Name: מבחני צבירת חרוז לאפיון של תא המשוערת הידבקות מולקולות (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-10-17T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 15 s
Description: למד שיטה מהירה לאפיון תכונות הידבקות מולקולות שיתוף תאים באמצעות מבחני צבירת חרוזים עם חלבוני ectodomain. השיטה מאפשרת בדיקה ישירה של פעילות הידבקות הומופילית בצורה פשוטה ואמינה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי פרס NSF/ARRA (IOS 0920357) ופרס מה-NIH (5R21MH098463).

.1 תא הכנה (יום -2 ל0) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיצול תאי HEK293 1: 5 באמצעות 0.05% פתרון טריפסין-EDTA ודגירה בצמיחת מדיה על 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO 2 עד 60 - 80% ומחוברות (2 - 3 ימים). עבור כל תנאי, תאי תרבות ב2 x 100 מנות מ&quot;מ. </li></ol> .2 Transfection תא (יום 1) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Transfect HEK293 תאים עם FC-היתוך קידוד פלסמיד באמצעות מגיב transfection כגון Lipofectamine. גם שיטות חלופיות שתבאנה ליעילות transfection הדומה ניתן להשתמש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור תאי transfected לחממה ל24 שעות. </li></ol> .3 תא רביה (יום 2) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צמיחת מדיה מחממים ללא סרום שור העוברי (-FBS) ל37 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש לשטוף את הכלים 2x עם 10 מ&quot;ל צמיחת מדיה -FBS, ולהחזיר את המנות ל37 מעלות צלזיוס החממה במשך שעה 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש לשטוף את זמן מנות תרבויות אחד יותר עם 10 מ&quot;ל צמיחת מדיה -FBS, עבור הסכום כולל של 3 שוטף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Incuבייט HEK293 תאי transfected על 37 מעלות צלזיוס במשך שעה אחרת 48 ללא FBS לפני איסוף תקשורת. </li></ol> .4 ביד צבירה (יום 4) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לאסוף מדיה ממנות התרבות, להעביר מדיה מכל זוג של מנות ל50 צינורות מ&quot;ל וספין חרוטי ב XG 500 במשך 5 דקות עד גלולה פסולת הסלולר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תקשורת מסנן מצינור חרוטי 50 מ&quot;ל לתוך מסנן צנטריפוגלי באמצעות מזרק 30 מ&quot;ל ו0.45 מיקרומטר מסנן מזרק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספין מסנני צנטריפוגלי ב4,000 XG ו -4 ° C עד נפח של תקשורת בתרבות המרוכזת הוא כ 500 μl (כ 15 דקות). חזור על פעולה עד כל התקשורת והתרבות כבר הוסיפה ומרוכזת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 1.5 μl של חרוזים מגנטיים חלבון G ל1 מ&quot;ל של קר כקרח כריכת מאגר בצינור 1.5 מ&quot;ל microcentrifuge עבור כל דגימה, מקום על מגנט ולהסיר חיץ. מייד להוסיף תקשורת והתרבות המרוכזת לחלבון G חרוזים מגנטיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סובב צינורות ב 4 מעלות צלזיוס למשך 2 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Plצינורות אס על מגנט ולהסיר תקשורת. מהר לשטוף חרוזי פעמיים עם קרח קר 1 מ&quot;ל חיץ מחייב, ולאחר מכן resuspend חרוזים ב300 μl חיץ מחייב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיצול resuspended חרוזים לתוך 2 צינורות, 150 μl לתוך צינור אחד, ולאחר מכן להוסיף 1.5 μl של 200 מ&quot;מ CaCl 2 או 200 mM EDTA ל&quot; סידן &quot;ותנאים&quot; אין סידן &quot;, בהתאמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברה מכל מצב 100 μl לדיכאון גם להחליק ולאסוף micrographs באמצעות מיקרוסקופ מועבר אור (איור 2). לאסוף תמונות מ5 שדות של תצוגה עבור כל ניסוי בכל נקודת זמן רצויה. </li></ol> ניתוח .5 נתונים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות ImageJ, או תוכנת ניתוח תמונה דומה, פתח את אחת מחמש מערכות נתוני תמונה באמצעות יבוא תמונת הרצף / ... מהתפריט הנפתח קובץ. אלה ייפתחו כערימת תמונה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בתמונה / מאפיינים ... תיבת הדו שיח, לשנות את iיחידות קוסם לפיקסלים ורוחב פיקסל להגדיר ופיקסל ל1.0. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להמיר את התמונות לינארי באמצעות / הסף ... הפקודה התאם בתפריט תמונה. לקבוע את הסף לכולל פיקסלים שתורמים לחרוזים או אגרגטים חרוז, אבל שלא לכלול רקע וחלקיקים קטנים. אחול על כל התמונות בערימה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בתיבת הדו שיח מדידות הסט, סמן את תיבות פינת וסטאק התפקיד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל לנתח חלקיקים ... בניתוח תפריט הנפתח. זה יהיה ליצור רשימה של חלקיקים מזוהים, כולל גודלם (שטח) ואת התמונה שבה הם זוהו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על תהליך זה עבורו ניסוי ותנאי ניסוי. </li></ol>

