הר הדמיה שטוחה של עור העכבר ויישומו לניתוח של שיער זקיק דפוסים וחושי אקסון מורפולוגיה

המטרה הכללית של הליך זה היא לה可וויזואליזציה של מבני עור, כגון זקיקי שיער וסיומות עצביות, במלואם ללא חיתוך פיזי של הדגימה. זאת מושגים תחילה על ידי איסוף עור מאזורי גוף שונים, כולל הגב, כף הרגל האחורית והזנב. השלב השני הוא יישור וניקוי של דגימות העור.

לאחר מכן, דגימות העור עוברות קיבוע מתאים. השלב הסופי הוא ביצוע צביעה אימונוהיסטוכימית או היסטוכימיה על דגימות העור. לבסוף, נעשה שימוש בדימות באמצעות מיקרוסקופ סטריאוסקופי או מיקרוסקופ קונפוקלי כדי להדגים את הגאומטריה של מבני עור שונים.

היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון הכנת דגימת הורמון אפודרמלית (epidermal hormone mount preparation), הוא שניתן ליישמה על עור בכל מיקום בגוף והיא אינה דורשת הפרדה של האפודרמיס מהדרמיס. שיטה זו יכולה לסייע במתן תשובות לשאלות מפתח במחקר של פולריות תאי פלנטר (plantar cell polarity). מאחר שהגאומטריה הדו-ממדית של העור והסידור המוזר של זקיקי השיער הופכים את העור למערכת אידיאלית לחקר תהליך זה, שיטה זו לא רק יכולה לספק תובנות לגבי פולריות תאי פלנטר, אלא ניתן ליישמה גם למחקר היבטים אחרים של התפתחות העור, כגון הגדרת סוגי נוירונים סומטוסנסוריים (somatosensory neurons) המבוססת על ויזואליזציה ישירה של מורפולוגיות בודדות בחלק העליון.

הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית, כיוון שהסרה של העור מאזורים מסוימים, כגון הרגליים והזנב, היא קשה ללמידה, והשגתו של פריסה מושלמת תוך מניעת קמטים ומתיחת יתר היא חשובה. בהדגמה זו, עור גב ייאסף משלושה עכברים שהורדמו באמצעות isof fluorine. Inhalation. השתמשו בלהבים כדי לבצע חתך אופקי מבסיס הזנב לאורך כל צד, תוך מעבר בצד הגבי של בסיס כל גפה, המשך לצד האוזניים וסיום באף.

קלפו בעדינות את העור מהרקמה שמתחתיו, מהחלק האחורי אל החלק הקדמי, על ידי החזקת העור בין אצבעות כפוףות כך שלא ייצבץ על ידי פינצטה. בעת קילוף העור בגובה האוזניים תחילה, גזרו את האוזניים בעזרת מספריים והמשיכו באיטיות רבה, שכן העור עלול להיקרע במיקום זה. מרגע זה ואילך, כוון את העור כך שהחלק הפנימי פונה כלפי מעלה.

הצמיד את העור ל-S Guard באמצעות כ-20 סיכות לחרקים המרוחקות באופן שווה סביב ההיקף. אין למתוח את העור יתר על המידה. כסה את העור ב-10 עד 20 milliliters של PBS באמצעות פינצטה זוויתית או מעוקלת.

הסיר בניתוח את השומן ורקמת החיבור הקשורה לעור. כוון את הקצה המחודד של הפינצטה בצורה אופקית כדי למזער את הסיכון שהפינצטה תחדור את העור. הוצא בועות אוויר שנלכדו מתחת לעור על ידי גלגול עדין של מקלוני צמר על פני השטח של העור.

השלב הבא הוא קיבוע עור כרית הרגל. אם העור ישמש לדימיון מלנין או להיסטוכימיה של פוספטאזה בסיסית, הוסיפו 20 milliliters לכל Petri dish של 10 centimeter של 4%P-F-A-P-B-S או 10%buffered formin שהוכרוה טרי. אם העור ישמש לצביעה אימונוהיסטוכימית או להדמיית קרטין טרנסגני, KRT 17 GFP, הוסיפו 20 milliliters לכל Petri dish של 10 centimeter של 2%P-F-A-P-B-S שהוכר טרי. סובבו בעדינות למשך לילה בחדר קרר, וביום למחרת, שטפו ב-PBS למשך יותר מ-10 דקות.

