Assay תפוקה גבוהה להפנוטיפ Enterica סלמונלה Typhimurium איגוד, פלישה, ושכפול בהמקרופאגים

המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא לסנן ולהעריך גנים הנדרשים לפלישה ו/או הישרדות בתוך תאי מקרופאגים במבחנה, באופן תפוקה גבוהה, ולזהות גנים מכניסטיים של פתוגנזה של סלמונלה. זה מושג על ידי הוספת זני סלמונלה מסוג בר או מוטנטי לתרביות תאי מקרופאגים. ב-96, צלחות באר למשך 30 דקות כזיהום במבחנה כשלב שני לאחר הדגירה של 30 דקות, סלמונלה שלא נצמדה לתאי המקרופאגים נשטפת וטרייה.

מדיום המכיל ריכוז גבוה של אנטיביוטיקה גנטמיצין מתווסף למשך שעה, שהורג את כל החיידקים החוץ-תאיים שאינם מופנמים. לאחר מכן, תרבית תאי המקרופאגים נשטפת שוב ומוסיפים מדיום טרי המכיל ריכוז נמוך של גנטמיצין לדגירה נוספת של 22.5 שעות על מנת לשמור על סביבה חוץ-תאית נקייה מחיידקים ולאפשר רק לסלמונלה התוך-תאית לשרוד ולהתרבות. התוצאות מראות כי על ידי השוואת הסלמונלה המוטנטית לזן מסוג הבר, הפנוטיפ במבחנה של הזנים המוטנטיים לפלישה ושכפול אסוציאציות נקבע על סמך מדידת יחידות היווצרות מושבה לתאי מקרופאגים המתקבלים על ידי בדיקת ציפוי דילול סדרתי עבור כל נקודת זמן.

היתרון העיקרי של הטכניקה שלנו הוא שהיא מודדת קשר, פלישה ושכפול של סלמונלה ותאים פגוציטים ושהיא יכולה למדוד מספר זנים בו זמנית לתפוקה גבוהה יותר. מדגימים את ההליך ד"ר ג'ינג וו, עמית מחקר פוסט-דוקטורט במעבדה שלי, וגברת רוברטה פיו, עמיתת מחקר במעבדה שלי כדי להתחיל בשורה מספר מעבר נמוך המשקף תאי מקרופאגים גולמיים 2 64 0.7 בבקבוק תרבית תאים T 75 עם מכסה מסנן מאוורר במדיום נשרים ששונו ב-delcos בתוספת 10% סרום בקר עוברי 0.5% נתרן ביקרבונט ו-1% x 100 x חומצות אמינו לא חיוניות NEAA ב-37 מעלות צלזיוס ב חממת פחמן דו חמצני 5%.

כאשר התאים מגיעים למפגש של 60 עד 80%, קצרו את התאים ב-DMEM עם מגרד תאים, ואז ספרו את התאים בציטומטר המו וחישבו את ריכוז התאים, דללו את תרחיף התאים לריכוז של 2.5 פעמים 10 לתאים החמישיים למיליליטר של תרבית תאי DMEM טרייה. צלחת בינונית 200 מיקרוליטר של תרחיף התאים המדולל באמצעות פיפטה רב-ערוצית לכל באר של תאי צלחת תרבית תאים של 96 בארות לשלוש צלחות נפרדות של 96 בארות לסט אחד של בדיקת פלישת תאים פגוציטיים ותייגו כל צלחת עם פלישת אסוציאציה ושכפול. ארבע בארות בצלחת משמשות לכל זן סלמונלה.

הניחו את הצלחות באינקובטור של 5% פחמן דו חמצני בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה כדי לאפשר לתאי המקרופאגים להיצמד לתחתית הבארות באותו היום. המקרופאגים הגולמיים 2 6 4 0.7 תאים מצופים ל 96 לוחות באר. בחר מושבות בודדות של סלמונלה מסוג בר entera serotype, tyria 1 0 4 2 8 דלתא INVA מוטנטית דלתא ארבע P מוטנטית ואת תרבית הזנים המוטנטיים הרצויה.

כל אחד מזני הסלמונלה בחמישה מיליליטר של מרק LB ומשלים את מרק ה-LB לזנים המוטנטיים עם 50 מיקרוגרם למיליליטר של מיצין יכול לגדל את החיידקים במשך 14 שעות ב-37 מעלות צלזיוס עם טלטול ב-220 סל"ד בצינורות תחתונים עגולים מפוליפרופילן 14 מיליליטר. לאחר הדגירה של הלילה בתת-תרבות של 37 מעלות צלזיוס, כל אחד מזני הסלמונלה ביחס של אחד ל-50 לחמישה מיליליטר של מרק ה-lb המתאים. גדל את התרביות במשך ארבע שעות נוספות ב-37 מעלות צלזיוס עם טלטול ב-220 סל"ד.

קרא את ערכי OD 600 של כל תרבית חיידקים בספקטרופוטומטר. לכל תרבית צריך להיות ערך OD 600 בין 0.6 ל-1.2 כדי לייעל את מערכת ההפרשה הפתוגנית של סלמונלה 1 עד 3 SPI ביטוי גנים של מערכת הפרשה אחת מסוג שלוש לפלישה. חשב את ריכוז החיידקים באמצעות הנוסחה אחת OD 600 שווה ל-7.5 כפול 10 למושבה השמינית היוצרת יחידות למיליליטר.

