפרטורת חדר (RT, 25 מעלות צלזיוס). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב PBS ולהוסיף 1 מיליליטר של PBS המכיל 4% PFA [4% PFA / PBS] היטב כל אחד ולדגור על RT במשך 30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב PFA 4% / PBS ולשטוף 3x coverslips, 5 דקות כל אחד עם PBS ב RT. coverslips חנות במשך שבוע אחד ב% PBS/0.1 PFA על 4 מעלות צלזיוס אם תרצה בכך. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Permeabilization / חסימה Permeabilize תאי PFA קבוע כדי לאפשר את הנוגדן כדי לגשת למטרות תאיים. לתאי ועלו חלבונים, לבצע את כל השלבים שלאחר מכן ללא saponin מתווסף פתרון BSA% PBS/0.5 1x. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להפחית את הרקע על ידי דוגרים עם 50 Cl NH 4 מ&quot;מ מדולל PBS 10 דקות ב RT ולשטוף עם RT-PBS פעם אחת במשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה תאים להיות עבור 30 דקות ב100-300 μl של PBS המכיל saponin 0.1% ו0.5% אלבומין בסרום שור (BSA). לדלל saponin ממניות 10% פילטר מעוקר, שהוכן במים ומאוחסנים ב 4 ° C. </li></ol> הערה: זה מונע ספציפי מחייב של נוגדנים לחלבונים תאיים על ידי חסימת coverslips בשל התוספת של BSA 0.5%. לחלופין, להחליף BSA עם הסרום עז המדולל ל -5% כדי לסייע להפחית ספציפי מחייב של נוגדנים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנה של לשכת האנוש <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן צלחת מבדק כיכר על ידי שכבות התחתונה של החדר עם מגבות נייר רטובות ומניח שכבה של Parafilm על העליונה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעדינות להעביר את coverslips, התאים פונים כלפי מעלה, על Parafilm באמצעות מלקחיים ומחט מזרק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סמן את Parafilm עם עט מעבדה כדי לזהות coverslips. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl">ראשי נוגדן דגירה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל את הנוגדן העיקרי PBS המכיל שני BSA 0.5% וsaponin .0.1%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעדינות למחוק את פתרון החסימה באמצעות רקמות במעבדה ומוסיף של פתרון הנוגדן הראשוני 100 μl. דגירה הנוגדן הראשוני בתאי BE לילה בשעה 4 ° C. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה נוגדנים משני <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטפו את השקופיות 3x עם% PBS/0.5 saponin% BSA/0.1 במשך 5 דקות כל אחד ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדולל משני נוגדנים מצומדות עם תג ניאון ב% PBS/0.5 saponin% BSA/0.1 ששני הנוגדנים מזהה מינים שבו הנוגדן הראשוני הועלה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספה של נוגדן בדילול 100 μl לכל coverslip. דגירה הנוגדנים משני עבור שעה 2 ב RT. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כביסה והרכבה של Coverslips <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף את coverslips 3x, 5 דקות כל אחד ב% PBS/0.5 saponin% BSA/0.1. הסר את החיץ לשטוף ולהוסיף 100-300 μl של PBS על coverslips. הערה: לקבלת אנטי כפוליםצביעת גוף, חזור על שלבים 4.4-4.5 עם הנוגדן ראשוני ומשניים נוסף הרצוי על פי מידע שהותווה בדיון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת מלקחיים, בעדינות להרים את coverslip ולמחוק את PBS באמצעות רקמות במעבדה או מגבת נייר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 15 μl של תקשורת מתאימה אנטי לדעוך הרכבה המכילה 4 &#39;,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) לcoverslip ולהפוך את coverslip, תאים למטה, לשקופית מיקרוסקופ זכוכית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את השקופיות לתוך תיקיית שקופיות ודגירה הרחק מאור ישיר הלילה ב RT כדי לאפשר את המדיום אנטי לדעוך קשה להגדיר כדי לרפא, על פי הוראות יצרן. ברגע שהמדיום אנטי לדעוך קבע, יכולה להיות מאוחסנות בשקופיות או 4 ° C או -20 ° C עד להדמיה מיקרוסקופית. </li></ol></li></ol> 5. להדמיה מיקרוסקופית של Coverslips ניתן הדמיה תאים מוכתמים באמצעות מיקרוסקופ או או confocal אם microscop הזקוף מסוגלדואר. למרות מיקרוסקופיה confocal מספקת תמונות ברזולוציה גבוהה בעומקים בדידים, מיקרוסקופי זקוף הוא מסוגל לייצר תמונות שימושיות יותר מהר. למען קיצור, שיטה של ​​הדמיה מוכתמת להיות תאים באמצעות מיקרוסקופיה סטנדרטית הוא מוצגת. באופן כללי, לisothiocyanate תמונה והעמסת (FITC) או fluorophores הדומה (כלומר חלבון פלואורסצנטי ירוק), טקסס האדומה וDAPI, דורש מיקרוסקופ עם מסננים מסוגלים להפלות fluorophores אלה. בדוק את המיקרוסקופ לפני תחילת פרוטוקול כדי לקבוע fluorophores התואם. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הדמיה על תקן אם מיקרוסקופ <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר שקופיות / coverslips מאוחסן מ-20 מעלות צלזיוס או 4 ° C ולאפשר להם לחמם לטמפרטורת חדר. כוח במיקרוסקופ ומנורת קשת כספית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח שקופיות מיקרוסקופ עם coverslip פונה כלפי אובייקטיבי על הבמה מיקרוסקופ. לשימוש במטרת טבילת שמן, להוסיף טיפה של שמן טבילה על coverslip. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר את מסנן DAPI ולפתוח את התריס. </li&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> להתמקד במטרה תוך מבט דרך העיני עד שהתמונה מופיעה. מכיוון שכל התאים יהיו כתם עם DAPI, הגרעינים צריכים להיות נצפים בקלות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף תמונות באמצעות תוכנת עיבוד תמונה בהתאמה. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Reid, B. J., Li, X., Galipeau, P. C., Vaughan, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Barrett%27s+oesophagus+and+oesophageal+adenocarcinoma%3A+time+for+a+new+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Barrett's oesophagus and oesophageal adenocarcinoma: time for a new synthesis.</a> Nat. Rev. Cancer. 10, 87-101 (2010).</li>
<li>Hayeck, T. J., Kong, C. Y., Spechler, S. J., Gazelle, G. S., Hur, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+prevalence+of+Barrett%27s+esophagus+in+the+US%3A+estimates+from+a+simulation+model+confirmed+by+SEER+data%5BTitle%5D)+AND+%22Dis.+Esophagus%22%5BJournal%5D)">The prevalence of Barrett's esophagus in the US: estimates from a simulation model confirmed by SEER data.</a> Dis. Esophagus. 23, 451-457 (2010).</li>
<li>Brown, L. M., Devesa, S. S., Chow, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Incidence+of+adenocarcinoma+of+the+esophagus+among+white+Americans+by+sex%2C+stage%2C+and+age%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Natl.+Cancer+Inst%22%5BJournal%5D)">Incidence of adenocarcinoma of the esophagus among white Americans by sex, stage, and age.</a> J. Natl. Cancer Inst. 100, 1184-1187 (2008).</li>
