הר הדמיה שטוחה של עור העכבר ויישומו לניתוח של שיער זקיק דפוסים וחושי אקסון מורפולוגיה

עור של יונקים מכיל מערך מגוון של מבנים - כמו זקיקי שיער וקצות עצבים - שמפגינים דפוסים ייחודיים של ארגון המרחבי. ניתוח עור כמו הר שטוח מנצל את הגיאומטריה 2 ממדית של רקמה זו להפקת תמונות ברזולוציה גבוהה בעובי מלא של מבני עור.

המטרה הכוללת של הליך זה היא לדמיין מבני עור כגון זקיקי שיער וקצות עצבים בשלמותם מבלי לחתוך פיזית את הדגימה. זה מושג תחילה על ידי איסוף עור מאזורי גוף שונים, כולל כף הרגל האחורית והזנב. השלב השני הוא לשטח ולנקות את דגימות העור.

לאחר מכן, דגימות העור נתונות לקיבוע מתאים. השלב האחרון הוא ביצוע צביעת חיסון או כימיה של היסטו על דגימות העור. בסופו של דבר, הדמיה באמצעות מיקרוסקופ מנתח או קונפוקלי משמשת להמחשת הגיאומטריה של מבני עור שונים.

היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות כמו הכנת הורמון אפידרמיס, הוא שניתן למרוח אותה על העור בכל מקום בגוף ואינה דורשת הפרדה של האפידרמיס מהדרמיס. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בחקר קוטביות תאי הכף. מכיוון שהגיאומטריה הדו-ממדית של העור והסידור המוזר של זקיקי השיער הופכים את העור למערכת אידיאלית לחקר תהליך זה, לא רק ששיטה זו יכולה לספק תובנה לגבי קוטביות תאי הצמח, ניתן ליישם אותה גם כדי לחקור היבטים אחרים של התפתחות העור, כגון הגדרה של סוגי נוירונים סומטוסנסוריים המבוססים על הדמיה ישירה של פעולות בודדות על מורפולוגיות עליונות.

הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית מכיוון שקשה ללמוד דיסקציה של העור מאזורים מסוימים כמו כפות הרגליים והזנב, חשוב לשטח אותם בצורה מושלמת ולהימנע מקמטים ומתיחות יתר. בהדגמה זו, עור הגב ייאסף משלושה עכברים שהומתו על ידי איזוף פלואור. שאיפה השתמש בלהבים כדי לבצע חתך אופקי מבסיס הזנב לאורך כל צד, עובר בצד הגבי של בסיס כל איבר, ממשיך לרוחב האוזניים ומסתיים באף.

קילף בעדינות את העור מהרקמה הבסיסית המשיכה מאחור לקדמית על ידי החזקת העור בין אצבעות הכפפות כך שלא יצבט על ידי מלקחיים. כאשר מקלפים את העור בגובה האוזניים תחילה, חותכים את האוזניים במספריים וממשיכים לאט במיוחד מכיוון שהעור יכול להיקרע במיקום זה. מנקודה זו ואילך, כוונו את העור כשהחלק הפנימי פונה כלפי מעלה.

הצמד את העור ל-S Guard עם כ-20 סיכות חרקים במרווחים שווים סביב הפריפריה. אין למתוח את העור יתר על המידה. כסו את העור ב-10 עד 20 מיליליטר PBS באמצעות מלקחיים זוויתיים או מעוקלים.

לנתח את השומן ורקמת החיבור הקשורים לעור. פנה לקצה המחודד של המלקחיים בצורה אופקית כדי למזער את הסיכון שהמלקחיים יחדרו לעור. הוצא את כל בועות האוויר שנלכדו מתחת לעור על ידי גלגול עדין של אפליקטור עם קצה כותנה על פני העור.

השלב הבא הוא לתקן את עור הסיכה. אם העור ישמש להדמיית מלנין או היסטוכימיה של פוספטאז אלקליין, הוסף 20 מיליליטר לצלחת סיגרים של 10 סנטימטר של 4% P-F-A-P-B-S או 10% פורמין חוצץ. אם העור ישמש לצביעה חיסונית או להמחשת קרטין מהונדס, KRT 17 GFP הוסף 20 מיליליטר לכל צלחת סוגר של 10 סנטימטר של 2% P-F-A-P-B-S שהוכנה בעדינות למשך הלילה בחדר קר למחרת, שטוף ב-PBS במשך יותר מ-10 דקות.