ההליך להיסטוכימיה של אלקאלי פוספטאז לא יודגם בסרטון זה. לצורך דימוי מלנין, יש לבצע דהידרטציה לעור באמצעות סדרת אתנול מדורגת, למשך יום אחד עבור כל שלב, תוך סיבוב אופקי עדין בטמפרטורת החדר. שלושה ימים לאחר מכן, יש להסיר רקמות חיבור שאינן רצויות מהעור המיובש כאשר העור נמצא ב-100% ethanol.

הסר את סיכות החרקים והעבר את העור לצלחת זכוכית בקוטר 10 סנטימטר. להצלחת הליך זה, יש לאסוף את דגימת העור כיחידה אחת שלמה ולהשטיח אותה באופן מושלם. הנח שתי זכוכיתיות מיקרוסקופ על העור כדי להשטיחו ולמנוע ממנו להתקמט.

הוסיפו 20 milliliters של benzoyl benzoate ו-benzoyl alcohol, או BBBA, אשר יקשחו במהירות את הרקמה במהלך השעות הבאות. הרימו את השקופיות מהעור למשך מספר שניות כדי לאפשר ל-BBBA להישטוף את העור. עור כף הרגל עבור ניתוח דפוסי זקיקי השיער מופק בדרך כלל מבעלי חיים בשלבים P1 עד P8. לאחר ההדחה, חתכו את כפות הרגליים מעל מפרק הקרסול ובצעו חתך ישר אחד לאורך המשטח הוונטרלי דרך כפות הרגליים.

קלפו בעדינות את העור מהרקמה שמתחתיו, תוך התקדמות בכיוון פרוksimali ל-distali. גזרו את האצבעות כדי לשחרר את העור והצמידו את העור למשטח הפינינג כאשר הפנימי פונה כלפי מעלה. ברגל קיימת כמות מינימלית של רקמת חיבור.

עור טרנסגני. עור KRT 17 GFP מוכן כעת לדימוי של מלנין. קבעו ועבדו את העור כפי שהודגם קודם לכן עבור עור גבי. לאחר המתנת החיה ביום P 21, הסירו את הפרווה באמצעות שפשוף עם מסיר שיער.

מרחו ג'ל על פני העור באמצעות אצבע ואגודל עם כפפה והמתינו 10 דקות. שטפו את פני העור במי ברז. לאחר מכן, בצעו נתיחה והצמידו את עור כף הרגל למסך הגנה S כפי שהודגם קודם לכן.

קבעו ב-1%P-F-A-P-B-S למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר ולאחר מכן שטפו ב-PBS. כדי להכין את עור הזנב, בצעו חיתוך מעגלי סביב בסיס הזנב ולאחר מכן חתך אורך לאורך פניו הגבון של הזנב. קלפו את עור הזנב החל מהקצה, תוך써 אחיזה חזקה בקצה עצם הזנב או ברקמה המחברת באמצעות צבת אחת, ובCעור באמצעות צבת שנייה.

הצמידו את עור הזנב למגן SIL לצורך ניתוח פיזור המלנין וכיוון זקיקי השערה. קבעו ועבדו את העור כפי שהודגם עבור עור גבי לפני הקיבעון, לצורך ניתוח בלוטות החלב. חתכו את עור הזנב לסדרת מקטעים באורך של כ-0.5 עד 1 סנטימטר, והדגירו את חתיכות העור ב-PBS עם 5 millimolar EDTA למשך לילה בטמפרטורה של 37 °C.

כדי להחליש את ההיצמדות בין הדרמיס לאפידרמיס למחרת, קלפו בעדינות את האפידרמיס מהדרמיס. הצמידו את ממשק האפידרמיס ל-S guard וקבעו ב-4% P-F-A-P-B-S למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, שטפו את האפידרמיס עם PBS וצבעו ב-oil red O כפי שמתואר בטקסט של הפרוטוקול.

מיקרוסקופ דיסקציה משמש להדמיה של עור מגב כף הרגל או של זנבות הטובעים ב-BBBA, המונחים באופן שטוח מתחת לעששת הזכוכית ועדיין בתוך צלחת הזכוכית. גישה זו ממזערת את זיהום המיקרוסקופ ב-BBBA. יש להאיר את הצלחת מלמטה כדי למזער את השונות המרחבית בעוצמת האור על פני שדה הראייה.