<li>Konturek, P. C., Burnat, G., Hahn, E. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+Barret%27s+adenocarcinoma+cell+growth+by+simvastatin%3A+involvement+of+COX-2+and+apoptosis-related+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Inhibition of Barret's adenocarcinoma cell growth by simvastatin: involvement of COX-2 and apoptosis-related proteins.</a> J. Physiol. Pharmacol. 58 Suppl 3, 141-148 (2007).</li>
<li>Peng, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glutathione+peroxidase+7+protects+against+oxidative+DNA+damage+in+oesophageal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Gut%22%5BJournal%5D)">Glutathione peroxidase 7 protects against oxidative DNA damage in oesophageal cells.</a> Gut. 61, 1250-1260 (2012).</li>
<li>Vona-Davis, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MAPK+and+PI3K+inhibition+reduces+proliferation+of+Barrett%27s+adenocarcinoma+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Surg.+Res%22%5BJournal%5D)">MAPK and PI3K inhibition reduces proliferation of Barrett's adenocarcinoma in vitro.</a> Surg. Res. 127, 53-58 (2005).</li>
<li>Inge, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((a+small+molecule+inhibitor+of+the+Src+kinase%2C+reduces+the+growth+and+activates+apoptosis+in+pre-neoplastic+Barrett%27s+esophagus+cell+lines%3A+evidence+for+a+noninvasive+treatment+of+high-grade+dysplasia%5BTitle%5D)+AND+%22Thoracic+Cardiovasc.+Surg%22%5BJournal%5D)">a small molecule inhibitor of the Src kinase, reduces the growth and activates apoptosis in pre-neoplastic Barrett's esophagus cell lines: evidence for a noninvasive treatment of high-grade dysplasia.</a> Thoracic Cardiovasc. Surg. 145, 531-538 (2013).</li>
<li>Jovov, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ion+transport+and+barrier+function+in+a+telomerase-immortalized+human+nondysplastic%2C+Barrett%27s+cell+line+%28BAR-T%29%5BTitle%5D)+AND+%22Dis.+Esophagus%22%5BJournal%5D)">Ion transport and barrier function in a telomerase-immortalized human nondysplastic, Barrett's cell line (BAR-T).</a> Dis. Esophagus. 22, 386-395 (2009).</li>
<li>Merlo, L. M., Kosoff, R. E., Gardiner, K. L., Maley, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+in+vitro+co-culture+model+of+esophageal+cells+identifies+ascorbic+acid+as+a+modulator+of+cell+competition%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cancer%22%5BJournal%5D)">An in vitro co-culture model of esophageal cells identifies ascorbic acid as a modulator of cell competition.</a> BMC Cancer. 11, 461(2011).</li>
<li>Zhang, H. Y., Hormi-Carver, K., Zhang, X., Spechler, S. J., Souza, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+benign+Barrett%27s+epithelial+cells%2C+acid+exposure+generates+reactive+oxygen+species+that+cause+DNA+double-strand+breaks%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">In benign Barrett's epithelial cells, acid exposure generates reactive oxygen species that cause DNA double-strand breaks.</a> Cancer Res. 69, 9083-9089 (2009).</li>
<li>Palanca-Wessels, M. C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extended+lifespan+of+Barrett%27s+esophagus+epithelium+transduced+with+the+human+telomerase+catalytic+subunit%3A+a+useful+in+vitro+model%5BTitle%5D)+AND+%22Carcinogenesis%22%5BJournal%5D)">Extended lifespan of Barrett's esophagus epithelium transduced with the human telomerase catalytic subunit: a useful in vitro model.</a> Carcinogenesis. 24, 1183-1190 (2003).</li>
<li>Kumble, S., Omary, M. B., Cartwright, C. A., Triadafilopoulos, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Src+activation+in+malignant+and+premalignant+epithelia+of+Barrett%27s+esophagus%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Src activation in malignant and premalignant epithelia of Barrett's esophagus.</a> Gastroenterology. 112, 348-356 (1997).</li>
<li>Inge, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((alpha-Catenin+overrides+Src-dependent+activation+of+beta-catenin+oncogenic+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cancer+Ther%22%5BJournal%5D)">alpha-Catenin overrides Src-dependent activation of beta-catenin oncogenic signaling.</a> Mol. Cancer Ther. 7, 1386-1397 (2008).</li>
<li>Coluccia, A. M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SKI-606+Decreases+Growth+and+Motility+of+Colorectal+Cancer+Cells+by+Preventing+pp60%28c-Src%29-Dependent+Tyrosine+Phosphorylation+of+%CE%B2-Catenin+and+Its+Nuclear+Signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">SKI-606 Decreases Growth and Motility of Colorectal Cancer Cells by Preventing pp60(c-Src)-Dependent Tyrosine Phosphorylation of β-Catenin and Its Nuclear Signaling.</a> Cancer Res. 66, 2279-2286 (2006).</li>
<li>Nam, J. -S., Ino, Y., Sakamoto, M., Hirohashi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Src+Family+Kinase+Inhibitor+PP2+Restores+the+E-Cadherin%2FCatenin+Cell+Adhesion+System+in+Human+Cancer+Cells+and+Reduces+Cancer+Metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Src Family Kinase Inhibitor PP2 Restores the E-Cadherin/Catenin Cell Adhesion System in Human Cancer Cells and Reduces Cancer Metastasis.</a> Clin. Cancer Res. 8, 2430-2436 (2002).</li>
<li>Chu, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((p27+phosphorylation+by+Src+regulates+inhibition+of+cyclin+E-Cdk2%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">p27 phosphorylation by Src regulates inhibition of cyclin E-Cdk2.</a> Cell. 128, 281-294 (2007).</li>
<li>Inge, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Soluble+E-cadherin+promotes+cell+survival+by+activating+epidermal+growth+factor+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Res%22%5BJournal%5D)">Soluble E-cadherin promotes cell survival by activating epidermal growth factor receptor.</a> Exp. Res. 317, 838-848 (2011).</li>
<li>Gan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+roles+of+ERK+and+Akt+pathways+in+regulation+of+EGFR-mediated+signaling+and+motility+in+prostate+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Differential roles of ERK and Akt pathways in regulation of EGFR-mediated signaling and motility in prostate cancer cells.</a> Oncogene. 29, 4947-4958 (2010).</li>
</ol>

החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

יש לנו התוויתי שיטה ליישום של IF של תאים להיות כלפי הבהרת ההשפעות הפיזיולוגיות של טיפולים ממוקדים על תאים אלה. אמנם יש לנו תיארתי את השימוש בנהלים אלה לתאים להיות, שמצאנו כי שיטות אלה תקפים גם למגוון רחב של סוגי תאים שונים 13,17,18 של. יתר על כן, ניתן לשנות נהלים אלה במספר דרכים כדי לייעל את הצביעה למטרות ספציפיות. אנו מוצאים פרמטר אחד שיש לו השפעה ישירה על אם ראוי הוא הבחירה של קיבעון. יש לנו תיארתי א...

<html> ושט בארט (BE) הוא שינוי metaplastic באפיתל הנורמלי הקשקש של הוושט ותוצאה של חשיפה כרונית לתוכן הקיבה הנובע ממחלת החזר הוושטי (GERD) 1. הוא חשב להיות להיות מנגנון הגנה בתגובה לGERD, עם זאת הנוכחות של BE מקנה סיכון מוגבר של אדנוקרצינומה של הוושט (EAC), מחלה אשר נושאת הישרדות נמוכה באופן משמעותי 1. הערכות הנוכחיות מצביעות על כך שעד 5.6% מכלל האוכלוסייה האמריקנית צריכים להיות, כמו להיות לעתים קרובות תסמינים, הוא חשב, עם זאת, הרוב המכריע של BE נשאר לא מאובחן 2. כשיעורי ההיארעות של שני GERD וEAC ראו צמיחה נמשכת 3, זה הפך להיות חשוב כדי להבין את המנגנונים המולקולריים מעורבים בהתקדמות של להיות EAC, במיוחד כאשר מידע זה עלול לספק גישות טיפוליות למניעת התקדמות של להיות EAC. מחקרים&gt; חולה מופנים הביאו לפרדיגמה הנוכחית של הפתוגנזה BE-EAC 1. דלקת כרונית, פציעה, ונזק genotoxic כתוצאה מחשיפה ממושכת לתוכן קיבה להפעיל לחץ סלקטיבי על הנגע לקדם התקדמות neoplastic לEAC. מספר השינויים הגנטיים שזוהו במהלך להיות התקדמות EAC. אולם, למרות זאת קיים מחסור מובהק של הבנה לגבי השינויים המדויקים בתא איתות והשפעות שלאחר מכן על מבנה תא ותפקודו. הונצחו בשורות תאים במבחנה הם כלים שימושיים לחקר ההשפעות של תא איתות, בעיקר בחוקר את ההשפעות של תרכובות טיפוליות ממוקדות. הזמינות המסחרית האחרונה של שורות תאים להיות מונצחות מאפשרת ללימודים כאלה. למרות מבחני תפוקה גבוהה, כגון מבחני כדאיות בשימוש נרחב, יכולים להיות בעל ערך בהערכת ההשפעות של טיפולים ממוקדים על התפשטות תאים וsurvival 4-6, מבחני אלה אינם שימושיים לחקירת ההשפעות של תא איתות על מורפולוגיה של תאים. מכתים Immunofluorescent (IF) הוא טכניקה שימושית חוקר את ההשפעות של טיפולים ממוקדים על המאפיינים מורפולוגיים, צמיחה וההישרדות של תאים והחלבונים שהם מעורבים. המעבדה שלנו יש להתאים שיטות אלה לכיוון קווי BE תא הנציחו, באמצעות IF כדי להעריך את ההשפעות של תרופה זמינה מבחינה קלינית על שורות תאים להיות בתקוות של התוויית טיפול אפשרי chemopreventative וסמנים ביולוגיים לטיפול תרופתי 7. כמו כן, יישום של טכניקות אלה בEAC, BE ושורות תאי הוושט הונצחו יש מתווית ממצאים קריטיים לגבי להיות התקדמות EAC 8-10. אנו מוצאים אם ניתוח של תאים להיות מטופלים עם טיפולים ממוקדים יש ערך, המאפשר אפיון של שינויים במבנה תא ולוקליזציה חלבון. כאן, אנו מציגים את השיטות שלנו כי אם של תאים להיות מונצחים לגharacterize טיפול תרופתי.

<table><tbody><tr><td>CP-A (קו תאים מטפלסטיים)</td><td>ATCC</td><td>CRL-4027</td><td></td></tr><tr><td>CP-B (קו תאים דיספלסטיים בדרגה גבוהה)</td><td>ATCC</td><td>CRL-4028</td><td></td></tr><tr><td>CP-C (קו תאים דיספלסטיים בדרגה גבוהה)</td> <td>ATCC</td><td>CRL-4029</td><td></td></tr><tr><td>CP-D (קו תאים דיספלסטיים בדרגה גבוהה)</td><td>ATCC</td><td>CRL-4030</td><td></td></tr><tr><td>קרטינוציטים-SFM (1x), Liquid</td><td>Life Technologies</td><td>17005-042</td><td></td></tr><tr><td>0.25% טריפסין-EDTA (1x), פנול אדום&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>25200056</td><td></td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי, מוסמך, HI</td><td>Life Technologies</td><td>10438026</td><td></td></tr><tr><td>תערובת אנטיביוטיקה PSN</td><td>Life Technologies</td><td>15640</td><td></td></tr><tr><td>PBS - Phosphate-Buffered</td><td>Salt Life Technologies</td><td>10010049</td><td></td></tr><tr><td>מגיב אנטי-דהיית זהב Pro-long עם DAPI&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>P36931</td><td></td></tr><tr><td>כיסוי זכוכית עגול 18 מ"מ</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>15-183-86</td><td></td></tr><tr><td>&בטא;-catenin נוגדן ראשוני (ארנב)</td><td>איתות תאים</td><td>9562S</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 (עיזים נגד ארנב)</td><td>Life Technologies</td><td>A11008</td><td></td></tr><tr><td>צלחת PS 10 ס"מ מטופלת TC, סטרילית</td><td>USA Scientific</td><td>CC7682-3394</td><td></td></tr><tr><td>צלחת PS שטופלה ב-TC 12 בארות, סטרילית</td><td>USA Scientific</td><td>5666-5180</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>276855</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>אמוניום כלוריד</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9434</td><td></td></tr><tr><td>Saponin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>47036</td><td></td></tr><tr><td>אלבומין סרום בקר - Fraction V</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>85040C</td><td></td></tr><tr><td>SKI-606 (Bosutinib)</td><td>Selleck Chemicals</td><td>S1014</td><td></td></tr><tr><td>צלחת בדיקה ביולוגית מרובעת&nbsp;</td><td>תרמו סיינטיפיק</td><td>240835</td><td></td></tr><tr><td>פרפילם&nbsp;</td><td>VWR</td><td>82024-546</td><td></td></tr><tr><td>פיפטות פסטר חד פעמיות, זכוכית צור</td><td>VWR</td><td>14672-380</td><td></td></tr><tr><td>Nexcelom מיני מונה תאים</td><td>Nexcelom</td><td></td><td></td></tr><tr><td>תאי ספירת תאים</td><td>Nexcelom</td><td>CHT4-SD100-014</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ Zeiss Apotome&nbsp;</td><td>צייס</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