<ol><li>Chen, X., Gumbiner, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paraxial+protocadherin+mediates+cell+sorting+and+tissue+morphogenesis+by+regulating+C-cadherin+adhesion+activity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Paraxial protocadherin mediates cell sorting and tissue morphogenesis by regulating C-cadherin adhesion activity.</a> J. Cell Biol. 174 (2), 301-313 (2006).</li>
<li>Grumet, M., Friedlander, D. R., Edelman, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+the+binding+of+Ng-CAM+to+laminin%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Adhes.+Commun%22%5BJournal%5D)">Evidence for the binding of Ng-CAM to laminin.</a> Cell Adhes. Commun. 1 (2), 177-190 (1993).</li>
<li>Hatta, K., Nose, A., Nagafuchi, A., Takeichi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloning+and+expression+of+cDNA+encoding+a+neural+calcium-dependent+cell+adhesion+molecule%3A+its+identity+in+the+cadherin+gene+family%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Cloning and expression of cDNA encoding a neural calcium-dependent cell adhesion molecule: its identity in the cadherin gene family.</a> J. Cell Biol. 106 (3), 873-881 (1988).</li>
<li>Hirano, S., Nose, A., Hatta, K., Kawakami, A., Takeichi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium-dependent+cell-cell+adhesion+molecules+%28cadherins%29%3A+subclass+specificities+and+possible+involvement+of+actin+bundles%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Calcium-dependent cell-cell adhesion molecules (cadherins): subclass specificities and possible involvement of actin bundles.</a> J. Cell Biol. 105 (6 Pt 1), 2501-2510 (1987).</li>
<li>Nose, A., Nagafuchi, A., Takeichi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expressed+recombinant+cadherins+mediate+cell+sorting+in+model+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Expressed recombinant cadherins mediate cell sorting in model systems.</a> Cell. 54 (7), 993-1001 (1988).</li>
<li>Nose, A., Takeichi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+cadherin+cell+adhesion+molecule%3A+its+expression+patterns+associated+with+implantation+and+organogenesis+of+mouse+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">A novel cadherin cell adhesion molecule: its expression patterns associated with implantation and organogenesis of mouse embryos.</a> J. Cell Biol. 103 (6 Pt 2), 2649-2658 (1986).</li>
<li>Schreiner, D., Weiner, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combinatorial+homophilic+interaction+between+gamma-protocadherin+multimers+greatly+expands+the+molecular+diversity+of+cell+adhesion%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Combinatorial homophilic interaction between gamma-protocadherin multimers greatly expands the molecular diversity of cell adhesion.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 107 (33), 14893-14898 (2010).</li>
<li>Takeichi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+correlation+between+cell+adhesive+properties+and+some+cell+surface+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Functional correlation between cell adhesive properties and some cell surface proteins.</a> J. Cell Biol. 75, 464-474 (1977).</li>
<li>Sivasankar, S., Brieher, W., Lavrik, N., Gumbiner, B., Leckband, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+molecular+force+measurements+of+multiple+adhesive+interactions+between+cadherin+ectodomains%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Direct molecular force measurements of multiple adhesive interactions between cadherin ectodomains.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 96 (21), 11820-11824 (1999).</li>
<li>Sivasankar, S., Gumbiner, B., Leckband, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+measurements+of+multiple+adhesive+alignments+and+unbinding+trajectories+between+cadherin+extracellular+domains%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Direct measurements of multiple adhesive alignments and unbinding trajectories between cadherin extracellular domains.</a> Biophys. J. 80, 1758-1768 (2001).</li>
<li>Sivasankar, S., Zhang, Y., Nelson, W. J., Chu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterizing+the+initial+encounter+complex+in+cadherin+adhesion%5BTitle%5D)+AND+%22Structure%22%5BJournal%5D)">Characterizing the initial encounter complex in cadherin adhesion.</a> Structure. 17 (8), 1075-1081 (2009).</li>
<li>Zhang, Y., Sivasankar, S., Nelson, W. J., Chu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resolving+cadherin+interactions+and+binding+cooperativity+at+the+single-molecule+level%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Resolving cadherin interactions and binding cooperativity at the single-molecule level.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106 (1), 109-114 (2009).</li>
<li>Yasuda, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activity-induced+protocadherin+arcadlin+regulates+dendritic+spine+number+by+triggering+N-cadherin+endocytosis+via+TAO2beta+and+p38+MAP+kinases%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Activity-induced protocadherin arcadlin regulates dendritic spine number by triggering N-cadherin endocytosis via TAO2beta and p38 MAP kinases.</a> Neuron. 56 (3), 456-471 (2007).</li>
<li>Chappuis-Flament, S., Wong, E., Hicks, L. D., Kay, C. M., Gumbiner, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+cadherin+extracellular+repeats+mediate+homophilic+binding+and+adhesion%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Multiple cadherin extracellular repeats mediate homophilic binding and adhesion.</a> J. Cell Biol. 154 (1), 231-243 (2001).</li>
<li>Emond, M. R., Biswas, S., Blevins, C. J., Jontes, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+complex+of+Protocadherin-19+and+N-cadherin+mediates+a+novel+mechanism+of+cell+adhesion%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">A complex of Protocadherin-19 and N-cadherin mediates a novel mechanism of cell adhesion.</a> J. Cell Biol. 195 (7), 1115-1121 (2011).</li>
<li>Biswas, S., Emond, M. R., Jontes, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+clustered+protocadherins+Pcdhalpha+and+Pcdhgamma+form+a+heteromeric+complex+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The clustered protocadherins Pcdhalpha and Pcdhgamma form a heteromeric complex in zebrafish.</a> Neuroscience. 219, 280-289 (2012).</li>
<li>Blevins, C. J., Emond, M. R., Biswas, S., Jontes, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+expression%2C+alternative+splicing%2C+and+adhesive+properties+of+the+zebrafish+delta1-protocadherins%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Differential expression, alternative splicing, and adhesive properties of the zebrafish delta1-protocadherins.</a> Neuroscience. 199, 523-534 (2011).</li>
<li>Morishita, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+the+cadherin-related+neuronal+receptor%2Fprotocadherin-alpha+first+extracellular+cadherin+domain+reveals+diversity+across+cadherin+families%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Structure of the cadherin-related neuronal receptor/protocadherin-alpha first extracellular cadherin domain reveals diversity across cadherin families.</a> J. Biol. Chem. 281, 33650-33663 (1074).</li>
<li>Wojtowicz, W. M., Flanagan, J. J., Millard, S. S., Zipursky, S. L., Clemens, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternative+splicing+of+Drosophila+Dscam+generates+axon+guidance+receptors+that+exhibit+isoform-specific+homophilic+binding%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Alternative splicing of Drosophila Dscam generates axon guidance receptors that exhibit isoform-specific homophilic binding.</a> Cell. 118 (5), 619-633 (2004).</li>
<li>Drees, F., Reilein, A., Nelson, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-adhesion+assays%3A+fabrication+of+an+E-cadherin+substratum+and+isolation+of+lateral+and+Basal+membrane+patches%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Cell-adhesion assays: fabrication of an E-cadherin substratum and isolation of lateral and Basal membrane patches.</a> Methods Mol. Biol. 294, 303-320 (2005).</li>
</ol>

המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים פיננסיים מתחרים.

הידבקות תא היא תכונה חיונית של חיים רב תאיים ומתווכת על ידי מגוון רחב של חלבונים בתא שטח. מבין אלה, מאפייני הדבקה מפורטים הם הבינו רק חלק קטן יחסית. הנה, יש לנו תארנו פרוטוקול פשוט, מהיר לחקירת היכולת הדבקה homophilic של ectodomains המופרש התמזג תג epitope נוח. לגישה זו יש מספר היתרונות חשובים. ראשית, שורות תאי יציבות אינן נדרשות 14,20, ככמויות מספיקות של חלבון יכולות להיות שנוצרו על ידי transfection החולף של 100 מנות מ&quot;מ. זה מאפשר ההקרנה של מספרים גדולים יותר של מ...

הידבקות תאי תאים חיונית לפיתוח ושלמותם של אורגניזמים רב תאיים ומתווכת על ידי מערך מגוון של מולקולות פני השטח של תא. רב של מולקולות הדבקה אלה זוהו ואופיין, שרבים יישארו להתגלות. מספר שיטות משמשות כדי לחקור את התכונות של מולקולות הידבקות תא (מצלמות), כוללים מבחני מיון תא, מבחני צבירת תא 1-8 ושיטות biophysical, כגון מיקרוסקופ כוח אטומי וכוח ספקטרוסקופיה משטח 9-12. המורכבות אפילו פשוטים במערכות מבחנה באמצעות שורות תאים עושה את זה קשה לקבוע את מאפייני ההדבקה של CAM משוער. בדרך כלל, מולקולה נחשבת CAM אם זה גורם להצטברות של תאים כאשר transfected לקו תא הלא דביק. עם זאת, ברור שזה לא עדות ישירה של פעילות הדבקה. למשל, להקל על מסירת השטח פני תא או יציבותCAM היה גם לגרום להצטברות תא גדל 1,13. יתר על כן, CAM אמיתי עלול להיכשל לתווך צבירת תא אם שורת התאים חסרת שיתוף גורמים אחרים הנדרשים למשלוח פני תא או התייצבות. כדי להימנע מגורמים שמסבך אלה, יותר מבחני ישירים יכול להיות מועסקים המבוססים על הרעיון כי אינטראקציות דבקים צריכים להיות רכוש ביוכימיים פנימי של תחום תאי. בעוד חרוזים בתחילה שימשו לאפיין Ng-CAM 2, אלה מבחני שהורחבו על מנת לחקור 12,14,15 הידבקות בתיווך cadherin. שימוש בשילוב של שילובי ectodomain-FC C-cadherin, המעבדה Gumbiner הראתה כי חזרות cadherin מרובות לתרום לhomophilic אינטראקציות 14. שימוש במבחני צבירת חרוז דומים, E-cadherin והידבקות N-cadherin גם היו מאופיין 12,15, כמו שיש לי מספר protocadherins 1,15-18 וisoforms Dscam מדרוזופילה <em&gt; 19. כאן אנו מתארים assay יחסית פשוט והמהיר לאפיון הפעילות הדבקה של ectodomains של מצלמות המשוערות homophilic (איור 1) המופרש, מתויג epitope. יש לנו בשימוש assay זה בעיקר כדי לאפיין חברי superfamily cadherin.

<table><tbody><tr><td>pFc-N1 פלסמיד</td><td>Addgene</td><td><חזק>להגשה</חזק></טווח></td><td></td></tr><tr><td>HEK293 תאים</td> אוסף <td>תרבית מסוג אמריקאי</td><td>CRL-1573</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Mediatech - Corning</td><td>10-013-CV</td><td></td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי (FBS)</td><td>Sigma</td><td>F2442</td><td></td></tr><tr><td>100x Pen-Strep (10,000 U/ml)</td><td>Life Technologies</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>0.05% Trypsin-EDTA</td><td>Life Technologies</td><td>25300054</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000</td><td>Life Technologies</td><td>11668030</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads &ndash; חלבון G</td><td>Life Technologies</td><td>10003D</td><td></td></tr><tr><td>סרום בקר אלבומין</td><td>סיגמא</td><td>A3294</td><td></td></tr><tr><td>שקופיות דיכאון</td><td>מדעי מיקרוסקופיה אלקטרונית</td><td>71878-06</td><td></td></tr><tr><td>Amicon Ultra-15 יחידת מסנן צנטריפוגלי עם קרום Ultracel-10</td><td>Millipore</td><td>UFC901024</td><td></td></tr><tr><td>מסנן מזרק 0.45 מ"מ</td><td>Sarstedt</td><td>83.1826</td><td></td></tr><tr><td>Dynamag-2 Magnet</td><td>Life Technologies</td><td>12321D</td><td></td></tr><tr><td>פיג'י (ImageJ) תוכנת ניתוח תמונה</td><td><a href="http://fiji.sc/Fiji">http://fiji.sc/Fiji</a></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">טבלה של מאגרים/פתרונות</td></tr><tr><td>צמיחה מדיה</td><td>DMEM + 10% FBS + מסנן עט-סטרפטוקוס</td><td>לעקר ולאחסן ב-4 מעלות צלזיוס.</td><td></td></tr><tr><td>מדיה צמיחה &ndash; מסנן</td><td>FBS DMEM + Pen-Strep</td><td>לעקר ולאחסן בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.</td><td></td></tr><tr><td>מאגר מחייב</td><td>50 מ"מ טריס, pH 7.4, 100 מ"מ NaCl, 10 מ"מ KCl, 0.2% מערבולת BSA</td><td>עד להמסה, שמור על קרח.</td><td></td></tr></tbody></table>