הגביהו את צלחת הזכוכית לגובה של כ-10 סנטימטרים מעל משטח העבודה הסטנדרטי של מיקרוסקופ הפרוזקטור והניחו פלטת פלסטיק או זכוכית מפזרת מעל מקור האור. עם סיום הדמיה, החזירו את העור ל-100% ethanol לאחסון לטווח ארוך בטמפרטורה של 20- מעלות צלזיוס. כדי להכין עור שנצבע באלקליין פוספטאז להדמיה, הניחו אותו בין שתי פלטות זכוכית מהסוג המשמש לג'לים של חלבונים קטנים.

הקפידו להימנע מהחדרת בועות אוויר בין הפלטות לעור. ספגו בזהירות כל עודף של BBBA באמצעות נייר סופג. הניחו את "סנדוויץ'" הפלטה-עור-פלטה על במה של מיקרוסקופ.

השתמשו בתאורה מסוג brightfield או DIC עם עדשה אובייקטיבית 10x וצעדי Z של שני מיקרומטרים או חמישה מיקרומטרים. השתמשו בבמה מכנית XY כדי ללכוד מונטאז' של תמונות XY המחוברות יחד ליצירת סט נתונים חד-ערכי (gray scale) תלת-ממדי יחיד. בצעו מעקב (tracing) חצי-אוטומטי של עצי אקסונים באמצעות אחת ממגוון חבילות תוכנה.

ניתן להשתמש בדימות בשדה בהיר (Brightfield imaging) של דגימות עור שטוחות כדי לדמות עצב תחושתי עורי בודד, המוצג כאן יחד עם התמונה שעוקבת אחריו. דימות בשדה בהיר מאפשר גם ויזואליזציה של דפוסי זקיקי שיער המבוססת על פיגמנטציה של מלנין. תמונות אלו מציגות עור של עכברים ביום P1 מסוג בר (wild type) ומעכברים עם נוק-אאוט של Frizzled six, ועור של עכברים ביום P7 עם נוק-אאוט של Frizzled six.

דימות במיקרוסקופיה של אור של דגימות עור שטוחות (flat mounts) יכול לשמש להגדרת הגאומטריה של בלוטות החלב והזנבות שלהן. בעור שחולק עם צבע Oil Red O, בלוטות החלב בעכבר עם נוקאאוט לגן frizzled six אינן מאורגנות בהשוואה לכף רגל גבית של עכבר מסוג פראי (wild type). עור שנאסף מעכברים מסוג פראי ועכברי נוקאאוט לגן frizzled six הנושאים קרטטין KRT 17 המסומן ב-GFP וצבוע בשמן.

צביעה ב-Red O גילתה כי בעור של עכברי ה-knockout קיים מערבולת שיער במרכזו. הדמיה קונפוקלית של דגימות שטוחות של העור יכולה להגדיר את הגאומטריה של זקיקי השיער שחוללו באמצעות KRT 17 GFP וצביעה אימונוהיסטוכימית עם anti GFP ושריר המקשש (erector pili). שרירי העין חוללו באמצעות צביעה אימונוהיסטוכימית עם anti smooth muscle actin.

צבירי תאי מרקל (Merkel cells) מודגשים באמצעות נוגדן ל-cytokeratin eight או באמצעות ספיגת צבע am 1 43, וזקיקת השערה המרכזית מודגשת באמצעות KRT 17 GFP. בניגוד למצב שבו הצביר פתוח לכיוון הקדמי (anterior), צביר תאי מרקל בעכביש עם נוק-אאוט של Frizzled six יוצר מעגל סגור. לאחר רכישת מיומנות, ניתן לבצע את הניתוח בערך תוך 30 דקות אם הוא מבוצע כהלכה, וניתן להכין דגימות שונות בתוך מספר ימים עד שבוע. לאחר צפייה בסרטון זה, אמירה לכם הבנה טובה כיצד לאסוף עור מאזורים שונים של הגוף וכיצד להכין אותם כדי להדגים מבני עור שונים בפורמט הורמונלי. ניתן לאסוף תמונות ברזולוציה גבוהה ובעובי מלא של מבני עור באמצעות מיקרוסקופיה של אור רגיל ומיקרוסקופיה קונפוקלית.

יש לזכור כי עבודה עם פאראפורמאלדהיד ו-BBBA עלולה להיות מסוכנת ביותר. יש למזער שאיפה של אדים על ידי שמירת תמיסות אלו במכלים סגורים, ויש להימנע ממגע עם העור. אין לאפשר ל-BBBA לבוא במגע עם פלסטיק.