שיטת immunofluorescent לאפיון של תאי הוושט של בארט

An Immunofluorescent Method for Characterization of Barrett&#8217;s Esophagus Cells

אדנוקרצינומה של הוושט (EAC) יש שיעור כולל הישרדות של פחות מ 17% ושכיחות של EAC עלתה באופן דרמטי בשני העשורים האחרונים. אחד מגורמי הסיכון העיקריים של EAC הוא שט בארט (BE), שינוי metaplastic של הוושט הקשקש הנורמלי בתגובה לצרבת כרונית. למרות הקשר המבוסס היטב בין EAC ולהיות, חקירה של האירועים המולקולריים, במיוחד מסלולי איתות שינו מעורבים התקדמות של להיות EAC, הם הבינו היטב. חלק גדול מזה נובע חוסר המתאים במודלים חוץ גופית זמינים ללמוד מחלות אלה. לאחרונה, קווי BE תא הונצחו הפכו זמינים באופן מסחרי המאפשרים לבדיקות במבחנה של BE. כאן, אנו מציגים שיטה לצביעת immunofluorescent של קווי BE תא הונצחו, ומאפשרים באפיון מבחנה של תא איתות ומבנה לאחר חשיפה לתרכובות טיפוליות. יישום של טכניקות אלה הלp לפתח תובנה המנגנונים המעורבים בתהיה התקדמות EAC ולספק אפיקי פוטנציאל לטיפול ומניעה של EAC.

דוגמא לתוצאות המתקבלות מיישום של הנהלים שתוארו באה לידי ביטוי בדמויות 1A-D. Coverslips עם CP-D ותאי BE CP-C טופלו ל24 שעות עם 1 מיקרומטר של מעכב Src המשפחה, SKI-606, או רכב (DMSO) ומוכתם באמצעות הנהלים מעל לצומת Adherens וWnt איתות חלבון, β -Catenin. ויזואליזציה של β-catenin הושגה על ידי תיוג עם IgG נגד ארנב מצמידים fluorophore ירוק, תוך תיוג של גרעין התא בוצע על ידי תיוג עם DAPI (כחול). Coverslips היו רכוב על שקופיות מיקרוסקופ באמצעות קשה להגדיר התקנה ותאים הם צי...

יש צורך ניכר למידע משופר על נהגים מולקולריים של ושט בארט. מכתים Immunofluorescent הוא טכניקה שימושית להבנת ההשפעות של תא איתות במורפולוגיה של תאים. אנו מציגים פרוטוקול פשוט, יעיל לשימוש בצביעת immunofluorescent להעריך טיפול רפואי בתאי הוושט של בארט.

שיטת Immunofluorescent לאפיון של תאי הוושט של בארט

Esophageal adenocarcinoma (EAC) has an overall survival rate of less than 17% and incidence of EAC has risen dramatically over the past two decades. One ...

המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא להעריך את השפעות הטיפול התרופתי על מבנה התא ועל לוקליזציה של חלבונים בתאי BE. זאת משיגים על ידי דגירה של תאי BE שגודלו על לוחות זכוכית (cover slips) עם תרופה נבחרת בתנאי תרבית תאים סטנדרטיים. כשלב שני, דגרו את תאי ה-BE המטופלים עם חומר מקבע, המשמר את מבנה החלבון ואת הלוקליזציה שלו.בשלב הבא, תאים מקובעים מדגמי be מוחדרים באופן רצפי לנוגדנים ראשוניים ולנוגדנים משניים המסומנים פלואורסצנטית, וזאת כדי להדמיא שינויים בחלבון המטרה הנבחר באמצעות מיקרוסקופיית פלואורסצנציה; התוצאות המתקבלות מראות כיצד טיפול תרופתי בתאי be משנה את לוקליזציית החלבון ואת מבנה התא, על בסיס ויזואליזציה של צביעה אימונופלואורסצנטית. אף ששיטה זו יכולה לספק תובנות לגבי ושט ברט (Barrett's esophagus), ניתן להחילה אותה גם על מערכות אחרות, כולל תאי סרטן ותאים נורמליים. התחילו את הפרוצדורה על ידי הנחת לביות (cover slips) בקוטר 18 מילימטר בתוך צלחת פטרי מזכוכית והעבירו אותם באוטוקלאב.לאחר מכן, העבירו את לוחות הכיסוי שעברו עיקור באוטוקלאב למרקע תרבית רקמות בעל 12 בארות, באמצעות פיפטת זכוכית סטרילית המחוברת לצינור ואקום. לאחר מכן, שטפו את לוחות הכיסוי ב-PBS סטרילי ובתווך גידול. בשלב הבא, בצעו טיפול בטריפסין.ספרו את התאים המומתים (immortalized cells) באמצעות סופר תאים אוטומטי או המוציטומטר, ולאחר מכן דללו את התאים במצע גידול לריכוז של 20,000 עד 40,000 תאים למיליליטר. לאחר מכן, העבירו מיליליטר אחד של תאים לכל באער המכיל זכוכית כיסוי. כדי להשיג ספירה כוללת של 20,000 עד 40,000 תאים לבאער, השתמשו בטיפ סטרילי של פיפט כדי לדחוף בעדינות את זכוכית הכיסוי לתחתית הבאער, כדי להבטיח שהתאים ייצמדו לזכוכית הכיסוי.כדי לטפל בתאי ה-BE, יש לדלל את התרופה שנבחרה במדריג בטמפרטורה של 37 degrees Celsius עד לריכוז הרצוי, ולערבב היטב על ידי הפיכה חוזרת של המבחנה או באמצעות וורטקס. יש להתחיל את הטיפול 24 שעות לאחר ההזרקה הראשונית של תאי ה-BE כדי לאפשר את היצמדות התאים לכיסוי הזכוכית (cover slip). כעת, יש לסמן באמצעות טוש מעבדה את פלטות הדגימות שיטופלו בתרופה ובחומר הנשאי (vehicle) כדי להבדיל בין קבוצת ההשוואה לקבוצת הביקורת. יש לטפל בכיסוי זכוכית נוסף של תאי BE ב-0.1% vehicle המדולל במדריג התרבית.לאחר מכן, העבירו את התאים לאינקובטור לתרביות תאים בטמפרטורה של 37 °C, 5% carbon dioxide ו-98% humidity. כעת, לאחר זמן האינקובציה הרצוי של הטיפול התרופתי, שאבו את המצע ושטפו את לוחות הכיסוי במהירות עם XPBS אחד בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, שאבו את ה-PBS והוסיפו מיליליטר אחד של PBS המכיל 4% PFA לכל באר, והדגירו בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות.בשלב הבא, שאבו את ה-4%P-F-A-P-B-S. שטפו את הזכוכיות המכסות שלוש פעמים, חמש דקות בכל פעם, ב-PBS בטמפרטורת החדר. במידת הצורך, ניתן לאחסן את הזכוכיות המכסות למשך שבוע ב-PBS ו-0.1%PFA בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס. כדי להפוך את התאים המקובעים ב-PFA לחדירים ולאפשר לנוגדן לגשת למטרות התוך-תאיות, דגרו את התאים עם 50 millimolar ammonium chloride המדולל ב-PBS למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.