ההליך להיסטוכימיה של פוספטאז אלקליין לא יודגם בסרטון זה. להדמיית מלנין, יש לייבש את העור באמצעות סדרת אתנול מדורגת יום אחד לכל צעד עם סיבוב אופקי עדין בטמפרטורת החדר. שלושה ימים לאחר מכן, יש להסיר שאריות של רקמות חיבור מהעור המיובש עם העור ב-100% אתנול.

הסר את סיכות החרקים והעביר את העור לכלי זכוכית בקוטר 10 סנטימטרים. להצלחת הליך זה, יש לאסוף את דגימת העור כחתיכה שלמה ולשטח אותה בצורה מושלמת. הניחו שתי שקופיות מיקרוסקופ זכוכית על העור כדי לשטח אותו ולמנוע ממנו להתכרבל.

הוסף 20 מיליליטר של בנזואיל בנזואט ובנזואיל אלכוהול או BBBA, אשר יקשו במהירות את הרקמה במהלך השעות הקרובות. הרם את הכפכפים מהעור למשך מספר שניות כדי לאפשר ל-BBBA לשטוף את העור. עור כף הרגל לניתוח דפוס זקיקי השיער מנותח בדרך כלל מ-P אחד עד P שמונה לבעלי חיים לאחר המתת חסד, חתכו את כפות הרגליים מעל מפרק הקרסול ובצעו חתך ישר יחיד לאורך פני הגחון דרך כפות הרגליים.

קלף בעדינות את העור מהרקמה הבסיסית בכיוון פרוקסימלי עד דיסטלי. חותכים את האצבעות כדי לשחרר את העור ומצמידים את העור לספיגה כשהמשטח הפנימי פונה כלפי מעלה. יש רקמת חיבור מינימלית בכף הרגל.

עור טרנסגני. עור KRT 17 GFP מוכן כעת להדמיה להדמיית מלנין. תקן ועבד את העור כפי שהודגם קודם לכן עבור עור הגב לאחר המתת חסד של חיית P 21, הסר את השיער על ידי שפשוף מסיר שיער.

יש למרוח ג'ל על פני העור בעזרת אצבע ואגודל עטויים בכפפה ולהמתין 10 דקות. שטפו את פני העור במי ברז. לאחר מכן יש לנתח ולהצמיד את עור כף הרגל למגן S כפי שהוצג קודם לכן.

יש לתקן עם 1% P-F-A-P-B-S למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר ולאחר מכן לשטוף ב-PBS. להכנת עור הזנב, בצע חתך עגול סביב בסיס הזנב ולאחר מכן חריץ אורכי העובר לאורך הזנב לאורך פניו הגחוניות. קלף את עור הזנב החל מהקצה על ידי אחיזה חזקה בקצה עצם הזנב ו/או רקמת החיבור עם זוג מלקחיים אחד ואת העור עם זוג מלקחיים שני.

הצמד את עור הזנב למגן SIL לניתוח פיזור המלנין וכיוון זקיק השיער. לתקן ולעבד את העור כפי שהודגם עבור עור הגב לניתוח בלוטות החלב לפני הקיבוע. חותכים את עור הזנב לסדרה של מקטעים באורך של כ-0.5 עד סנטימטר אחד, ודוגרים על חתיכות העור ב-PBS EDTA של חמישה מילי-מולרית למשך הלילה ב-37 מעלות צלזיוס.

כדי להחליש את הידבקות הדרמיס אפידרמיס למחרת, יש לקלף בעדינות את האפידרמיס מהדרמיס. הצמד את ממשק האפידרמיס למגן S וקבע 4% P-F-A-P-B-S למשך שעה בטמפרטורת החדר. לאחר מכן יש לשטוף את האפידרמיס עם PBS ולהכתים בשמן אדום O כמתואר בטקסט הפרוטוקול.

מיקרוסקופ מנתח משמש להדמיית עורות כף הרגל או הזנב הגביים השקועים ב-BBBA שטוחים מתחת למגלשת הזכוכית ועדיין בכלי הזכוכית. גישה זו ממזערת את זיהום BBBA במיקרוסקופ. האירו את הצלחת מלמטה כדי למזער את השונות המרחבית בעוצמת האור על פני שדה הראייה.

