Name: יסודי תרבות של עכבר דופאמין נוירונים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-09-08T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 58 s
Description: למד כיצד ליצור תרבות ראשונית של נוירונים דופאמינרגיים ממוחות עכבר עובריים. שיטה זו מאפשרת חקר פגיעות נוירונים במחלת פרקינסון ובהפרעות נוירולוגיות נוספות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

נתמך על ידי מענקים מ-CNRS ו-INSERM. ראש הממשלה מכיר בתמיכת הקרן למחקר רפואי בצרפת (Equipe FRM 2009). SC מודה על תמיכתה של הקרן הצרפתית.

העכברים המשמשים בעבודה זו טופלו ויטופלו בהתאם להנחיות של מועצת האיחוד האירופית (86/609 / איחוד אירופי) לשימוש בחיות מעבדה. .1 הכנת פתרונות הנדרשים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתרונות מניות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתרון 10x פולי-L-ornithine (אש&quot;ף): לשקול את 10 מ&quot;ג hydrobromide אש&quot;ף (משקל מולקולרי = 30,000-70,000) ולפזר ב70 מ&quot;ל של מים סטריליים. סנן את הפתרון באמצעות 0.2 מיקרומטר מסנן מזרק, aliquot, ולאחסן ב -20 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 30% פתרון גלוקוז: לשקול את 30 גרם של D (+) - גלוקוז ולהתמוסס במים סטריליים להיקף כולל של 100 מ&quot;ל. מסנן, aliquot, ולאחסן ב 4 ° C.. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בינוני של 5x השתנה Dulbecco של הנשר (DMEM) / תערובת מזין F-12 חם: לשקול את 6 גרם של אבקת DMEM / F-12 חם ומתמוסס במים סטריליים להיקף כולל של 100 מ&quot;ל. מסנן, aliquot, ולאחסן ב 4 ° C.. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 7.5% סודיום ביקרבונט (NaHCO 3) Solutiב: לשקול את 7.5 גרם של NaHCO 3 ולהתמוסס במים סטריליים להיקף כולל של 100 מ&quot;ל. מסנן, aliquot, ולאחסן ב 4 ° C.. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 1 M HEPES פתרון: לשקול את 23.8 גרם של HEPES ולהתמוסס במים סטריליים להיקף כולל של 100 מ&quot;ל. מסנן, aliquot, ולאחסן ב 4 ° C.. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אתנול 70% (v / v): לדלל 70 מ&quot;ל של אתנול מוחלט עם 30 מ&quot;ל של מים סטריליים. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בופר פוספט עם גלוקוז ואנטיביוטיקה (PBS-GAB): להוסיף 10 מ&quot;ל של 30% פתרון גלוקוז ו5 מ&quot;ל של תמיסת פניצילין, סטרפטומיצין 500 מ&quot;ל של בופר פוספט של Dulbecco. חנות ב 4 ° C.. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מומת בסרום שור עוברי (iFBS): להפשיר בסרום שור הלילה בשעה 4 מעלות צלזיוס ולהשבית ב56 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות. Aliquot לתוך 50 מ&quot;ל ולאחסן ב -20 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תרבות בינונית: במים סטריליים, לערבב ברציפות 40 מ&quot;ל של 5x DMEM / F12-שינקין, 1 מ&quot;ל של 1 M HEPES, 2 מ&quot;ל של 200 מ&quot;מ L-גלוטמין, 2 מ&quot;ל של פניצילין, סטרפטומיצין, 4 מ&quot;ל של 30% גלוקוזnd 3 מ&quot;ל של .7.5% NaHCO 3 עד נפח סופי של 180 מ&quot;ל. לסנן ולהשתמש באותו היום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ההורמון Mix <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 180 מ&quot;ל של מדיום התרבות. לפזר 200 מ&quot;ג של apo-transferrin במדיום זה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשקול את 50 מ&quot;ג של אינסולין ולהתמוסס ב2 מ&quot;ל של 0.1 M HCl. לאט להוסיף 8 מ&quot;ל של מים סטריליים תוך ערבוב בעדינות. לדלל את הפתרון הזה במדיום התרבות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשקול את 19.3 מ&quot;ג של Putrescine dihydrochloride ולהתמוסס ב10 מ&quot;ל של מים סטריליים. מוסיף את הפתרון 10 מ&quot;ל לתערובת ההורמון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרון 3 מ&quot;מ selenite נתרן במים סטריליים ופתרון פרוגסטרון 2 מ&quot;מ באתנול מוחלט. הוסף 20 μl של כל פתרון לתערובת ההורמון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סנן את תערובת ההורמון, aliquot לתוך 10 מ&quot;ל ולאחסן ב -20 מעלות צלזיוס. </li></ol></li></ol> 2 הכנת פלטות תרבות ומכשירים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> FBS ציפוי של צלחות התרבות: היום לפני הנתיחה, להכין 180 מ&quot;ל של מדיום התרבות. הוסף 10 מ&quot;ל שלiFBS 90 מ&quot;ל של מדיום התרבות. הוסף 300 μl / גם של מדיום התרבות / 10 iFBS% ל24 גם צלחות Precoated פולי-D-ליזין. דגירה הלילה בשעה 37 C °. אחסן את המדיה שנותרה (עם ובלי iFBS) בשעה 4 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעקר את המכשירים וטפטפות פסטר. אסוף את הציוד מפורט בטבלת חומרים, כמו גם זרימה למינרית Class II וCO 2 באינקובטור. </li></ol> .3 Dissection של העכבר mesencephalon <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להקריב את העכבר בהריון E13.5 (על פי הנחיות מוסדיות). נקה את הבטן של העכבר עם 70% אתנול ולפתוח את קיר הבטן. לאסוף את קרן הרחם, לפתוח אותם באמצעות מספריים עדינים, לנתח כל עובר מקרני הרחם, ולהסיר את הקרומים מי השפיר. מניחים את העוברים בצלחת פטרי 100 מ&quot;מ המכילה PBS-GAB סטרילי ולשטוף אותם על ידי העברה ב3 אמבטיות זהות רצופות באמצעות מלקחיים. לנתיחה, למקם את העוברים על ידי 3 בצלחת פטרי סטרילית 60 מ&quot;מ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Movדואר צלחת פטרי הסופי תחת סטראו. אל לערוף את העוברים. בעזרת המספריים Vannas, תחתוך את המוח. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוציא בזהירות ולבטל את האזורים הקדמיים והמוח אחוריים. לצד מקורי, לחתוך קרוב לאזור התלמוס, לצד קיצוץ הזנב באזור המצר, להסיר את colliculus מעולה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברגע שמוח תיכון הגחון מבודד, להסיר בזהירות קרומי המוח באמצעות מלקחיים יפים במיוחד. לאסוף קטעים גזורים, ללא קרומי המוח, בצינור 13 מ&quot;ל סטרילי המלא PBS-GAB. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נקה את הצינור המכיל mesencephala ביסודיות עם אתנול 70% ולהביא אותו מתחת למכסת המנוע. </li></ol> דיסוציאציה .4 הסלולרי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף mesencephala 3x עם PBS-GAB סטרילי. לאפשר שברי המוח ליישב בין כל שטיפה ולהימנע מלשבש את הרקמה. לאחר לשטוף האחרון, להסיר בזהירות רב כפתרון שאפשר לדגור מגזרי מוח ב 3 מ&quot;ל של טריפסין / EDTA ל15 דקות ב 37 מעלות צלזיוס בCO 2 באינקובטור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אש פולנית טפטפות פסטר על מנת למקסם את ההישרדות של תאי העצב כמו הסוף של pipet זכוכית שאינה מלוטשת היא חד ויכולה לגרום נזק לתאים במהלך שלבי הניתוק. מעט להפחית את קוטר הגפיים (עד 0.5 מ&quot;מ) של פיפטה פסטר תוך אש וליטוש לזה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוציא בזהירות כמה שפתרון / EDTA טריפסין ככל האפשר ולהוסיף 10 מ&quot;ל של מדיום התרבות / 10 iFBS%. מגזרי המוח לשטוף 3x עם iFBS מדיום התרבות / 10%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות פיפטה פסטר האש מלוטשת, מתחיל ניתוק של mesencephala ב6 מ&quot;ל של מדיום התרבות / 10 iFBS%. Triturate 10x (למנוע בועות אוויר), לאפשר לנתחים להתיישב, ואז לאסוף את המדיום בצינור מ&quot;ל 13 סטרילי חדש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 6 מ&quot;ל של מדיום התרבות, חזור על השלב הקודם פעם אחת ולאסוף את המדיום המכיל תאים ניתקו באותו הצינור 13 מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאי צנטריפוגה ב160 גרם במשך 5 דקות. בטל supernatant ו resuspend התאים במדיום התרבות בתוספת10% תמהיל הורמון. </li></ol> .5 נייד ציפוי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספירת תאים בתרחיף בתא Malassez ולהתאים את עוצמת הקול של מדיום לריכוז של 600,000 תאים / מ&quot;ל. ניתן להשיג בסביבות 1,700,000 תאים מmesencephalon עכבר אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר FBS המכיל מדיום ציפוי מ24 גם צלחות ולהוסיף בכל טוב 1 מ&quot;ל של השעיה תא (600,000 תאים / היטב, 2-4% מTH + תאים). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה את הצלחת על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2/95% אוויר. אין שינוי מדיום הוא הכרחי. נוירונים דופאמין בשלים לאחר סביב 5-7 ימים במבחנה (ביטוי עקבי של טרנספורטר דופאמין). שמור את התאים בתרבית עד 15 ימים ללא החלפה בינונית. </li></ol> פרוטוקול .6 Immunofluorescence <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ניקוי של Coverslips <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> היום לפני הנתיחה, להוסיף 10 מ&quot;ל של 1 M HCl לתוך צלחת פטרי. הנח על פני השטח של coverslips הזכוכית הנוזלי 12-15 ולחכות 15 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשקוע הכיסוילהחליק לתוך הנוזל והמתן 15 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר HCl ולשטוף 3x עם מים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף את coverslips במהירות עם אתנול טהור פעם אחת, ולאחר מכן להוסיף אתנול טהור למאכל ולחכות 30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מתחת למכסה המנוע, להסיר coverslips ניקה מאתנול ולהוסיף coverslip 1 לכל טוב של צלחת תרבית תאי 12 גם באמצעות מלקחיים מעוקרים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף coverslips פעמיים עם מים סטריליים (1 מ&quot;ל / טוב). לאחר מכן, לשטוף אותם פעם עם PBS סטרילי. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ציפוי של Coverslips <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר PBS ולהוסיף 500 μl / גם של 2x אש&quot;ף (בדילול מלא PBS). דגירה של 4 שעות ב 37 ° C בחממת CO 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את פתרון אש&quot;ף ולשטוף 3x עם PBS סטרילי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר PBS ולהוסיף 500 μl / גם של 20 iFBS% / 1 גר &#39;/ מ&quot;ל ​​Laminin. דגירה הלילה בשעה 37 ° C בחממת CO 2. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ציפוי התאים לImmunofluorescence <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר בינוני ציפוי מ12 גם צלחות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת 900,000 תאים / היטב ב2 מ&quot;ל נפח ולגדל את התאים על 37 מעלות צלזיוס בחממה. יכולים להיות כל הזמן תאים בתרבית עד 15 ימים ללא החלפה בינונית. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Immunostaining <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר בינוני מ12 גם צלחות ולשטוף עם 500 μl / גם DMEM שחומם מראש על 37 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 500 μl / גם של DMEM שחומם מראש על 37 מעלות צלזיוס, ולאחר מכן להוסיף paraformaldehyde עדינות 160 μl / גם של 8% (PFA, 2% ריכוז סופי) ודגירה של 10 דקות על 37 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר PFA ולשטוף 3x עם PBS / 0.1 M גליצין עבור 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר PBS, להוסיף / טוב של PBS / 0.05% טריטון X-100/20% בסרום עיזים 300 μl ודגירת 30 דקות בטמפרטורת חדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר בינוני, להוסיף טריטון X-100/1% בסרום עיזים 300 μl / גם של נוגדן הראשוני מדולל PBS / 0.05% ודגירה של 2 שעות בטמפרטורת חדר. נוגדנים עיקריים שיכול לשמש לזיהוי של נוירונים דופאמין ואפיון של התרבות מצוינים בטבלת חומרים. שמור1 גם בלי נוגדן ראשוני על מנת להעריך לרקע של הנוגדנים משני השונים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר בינוני ולשטוף 3x עם PBS / 0.2% ג&#39;לטין עבור 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר בינוני, להוסיף טריטון X-100/1% בסרום עיזים 300 μl / גם של נוגדנים משני בדילול המלא PBS / 0.05% ודגירה עבור שעה 1 בטמפרטורת חדר, בחושך. נוגדנים משני המשמשים מצוינים בטבלת חומרים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר בינוני ולשטוף 3x עם PBS / 0.2% ג&#39;לטין עבור 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר בינוני ולשטוף 3x עם PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הר coverslips בצד תא שקופיות זכוכית למטה בירידה של Vectashield. שמור את השקופיות בלילה טמפרטורת חדר כדי לתת לי בינונית יבש ההרכבה, לאחר מכן לאחסן אותם ב 4 ° C.. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לרכוש תמונות באמצעות מיקרוסקופ confocal או מיקרוסקופ שלב בניגוד מצויד לepifluorescence. נציג תמונות נרכשו באמצעות מיקרוסקופ confocal לייקה SP2 UV. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Glowinski, J., Cheramy, A., Romo, R., Barbeito, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Presynaptic+regulation+of+dopaminergic+transmission+in+the+striatum%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Presynaptic regulation of dopaminergic transmission in the striatum.</a> Cell Mol Neurobiol. 8, 7-17 (1988).</li>
<li>Iversen, S. D., Iversen, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dopamine%3A+50+years+in+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Dopamine: 50 years in perspective.</a> Trends Neurosci. 30, 188-193 (2007).</li>
<li>Dahlstroem, A., Fuxe, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+the+Existence+of+Monoamine-Containing+Neurons+in+the+Central+Nervous+System+I.+Demonstration+of+Monoamines+in+the+Cell+Bodies+of+Brain+Stem+Neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Physiol+Scand+Suppl.+SUPPL%22%5BJournal%5D)">Evidence for the Existence of Monoamine-Containing Neurons in the Central Nervous System I. Demonstration of Monoamines in the Cell Bodies of Brain Stem Neurons.</a> Acta Physiol Scand Suppl. SUPPL. , 231-255 (1964).</li>
<li>Chinta, S. J., Andersen, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dopaminergic+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Biochem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Dopaminergic neurons.</a> Int J Biochem Cell Biol. 37, 942-946 (2005).</li>
