Name: להתמקד גיבוש: Assay מבוסס תאים כדי לקבוע את הפוטנציאל שבעור של גין (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-12-31T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 18 s
Description: למדו את שיטת Focus Formation Assay להערכת הפוטנציאל האונקוגני של גנים בתאי פיברובלסט עכברים NIH 3T3 באמצעות רטרוורוס. שיטה זו מאפשרת זיהוי יכולת הגנים לגרום לצמיחה בלתי תלויה בצפיפות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי מענק מניו Innovator תכנית פרס של מנהל ה- NIH (ED). AA נתמך בחלקו על ידי פרסים לתואר ראשון מהמכון הלאומי לסרטן והקרן הלאומי למדע.

1. ביצוע הווקטורים ויראליים רצפי הקידוד עבור הגן של עניין, כמו גם בקרות החיוביות ושליליות, מוכנסים לתוך pBABEpuro על ידי שיטות מסורתיות שיבוט (PCR הגברה, עיכול הגבלה וקשירה). ישנם ארבעה אתרי הגבלה על הווקטור שבו ניתן להכניס את ה- DNA: BamHI, SnaBI, EcoRI וסאלי. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את ה- DNA פלסמיד כיתה transfection מהתאים מוסמכים באמצעות ערכת midi פלסמיד QIAGEN. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למדוד ריכוז ה- DNA באמצעות ספקטרופוטומטר NanoDrop2000. </li></ol> 2. רטרו-וירוס הפקה קו תא אריזת Plat-E ישמש להפקת רטרו-וירוס ecotropic שיספוק את cDNA של עניין לתאי NIH 3T3. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הקמת תרבויות Plat-E מ תאים קפואים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במהירות להפשיר תאי Plat-E באמבט מים 37 מעלות צלזיוס ולהעביר צינור חרוטי 15 מיליליטר. לאט לאט להוסיף 9 מיליליטר של מדיום Plat-E (Duהנשר בינוני של lbecco שונה (DMEM) + 10% שור עוברי סרום (FBS) + פניצילין וסטרפטומיצין). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגות הצינור ב 180 x גרם במשך 5 דקות וזורקים supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשעות מחדש את התאים עם 10 מיליליטר של מדיום Plat-E והעברה לצלחת תרבות 10 סנטימטרים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה התאים ב-37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 באינקובטור עד שהם% ומחוברות 80-90 (כ 2 ימים). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיצול תא <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב את המדיום ולשטוף תאי פעם עם PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 2 מיליליטר של 0.05% טריפסין-EDTA דגירה דקות 1 ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתק את התאים על ידי הקשה על אצבע, להוסיף 10 מיליליטר של מדיום Plat-E, ולהעביר את ההשעיה תא צינור 15 מיליליטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגות הצינור ב 180 x גרם במשך 5 דקות וזורקים supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend התאים עם 10 מיליליטר של מדיום Plat-E וזרעם במנות חדשות ב1: 4-1: 6 דילולים. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Plat-E זריעה וTransfection <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זרע 2 x 10 6תאים לכל צלחת תרבות 10 סנטימטרים באמצעות מדיום Plat-E ללא כל אנטיביוטיקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה התאים O / N ב37 ° C, חממה 5% CO 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למחרת, להעביר 300 μl של Opti-ממ לתוך צינור 1.5 מיליליטר microfuge. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 27 μl של polyethylenimine (PEI), מגיב transfection חסכוני 12, אל הצינור מוכן עם Opti-MEM. מערבבים בעדינות על ידי הקשה על אצבע ודגירה של 5 דקות ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 9 מיקרוגרם של ה- DNA פלסמיד כיתה transfection לתוך צינור Opti-ממ / PEI, מערבב בעדינות על ידי vortexing, ודגירה במשך 15 דקות ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוסיף את ה- DNA / PEI ירידה מבחינת מורכבת לתוך צלחת Plat-E, ודגירת O / N ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למחרת, לשאוב את המדיום המכיל את מגיב transfection ולהוסיף 10 מיליליטר של מדיום Plat-E הטרי (ללא אנטיביוטיקה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להחזיר את התאים לחממה. </li></ol></li></ol> 3. תאי NIH 3T3 וזיהום <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הקמת NIHתרבויות 3T3 וזריעה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במהירות להפשיר תאי NIH 3T3 באמבט מים 37 מעלות צלזיוס ולהעביר לצינור 15 מיליליטר. לאט לאט להוסיף 9 מיליליטר של מדיום NIH 3T3 (DMEM + 10% FBS). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגות הצינור ב 180 x גרם במשך 5 דקות וזורקים supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend התאים עם 10 מיליליטר של מדיום NIH 3T3 והעברה לצלחת תרבות 10 סנטימטרים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה התאים ב37 ° C, חממה 5% CO 2. זה מאוד חשוב כי תאי NIH 3T3 תמיד נשמרים underconfluent (50-60%), כתדר של שינוי ספונטני (ולכן רמות בסיסיות של היווצרות מוקדים) מגביר פעם בתרבות מגיעה confluency. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זרע 3 x 10 5 תאים לכל צלחת 10 סנטימטרים ודגירת O / N לזיהום למחרת. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זיהום <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קציר supernatant retroviral מצלחת Plat-E באמצעות מזרק חד פעמי מיליליטר 10, סינונו דרך מסנן קרום ניילון גודל 0.45 מיקרומטר נקבובית, והעברתו ל-15 מיליליטרצינור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 10 מיליליטר של מדיום Plat-E הטרי לתאים (ללא אנטיביוטיקה), ולהחזיר אותם לחממה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב את המדיום מצלחת תא NIH 3T3 להיות נגועות, ולהוסיף 5 מיליליטר של מדיום NIH 3T3 רגיל ו -5 מיליליטר של supernatant המסונן המכיל וירוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף polybrene לצלחת בריכוז של 6 מיקרוגרם / מיליליטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה התאים O / N ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למחרת, חזור על השלבים 3.2.1 - 3.2.5 לסיבוב שני של זיהום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החלף את המדיום המכיל וירוס עם מדיום NIH 3T3 רגיל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אפשר תאי NIH 3T3 לגדול במשך 2-3 שבועות, החלפה הבינוני במידת צורך. בדוק ביטוי של החלבון של עניין על ידי אלקטרופורזה הקונבנציונלית החלבון וimmunoblot על lysates תא שלם מצלחות העתק. </li></ol></li></ol> 4. מכתים וכימות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קריסטל ויולט מכתים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב את מדיום NIH 3T3 ולמקם את הכליםעל קרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף הכלים פעמיים עם PBS קר כקרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תקן את התאים עם מתנול קר כקרח במשך 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את המנות מהקרח, לשאוב מתנול, ולהוסיף 3 מיליליטר של 0.5% פתרון סגול גביש עשה ב 25% מתנול (RT). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה המנות במשך 5 דקות בRT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב את הפתרון סגול גביש ולשטוף היטב את המנה עם מילי- Q H 2 O עד שלא צבע יורד בשטיפה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאפשר את הכלים לייבוש O / N בbenchtop (שנחשף). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כימות מוקדים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברגע שהמנות יבשות, להשתמש בסרגל למדוד את האוספים צבעוניים הכהה של תאים על הצלחת. לספור רק את אלה שהם יותר מ 5 מ&quot;מ בקוטר כ&quot; מוקדים &quot;. רשום את מספר המוקדים ולחשב ממוצעים והמשמעות בהשוואה לקבוצת הביקורת. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Clark, G. J., Cox, A. D., Graham, S. M., Der, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biological+assays+for+Ras+transformation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+enzymology%22%5BJournal%5D)">Biological assays for Ras transformation.</a> Methods in enzymology. , 255-395 (1995).</li>
<li>Celis, J. E. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCelis%2C+JE+%22Cell+biology+%3A+a+laboratory+handbook%22">Cell biology : a laboratory handbook</a>. , 3rd edn, Elsevier Academic. 345-352 (2006).</li>
<li>Raptis, L., Vultur, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neoplastic+transformation+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+molecular+biology%22%5BJournal%5D)">Neoplastic transformation assays.</a> Methods in molecular biology. 165, 151-164 (2001).</li>
<li>Johnson, P. J., Coussens, P. M., Danko, A. V., Shalloway, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overexpressed+pp60c-src+can+induce+focus+formation+without+complete+transformation+of+NIH+3T3+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+cellular+biology%22%5BJournal%5D)">Overexpressed pp60c-src can induce focus formation without complete transformation of NIH 3T3 cells.</a> Molecular and cellular biology. 5, 1073-1083 (1985).</li>
<li>Bonner, T. I., Kerby, S. B., Sutrave, P., Gunnell, M. A., Mark, G., Rapp, U. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+biological+activity+of+human+homologs+of+the+raf%2Fmil+oncogene%5BTitle%5D)+AND+%22IMolecular+and+cellular+biology%22%5BJournal%5D)">Structure and biological activity of human homologs of the raf/mil oncogene.</a> IMolecular and cellular biology. 5, 71400-71407 (1985).</li>
<li>Yancopoulos, G. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((N-myc+can+cooperate+with+ras+to+transform+normal+cells+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">N-myc can cooperate with ras to transform normal cells in culture.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 82, 5455-5459 (1985).</li>