לאחר מכן, שטפו אותם פעם אחת ב-PBS בטמפרטורת החדר למשך חמש דקות. פעולה זו תפחית את הרקע כדי למנוע קישור לא ספציפי של נוגדים לחלבונים התאיים. הדגירו את תאי ה-BE למשך 30 דקות ב-100 עד 300 µL של PBS המכיל 0.1% troponin ו-0.5% BSA.לאחר מכן, הכינו צלחת ביו-אסאי מרובעת על ידי ריפוד תחתית התא במגבונים נייר רטובים והנחת שכבה של parfum מעליהם. סמנו את ה-Parfum בעזרת טוש מעבדה כדי לזהות את הזכוכיות המכסות. העבירו בעדינות את הזכוכיות המכסות, כאשר התאים פונים כלפי מעלה, אל ה-param באמצעות פינצטה ומחט של מזרק.כעת דללו את הנוגדן הראשוני ב-PBS המכיל הן 0.5% BSA והן 0.1% saponin וספגו בעדינות את תמיסת החסימה. באמצעות נייר סופג למעבדה, הוסיפו 100 µL של תמיסת הנוגדן הראשוני והדגירו את התאים למשך לילה בטמפרטורה של 4 °C. למחרת.שטוף את העגיות שלוש פעמים ב-PBS המכיל 0.5%BSA ו-0.1%troponin למשך חמש דקות בכל פעם בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, דלל את הנוגדן המשני המצומד לתג פלואורסצנטי ב-PBS המכיל 0.5%BSA ו-0.1%ponent. הוסף 100 microliters של נוגדן מדולל לכל זכוכית כיסוי והדגר את התאים למשך שעתיים בטמפרטורת החדר לאחר שעתיים.שטפו את לוחות הכיסוי שלוש פעמים, חמש דקות בכל פעם, ב-PBS המכיל 0.5%BSA ו-0.1%troponin. הסירו את תמיסת השטיפה והוסיפו 100 עד 300 microliters של PBS ללוחות הכיסוי. הרימו בעדינות את לוח הכיסוי בעזרת פינצטה וספגו את ה-PBS באמצעות נייר סופג למעבדה או נייר מגבת.לאחר מכן, הוסיפו 15 µL של מדיום קיבוע Antifa מתאים המכיל DPI לכיסוי הזכוכית. הניחו את כיסוי הזכוכיתההפוך על סלייד מיקרוסקופ מזכוכית, כאשר התאים פונים כלפי מטה. לאחר מכן, הכניסו את הסליידים לתוך תיקיית סליידים ושמרו אותם הרחק מאור ישיר למשך לילה בטמפרטורת החדר כדי לאפשר למדיום ה-Antifa להתקשות.לאחר שהתווך Antifa הת굳ב, ניתן לאחסן את השקופיות בטמפרטורה של ארבעה מעלות צלזיוס או במינוס 20 מעלות צלזיוס עד להדמיה במיקרוסקופ. בשלב זה, הוציאו את שקופיות האחסון ממינוס 20 מעלות צלזיוס או מארבעה מעלות צלזיוס והמתינו שיגיעו לטמפרטורת החדר. הדליקו את המיקרוסקופ ואת נורת קשת הכספית.הנח על במיקרוסקופ זכוכית עם זכוכית כיסוי הפונה לעבר העדשה. לאחר מכן, בחר במסנן DAPI ופתח את התריס. כוון את המיקוד של העדשה תוך כדי התבוננות דרך העיניות עד להופעת התמונה.מכיוון שכל התאים נצבעו ב-dpi, ניתן לצפות בגרעינים בקלות. אספו תמונות באמצעות תוכנה מתאימה לעיבוד תמונות; בלוחית כיסוי זו, תאים מסוג CPC ו-CPD טופלו בביקורת (vehicle) או בריכוז של 1 µM של מעכב SRC, SKI 6 0 6, למשך 24 שעות. לאחר מכן התאים קובעו ונצבעו.בהתאם לפרוטוקול המתואר, beta catenin המסומן בירוק הודגם באמצעות נוגדן ספציפי ונוגדן משני המצומד ל-LOR 4 88, בעוד שהגרעין נצבע ב-DPI המסומן בכחול. שימו לב לשינוי במיקום של beta-catenin מהגרעין לממברנת התא לאחר טיפול ב-SKI 6 0 6.לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה של אופן ביצוע צביעה אימונו-פלואורסצנטית של ושט ברט (Barrett's esophagus) לצורך חקירת לוקליזציה של חלבונים או מבנה תאים.