<li>Bjorklund, A., Dunnett, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dopamine+neuron+systems+in+the+brain%3A+an+update%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Dopamine neuron systems in the brain: an update.</a> Trends Neurosci. 30, 194-202 (2007).</li>
<li>Hegarty, S. V., Sullivan, A. M., O'Keeffe, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Midbrain+dopaminergic+neurons%3A+a+review+of+the+molecular+circuitry+that+regulates+their+development%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Midbrain dopaminergic neurons: a review of the molecular circuitry that regulates their development.</a> Dev Biol. 379, 123-138 (2013).</li>
<li>Samii, A., Nutt, J. G., Ransom, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Parkinson's disease.</a> Lancet. 363, 1783-1793 (2004).</li>
<li>Santini, E., Heiman, M., Greengard, P., Valjent, E., Fisone, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+mTOR+signaling+in+Parkinson%27s+disease+prevents+L-DOPA-induced+dyskinesia%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Signal%22%5BJournal%5D)">Inhibition of mTOR signaling in Parkinson's disease prevents L-DOPA-induced dyskinesia.</a> Sci Signal. 2, (2009).</li>
<li>Ohlin, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascular+endothelial+growth+factor+is+upregulated+by+L-dopa+in+the+parkinsonian+brain%3A+implications+for+the+development+of+dyskinesia%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">Vascular endothelial growth factor is upregulated by L-dopa in the parkinsonian brain: implications for the development of dyskinesia.</a> Brain. 134, 2339-2357 (2011).</li>
<li>Obeso, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Missing+pieces+in+the+Parkinson%27s+disease+puzzle%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Missing pieces in the Parkinson's disease puzzle.</a> Nat Med. 16, 653-661 (2010).</li>
<li>Cooper, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pharmacological+rescue+of+mitochondrial+deficits+in+iPSC-derived+neural+cells+from+patients+with+familial+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Pharmacological rescue of mitochondrial deficits in iPSC-derived neural cells from patients with familial Parkinson's disease.</a> Sci Transl Med. 4, (2012).</li>
<li>Michel, P. P., Toulorge, D., Guerreiro, S., Hirsch, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+needs+of+dopamine+neurons+for+stimulation+in+order+to+survive%3A+implication+for+Parkinson+disease%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Specific needs of dopamine neurons for stimulation in order to survive: implication for Parkinson disease.</a> FASEB J. 27, 3414-3423 (2013).</li>
<li>Decressac, M., Volakakis, N., Bjorklund, A., Perlmann, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NURR1+in+Parkinson+disease-from+pathogenesis+to+therapeutic+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurol%22%5BJournal%5D)">NURR1 in Parkinson disease-from pathogenesis to therapeutic potential.</a> Nat Rev Neurol. , (2013).</li>
<li>Jouve, L., Salin, P., Melon, C., Le Goff, L. K. erkerian- <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deep+brain+stimulation+of+the+center+median-parafascicular+complex+of+the+thalamus+has+efficient+anti-parkinsonian+action+associated+with+widespread+cellular+responses+in+the+basal+ganglia+network+in+a+rat+model+of+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Deep brain stimulation of the center median-parafascicular complex of the thalamus has efficient anti-parkinsonian action associated with widespread cellular responses in the basal ganglia network in a rat model of Parkinson's disease.</a> J Neurosci. 30, 9919-9928 (2010).</li>
<li>Hirsch, E. C., Jenner, P., Przedborski, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathogenesis+of+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Mov+Disord%22%5BJournal%5D)">Pathogenesis of Parkinson's disease.</a> Mov Disord. 28, 24-30 (2013).</li>
<li>di Porzio, U., Daguet, M. C., Glowinski, J., Prochiantz, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+striatal+cells+on+in+vitro+maturation+of+mesencephalic+dopaminergic+neurones+grown+in+serum-free+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Effect of striatal cells on in vitro maturation of mesencephalic dopaminergic neurones grown in serum-free conditions.</a> Nature. 288, 370-373 (1980).</li>
<li>Denis-Donini, S., Glowinski, J., Prochiantz, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glial+heterogeneity+may+define+the+three-dimensional+shape+of+mouse+mesencephalic+dopaminergic+neurones%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Glial heterogeneity may define the three-dimensional shape of mouse mesencephalic dopaminergic neurones.</a> Nature. 307, 641-643 (1984).</li>
<li>Barbin, G., Mallat, M., Prochiantz, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+studies+on+the+maturation+of+mesencephalic+dopaminergic+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">In vitro studies on the maturation of mesencephalic dopaminergic neurons.</a> Dev Neurosci. 7, 296-307 (1985).</li>
<li>Marey-Semper, I., Gelman, M., Levi-Strauss, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+selective+toxicity+toward+cultured+mesencephalic+dopaminergic+neurons+is+induced+by+the+synergistic+effects+of+energetic+metabolism+impairment+and+NMDA+receptor+activation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">A selective toxicity toward cultured mesencephalic dopaminergic neurons is induced by the synergistic effects of energetic metabolism impairment and NMDA receptor activation.</a> J Neurosci. 15, 5912-5918 (1995).</li>
<li>Salthun-Lassalle, B., Hirsch, E. C., Wolfart, J., Ruberg, M., Michel, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rescue+of+mesencephalic+dopaminergic+neurons+in+culture+by+low-level+stimulation+of+voltage-gated+sodium+channels%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Rescue of mesencephalic dopaminergic neurons in culture by low-level stimulation of voltage-gated sodium channels.</a> J Neurosci. 24, 5922-5930 (2004).</li>
<li>Toulorge, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuroprotection+of+midbrain+dopamine+neurons+by+nicotine+is+gated+by+cytoplasmic+Ca2%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Neuroprotection of midbrain dopamine neurons by nicotine is gated by cytoplasmic Ca2.</a> FASEB J. 25, 2563-2573 (2011).</li>