מבחני צבירת חרוז לאפיון של תא המשוערת הידבקות מולקולות

Bead Aggregation Assays for the Characterization of Putative Cell Adhesion Molecules

הידבקות תאי תאים היא יסוד לחיים רב תאיים ומתווכת על ידי מערך מגוון של חלבונים בתא שטח. עם זאת, האינטראקציות הדבקה לרבים מחלבונים אלו הם הבינו היטב. כאן אנו מציגים שיטה פשוטה, מהירה לאפיון מאפייני ההדבקה של מולקולות הידבקות תא homophilic המשוערות. HEK293 תאים בתרבית הם transfected עם פלסמיד דנ&quot;א קידוד ectodomain של חלבון בתא שטח מופרש, epitope מתויג. באמצעות חרוזים פונקציונליות ספציפיים לתג epitope, החלבון המסיס, מופרש ההיתוך הוא נתפס ממדיום התרבות. לאחר מכן ניתן להשתמש חרוזים המצופים ישירות במבחני צבירת חרוז או בחרוז ניאון מיון מבחני לבדיקת הידבקות homophilic. אם תרצה, mutagenesis לאחר מכן ניתן להשתמש כדי להבהיר את חומצות אמינו הספציפיות או תחומים הנדרשים להידבקות. assay זה דורש רק כמויות קטנות של חלבון ביטא, אינו מחייב את הייצור של שורות תאי יציבות, ויכול להיות עכוmplished ב4 ימים.

דוגמא לניסוי מוצג באיור 2, אשר מציג צבירת חרוז סידן תלוי על ידי ectodomain של N-cadherin התמזג Fc (NcadEC-FC). בהעדר סידן, חרוזים תערוכת נטייה קטנה או לא כדי לצבור ואין עלייה בגודל כולל עם זמן (איור 1 א, ג). בנוכחות סידן, חרוזים מצופים בצבירה איתנה מופע NcadEC-FC, עם גודל כולל הגדלת לאורך הזמן (איור 1 ב, ג). ניסוי זה חזר על עצמו שלוש פעמים, עם כל מופע המורכב מתמונות מחמישה שדות שאינם חופפים. גודל החלקיקים באזור פיקסל נקבע עבור כל ...

כאן אנו מציגים שיטה פשוטה ומהירה לאפיון תכונות ההדבקה הפנימיות של מולקולות הידבקות תאים משוערות. האקטודומיין המופרש המתויג באפיטופ של מולקולת הידבקות תאים נלכד ממדיום התרבות על חרוזים קטנים ואחידים מתפקדים. לאחר מכן ניתן להשתמש בחרוזים אלה באופן מיידי במבחני צבירת חרוזים פשוטים.

Cell-cell adhesion is fundamental to multicellular life and is mediated by a diverse array of cell surface proteins. However, the adhesive interactions ...

