מבחני צבירת חרוז לאפיון של תא המשוערת הידבקות מולקולות

המטרה הכוללת של הליך זה היא לבדוק את היכולת של תחומי ecto חלבון לתווך הידבקות הומופילית כדי להשיג פלסמידים אלה המקודדים היתוך של שבר תחום ecto לאזור FC של IgG אנושי מועברים לתאי HEC 2 93. חלבוני ההיתוך המופרשים של Odin FC נלכדים על חרוזים מגנטיים מצומדים לחלבון G, ולאחר שטיפה, החרוזים המצופים מורשים לקיים אינטראקציה בתמיסה. לאחר מכן מצלמים את החרוזים המצופים כדי להעריך את היקף הצבירה ולבסוף, מכומתים באמצעות ניתוח תמונה פשוט, הנתונים המתקבלים חושפים אם החלבון הנחקר מסוגל לתווך הידבקות הומופילית.

היתרונות העיקריים של טכניקה זו על פני שיטות קיימות כגון מבחני צבירת תאים, הוא שהיא מהירה, פשוטה ובודקת ישירות את פעילות ההדבקה של החלבון שבחרת. מי שתדגים את הטכניקה הזו תהיה ד"ר מישל אימן, מדענית בכירה מהמעבדה. התחל הליך זה על ידי הכנת התאים המתורבתים ל-NCA כאן ECFC, יומיים-שלושה לפני הטרנספקציה.

השתמש ב-0.05% נסיעות ב-EDTA כדי לנתק את תאי HEC 2 93 מצלחות התרבית. הכינו שתי מנות 100 מילימטר לכל מצב. פצל את התאים אחד עד חמישה, ולאחר מכן תרבית אותם פנימה.

מדיום גידול משלים. דגרו על התאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני עד שהם יהיו 60 עד 80% מתלכדים. ביום הטרנספקציה, השתמש במגיב כגון ליפו כדי להכניס פלסמיד המקודד היתוך FC.

לאחר הטרנספקציה, החזירו את התאים לאינקובטור למשך 24 שעות ביום שלאחר הטרנספקציה Prewarm, DMEM עם סטרפטוקוקוקוס וללא סרום בקר עוברי ל-37 מעלות צלזיוס. שוטפים כל מנה פעמיים עם 10 מיליליטר מהמדיום המחומם, ולאחר מכן מחזירים את הכלים לחממה של 37 מעלות צלזיוס למשך שעה לאחר הדגירה, שוטפים את כלי התרבות פעם נוספת עם 10 מיליליטר DMEM ללא סרום בקר עוברי בסך הכל שלוש כביסות, ואז דוגרים על התאים המועברים ב-37 מעלות צלזיוס למשך 48 שעות נוספות לפני איסוף המדיום. ארבעה ימים לאחר הטרנספקציה, השתמש בפיפטה סרולוגית כדי לאסוף את המדיום מכל זוג צלחות תרבית ולהעביר אותו לצינור חרוטי של 50 מיליליטר.

לאחר מכן צנטריפוגה של המדיום ב-500 גרם לחמש דקות כדי לגלול את הפסולת הסלולרית לאחר הסיבוב, שפכו את המדיום מכל צינור חרוטי של 50 מיליליטר למזרק של 30 מיליליטר וסננו אותו דרך מזרק של 0.45 מיקרון. מסננים לרכז צנטריפוגלי. סובב את המסננים הצנטריפוגליים עד שנפח מדיום התרבות המרוכז הצטמצם לכ-500 מיקרוליטר.

הנסיעה אורכת כ-15 דקות. חזור על תהליך זה עד שכל מדיום התרבות נוסף ומרוכז. לאחר מכן, בצינור מיקרו צנטריפוגה של 1.5 מיליליטר לכל דגימה ב-1.5 מיקרוליטר של חרוזים מגנטיים של חלבון G למיליליטר אחד של מאגר קשירה קר כקרח.

ההיבט הקשה ביותר בהליך זה הוא צבירת החרוזים. כדי להבטיח הצלחה, הקפד לבצע את ההליך בדיוק. התבוננו בחרוזים במהירות, אך לא בחומרה רבה מדי.