<li>Rousseau, E., Michel, P. P., Hirsch, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Iron-Binding+Protein+Lactoferrin+Protects+Vulnerable+Dopamine+Neurons+from+Degeneration+by+Preserving+Mitochondrial+Calcium+Homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">The Iron-Binding Protein Lactoferrin Protects Vulnerable Dopamine Neurons from Degeneration by Preserving Mitochondrial Calcium Homeostasis.</a> Mol Pharmacol. 84, (2013).</li>
<li>Orme, R. P., Bhangal, M. S., Fricker, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcitriol+imparts+neuroprotection+in+vitro+to+midbrain+dopaminergic+neurons+by+upregulating+GDNF+expression%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Calcitriol imparts neuroprotection in vitro to midbrain dopaminergic neurons by upregulating GDNF expression.</a> PLoS One. 8 (e62040), (2013).</li>
<li>Choi, W. S., Kruse, S. E., Palmiter, R. D., Xia, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+complex+I+inhibition+is+not+required+for+dopaminergic+neuron+death+induced+by+rotenone%2C+MPP%2B%2C+or+paraquat%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial complex I inhibition is not required for dopaminergic neuron death induced by rotenone, MPP+, or paraquat.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 15136-15141 (2008).</li>
<li>Trancikova, A., Ramonet, D., Moore, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+mouse+models+of+neurodegenerative+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Mol+Biol+Transl+Sci%22%5BJournal%5D)">Genetic mouse models of neurodegenerative diseases.</a> Prog Mol Biol Transl Sci. 100, 419-482 (2011).</li>
<li>Gao, H. M., Liu, B., Zhang, W., Hong, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Critical+role+of+microglial+NADPH+oxidase-derived+free+radicals+in+the+in+vitro+MPTP+model+of+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Critical role of microglial NADPH oxidase-derived free radicals in the in vitro MPTP model of Parkinson's disease.</a> FASEB J. 17, 1954-1956 (2003).</li>
<li>Lin, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conditional+expression+of+Parkinson%27s+disease-related+mutant+alpha-synuclein+in+the+midbrain+dopaminergic+neurons+causes+progressive+neurodegeneration+and+degradation+of+transcription+factor+nuclear+receptor+related+1%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Conditional expression of Parkinson's disease-related mutant alpha-synuclein in the midbrain dopaminergic neurons causes progressive neurodegeneration and degradation of transcription factor nuclear receptor related 1.</a> J Neurosci. 32, 9248-9264 (2012).</li>
<li>Bye, C. R., Thompson, L. H., Parish, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Birth+dating+of+midbrain+dopamine+neurons+identifies+A9+enriched+tissue+for+transplantation+into+parkinsonian+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Birth dating of midbrain dopamine neurons identifies A9 enriched tissue for transplantation into parkinsonian mice.</a> Exp Neurol. 236, 58-68 (2012).</li>
<li>Ramonet, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dopaminergic+neuronal+loss%2C+reduced+neurite+complexity+and+autophagic+abnormalities+in+transgenic+mice+expressing+G2019S+mutant+LRRK2%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Dopaminergic neuronal loss, reduced neurite complexity and autophagic abnormalities in transgenic mice expressing G2019S mutant LRRK2.</a> PLoS One. 6 (e18568), (2011).</li>
<li>Prestoz, L., Jaber, M., Gaillard, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dopaminergic+axon+guidance%3A+which+makes+what%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Dopaminergic axon guidance: which makes what.</a> Front Cell Neurosci. 6, (2012).</li>
<li>Nunes, I., Tovmasian, L. T., Silva, R. M., Burke, R. E., Goff, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pitx3+is+required+for+development+of+substantia+nigra+dopaminergic+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Pitx3 is required for development of substantia nigra dopaminergic neurons.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 100, 4245-4250 (1073).</li>
<li>Ferri, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Foxa1+and+Foxa2+regulate+multiple+phases+of+midbrain+dopaminergic+neuron+development+in+a+dosage-dependent+manner%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Foxa1 and Foxa2 regulate multiple phases of midbrain dopaminergic neuron development in a dosage-dependent manner.</a> Development. 134, 2761-2769 (2007).</li>
<li>Rayport, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identified+postnatal+mesolimbic+dopamine+neurons+in+culture%3A+morphology+and+electrophysiology%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Identified postnatal mesolimbic dopamine neurons in culture: morphology and electrophysiology.</a> J Neurosci. 12, 4264-4280 (1992).</li>
<li>Kim, K. M., Nakajima, S., Nakajima, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dopamine+and+GABA+receptors+in+cultured+substantia+nigra+neurons%3A+correlation+of+electrophysiology+and+immunocytochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Dopamine and GABA receptors in cultured substantia nigra neurons: correlation of electrophysiology and immunocytochemistry.</a> Neuroscience. 78, 759-769 (1997).</li>
<li>Nefzger, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lmx1a+allows+context-specific+isolation+of+progenitors+of+GABAergic+or+dopaminergic+neurons+during+neural+differentiation+of+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Lmx1a allows context-specific isolation of progenitors of GABAergic or dopaminergic neurons during neural differentiation of embryonic stem cells.</a> Stem Cells. 30, 1349-1361 (2012).</li>
<li>Su, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immediate+expression+of+Cdh2+is+essential+for+efficient+neural+differentiation+of+mouse+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Immediate expression of Cdh2 is essential for efficient neural differentiation of mouse induced pluripotent stem cells.</a> Stem Cell Res. 10, 338-348 (2013).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