<li>Fujiwara, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transforming+activity+of+purinergic+receptor+P2Y%2C+G+protein+coupled%2C+8+revealed+by+retroviral+expression+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia+%26+lymphoma%22%5BJournal%5D)">Transforming activity of purinergic receptor P2Y, G protein coupled, 8 revealed by retroviral expression screening.</a> Leukemia & lymphoma. 48, 978-986 (2007).</li>
<li>Morita, S., Kojima, T., Kitamura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plat-E%3A+an+efficient+and+stable+system+for+transient+packaging+of+retroviruses%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Plat-E: an efficient and stable system for transient packaging of retroviruses.</a> Gene. 7, 1063-1066 (2000).</li>
<li>Morgenstern, J. P., Land, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advanced+mammalian+gene+transfer%3A+high+titre+retroviral+vectors+with+multiple+drug+selection+markers+and+a+complementary+helper-free+packaging+cell+line%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+acids+research%22%5BJournal%5D)">Advanced mammalian gene transfer: high titre retroviral vectors with multiple drug selection markers and a complementary helper-free packaging cell line.</a> Nucleic acids research. 18, 3587-3596 (1990).</li>
<li>Kim, T. K., Eberwine, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mammalian+cell+transfection%3A+the+present+and+the+future%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+and+bioanalytical+chemistry%22%5BJournal%5D)">Mammalian cell transfection: the present and the future.</a> Analytical and bioanalytical chemistry. 397, 3173-3178 (2010).</li>
<li>Klaver, B., Berkhout, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+5%27+and+3%27+long+terminal+repeat+promoter+function+in+human+immunodeficiency+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+virology%22%5BJournal%5D)">Comparison of 5' and 3' long terminal repeat promoter function in human immunodeficiency virus.</a> Journal of virology. 68, 3830-3840 (1994).</li>
<li>Fukumoto, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cost-effective+gene+transfection+by+DNA+compaction+at+pH+4.0+using+acidified%2C+long+shelf-life+polyethylenimine%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotechnology%22%5BJournal%5D)">Cost-effective gene transfection by DNA compaction at pH 4.0 using acidified, long shelf-life polyethylenimine.</a> Cytotechnology. 62, 73-82 (2010).</li>
<li>Fox, E. J., Wright, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((S-phase-specific+expression+of+the+Mad3+gene+in+proliferating+and+differentiating+cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+Biochemical+journal%22%5BJournal%5D)">S-phase-specific expression of the Mad3 gene in proliferating and differentiating cells.</a> The Biochemical journal. 359, 361-367 (2001).</li>
<li>Yun, J. S., Rust, J. M., Ishimaru, T., Diaz, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+role+of+the+Mad+family+member+Mad3+in+cerebellar+granule+neuron+precursor+proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+cellular+biology%22%5BJournal%5D)">A novel role of the Mad family member Mad3 in cerebellar granule neuron precursor proliferation.</a> Molecular and cellular biology. 27, 8178-8189 (2007).</li>
<li>Gore, Y., Lantner, F., Hart, G., Shachar, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mad3+negatively+regulates+B+cell+differentiation+in+the+spleen+by+inducing+Id2+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+biology+of+the+cell%22%5BJournal%5D)">Mad3 negatively regulates B cell differentiation in the spleen by inducing Id2 expression.</a> Molecular biology of the cell. 21, 1864-1871 (2010).</li>
<li>Barisone, G. A., Yun, J. S., Diaz, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+cerebellar+proliferation+to+tumorigenesis%3A+new+insights+into+the+role+of+Mad3%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+cycle%22%5BJournal%5D)">From cerebellar proliferation to tumorigenesis: new insights into the role of Mad3.</a> Cell cycle. 7, 423-427 (2008).</li>
<li>Barisone, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+MXD3+in+proliferation+of+DAOY+human+medulloblastoma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Role of MXD3 in proliferation of DAOY human medulloblastoma cells.</a> PloS One. 7, e38508(2012).</li>
<li>Nair, S. K., Burley, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((X-ray+structures+of+Myc-Max+and+Mad-Max+recognizing+DNA.+Molecular+bases+of+regulation+by+proto-oncogenic+transcription+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">X-ray structures of Myc-Max and Mad-Max recognizing DNA. Molecular bases of regulation by proto-oncogenic transcription factors.</a> Cell. 112, 193-205 (2003).</li>
</ol>