המטרה הכוללת של הליך זה היא לבדוק את היכולת של תחומי ecto חלבון לתווך הידבקות הומופילית כדי להשיג פלסמידים אלה המקודדים היתוך של שבר תחום ecto לאזור FC של IgG אנושי מועברים לתאי HEC 2 93. חלבוני ההיתוך המופרשים של Odin FC נלכדים על חרוזים מגנטיים מצומדים לחלבון G, ולאחר שטיפה, החרוזים המצופים מורשים לקיים אינטראקציה בתמיסה. לאחר מכן מצלמים את החרוזים המצופים כדי להעריך את היקף הצבירה ולבסוף, מכומתים באמצעות ניתוח תמונה פשוט, הנתונים המתקבלים חושפים אם החלבון הנחקר מסוגל לתווך הידבקות הומופילית.היתרונות העיקריים של טכניקה זו על פני שיטות קיימות כגון מבחני צבירת תאים, הוא שהיא מהירה, פשוטה ובודקת ישירות את פעילות ההדבקה של החלבון שבחרת. מי שתדגים את הטכניקה הזו תהיה ד"ר מישל אימן, מדענית בכירה מהמעבדה. התחל הליך זה על ידי הכנת התאים המתורבתים ל-NCA כאן ECFC, יומיים-שלושה לפני הטרנספקציה.השתמש ב-0.05% נסיעות ב-EDTA כדי לנתק את תאי HEC 2 93 מצלחות התרבית. הכינו שתי מנות 100 מילימטר לכל מצב. פצל את התאים אחד עד חמישה, ולאחר מכן תרבית אותם פנימה.מדיום גידול משלים. דגרו על התאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני עד שהם יהיו 60 עד 80% מתלכדים. ביום הטרנספקציה, השתמש במגיב כגון ליפו כדי להכניס פלסמיד המקודד היתוך FC.לאחר הטרנספקציה, החזירו את התאים לאינקובטור למשך 24 שעות ביום שלאחר הטרנספקציה Prewarm, DMEM עם סטרפטוקוקוקוס וללא סרום בקר עוברי ל-37 מעלות צלזיוס. שוטפים כל מנה פעמיים עם 10 מיליליטר מהמדיום המחומם, ולאחר מכן מחזירים את הכלים לחממה של 37 מעלות צלזיוס למשך שעה לאחר הדגירה, שוטפים את כלי התרבות פעם נוספת עם 10 מיליליטר DMEM ללא סרום בקר עוברי בסך הכל שלוש כביסות, ואז דוגרים על התאים המועברים ב-37 מעלות צלזיוס למשך 48 שעות נוספות לפני איסוף המדיום. ארבעה ימים לאחר הטרנספקציה, השתמש בפיפטה סרולוגית כדי לאסוף את המדיום מכל זוג צלחות תרבית ולהעביר אותו לצינור חרוטי של 50 מיליליטר.לאחר מכן צנטריפוגה של המדיום ב-500 גרם לחמש דקות כדי לגלול את הפסולת הסלולרית לאחר הסיבוב, שפכו את המדיום מכל צינור חרוטי של 50 מיליליטר למזרק של 30 מיליליטר וסננו אותו דרך מזרק של 0.45 מיקרון. מסננים לרכז צנטריפוגלי. סובב את המסננים הצנטריפוגליים עד שנפח מדיום התרבות המרוכז הצטמצם לכ-500 מיקרוליטר.הנסיעה אורכת כ-15 דקות. חזור על תהליך זה עד שכל מדיום התרבות נוסף ומרוכז. לאחר מכן, בצינור מיקרו צנטריפוגה של 1.5 מיליליטר לכל דגימה ב-1.5 מיקרוליטר של חרוזים מגנטיים של חלבון G למיליליטר אחד של מאגר קשירה קר כקרח.ההיבט הקשה ביותר בהליך זה הוא צבירת החרוזים. כדי להבטיח הצלחה, הקפד לבצע את ההליך בדיוק. התבוננו בחרוזים במהירות, אך לא בחומרה רבה מדי.