פרוטוקול זה מציג את הנהלים וחומרים כימיים הדרושים כדי להכין את התרבות העיקרית של נוירונים mesencephalic מהעכבר העוברי והליך immunofluorescence לזהות נוירונים דופאמין. שלבים קריטיים של ההליך הם לנתיחה של העוברים והניתוק המכני של שברי המוח שנאספו. מכשירים לנתיחה באיכות גבוהים מסייע להשתלט על הטכניקה לנתיחה. נוירונים DA מהווים חלק קטן מmesencephalon. בהתאם לכך, איסוף החלק הימני של mesencephalon הגחון הוא חיוני להשגת תרבות המכילה 2-4% מתאי עצב DA. ניתוק מכאני צריך להתבצע בזהירות ובעדי...

דופמין, אחד מהמוליכים העצביים במוח החיוני 1,2, בעיקר שפורסם על ידי דופאמין המוח התיכון הנוירונים (DA). רוב הנוירונים DA מתגוררים בחלק הגחוני של mesencephalon 2-6. סכמטי, ניתן לחלק את תאי עצב DA המוח התיכון בשלוש מבחינה אנטומית ותפקודי של מערכות שונות הקרנה: mesostriatal, mesolimbic, ומסלולי mesocortical 2,5. מסלול nigrostriatal מעורב במנוע התנהגות, מסלולי mesolimbic לשחק תפקיד חשוב בחיזוק, מוטיבציה, ולמידה, ואילו מסלולי דופאמין מקרינים לקליפת מוח הקדם חזיתית הם מעורבים בקוגניציה 2. נוירונים DA מעורבים בכמה הפרעות נוירולוגיות אדם כמו סכיזופרניה, קשב וריכוז, הפרעת פעילות יתר, והמחלה (PD) פרקינסון 2,4. PD מתאפיין בניוון מתקדם וסלקטיבי של תאי עצב DA חיבור nigra substantiacompacta Pars (SNC) לסטריאטום. הפסד של תוצאות נוירונים DA Nigro-striatal בדלדול הדופמין החמור בסטריאטום, כי הוא אחראי לתסמינים המוטוריים של מחלת הפרקינסון (bradykinesia, רעד במנוחה, נוקשות) 7. הגורם הראשוני לPD אידיופטית לא הוקם והטיפולים הנוכחיים הם רק סימפטום, במטרה להחזיר את רמת הדופמין בסטריאטום. התרופה המומלצת ביותר היא L-דופא (Levodopa), המבשר הטבעי של דופמין. למרות שהממשל של Levodopa מפצה על האובדן של דופאמין למשך פרק זמן מסוים, סיבוכים מוטוריים להתרחש לאחר טיפולים ארוכי טווח (dyskinesia והפעלה / כיבוי מדינות) 8,9. מחקר על נוירונים דופאמין ופ&quot;ד הוא בהתקדמות מתמדת ומאמצים אינטנסיביים נעשים כדי לפתח טיפולים הבוסס על השתלת תאים, ריפוי גנטי, או סוכני הגנה עצביים 10,11. עם זאת, נושא מרכזי נשאר לא הובהר: מה הוא הגורם של vulnerab הקיצוניility של נוירונים DA? ניתן למצוא חלק מהתשובה בפעילות של תאי עצב DA. נראית ירידה בפעילות החשמלית ושל הרגישות של תאי עצב DA כדי להגדיל את נטייתם להידרדר 12. אף על פי כן, את המורכבות של הפתוגנזה פ&quot;ד דורשים מחקרים נוספים על מנת לזהות את המנגנונים מעורבים בDA נוירונים ניוון 13-15. תרבויות עיקריות רלוונטיות במיוחד ללמוד תכונות תא עצב DA 16-19 ולקרוא תיגר על הנוירונים האלה ללחצים שונים להערכה של סוכני הגנה עצביים 20-24. מודלים תרבות עכברוש משמשים בתדירות הגבוהה ביותר, כפי שהנתיחה של mesencephalon עובר עכברוש היא קלה יותר, בהשוואה לעכבר, וניתן לקבל כמויות גדולות יותר של תאי עצב בחולדות. עם זאת, דור של דגמי עכבר מהונדסים של המחלה 25 יש מידה ניכרת הגדיל את האינטרס של קהילת מדען המוח לתרבויות עיקריות מהעכבר 26-29. למרות שתרבויות יחסי ציבורepared מבעלי חיים שזה עתה נולדו יכול לשמש, עדיף להכין אותם מעוברים בשלב שלאחר mitotic (E13.5 לנוירונים mesencephalon), כאשר נוירונים שמרו היכולת שלהם להבחין. הפרוטוקול הבא מציג נוירונים mesencephalon מבודדים בתרבות העיקרית מעוברי עכברים (E13.5), שהם קשים ביותר להכנה. יש לציין, אנו מספקים פרוטוקול באמצעות מדיום סרום ללא תרבות לשחזור טוב יותר. שני השלבים הקריטיים ביותר בהכנת התרבות (לנתיחה וניתוק מכאני) שיפורטו בזהירות בווידאו קשור.