יש לי המחברים אין לחשוף.

FFA מספק שיטה קלה ומהירה כדי להעריך שינוי ממאיר במבחנה. זה ניתן להקרנה של מספר גדול יחסית של גני מועמדים, והדרישות הטכניות הצנועים שלה לעשות את זה יעיל וחסכוני. יתר על כן, ניתן coexpressed שתיים או יותר גנים (המכונה לעתים assay &quot;שיתוף פעולה&quot;) כדי להעריך את הפוטנציאל הסרטני של השילוב. היתרונות של assay זה מסתמכים על הטכניקה הפשוטה שלו, שלה קל והכימות שלה קצר יחסית סיבוב סביב הזמן. יש להדגיש, עם זאת, שזה מציב את המגבלות של כל מבחני חוץ הגופייה. Assay מערי...

ניתן להבחין בתאי גידול מעמיתיהם הרגילים על ידי מגוון רחב של שינויים, מדפוסי ביטוי גנים לepigenomics לשינויים מורפולוגיים ושגשוג. בקרב האחרון, הפחית את התלות בסרום, אובדן קשר עיכוב (צפיפות), הרכישה של התפשטות מעגן-עצמאי וסופו של דבר, את היכולת ליצור גידולים כאשר הוזרקו לבעלי חיים הם אינדיקטורים שימושיים, הניתנים למדידה של שינוי הממאיר 3. כמה במבחנה ובמבחני vivo פותחו לשינוי סלולארי. במבחנה מבחני מכוונים לזיהוי ומדידת שינויים במורפולוגיה תרבות (assay היווצרות מוקד), דינמיקת התרבות (שיעור צמיחה, צפיפות רוויה) וגורם גדילה (צמיחה בסרום מופחת) או מעגן (צמיחה באגר רכה) דרישות. תקן הזהב לקביעת האופי הממאיר של סוג תא נשאר היווצרות גידול (xenografts) בחיות מעבדה. עם זאת, לאהוא יעלה ואורך של מחקרי in vivo לא תמיד להפוך אותם מוצדק כצעד ראשון אימות או הקרנה של אונקוגנים מועמד. למרות שאף assay במבחנה מספק הערכה ברורה של הפוטנציאל שבעור של גן, הם מספקים תובנה פוטנציאל שבעור שעשויה לצמצם את העתיד במחקרי vivo. אחת מהמערכות הנפוצות ביותר להערכת פוטנציאל סרטני במבחנה הוא Assay גיבוש הפוקוס 2. גישה זו מסתמכת על השימוש בפיברובלסטים עכבר NIH 3T3, קו תאים לא שינה שמראה עיכוב קשר חזק. ביטוי יתר של תוצאות אונקוגן באובדן צמיחת צפיפות תלויה; תאים הופכים יכולים לגדול אז במספר שכבות, ויצרו &quot;מוקדים&quot;, דמיינו בקלות נגד monolayer הרקע של תאים-שינה הלא. גיבוש הפוקוס Assay, אז, מודד את היכולת של אונקוגן מועמד לגרום לשינוי ממאיר, כפי שמעיד על אובדן inhib קשרition כפנוטיפ למדידה. FFA נעשה שימוש כדי להעריך שינוי בביטוי יתר של החלבון קינאז (למשל, 4 Src, BRAF 5), גורמי שעתוק (למשל, N-myc 6) קולטנים, G-מצמידים חלבון (לדוגמא, 7 P2RY8) וGTPases (למשל , ראס 1), בין יתר. הקלות היחסית של assay זה הופכת אותו לבחירה טובה שתספק תשובה מהירה וחזותי ברורה אם ביטוי יתר של הגן די בכך כדי להפוך את תאי פיברובלסטים עכבר NIH 3T3 במבחנה. FFA המתואר בפרוטוקול זה משתמש בקו Plat-E תא אריזה 8, המספק חלבוני אריזה נגיפיים, וpBABEpuro retroviral הווקטור 9 (פלסמיד Addgene 1764) כדי לייצר רטרו-וירוס. לאחר transfection עם מבנה pBABEpuro המכיל את הגן של עניין, שורת תאי Plat-E תפיק רטרו-וירוס ecotropic שיכול לשמש כדי להדביק תאי NIH 3T3. Tהשיטה הנגיפית של מסירת הגן היא יעילה יותר מאשר שיטות transfection הכימי מסורתיות והיא מציעה דרך לבטא את הגן 10-קיימא. התאגד ברגע שלתוך הגנום של תאי NIH 3T3, ביטוי יתר של הגן של עניין הוא מונע על ידי האמרגן חוזר מסוף ארוך הנגיפי (LTR) 11. ביטוי קבוע זה יכול לשמש כדי לקבוע אם הגן של עניין יש לו פעילות שבעור, כפי שהיא נמדדת על ידי יצירת מוקדים, על תאי NIH 3T3.