לעולם אין לאפשר להם להתייבש בצד הצינור או להישאר על המגנט זמן רב מדי. הניחו את הצינור על מגנט ובעזרת פיפטה, שאפו את המאגר. לאחר מכן הוסף מיד את מדיום התרבות המרוכז לחרוזים המגנטיים של החלבון G.סובב את הצינורות בארבע מעלות צלזיוס למשך שעתיים. הניחו את הצינורות על מגנט והסירו את המדיום במהירות. שטפו את החרוזים פעמיים עם מיליליטר אחד של מאגר כריכה קר כקרח, ולאחר מכן השעו מחדש את החרוזים ב-300 מיקרוליטר של מאגר קשירה.פצלו את החרוזים התלויים לשני צינורות עם 150 מיקרוליטר לכל צינור. לאחר מכן הוסף 1.5 מיקרוליטר של סידן כלורי או EDTA לתנאי הסידן וללא סידן בהתאמה. העבירו 100 מיקרוליטר מכל מצב לשקע.החלק היטב באמצעות מיקרוסקופ אור מועבר. אסוף תמונות מחמישה שדות ראייה עבור כל ניסוי בכל נקודת זמן רצויה. שימוש בתמונה J או בתוכנת ניתוח תמונה דומה.פתח אחד מחמשת מערכי נתוני התמונה בתמונה J בתפריט הנפתח. בחלק העליון של המסך, בחר קובץ. לאחר מכן בחר ייבוא ולאחר מכן רצף תמונות.מצאו את התיקייה הכוללת את קובצי התמונות ופתחו אותם כאוסף תמונות. לאחר מכן בשורת התפריטים הנפתחת, לחץ על התמונה ולאחר מכן בחר מאפיינים. כדי לפתוח את חלון המאפיינים שם.שנו את יחידות התמונה לפיקסלים וקבעו את רוחב הפיקסלים וגובה הפיקסלים ל- 1.0. לחץ שוב על התמונה, בחר התאם ואז סף כדי לפתוח את חלון הסף והשתמש במחוון כדי להתאים את סף התמונה. כלול פיקסלים התורמים לחרוזים ואינם כוללים חלקיקים קטנים.החילו את הסף על כל התמונות באוסף התמונות. הבא בשורת התפריטים הנפתחת בחלק העליון של המסך. לחץ על ניתוח.לאחר מכן בחר הגדר מידות כדי לפתוח את תיבת הדו-שיח של המדידה באמצעות תיבות הסימון, בחר אזור ומיקום ערימה בחלק העליון של המסך. לחץ על ניתוח ולאחר מכן בחר נתח חלקיקים. זה ייצור רשימה של חלקיקים מזוהים כולל גודלם והתמונה שבה הם זוהו.חזור על תהליך זה עבור כל ניסוי וכל תנאי ניסוי כדי לקבוע את יכולת ההדבקה התלויה בסידן של דג הזברה והקדרין. תאי HEC 2 9 3 הועברו עם תחום הרין OD NCAT התמזגו שני fc ובעקבות צבירת חרוזים תלויי סידן צולמו ונותחו כמתואר בסרטון זה כפי שניתן לראות בתמונות אלה. בהיעדר סידן, החרוזים מראים נטייה מועטה או בכלל לא להצטבר, ואין עלייה בגודל המצטבר עם הזמן בנוכחות סידן.עם זאת, פעימות המצופות ב-NCAT כאן ו-ECFC מראות צבירה חזקה כאשר הגודל המצטבר גדל עם הזמן כמדד כמותי למחצה של הידבקות. תמונות האור המועברות משלושה ניסויים נותחו כדי לקבוע את הגודל הממוצע של האגרגטים. כפי שניתן לראות בתרשים זה, הצטברות של חרוזים מצופים ECFC בנוכחות סידן ובהיעדר סידן נקבעה במרווחים של 15 דקות.במהלך שעה, נתונים אלה מגלים כי תחום האקטו של דג הזברה n cadherin מתווך הידבקות הומופילית תלויה בסידן. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לבדוק אם הידבקות היא תכונה ביוכימית מהותית של החלבון המעניין שלך.

