להתמקד גיבוש: Assay מבוסס תאים כדי לקבוע את הפוטנציאל שבעור של ג'ין

המטרה הכוללת של הליך זה היא לבצע את בדיקת היווצרות המיקוד בשורות תאים פיברובלסטים של עכברים, באמצעות רטרו-וירוס כדי לקבוע את הפוטנציאל האונקוגני של גן. זה מושג על ידי שיבוט רצף הגן המעניין לווקטור רטרו-ויראלי. השלב השני הוא לייצר חלקיקים רטרו-ויראליים באמצעות הווקטור הנגיפי ותאי האריזה PLA e.

לאחר מכן, הרטרו-וירוס משמש כדי להדביק שלושה תאי פיברובלסטים של עכבר NIH שלושה T על מנת להעריך את פוטנציאל הטרנספורמציה של הגן המבוקש. השלב האחרון הוא לאפשר ל-NIH שלושה תאי T להתחלק במשך שבועיים-שלושה, ולאחר מכן צביעה סגולה קריסטלית כדי לכמת את מספר המוקדים שנוצרו. בסופו של דבר, מבחן היווצרות המיקוד משמש כדי להראות אם ביטוי יתר של גן מעניין מספיק כדי לגרום לצמיחה בלתי תלויה בצפיפות בתאי פיברובלסטים של עכברים.

שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום הביולוגיה של הסרטן, כגון בדיקת הפוטנציאל האונקוגני של גן. כדי להתחיל, צור את הווקטור הנגיפי כמתואר בפרוטוקול הטקסט. לאחר מכן הקימו תרביות plat E מתאים קפואים על ידי הפשרה מהירה של תאי plat E באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס, ולאחר מכן העברה לצינור חרוטי של 15 מיליליטר.

הוסף לאט תשעה מיליליטר של מדיום PLA E לצינור החרוטי של 15 מיליליטר. צנטריפוגה את הצינור ב-180 פעמים G למשך חמש דקות, והשליכו את הסופרנטנט. השעו מחדש את התאים עם 10 מיליליטר מדיום פלטת E, והעבירו לתבנית תרבית של 10 סנטימטרים.

לאחר מכן דגרו את התאים בחממה של 37 מעלות צלזיוס 5% CO2 עד שהם יהיו בין 80 ל-90% קונפלואנט. בצע פיצול תאים על ידי שאיבת המדיום תחילה, ולאחר מכן שטוף את התאים פעם אחת עם PBS לפני הוספת שני מיליליטר של 0.05% טריפסין EDTA ודגירה למשך דקה אחת בטמפרטורת החדר, נתק את התאים על ידי הקשה באצבעות. לאחר מכן הוסף 10 מיליליטר של מדיום פלטת E והעביר את מתלה התא לצינור של 15 מיליליטר.

צנטריפוגה את הצינור כמו קודם והשעו מחדש את התאים עם 10 מיליליטר של מדיום פלטת E. הזרע הבא, 2 מיליון תאים לכלי תרבית של 10 סנטימטר באמצעות מדיום פלטת E ללא כל אנטיביוטיקה ומשאיר את התאים לדגור למשך הלילה. למחרת, העבירו 300 מיקרוליטר של אופטימום לצינור מיקרו של 1.5 מיליליטר.

הוסף 27 מיקרוליטר פוליאתילן אמין לצינור המוכן עם Optum. יש לערבב בעדינות על ידי הקשה על האצבעות ולדגור במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, הוסף תשעה מיקרוגרם של DNA פלסמיד בדרגת טרנספקציה לתוך הצינור המעורבב בעדינות על ידי מערבולת ודגירה למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר.

לאחר מכן מוסיפים את התערובת טיפתית לתוך צלחת הפלטה E לפני הדגירה למשך הלילה. למחרת שאבו את המדיום המכיל את מגיב הטרנספקציה והוסיפו 10 מיליליטר של מדיום פלטת E טרי לפני החזרת התאים לאינקובטור כדי להקים תרביות NIH שלוש T. ראשית, יש להפשיר במהירות את התאים באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס ולהעביר לצינור של 15 מיליליטר.