הרם את צלחת הזכוכית לגובה של כ -10 סנטימטרים מעל משטח העבודה הסטנדרטי של מיקרוסקופ החיתוך והנח צלחת פלסטיק או זכוכית מפזרת מעל מקור האור. בסיום ההדמיה, החזירו את העור ל-100% אתנול לאחסון לטווח ארוך בטמפרטורה שלילית של 20 מעלות צלזיוס. להכנת עור מוכתם פוספטאז אלקליין להדמיה, הניחו אותו בין שתי צלחות זכוכית מהסוג המשמש לג'ל חלבון קטן.

היזהר להימנע מהכנסת בועות אוויר בין הצלחות לעור. נדפו בזהירות את כל עודפי ה-BBBA בעזרת מגבת נייר. הניחו את הכריך הזה של צלחת עור צלחת על במת מיקרוסקופ.

השתמש בתאורת שדה בהיר או DIC עם מטרה של פי 10 ושני מיקרומטר או חמישה מיקרומטר צעדי Z. השתמש בבמת XY ממוכנת כדי ללכוד מונטאז' של תמונות XY שמחוברות יחד ליצירת ערכת נתונים תלת-ממדית אחת בגווני אפור. בצע מעקב אוטומטי למחצה של סוכות אקסון עם כל אחת ממגוון חבילות התוכנה.

ניתן להשתמש בהדמיית שדה בהיר של תושבות שטוחות עור כדי לדמות סוכת חושים עורית בודדת המוצגת כאן עם התמונה העקבה שלה. הדמיית Brightfield מאפשרת גם הדמיה של דפוסי זקיקי שיער המבוססים על פיגמנטציה של מלנין. תמונות אלה מציגות P עור אחד מסוג פרא ומקורזל שישה עכברי נוקאאוט ו-P שבעה עור משישה עכברי נוקאאוט מקורזלים.

ניתן להשתמש בהדמיית מיקרוסקופ אור של תושבות שטוחות של העור כדי להגדיר את הגיאומטריה של בלוטות החלב והזנבות. עור המוצג באדום שמן O בלוטות החלב אינן מאורגנות בעכבר מקורזל של שש נוקאאוט בהשוואה לכף רגל גבית מסוג פראי. עור שנקטף מסוג בר ומקורזל שישה עכברי נוקאאוט הנושאים GFP מתויג קרטין KRT 17 GFP ומוכתם בשמן.

Red O גילה שלעור הנוקאאוט יש מערבולת שיער במרכזו. הדמיה קונפוקלית של תושבות עור שטוחות יכולה גם להגדיר את הגיאומטריה של זקיקי השיער המומחשת עם KRT 17 GFP וגלולת צביעה חיסונית וזקפה נגד GFP. שרירי העיניים הדמיינו עם צביעה חיסונית של אקטין שריר אנטי סמו.

אשכולות תאי מרקל מוצגים עם אנטי ציטוקרטין שמונה או עם ספיגת צבע am 1 43 וזקיק השיער המרכזי שלו מומחש עם KRT 17 GFP במקום להיות פתוח לכיוון הקדמי, אשכול תאי מרקל המקורזל יוצר מעגל סגור לאחר שליטה ניתן לבצע דיסקציה תוך כ-30 דקות אם היא מבוצעת כראוי וניתן לבצע דירוגים שונים תוך מספר ימים עד שבוע. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לאסוף עור מאזורים שונים בגוף וכיצד לעמוד אותם כדי לדמיין מבני עור שונים בפורמט ההורמונים. ניתן לאסוף תמונות בעובי מלא וברזולוציה גבוהה של מבני עור על ידי מיקרוסקופ אור גבוה סטנדרטי ומיקרוסקופיה קונפוקלית.

אל תשכח שעבודה עם אלדהיד פרפורמי ו-BBBA יכולה להיות מסוכנת ביותר. יש למזער שאיפת אדים על ידי שמירת תמיסות אלה במיכלים מכוסים ולהימנע ממגע עם העור. אל תאפשר ל-BBBA ליצור קשר עם פלסטיק.