לאחר מכן CFU מדלל את החיידקים לריכוז של חמש פעמים 10 עד שש, ה-FU למיליליטר ושלושה מיליליטר של מדיום תרבית תאי DMEM טרי הסר 3 96 צלחות תרבית תאים המכילות מקרופאגים מאינקובטור הפחמן הדו חמצני ושטוף כל באר פעם אחת עם 200 מיקרוליטר של XPBS אחד. לאחר הסרת שטיפת ה- PBS לחלוטין מכל אחת, הוסף היטב 200 מיקרוליטר חיידקים במדיום DMEM לכל באר. התוצאה היא 10 פעמים 10 עד ששת תאי הסלמונלה בכל באר וריבוי MOI זיהומי של 20 עד צנטריפוגה אחת את הצלחות במיכל אטום ב 1000 פעמים G למשך 10 דקות.

לאחר מכן הניחו את הצלחות באינקובטור פחמן דו חמצני של 5% בחום של 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. לאחר השלמת הדגירה של 30 דקות, הוציאו את הצלחות מהחממה ושטפו כל באר שלוש פעמים עם 200 מיקרוליטר של XPBS אחד כדי להסיר חיידקים לא קשורים. לאחר מכן ב -200 מיקרוליטר של מדיום DMEM המכיל 100 מיקרוגרם למיליליטר של גנטמיצין לכל באר של הצלחות המסומנות בפלישה ושכפול על מנת להרוג את הסלמונלה החוץ-תאית.

לאחר מכן החזירו את הצלחות לחממת פחמן דו חמצני של 5% בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך שעה נוספת. עבור צלחת האסוציאציה, שמור באר אחת מכל זן נגוע לרישום ספירת תאי מקרופאגים וטפל בבארות הנותרות ב-200 מיקרוליטר של XPBS אחד המכיל 1% טריטון X 100 למשך 10 דקות. כדי לפרוס את התאים, קצרו את הסלמונלה מכל באר והניחו אותם בצינורות אורף של 1.5 מיליליטר ערכו דילול דגנים פי עשרה עם 900 מיקרוליטר של XPBS אחד על הדגימות שנקטפו מכל באר ומערבולת בין כל מערבולת דילול את הדילול השלישי, 10 עד שלילי שלוש לכל חיידק והניחו 10 מיקרוליטר מהדגימה על צלחות LB עבור צלחות מסוג בר או LB.

עם יכול מיצין לזנים המוטנטיים. חזור על שלב זה ארבע פעמים בסך הכל חמש טיפות של 10 מיקרוליטר במרווחים שווים על הצלחות לאחר שהטיפות נספגות באגר, הופכים את הצלחות ומדגרים למשך הלילה באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס, טפלו בבארות הנותרות שנשמרו לספירת המקרופאגים ב-150 מיקרוליטר של XPBS אחד המכיל 0.25% TRIPSIN EDTA למשך 10 דקות. לאחר איזום טריפסין מעבירים מקרופאגים לצינורות עינור של 1.5 מיליליטר ומטפלים ב-50 מיקרוליטר FBS כדי לנטרל את תמיסת ה-EDTA של טריין.

לאחר מכן הסירו 10 מיקרוליטר מתרחיף התא מצינור EOR אחד לתוך צינור חדש. הוסף 10 מיקרוליטר של 0.4% טריאן כחול כדי לצבוע את התאים ולספור אותם בציטומטר המו כאשר לוחות הפלישה והשכפול השלימו את הדגירה של שעה אחת בחממת הפחמן הדו חמצני. מוציאים את הצלחות מהחממה ושוטפים כל באר שלוש פעמים עם 200 מיקרוליטר של XPBS אחד.

לאחר מכן, הוסף 200 מיקרוליטר של מדיום DMEM המכיל 10 מיקרוגרם למיליליטר של גנטמיצין לצלחת השכפול כדי לשמור על פינוי סלמונלה חוץ-תאית במדיום. לאחר מכן הניחו את הצלחת בחממת פחמן דו חמצני של 5% בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 22.5 שעות נוספות. לאחר מכן קצרו והחזירו את הסלמונלה מצלחת הפלישה לצלחות אגר וספרו את המקרופאגים מבאר אחת של כל זן נגוע לפי השלבים שתוארו עבור צלחת האסוציאציה למחרת.

הסר את צלחת השכפול מהחממה ושטוף כל באר שלוש פעמים עם 200 מיקרוליטר של XPBS אחד. לאחר מכן קצרו והחזירו את הסלמונלה מצלחת השכפול על צלחות אגר וספרו את המקרופאגים מבאר אחת של כל זן נגוע לפי השלבים המתוארים עבור לוחית האסוציאציה. לאחר שצלחות האגר דגרו למשך הלילה באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס, הסר את הצלחות מהחממה וציין את מספר מושבות החיידקים לצלחת.

כאשר סופרים כל צלחת, חלוקת המושבות צריכה להיות בין 10 ל -100 מושבות. אם הספירה גבוהה מדי או נמוכה מדי, יש להחזיר את המדגם עם דילול גבוה או נמוך פי עשרה לפי הצורך. מבחן פלישת התאים הפגוציטיים מזהה כראוי את הפנוטיפ של מוטציות מחיקת סלמונלה כפי שמוצג עבור זן בקרת פלישת דלתא INVA, מוטציה פגומה ידועה בפלישה, וזן בקרת שכפול דלתא ארבע P.

מוטציה מוטנטית פגומה ידועה בשכפול A ומוטציה B הם שני זנים מייצגים המשתמשים בפרוטוקול זה המציגים פנוטיפים משתנים לשכפול במקרופאגים 20 מתוך 38. מוטציות סלמונלה שנבדקו עד כה בבדיקת פלישת התאים הפגוציטים מציגות פגמים משתנים אך משמעותיים בפלישת הקשר ו/או בשכפול במקרופאגים גולמיים 2 6 4 0.7. פרוטוקול זה נבדק רק עבור כמה תאים סטטיים של נלה ואפקט מארח.

לפיכך, שינוי ואופטימיזציה יהיו נחוצים עבור חיידקים ותאים מארחים אחרים.