<table><tbody><tr><td>סרום בקר עוברי</td><td>לונזה</td><td>14-801F</td><td></td></tr><tr><td>DMEM 4.5 גרם/ליטר גלוקוז עם L-גלוטמין</td><td>לונזה</td><td>BE12-604F</td><td></td></tr><tr><td>0.05% טריפסין-EDTA (1x), פנול אדום</td><td>Life Technologies</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>פניצילין-סטרפטומיצין (10,000 יח'/מ"ל)</td><td>Life Technologies</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>L-גלוטמין, תמיסה של 200 מ"מ</td><td>Life Technologies</td><td></td><td></td>25030123</tr><tr><td>Dulbecco' s פוספט חוצץ מלח</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>דולבקו s Modified Eagle' s תערובת בינונית/תזונתית F-12 חזיר</td><td>סיגמא-אולדריץ'&nbsp;</td><td>D0547</td><td>אבקת</td></tr><tr><td>למינין - 1 מ"ג/מ"ל ב-Tris buffered NaCl</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>L2020</td><td></td></tr><tr><td>פולי-L-אורניתין הידרוברומיד</td><td>סיגמא-אולדריץ'&nbsp;</td><td>P3655</td><td></td></tr><tr><td>אינסולין מלבלב חזיר</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>I5523</td><td></td></tr><tr><td>apo-Transferrin Human</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>T1147</td><td></td></tr><tr><td>פוטרסין דיהידרוכלוריד</td><td>סיגמא-אולדריץ'&nbsp;</td><td>P5780</td><td></td></tr><tr><td>פרוגסטרון</td><td>סיגמא-אולדריץ'&nbsp;</td><td>P8783</td><td></td></tr><tr><td>נתרן סלניט</td><td>סיגמא-אולדריץ'&nbsp;</td><td>S5261</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>סיגמא-אולדריץ'&nbsp;</td><td>H4034&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>גליצין</td><td>סיגמא-אולדריץ'&nbsp;</td><td>G7126</td><td>תמיסת מלאי 1 M במים</td></tr><tr><td>ג'לטין</td><td>סיגמא-אולדריץ'&nbsp;</td><td>G9391</td><td>תמיסת מלאי 2% (w/v) במים</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>T8532</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde 16% במים</td><td>מדעי מיקרוסקופ אלקטרונים</td><td>RT 15710-S</td><td></td></tr><tr><td>נתרן ביקרבונט (NaHCO3)</td> <td>Merck Millipore</td><td>106329</td><td></td></tr><tr><td>D(+)-גלוקוז, מונוהידראט</td><td>Merck Millipore</td><td>4074-2</td><td></td></tr><tr><td>חומצה הידרוכלורית - c(HCl) = 1 מול/ליטר (1 N) Titripur</td><td>Merck Millipore</td><td>109057</td><td></td></tr><tr><td>מים סטריליים - Aqua B.</td><td>Braun</td><td></td><td></td></tr><tr><td>אתנול מוחלט NORMAPUR מגיב אנליטי</td><td>VWR</td><td>20821.321</td><td></td></tr><tr><td>צלחות פטרי סטריליות</td><td>VWR</td><td>82050-566</td><td></td></tr><tr><td>פיפטות פסטר זכוכית רגילה - Wilhem Ulbrich GdbR.</td><td>VWR</td><td>612-2297</td><td></td></tr><tr><td>תא ספירה Malassez</td><td>VWR</td><td>631-0975</td><td></td></tr><tr><td>מסנן מזרק Acrodisc סרום עם קרום Supor, סטרילי, GF/0.2 ומיקרו; m, 37 מ"מ</td><td>PALL Life science</td><td>4525</td><td></td></tr><tr><td>מספריים כירורגיים - ישרים, חדים-חדים, באורך 14.5 ס"מ</td><td>Fine Science Tools</td><td>14002-14</td><td>לפתיחת דופן הבטן</td></tr><tr><td>מספריים - ישרים, מחודדים, עדינים, באורך 10 ס"מ</td><td>MORIA</td><td>4877A</td><td>לפתיחת דופן הרחם</td></tr><tr><td>מלקחיים - לסתות מעוקלות, רגילות, משוננות 1 מ"מ</td><td>MORIA</td><td>2183</td><td>למניפולציה של עוברים</td></tr><tr><td>Vannas מספריים - מעוגלים, מחודדים, 7 מ"מ</td> להבים <td>MORIA</td><td>MC50</td><td>להוצאת מלקחיים עדינים במיוחד של mesencephalon</td></tr><tr><td>- מעוקל, עדין, באורך 13 ס"מ</td><td>MORIA</td><td>9987</td><td>להסרת קרומי המוח</td></tr><tr><td>BD BioCoat Poly-D-Lysine 24-well Multiwell Plates</td><td>BD Bioscience</td><td>356414</td><td></td></tr><tr><td>BD Falcon 12 בארות צלחת תרבית תאים, תחתית שטוחה עם מכסה</td><td>BD Bioscience</td><td>353043</td><td></td></tr><tr><td>שקופיות מיקרוסקופ SuperFrost, קצוות קרקע 90&ordm;</td><td>מנזל-GL ואומל; משקפי כיסוי מדויק SER</td><td>AG00008032E</td><td></td></tr><tr><td>עובי מס' 1.5H עגול 18 מ"מ &Oslash;</td><td>MARIENFELD</td><td>117580</td><td></td></tr><tr><td>ארנב פוליקלונלי חלבון הקשור למיקרו-צינוריות 2 (MAP2) נוגדן</td><td>Chemicon Millipore</td><td>AB5622</td><td>1/200</td></tr><tr><td>נוגדן חד-שבטי נגד גלוטמט דקרבוקסילאז (GAD67), שיבוט 1G10.2</td><td>Chemicon Millipore</td><td>MAB5406</td><td>1/400</td></tr><tr><td>נוגדן נגד טרנספורטר נגד דופמין (DAT) חולדה חד-שבטית, שיבוט DAT-Nt&nbsp;</td><td>Chemicon Millipore</td><td>MAB369</td><td>1/500</td></tr><tr><td>נוגדן</td><td></td><td></td> חד-שבטי נגד 5-HT <td>עכבר 1/8,000 - מתנה נדיבה מאיב צ'רניי (שוויץ, Yves.Charnay@hcuge.ch)</td></tr> <tr><td>סרום עיזים, ניו זילנד Origin</td><td>Life Technologies</td><td>16210-064</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 405 עיזים נגד ארנב IgG (H+L) Antibody</td><td>Life Technologies</td><td>A-31556</td><td>1/200</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 עז נגד עכבר IgG (H+L) Antibody</td><td>Life Technologies</td><td>A-11001</td><td>1/1,000</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 עז נגד חולדות IgG (H+L) Antibody</td><td>Life Technologies</td><td>A-11007</td><td>1/1,000</td></tr><tr><td>VECTASHIELD HardSet הרכבה Medium</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1400</td><td></td></tr><tr><td>סטריאומיקרוסקופ</td><td>קרל זייס מיקרוסקופיה</td><td>Stemi-2000C</td><td></td></tr><tr><td>מבער בונסן FIREBOY</td><td>פולקסווגן</td><td>451-0136</td><td></td></tr></tbody></table>