bead-aggregation-assays-for-characterization-putative-cell-adhesion

Research

JoVE Journal

Bioengineering

הנדסה ביולוגית

תדירות הדבקה assay למדידת קולטן ליגנד קינטיקה אינטראקציה כאשר הן מולקולות מעוגנים על פני השטח של התאים אינטראקציה מתוארת. Assay זה מכני מבוסס מודגמת באמצעות micropipette-בלחץ דם אנושי תא אדום כמו חיישן הידבקות integrin αLβ2 ו מולקולה-1 הדבקה אינטר כמו אינטראקציה קולטנים ligands.

תדירות הדבקה Assay עבור באתרו קינטיקס ניתוח חוצה Junctional אינטראקציות מולקולריות על ממשק Cell-Cell

בסרטון זה אנו מדגימים את הטכניקה למדידת אינטראקציות טרנס-תאיות בין מולקולות היצמדות תאים סינפטיים באמצעות בדיקת צבירת תאי HEK. בבדיקה זו, מספר שווה של תאי HEK המבטאים מולקולת היצמדות תאים קדם-סינפטית רצויה וחלבון פלואורסצנטי מעורבבים עם תאי HEK המבטאים מולקולת היצמדות תאים פוסט-סינפטית וחלבון פלואורסצנטי נוסף. האינטראקציה בין מולקולות ההיצמדות התא מאלצת את התאים להצטבר, דבר שניתן למדוד באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי.