<table><tbody><tr><td>pBABE-puro וקטור</td><td>Addgene</td><td>Plasmid 1764</td><td>וקטור שיבוט</td></tr><tr><td>Platinum-E קו תאים אריזה רטרו-ויראלי, Ecotropic</td><td>Cell Biolabs, Inc.</td>קו תאים <td>RV-101</td><td>לייצור ויראלי</td></tr><tr><td>NIH 3T3 קו תאים עכברי</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>93061524</td><td>קו תאים לבדיקת היווצרות מיקוד</td></tr><tr><td>10 מ"ל BD Luer-Lok מזרק קצה</td> BD <td>Biosciences</td><td>309604</td><td>מגיב לייצור ויראלי</td></tr><tr><td>0.45 &mu; m מסנן מזרק Puradisc</td><td>Whatman</td><td>6750-2504</td><td>מגיב ייצור ויראלי</td></tr><tr><td>פוליאתילנימין (PEI)</td><td>Polysciences, Inc.</td><td>23966-2</td><td>מגיב טרנספקציה תאים</td></tr><tr><td>זיהום פוליברן / מגיב טרנספקציה</td><td>EMD Millipore</td><td>TR-1003-G</td><td>מגיב טרנספקציה תאים</td></tr><tr><td>קריסטל סגול</td><td>פישר מדעי</td><td>C581-25</td><td>מגיב כתמי תאים</td></tr><tr><td>פלסמיד פלוסמיד פלוסמידי ערכת</td><td>QIAGEN</td><td>12945</td><td>טיהור פלסמיד</td></tr><tr><td>BD פלקון תרבית רקמות כלים</td><td>BD Biosciences</td><td>353003</td><td>אספקת תרבית תאים</td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)</td> <td>Gibco</td><td>11995-065</td><td>מדיה לתרבית תאים</td></tr><tr><td>0.05% Trypsin-EDTA</td><td>Gibco</td><td>25300-054</td><td>מספקת תרבית תאים</td></tr><tr><td>Opti-MEM I סרום מופחת בינוני</td><td>Gibco</td><td>31985-062</td><td>מדיה לתרבית תאים</td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי (FBS)</td> <td>Gibco</td><td>16000-044</td><td>מדיה לתרבית תאים</td></tr></tbody></table>

להתמקד גיבוש: assay מבוסס תאים כדי לקבוע את הפוטנציאל שבעור של ג&#39;ין

Focus Formation: A Cell-based Assay to Determine the Oncogenic Potential of a Gene

טרנספורמציה ממאירה של תאים קשורה בדרך כלל להתפשטות מוגברת, עיכוב אובדן מגע, רכישת פוטנציאל גידול בלתי תלוי בעיגון והיכולת ליצור גידולים בחיות ניסוי1. בתאי NIH 3T3, ידוע כי מסלול העברת אותות Ras מעורר רבים מהאירועים הללו, מה שמכונה טרנספורמציה של Ras. החדרת גן מבוטא יתר בתאי NIH 3T3 עשויה לקדם טרנספורמציה מורפולוגית ואובדן עיכוב מגע, מה שיכול לעזור לקבוע את הפוטנציאל האונקוגני של אותו גן מעניין. בדיקה המספקת שיטה פשוטה להערכת היבט אחד של פוטנציאל הטרנספורמציה של אונקוגן היא בדיקת היווצרות מיקוד (FFA)2. כאשר תאי NIH 3T3 מתחלקים באופן נורמלי בתרבית, הם עושים זאת עד שהם מגיעים לשכבה חד-שכבתית קונפלונטית. עם זאת, בנוכחות אונקוגן המתבטא יתר על המידה, תאים אלה יכולים להתחיל לצמוח במוקדים צפופים ורב-שכבתיים1 שניתן לדמיין ולכמת על ידי צביעת סגול קריסטל או המה 3. במאמר זה אנו מתארים את פרוטוקול FFA עם התמרה רטרו-ויראלית של הגן המעניין לתאי NIH 3T3, וכיצד לכמת את מספר המוקדים באמצעות צביעה. התמרה רטרו-ויראלית מציעה שיטה יעילה יותר להעברת גנים מאשר טרנספקציה, והשימוש ברטרו-וירוס עכברי אקוטרופי מספק בקרת בטיחות ביולוגית בעבודה עם אונקוגנים אנושיים פוטנציאליים.

MXD3 הוא גורם שעתוק הרוכסן לאוצין סליל לולאה, סליל בסיסי (bHLHZ) שהוא חבר של MYC / מקס / רשת MAD. זה חבר טיפוסי של משפחת MAD 13-15, וזה כבר דיווח להיות מעורב בהיווצרות הסרטן 16,17. בהשוואה לpBABEpuro (בקרה שלילית) וMYC (ביקורת חיובית), היו מנות NIH 3T3 בי MXD3 היה ביטוי יתר באופן משמעותי פחות מוקדים (איור 1 א). הנתונים באיור 1 ב נאספו מניסויים רבים כדי לקבוע משמעות. <p class="jove_content" style=";text-align:right;directi...

Assay גיבוש הפוקוס מספק שיטה פשוטה להעריך את הפוטנציאל להפוך לאונקוגן מועמד.

להתמקד גיבוש: Assay מבוסס תאים כדי לקבוע את הפוטנציאל שבעור של ג&#39;ין

Malignant transformation of cells is typically associated with increased proliferation, loss of contact inhibition, acquisition of anchorage-independent ...