יסודי תרבות של עכבר דופאמין נוירונים

Primary Culture of Mouse Dopaminergic Neurons

נוירונים דופאמין מהווים פחות מ -1% מהמספר הכולל של תאי עצב במוח. סכום זה נמוך של תאי עצב מווסת את תפקודי מוח חשובים כגון שליטה מוטורית, מוטיבציה, וזיכרון עבודה. נוירונים דופאמין Nigrostriatal להידרדר באופן סלקטיבי במחלת פרקינסון (PD). איבוד עצבי מתקדם זה קשור באופן חד משמעי עם הסימפטומים מנועים של פתולוגיה (bradykinesia, רעד במנוחה, נוקשות שרירים ו). הסוכן העיקרי האחראי לניוון תא עצב דופאמין הוא עדיין לא ידוע. עם זאת, נוירונים אלה מופיעים להיות מאוד פגיעים בתנאים מגוונים. תרבויות עיקריות מהוות אחד המודלים הרלוונטיים ביותר לחקור תכונות ומאפיינים של נוירונים דופאמין. ניתן להגיש תרבויות אלה לסוכני מתח שונים המחקים פתולוגיה PD ותרכובות הגנה עצביות על מנת לעצור או להאט את הניוון עצבי. מודלים רבים מהונדסים העכבר של PD כי כבר generated בעשור האחרון גדל עוד יותר את האינטרס של חוקרים לתרבויות נוירון דופאמין. הנה, פרוטוקול הווידאו מתמקד בנתיחה העדינה של מוח עכבר העוברי. כריתה מדויקת של mesencephalon הגחון היא חיונית כדי להשיג תרבויות עצביות מספיק עשירות בתאי דופאמין כדי לאפשר מחקרים עוקבים. פרוטוקול זה יכול להתממש עם עכברים הטרנסגניים עובריים ומתאים לצביעת immunofluorescence, PCR כמותי, כימות שליח שני, או הערכת מוות / הישרדות עצבית.

תרשים זרימה מאוירת של צעדי תרבות mesencephalon מוצג באיור 1. בקצרה, לאחר איסוף עוברי E13.5 מעכבר שוויצרי בהריון, mesencephalon הגחון הוא גזור מכל העובר. שברי המוח המבודדים הם ברציפות שהוגשו לעיכול אנזימטי וניתוק מכאני. תאים ניתקים הם pelleted על ידי צנטריפוגה, resuspended במדיום התרבות ומצופה בלוחות 12- או 24 גם מצופה מראש. תאים נשמרים עד 15 ימים ללא החלפה בינונית. תרשים מפורט זרימה של נתיחת mese...

נוירונים דופמינרגיים ממלאים תפקיד ויסות חיוני במוח. אובדן שלהם קשור למחלת פרקינסון. בסרטון זה, אנו מראים כיצד ליצור תרביות ראשוניות של נוירונים דופמינרגיים מרכזיים ממזנספלון של עכברים עובריים. תרבויות כאלה שימושיות לחקר הפגיעות הקיצונית של נוירונים אלה ללחצים שונים.

Dopaminergic neurons represent less than 1% of the total number of neurons in the brain. This low amount of neurons regulates important brain functions ...

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא להדגים כיצד להקים תרבית ראשונית של נוירונים דופמינרגיים ממוחות של עוברי עכברים. דבר זה מושג תחילה על ידי איסוף עוברי עכברים ביום E 13.5. השלב השני הוא ביצוע דיסקציה למוחות העוברים ובידוד ה-mesencephalon.בשלב הבא, מבוצעים פירוק אנזימטי ומכני של המזנצפאלון (המוח האמצעי) שנאסף. השלב הסופי הוא זריעה של תאי העצבים שפוּרקו. לבסוף, נעשה שימוש בצביעה אימונופלואורסצנטית כדי להראות את נוכחותם של נוירונים דופמינרגים בתרבית.שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בתחום ההפרעות הנוירולוגיות והפסיכיאטריות, כגון סכיזופרניה, הפרעת קשב וריכוז (ADHD) ומחלת פרקינסון. הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית, שכן שלבי הניתוח וההפרדה התאית קשים ללמידה בשל הצורך במחוות מדויקות ובזיהוי אנטומי של המבנה; הדגמת הפרוצדורה תבוצע על ידי מהנדס מהקבוצה שלי כדי להתחיל בהליך זה. לאחר הקרבת עכברה הרעיונית ביום הריון E 13.5, נקה את בטנה ב-70% ethanol.בשלב הבא, פתחו את דופן הבטן ואספו את קרני הרחם. הוציאו כל עובר מקרני הרחם והסירו את קרומי השליה. לאחר מכן, העבירו את העוברים לצחנת פטרי של 100 millimeter המכילה P-B-S-G-A-B סטרילי.שטפו אותם על ידי העברה לשלוש רחצות זהות רצופות. לאחר מכן, העבירו את העוברים לצלחת פטרי סטרילית בקוטר 60 מילימטר לצורך דיסקציה. הניחו את צלחת הפטרי תחת מיקרוסקופ סטר

primary-culture-of-mouse-dopaminergic-neurons

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

ראשי ניתק הדופמין במוח התיכון בתרביות תאים מאפשרים ללמוד את המאפיינים presynaptic של נוירונים דופמין. הם יכולים לשמש כדי לפקח בזמן אמת שחרור הדופמין קינטיקה של חלבונים / רמות ה-mRNA של הרגולטורים של exocytosis דופמין. כאן, אנו מראים לך איך לייצר מן התרבויות הללו בילודים מכרסמים.