לעולם אין לאפשר להם להתייבש בצד הצינור או להישאר על המגנט זמן רב מדי. הניחו את הצינור על מגנט ובעזרת פיפטה, שאפו את המאגר. לאחר מכן הוסף מיד את מדיום התרבות המרוכז לחרוזים המגנטיים של החלבון G.

סובב את הצינורות בארבע מעלות צלזיוס למשך שעתיים. הניחו את הצינורות על מגנט והסירו את המדיום במהירות. שטפו את החרוזים פעמיים עם מיליליטר אחד של מאגר כריכה קר כקרח, ולאחר מכן השעו מחדש את החרוזים ב-300 מיקרוליטר של מאגר קשירה.

פצלו את החרוזים התלויים לשני צינורות עם 150 מיקרוליטר לכל צינור. לאחר מכן הוסף 1.5 מיקרוליטר של סידן כלורי או EDTA לתנאי הסידן וללא סידן בהתאמה. העבירו 100 מיקרוליטר מכל מצב לשקע.

החלק היטב באמצעות מיקרוסקופ אור מועבר. אסוף תמונות מחמישה שדות ראייה עבור כל ניסוי בכל נקודת זמן רצויה. שימוש בתמונה J או בתוכנת ניתוח תמונה דומה.

פתח אחד מחמשת מערכי נתוני התמונה בתמונה J בתפריט הנפתח. בחלק העליון של המסך, בחר קובץ. לאחר מכן בחר ייבוא ולאחר מכן רצף תמונות.

מצאו את התיקייה הכוללת את קובצי התמונות ופתחו אותם כאוסף תמונות. לאחר מכן בשורת התפריטים הנפתחת, לחץ על התמונה ולאחר מכן בחר מאפיינים. כדי לפתוח את חלון המאפיינים שם.

שנו את יחידות התמונה לפיקסלים וקבעו את רוחב הפיקסלים וגובה הפיקסלים ל- 1.0. לחץ שוב על התמונה, בחר התאם ואז סף כדי לפתוח את חלון הסף והשתמש במחוון כדי להתאים את סף התמונה. כלול פיקסלים התורמים לחרוזים ואינם כוללים חלקיקים קטנים.

החילו את הסף על כל התמונות באוסף התמונות. הבא בשורת התפריטים הנפתחת בחלק העליון של המסך. לחץ על ניתוח.

לאחר מכן בחר הגדר מידות כדי לפתוח את תיבת הדו-שיח של המדידה באמצעות תיבות הסימון, בחר אזור ומיקום ערימה בחלק העליון של המסך. לחץ על ניתוח ולאחר מכן בחר נתח חלקיקים. זה ייצור רשימה של חלקיקים מזוהים כולל גודלם והתמונה שבה הם זוהו.

חזור על תהליך זה עבור כל ניסוי וכל תנאי ניסוי כדי לקבוע את יכולת ההדבקה התלויה בסידן של דג הזברה והקדרין. תאי HEC 2 9 3 הועברו עם תחום הרין OD NCAT התמזגו שני fc ובעקבות צבירת חרוזים תלויי סידן צולמו ונותחו כמתואר בסרטון זה כפי שניתן לראות בתמונות אלה. בהיעדר סידן, החרוזים מראים נטייה מועטה או בכלל לא להצטבר, ואין עלייה בגודל המצטבר עם הזמן בנוכחות סידן.

עם זאת, פעימות המצופות ב-NCAT כאן ו-ECFC מראות צבירה חזקה כאשר הגודל המצטבר גדל עם הזמן כמדד כמותי למחצה של הידבקות. תמונות האור המועברות משלושה ניסויים נותחו כדי לקבוע את הגודל הממוצע של האגרגטים. כפי שניתן לראות בתרשים זה, הצטברות של חרוזים מצופים ECFC בנוכחות סידן ובהיעדר סידן נקבעה במרווחים של 15 דקות.

במהלך שעה, נתונים אלה מגלים כי תחום האקטו של דג הזברה n cadherin מתווך הידבקות הומופילית תלויה בסידן. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לבדוק אם הידבקות היא תכונה ביוכימית מהותית של החלבון המעניין שלך.