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא לבצע בדיקת השראת מוקדים (focus formation assay) בשורות תאים של פיברובלסטים של עכבר, תוך שימוש ברטרו-וירוס כדי לקבוע את הפוטנציאל האונקוגני של גן. הדבר מושג תחילה על ידי שיבוט הרצף של הגן המבוקש לתוך וקטור רטרו-וירוסלי. השלב השני הוא ייצור חלקיקים רטרו-וירוסליים באמצעות הווקטור הוויראלי ותאי אריזה מסוג PLA e.בשלב הבא, הרטרו-וירוס משמש להדבקת תאי פיברובלסט של עכבר מסוג NIH three T three, במטרה להעריך את הפוטנציאל התמירתי של הגן הנחקר. השלב הסופי הוא מתן אפשרות לתאי ה-NIH three T three להתחלק במשך שבועיים עד שלושה, ולאחריהם צביעה ב-crystal violet כדי לכמת את מספר המוקדים (foci) שנוצרו. בסופו של דבר, בדיקת יצירת מוקדים משמשת כדי להראות אם ביטוי יתר של גן נחקר מספיק כדי להשרות צמיחה שאינה תלויה בצפיפות בתאי פיברובלסט של עכבר.שיטה זו יכולה לסייע במענה על שאלות מפתח בתחום הביולוגיה של הסרטן, כגון סריקה של הפוטנציאל האונקוגני של גן. ראשית, הכינו את הווקטור הוויראלי כפי שמתואר בפרוטוקול הטקסט. לאחר מכן, הקימו תרביות של תאי plat E מתאים תאים קפואים על ידי הפשרה מהירה של תאי plat E באמבט מים בטמפרטורה של 37 °C, ולאחר מכן העברה למבחנה קונית של 15 milliliter.הוסיפו לאט 9 ml של מצע PLA E לפObviouslyל מבחנה קונית של 15 ml. צנטריפוגו את המבחנה ב-180 ×g למשך חמש דקות, והשליכו את הנוזל העליון (supernatant). השעיקו מחדש את התאים עם 10 ml של מצע plat E, והעבירו לצלוחית תרבית של 10 cm.לאחר מכן, דגרו את התאים באינקובטור בטמפרטורה של 37 °C וב-5% CO2 עד להגעה לרמת התמזגות (Confluence) של 80 עד 90%. בצעו פיצול תאים על ידי שאיבה ראשונית של המצע, לאחר מכן שטפו את התאים פעם אחת עם PBS לפני הוספת 2 mL של 0.05% trypsin EDTA ודגירה של דקה אחת בטמפרטורת החדר; נתקו את התאים באמצעות תיפוף קל של המבחנה. לאחר מכן, הוסיפו 10 mL של מצע plat E והעבירו את תרחיף התאים למבחנה של 15 mL.סובב את המבחנה בצנטריפוגה כפי שנעשה קודם לכן, ותלה את התאים מחדש ב-10 milliliters של מצע plat E. לאחר מכן, זרע 2 מיליון תאים לכל צלחת תרבית של 10 centimeter תוך שימוש במצע plat E ללא אנטיביוטיקה, והשאר את התאים לדגירה למשך הלילה. למחרת, העבר 300 microliters של אופטימום למבחנה זעירה (micro tube) של 1.5 milliliter.הוסיפו 27 µL של polyethylene amine למבחנה המוכנה עם Optum. ערבבו בעדינות בטפיחות אצבע והדגרימו למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, הוסיפו למבחנה 9 µg של plasmid DNA בדרגת transfection, ערבבו בעדינות באמצעות vortex והדגרימו למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר.לאחר מכן, הוסיפו את התערובת בטפטוף לצלוחית plat E לפני דגירה למשך לילה. למחרת, שאבו את המצע המכיל את רכיב הטרנספקציה והוסיפו 10 milliliters של מצע plat E טרי לפני החזרת התאים למדגרה לצורך הקמת תרביות NIH three T three. ראשית, הפשירו במהירות את התאים במסבך מים בטמפרטורה של 37 °C והעבירו אותם למבחנה של 15 milliliters.