an-immunofluorescent-method-for-characterization-barretts-esophagus

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

אנו תיאר הליך disaggregation של סרטן המעי (CRC) לייצר תאים בודדים קיימא, אשר נלכדים אז על microarrays נוגדן אישית הכרה אנטיגנים השטח (DotScan microarray CRC). תת אוכלוסיות של תאים חייב microarray ניתן צדודית על ידי ריבוב הקרינה באמצעות נוגדנים חד שבטיים מתוייגים עם צבעי ניאון.

סרטן המעי הגס Cell Surface חלבון פרופיל שימוש microarray ו ריבוב נוגדן פלואורסצנטי

סרטון זה מדגים שיטה מבוססת אימונופלואורסנציה להדמיית תאי ציצית מעיים בקריוסקציות ג'ג'ונום של עכבר צף חופשי. בתוך וילי המעי, לוקליזציה משותפת של פלואורסצנטיות ירוקה בקצה הלומינלי עם מסת שורש אדומה מורחבת מצביעה על נוכחות של תאי ציצית.

שיטה מבוססת אימונופלואורסנציה להדמיית תאי Tuft בקריוקציות Jejunum

מקור: Ear, P. H., et. al. הקמה ואפיון של ספרואידים של גידול נוירואנדוקריני במעי הדק. J. Vis. Exp. (2019)סרטון זה מדגים את הצביעה האימונופלואורסצנטית של ספרואידים של גידול נוירואנדוקריני במעי הדק. הספרואידים מקובעים, חדירים ונחסמים ולאחר מכן מודגרים בנוגדנים ראשוניים ומשניים. צבע מתווסף לגרעיני צביעה לפני הרכבתם והדמתם תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי.