ראשי ניתק דופמין במוח התיכון Cell תרבויות מן ילודים מכרסמים

פרוטוקול זה מתאר את הצעדים הנדרשים כדי לנתח, transfect דרך electroporation ועכבר תרבות נוירונים בהיפוקמפוס ואת קליפת המוח. לטווח קצר תרבויות ניתן להשתמש ללימודי תולדה של האקסון והדרכה, ואילו לטווח ארוך תרבויות יכול לשמש מחקרים synaptogenesis ניתוח בעמוד השדרה הדנדריטים.

Nucleofection ותרבות ראשונית של נוירונים בהיפוקמפוס עכבר עובריים קליפתיים

מאמר זה מתאר שיטות להפיק אוכלוסיות מועשר Murine של תאים מבשר oligodendrocyte (OPCs) בתרבות העיקרי, אשר להבדיל לייצר oligodendrocytes בוגרת (OLS). בנוסף, דו"ח זה מתאר את טכניקות כדי לייצר Murine myelinating שיתוף תרבויות על ידי זריעת OPCs העכבר על המיטה neurite של הגב עכבר שורש עצב הגנגליון (DRGNs).

גזירת תרבויות Oligodendrocyte מועשר Neuron Oligodendrocyte / Myelinating משותף תרבויות מן שלאחר הלידה רקמות Murine

סרטון זה מתאר שיטה לטיפוח נוירונים דופמינרגיים מרקמת מוח עוברית של עכבר. התהליך כולל טיפול במוח התיכון באמצעות אנזים מפרקי חלבון, ניתוק התאים וגידולם על גבי כיסויים מצופים פולימר בתווך עשיר בחומרים מזינים עם אנטיביוטיקה לצורך גדילתם ויכולת הקיום שלהם לטווח ארוך.

גידול ותחזוקה של תאי עצב דופמינרגיים מרקמת מוח עוברית של עכבר

הסרטון מדגים את תהליך הבידוד והטיפוח של נוירוני דופמין מהמוח התיכון של עוברי עכברים. רצפות המוח התיכון הגחוני המבודד מנותקות באמצעות אנזימים. נוירוני הדופמין המתקבלים נקצרים ומועברים למיקרו-איים בתוך צלחות מרובות בארות. התאים מודגרים בתווך נוירון דופמין כדי לשמור על התאים בצפיפות גבוהה בתוך המיקרו-איים.

בידוד ותרבית של נוירוני דופמין עובריים ראשוניים במוח התיכון

סרטון זה מדגים את תהליך כימות הצטברות אלפא-סינוקלאין בנוירונים עובריים של עכברי דופמין שטופלו מראש בסיבי אלפא-סינוקלאין שנוצרו מראש. הוא מתאר את השלבים לתיקון, צביעה וכימות של נוירוני הדופמין המכילים אגרגטים אלפא-סינוקלאין באמצעות immunofluorescence.

חקר הצטברות אלפא-סינוקלאין בתאי עצב דופמין עובריים ראשוניים

כאן אנו מתארים פרוטוקול מפורט לדור בו זמני של תרביות תאים עצביות מבשר, כמו גם monolayers או neurospheres חסיד, מאזור subventricular וgyrus משוננת של עכברים בוגרים בודדים.

עכבר אחד, שתי תרבויות: בידוד והתרבות של תאי גזע עצביים למבוגרים משני האזורים העצביים של עכברים בודדים

הגורמים לניוון של נוירונים דופמינרגיים במוח התיכון במהלך מחלת פרקינסון אינם מובנים במלואם. מערכות תרבית תאיות מספקות כלי חיוני לחקר התכונות הנוירופיזיולוגיות של נוירונים אלה. כאן אנו מציגים פרוטוקול אופטימלי, שניתן להשתמש בו למודלים במבחנה של ניוון עצבי.

בידוד, תרבות והטווח ארוך תחזוקה של יסודיים mesencephalic דופאמין נוירונים ממוח עוברי מכרסם

במחלת פרקינסון (PD), חומר שחור (SNC) נוירונים דופאמינרגיים להתנוון, שמובילים מוטורי. כאן אנו מדווחים פרוטוקול נוירונים culturing מוח תיכון גחון של עכבר להביע eGFP מונע על ידי hydroxylase טירוזין (TH) רצף אמרגן, קצירת נוירונים ניאון פרט מן התרבויות, ומדידת transcriptome שלהם באמצעות-seq RNA.

זיהוי אמין של חיים דופאמין נוירונים תרבויות המוח התיכון באמצעות רצף RNA ו- TH-מונחה האמרגן ביטוי eGFP

ניהול ניסויים בלתי מתורבת כדי לשקף את התנאים הvivo ככל האפשר, אינו משימה קלה. השימוש בתרביות תאים ראשונית הוא צעד חשוב להבנת הביולוגיה התאית באורגניזם שלם. הפרוטוקול שסופקו מתאר כיצד לצמוח בהצלחה תרבות עובריים העכבר מתחלקים נוירונים.

התרבות הראשית של הנוירונים מבודדים מתוך עכבר ממוח עובריים

כאן, אנו מציגים פרוטוקול מפורט כדי ללמוד על הצטברות עצבי-מערכת בהצטברות נוירונים לעכבר הראשי דופמין. מערכת זרחזת-מצרפים לאגרגטים בנוירונים מושרה במבנה טרום-ביצוע. הדמיה אוטומטית של תאים אימונוofluor, וניתוח תמונה משוחדת להפוך את הפרוטוקול הזה חזק מתאים הקרנת תפוקה בינונית עד גבוהה של תרופות המעזות α-הצטברות.

לימוד טרום בנוי Fibril ריל המושרה α-Synuclein הצטברות בעכבר עובריים העיקרי מיילדופאמין דופמין המוח

למד כיצד ליצור תרבות ראשונית של נוירונים דופאמינרגיים ממוחות עכבר עובריים. שיטה זו מאפשרת חקר פגיעות נוירונים במחלת פרקינסון ובהפרעות נוירולוגיות נוספות.

יסודי תרבות של עכבר דופאמין נוירונים

גלה סרטונים נוספים