הוסיפו באיטיות 9 mL של מצע NIH 3T3 לתאים, סובבו את המבחנה בצנטריפוגה ב-180 ×g למשך חמש דקות והשליכו את העליון. לאחר מכן, השהו שוב את התאים ב-10 mL של מצע NIH 3T3, והעבירו אותם לצC לתרבית בלחצנית בקוטר 10 ס"מ. דגרו את התאים באינקובטור בטמפרטורה של 37 °C ו-5% CO2, והקפידו להחזיקם מתחת למצב של התמסגרות (confluence), כיוון ששכיחות הטרנספורמציה הספונטנית עולה ככל שהתאים הופכים לצפופים יותר.כאשר התרבית מגיעה לשיאי צפיפות (confluency), זרע 3x10⁵ תאי NIH 3T3 לכל צלחת פטרי בקוטר 10 סנטימטרים והדגר למשך לילה לקראת ההדבקה ביום למחרת. למחרת, אסוף את העלון הרטרוויראלי (retroviral supernatant) מצלחת ה-PLAT E באמצעות מזרק חד-פעמי של 10 מיליליטר, סנן אותו דרך מסנן ממברנת ניילון עם גודל נקבים של 0.45 מיקרון, והעבר אותו לשפרופה של 15 מיליליטר. הוסף 10 מיליליטר של מצע PLAT E טרי לתאים לפני השבתם למדגרה.לאחר מכן, שאבו את המצע מתוך צלחת תאי NIH 3T3 המיועדים להדבקה, והוסיפו 5 mL של מצע NIH 3T3 רגיל ו-5 mL של תמיסת על פילטרית המכילה את הווירוס. לאחר מכן, הוסיפו polybrene לצלחת בריכוז של 6 µg/mL.דגרו את התאים למשך הלילה לפני חזרה על שלבי ההדבקה לסבב הדבקה שני. לאחר ההדבקה, החליפו את המדיום המכיל את הווירוס במדיום IH3T3 רגיל. אפשרו לתאי ה-IH3T3 לגדול למשך יומיים עד שלושה, תוך החלפת המדיום לפי הצורך, לצורך צביעה ב-crystal violet.שאבו את המצע של תאי NIH 3T3 והניחו את הצלחות על קרח. שטפו את הצלחות פעמיים עם PBS קר מאוד. קבעו את התאים באמצעות מתנול קר מאוד למשך 10 דקות.לאחר מכן, הוציאו את הצלחות מהקרח ושאבו את המתנול. הוסיפו שלושה מיליליטרים של תמיסת crystal violet בריכוז 0.5% שהוכנה ב-25% מתנול, והדגירו את הצלחות למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. לאחר הדגירה, שאבו את תמיסת ה-crystal violet ושטפו בזהירות את הצלחת במי Milli Q עד שלא יישאר צבע במי השטיפה.השאירו את הצלחות להתייבש ללא מכסה למשך הלילה על גבי משטח עבודה. לאחר שהצלחות יבשו, השתמשו בסרגל כדי למדוד את המוקדים וספרו את אלה שקוטרם גדול מחמישה מילימטרים ורשמו את המספר. MXD3 הוא גורם שעתוק בסיסי מסוג helix loop helix leucine zipper, המהווה חבר לא טיפוסי במשפחת MAD, ודווח כי הוא מעורב בתהליכי קרצינוגנזה בהשוואה לבקרת השלילה ובקרת החיוביות.במנות NIH 3T3 שבהן בוצע ביטוי יתר של MXD3, נצפו מיקודים (foci) פחותים באופן משמעותי. הנתונים נאספו ממספר ניסויים כדי לקבוע מובהקות, ובבדיקה זו נצפו מגמות דומות. התוצאות מעידות כי MXD3 אינו פועל כאתרוגן (oncogene) בעקבות פרוצדורה זו.ניתן לבצע שיטות נוספות, כגון בדיקת השראת מוקדים (focus formation assay) עם שילובי גנים, בדיקת תרבייה במידע רך (soft agar proliferation) ואנליזת מחזור תאים, כדי לענות על שאלות נוספות במטרה להעריך את תפקידו של גן מסוים בתהליך הפתוגנזה של קרצינוגנזה.