אפיון ספרואידים של גידול נוירואנדוקריני במעי הדק באמצעות אימונופלואורסצנציה

דימות פלואורסצנטי המשופרת חיוני לצבוע (VFI) היא רומן בטכניקת vivo המשלב הדמיה אפיתל ברזולוציה גבוהה עם ניגוד ניאון אקטואלי אקסוגני כדי להדגיש את מורפולוגיה בלוטות ולהתוות neoplasia (דיספלזיה בדרגה גבוהה וסרטן) בושט דיסטלי.

אבחנה של neoplasia בוושט של בארט באמצעות דימות פלואורסצנטי המשופרת ויטל לצבוע

אנו מציגים פרוטוקול ליצירת תרביות ראשוניות של תאי סטרומה בוושט עכבריים ואנושיים עם פנוטיפ מיופיברובלסטים. לתאים מתורבתים יש מורפולוגיה בצורת ציר, מבטאים α-SMA ווימנטין, וחסרים סמני פני תא אפיתל, המטופויאטי ואנדותל. ניתן להשתמש בתאי סטרומה מאופיינים במחקרים פונקציונליים של אינטראקציות אפיתל-סטרומליות.

בידוד של myofibroblasts מעכבר והוושט אדם

כתב יד זה מתאר את הייצור, אפיון ושימושים פוטנציאליים של רקמת מבנה הוושט 3D מהונדס הוכנה מפיברובלסטים נורמלים עיקריים אנושיים הוושט ותאי אפיתל קשקש זורעים בתוך פיגום חזירי דה-cellularized. התוצאות מראות ההיווצרות של האפיתל מרובדת בוגר דומה לושט האדם הנורמלי.

ייצור, אפיון ופוטנציאל שימושים של הוושט רירי דגם אדם מהונדס-רקמות 3D

Multiparameter פלואורסצנטי אימונוהיסטוכימיה ניתן להשתמש כדי להעריך את המספר, הפצה יחסית, ולוקליזציה של אוכלוסיות תאים החיסון microenvironment הגידול. כתב היד מתאר את השימוש בטכניקה זו כדי לנתח תת-תאים של תאי T בסרטן הלוע.

ארבע צבע הקרינה אימונוהיסטוכימיה של T- תאים subpopulations ב פורמולה קבוע פורמאלית, פרפין, מוטבע האדם דגימות שלפוחית ​​השתן דגימות קרצינומה של תאי קשקש

ניתוח תמונת ברקוד מרובה שיפר לאחרונה את אפיון המיקרו-סביבה של הגידול, ומאפשר מחקרים מקיפים של הרכב התא, המצב התפקודי והאינטראקציות בין התא לתא. במאמר זה אנו מתארים פרוטוקול צביעה והדמיה באמצעות ברקוד של נוגדנים מצומדים אוליגונוקלאוטידים והדמיית מחזור, המאפשרת שימוש בטכניקת ניתוח תמונה בממד גבוה.

ניתוח תמונת ברקוד מרובה פרופיל חיסוני ואפיון מיפוי מרחבי באנליזה חד-תאית של דגימות רקמת פרפין

תרביות משותפות אורגנואידים-פיברובלסטים מספקות מודל לחקר נישת תאי הגזע in vivo . כאן מתואר פרוטוקול לתרביות משותפות אורגנואידים-פיברובלסטים בוושט. בנוסף, הדמיה של הר שלם משמשת כדי להמחיש את האינטראקציה פיברובלסט-אורגנואידים.

אפיון פונקציונלי והדמיה של פיברובלסטים בוושט באמצעות תרביות אורגנואידים

הפרוטוקול הנוכחי מתאר הקמה וניתוח היסטולוגי של מודלים אורגנואידים בוושט המייצגים שלבים שונים של התקדמות הגידול. שיטה זו מאפשרת לחוקרים לחקור שינויים במורפולוגיה התאית, בארגון המרחבי ובדפוסי ביטוי הסמנים המולקולריים במהלך המעבר מרקמות נורמליות לרקמות סרטניות.

הקמה וניתוח היסטולוגי של אורגנואידים בוושט: מידול ההתקדמות מרקמות נורמליות לסרטניות

פרוטוקול זה מתאר שיטה לבידוד בו-זמנית של אורגנואידים סרטניים, פיברובלסטים הקשורים לקרצינומה (CAFs), ופיברובלסטים (CFs) שאינם קשורים לגידולים מאותו מטופל עם קרצינומה של תאי קשקש הוושט (ESCC). שימוש בחומרים המותאמים למטופלים הללו יכול למנוע בעיות של שונות בין-מטופלת ולספק פלטפורמה ניסויית מתאימה למחקר ESCC.

הקמת אורגנידים גידוליים, פיברובלסטים הקשורים לקרצינומה, ופיברובלסטים מקבילים מאותו מטופל סרטן וושט

למדו שיטת צביעת immunofluorescent לאפיון תאי הוושט של בארט. הפרוטוקול מאפשר הערכת השפעות טיפול תרופתי על מבנה תאים ולוקליזציה של חלבונים במיקרוסקופ פלואורסצנטי.

שיטת Immunofluorescent לאפיון של תאי הוושט של בארט

גלה סרטונים נוספים