הוסיפו לאט תשעה מיליליטר של NIH שלוש, T שלושה מדיום לתאים, צנטריפוגה את הצינור ב-180 פעמים G למשך חמש דקות והשליכו את החטיף. לאחר מכן השעו מחדש את התאים עם 10 מיליליטר של NIH שלוש, T שלושה מדיום, והעבירו לתבנית תרבית של 10 סנטימטרים. דגרו את התאים בחממה של 37 מעלות צלזיוס 5% CO2, ושמרו אותם מתחת לקונפלואנט ככל שתדירות הטרנספורמציה הספונטנית עולה.

ברגע שתרבית מגיעה לשטף דיבור, ברגע שגדל זרע שלוש פעמים 10 עד החמישי, שלושה T שלושה תאים לכל צלחת של 10 סנטימטר ודוגרים למשך הלילה לזיהום למחרת. למחרת, קצרו את הסופרנטנט הרטרו-ויראלי מצלחת E באמצעות מזרק חד פעמי של 10 מיליליטר, סינון אותו דרך מסנן קרום ניילון בגודל 0.45 מיקרון, והעברתו לצינור של 15 מיליליטר. הוסף 10 מיליליטר מדיום E טרי לתאים לפני החזרתם לחממה.

לאחר מכן שאפו את המדיום מצלחת ה-NIH שלושה T שלושה תאים כדי להידבק והוסיפו חמישה מיליליטר של NI H רגיל שלושה, T שלושה מדיום וחמישה מיליליטר של וירוס המכיל סופרנטנט מסונן. לאחר מכן, הוסף מוח פולי למנה. הוסף ריכוז של שישה מיקרוגרם למיליליטר.

דגרו על התאים למשך הלילה לפני שתחזרו על שלבי ההדבקה לסבב שני של זיהום. לאחר ההדבקה להחליף את הנגיף, להכיל מדיום עם IH רגיל שלוש T שלוש מדיום. אפשר ל-IH שלושה תאי T לגדול במשך שניים עד שלושה, ולהחליף את המדיום לפי הצורך לצביעה קריסטלית סגולה.

שאפו את ה-NIH שלוש T שלוש בינוניות והניחו את הכלים על קרח. שוטפים את הכלים פעמיים עם PBS קר כקרח. תקן את התאים עם מתנול קר כקרח למשך 10 דקות.

לאחר מכן מוציאים את הכלים מהקרח ושואבים את המתנול. הוסף שלושה מיליליטר של תמיסת סגול קריסטל 0.5% העשויה ב-25% מתנול ודגירה על הכלים למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. לאחר הדגירה יש לשאוב את תמיסת הקריסטל סגול ולשטוף בזהירות את הכלי במי Milli Q עד שלא יורד צבע בשטיפה.

הניחו לכלים להתייבש ללא כיסוי למשך הלילה על ספסל. לאחר שהכלים יבשים, השתמש בסרגל כדי למדוד את המוקדים ולספור את אלה שקוטרם עולה על חמישה מילימטרים. המספר MXD שלוש הוא גורם שעתוק רוכסן לאוצין סליל לולאת סליל בסיסי שהוא חבר לא טיפוסי במשפחת MAD, ודווח שהוא מעורב בסרטן בהשוואה לבקרה השלילית והבקרה החיובית.

לשלוש מנות ה-NIH שלוש T שבהן התבטא יתר על המידה MXD 3 היו פחות מוקדים באופן משמעותי. הנתונים נאספו מניסויים מרובים כדי לקבוע את המשמעות ואותן מגמות נצפו מבדיקה זו. התוצאות מצביעות על כך ש-MXD 3 אינו מתפקד כאונקוגן בעקבות הליך זה.

ניתן לבצע שיטות אחרות כמו בדיקת היווצרות מיקוד עם שילובי גנים, גידול בהתפשטות מקדחה רכה וניתוח מחזור התא על מנת לענות על שאלות נוספות כדי להעריך את תפקידו של גן מעניין בפתוגנזה של אונקוגנזה.