focus-formation-cell-based-assay-to-determine-oncogenic-potential

Research

JoVE Journal

Medicine

רפואה

סרטון זה מתאר בדיקת היווצרות מושבת אגר רכה כדי לבדוק את ההשפעות של מעכב אנזים PADI ו- BB-Cl-amidine על גידולים בסרטן השד במבחנה. בדיקה זו מאפשרת גם הערכה כמותית של פוטנציאל התמרת התא בהקשר של הפרעות גנטיות.

בדיקת היווצרות מושבת אגר רכה: שיטה לבדיקת השפעות של תרכובות חדשות על התפשטות תאים סרטניים

סרטון זה מתאר את בדיקת היווצרות המושבה, המסייעת לקבוע את יכולתם של תאי סרטן הריאה להתרבות ללא הגבלת זמן וליצור מושבות בודדות. אנו יכולים לנתח את ההשפעה של סוכן אנטי-סרטני על התאים יוצרי המושבה על ידי ניתוח השינויים במספר ו / או בגודל של המושבות המתקבלות.

בדיקת היווצרות מושבה: הערכת היעילות של חומרים אנטי-סרטניים על תאי סרטן ריאה יוצרי מושבה

סרטון זה מתאר את הפרוטוקול של יחידת היווצרות מושבה מבוססת מתיל צלולוז או בדיקת CFU, המסייעת לזהות ולספור את מספר המושבות שנוצרו על ידי תאים לוקמיים בתגובה לטיפול בתרכובות אנטי-סרטניות.

בדיקת CFU מבוססת מתיל תאית: שיטה לקביעת ההשפעה של תרכובות אנטי-סרטניות על היווצרות מושבות בתאים לוקמיים

השגת הבנה ברמת מערכות של תהליכים תאיים היא מטרה של ביולוגיה של התא המודרנית. אנו מתארים כאן אסטרטגיות לכתבי לוציפראז ריבוב של תפקוד תאי שונים נקודות קצה לחקור את תפקוד גן באמצעות הגנום בקנה מידה ספריות RNAi.

פלטפורמת הקרנה מבוססת לוציפראז Multiplexed לחקירת מלחמה בסרטן הקשורים להעברת אותות בתאים בתרבית

בדיקת היווצרות מושבת אגר רכה היא שיטה המשמשת לאישור צמיחה בלתי תלויה בעיגון תאי במבחנה. מטרת פרוטוקול זה היא להמחיש שיטה מחמירה לאיתור הפוטנציאל הגידולי של תאים שעברו טרנספורמציה וההשפעות מדכאות הגידול של חלבונים על תאים שעברו טרנספורמציה.

Assay גיבוש רך אגר המושבה

זיהוי מטרות תרופות חדשות שעוברות מניסויים פרה-קליניים לניסויים בבני אדם הוא בראש סדר העדיפויות המדעי. לשם כך, אנו מתארים כאן גישה גנומית פונקציונלית לבחינת ההשפעה של דלדול גנים על ספרואידים בקו תאים סרטניים, אשר מודלים בצורה מתאימה יותר סרטן אנושי in vivo.

ניצול הקרנת Genomics פונקציונלית כדי לזהות מטרות תרופה חדשנית פוטנציאלי תרבויות אליפטית תא סרטני

פיתחנו פרוטוקול חדש לחקר הדינמיקה האוכלוסייה הטרוקלולרית בתגובה הפרעות. כתב יד זה מתאר פלטפורמה מבוססת הדמיה המייצרת מערכי נתונים כמותיים לאפיון סימולטני של פנוטיפים סלולריים מרובים של אוכלוסיות הטרוסלריות בצורה חזקה.

אפליה ואפיון אוכלוסיות הטרוסקלריות באמצעות טכניקות הדמיה כמותית

כאן, אנו מתארים את פרוטוקולי האימות גנטי וכימי של c-פוס, Dusp1 כמטרה סמים בלוקמיה באמצעות העכבר גנטי, humanized במבחנה ויוו מודלים. בשיטה זו ניתן ליישם כל מטרה עבור אימות הגנטי ופיתוח טיפולית.

שיטות להערכת את התפקיד של c-פוס, Dusp1 התלות אונקוגן

פרוטוקול זה מתאר שיטה המיומנת לבידוד של תאים ראשוניים של העכבר השרירים, היווצרות tumorsphere וטיפול, השתלת השתלת החל בתרבויות tumorsphere.

והטיפול מתאי הגידול הראשוניים מבודדים מעכבר תמס שריר

תחומים עם הפרעה מהותית חשובים לתפקוד גורם שעתוק היתוך אונקוגני. כדי למקד חלבונים אלה באופן טיפולי, נדרשת הבנה מפורטת יותר של מנגנוני הרגולציה המועסקים על ידי תחומים אלה. כאן, אנו משתמשים בתעתיק כדי למפות תכונות מבניות חשובות של תחום EWS שהופרע באופן מהותי בסרקומה יואינג.

מיפוי קשרי מבנה-פונקציה של גורמי שעתוק אונקוגניים מופרעים באמצעות ניתוח תמלול

פרוטוקול ניסויי זה מספק שיטה יציבה, חסכונית ויעילה המשלבת הפלת lncRNA עם בדיקות ליצירת מושבות כדי לכמת את השפעת ה-lncRNA על התרבות תאי האוסטאוסרקומה.

בדיקת היווצרות מושבה לזיהוי יכולת ההתרבות של תאי האוסטאוסרקומה שנגרמו ל-LncRNA

למדו את שיטת Focus Formation Assay להערכת הפוטנציאל האונקוגני של גנים בתאי פיברובלסט עכברים NIH 3T3 באמצעות רטרוורוס. שיטה זו מאפשרת זיהוי יכולת הגנים לגרום לצמיחה בלתי תלויה בצפיפות.

להתמקד גיבוש: Assay מבוסס תאים כדי לקבוע את הפוטנציאל שבעור של ג'ין

גלה סרטונים נוספים