בדיקת צבירת תאים לזיהוי אינטראקציות טרנס בין מולקולות היצמדות תאים

אנו מדווחים על שיטה במבחנה המאפשרת לכמת את המספר האמיתי של תאי דבק בתוך חד-שכבת תא אנדותל.

כימות של דביקות תא האנדותל<em&gt; במבחנה</em

התקשרות חיידקית לתאי מארח היא שלב מפתח במהלך קולוניזציה וזיהום של המארח. פרוטוקול זה מתאר את הייצור של הידבקויות רקומביננטיות מצומדות פולימר כחומרים ביומימטיים המאפשרים ניתוח של תרומתם של הידבקויות בודדות לתהליכים אלה, ללא תלות בגורמים חיידקיים אחרים.

חומרי Biomimetic לאפיין אינטראקציות חיידקים-מארח

assay הידבקות זרימה זו מספק מודל השפעה פשוט, גבוה של אינטראקציות תא אפיתל T. משאבת מזרק משמש להפקת מאמץ הגזירה, וכן במיקרוסקופ confocal לוכדת תמונות כימות. מטרת המחקרים אלה היא לכמת הידבקות תא T ביעילות באמצעות תנאי זרימה.

Assay הדבקה תחת מאמץ גזירה לחקר T לימפוציטים-הדבקה אינטראקציות מולקולה

הידבקויות פני התא הם מרכזי mechanotransduction, כפי שהם לשדר מתח מכני ליזום את מסלולי איתות מעורבים הומאוסטזיס ופיתוח רקמות. כאן, אנו מציגים פרוטוקול לנתח את התהליכים הביוכימיים אשר מופעלים בתגובה מתח, באמצעות microbeads מגנטי מצופה ליגנד ויישום כוח לקולטנים הידבקות.

ניתוח Cell Surface שיפוץ הדבקה בתגובה מתח מכני באמצעות חרוזים מגנטיים

מחקר זה מדגים את השירות ואת קלות מדידה הרחבה כמותית קרום התא שלה מתאם קיבולת דבק של תאים. בתור דוגמא מייצגת, אנחנו מראים כאן את הפרוטאין הקשורות Dickkopf 3 (DKK3) מעודד היווצרות מוגברת lobopodia תא adhesiveness ב adrenocortical קרצינומה של תאים במבחנה.

אפיון של קרום התא הרחבות ולימוד תפקידיהם סרטן התא אדהזיה דינמיקה

אדהזיה דינמי של תאים חיסוניים לקיר כלי הוא תנאי הכרחי בטן יונת. כאן, אנו מציגים את פרוטוקול עבור assay פונקציונלי במבחנה לניתוח ההשפעה של נוגדנים אנטי-אינטגרין, נוגדנים או גורמים אחרים על הדבקה תא דינמי של תאים אנושיים באמצעות addressin מצופים נימים.

אדהזיה דינמי Assay לניתוח פונקציונלי של טיפולים למניעת הידבקות במחלות מעי דלקתיות

כאן, אנו מציגים פרוטוקול אופטימיזציה כדי למדוד במהירות ובאופן חצי שוויוני אינטראקציות קולטן ליגנד בטרנס במערכת תאים הטרולוגית באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית.

מדידת אינטראקציות טרנס-תאיות באמצעות צבירת חלבונים במערכת תאים הטרולוגית

המאמר מתאר את הכמת של 1) את גודל ומספר של הידעיות מיקוד ו 2) אינדקס צורת תא ואת ההתפלגות שלה מתוך תמונות קונפוקלית וקד של המונאולאיירס הקונאולית של תאים MCF7.

קוונפיקציה של אזור הדבקה בתשתית התא והפצות צורות התא ב-MCF7 Cell Monolayers

פרוטוקול זה מציג את ההליכים הניסיוניים לביצוע טביעת הרגל של הידבקות כדי לדמיין את אירועי ההדבקה במהלך הידבקות מהירה של תאים.

הדמיה הידבקות מולקולרית בתא מתגלגל על ידי הידבקות טביעת רגל אסאי

למד שיטה מהירה לאפיון תכונות הידבקות מולקולות שיתוף תאים באמצעות מבחני צבירת חרוזים עם חלבוני ectodomain. השיטה מאפשרת בדיקה ישירה של פעילות הידבקות הומופילית בצורה פשוטה ואמינה.

מבחני צבירת חרוז לאפיון של תא המשוערת הידבקות מולקולות

גלה סרטונים נוספים