Name: בידוד RNA מן העכבר לבלב: רקמות ribonuclease עשיר (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-08-02T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 47 s
Description: למדו לבודד RNA באיכות גבוהה מלבלב עכבר עשיר בריבונוקלאזות. השיטה מבטיחה RNA עם מספר שלמות גבוה מ-7 לניתוח ביטוי גנים שגרתי.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים Jianhua לינג, ריימונד מקדונלד, גאלווין סוויפט, מישל גריפין, פול Grippo וSatyanarayana Rachagani להערות, הצעותיהם מועילות ושיתוף של הפרוטוקולים שלהם. עבודה זו נתמכה על ידי U01CA111294 מענק ופרס פיתוח רעיון מהביצוע העצמי תכנית המחקר של אוניברסיטת מדינת אוהיו.

1. הכנה השיטות הבאות לדבוק במדיניות שנקבעה על ידי הוועדה של המוסד לטיפול בבעלי חיים ושימוש (IACUC). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מומלץ לבודד לא יותר מ -6 לבלב של עכבר בכל יום נתון. יש את כל מכשירי הניתוח נקיים וautoclaved, סט אחד לכל בעל חיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לייבל כל microcentrifuge הצינורות. ארבעה 2 צינורות מיליליטר לכל בעל חיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח 8 מיליליטר של מגיב תמוגה ב50 צינורות צנטריפוגה מיליליטר על קרח. הערה: בעוד שערכת הטיהור מגיעה עם מגיב פנול thiocyanate guanidine כי הוא מתאים לבידוד לבלב, מגיב תמוגה משמש בשל הכמויות הגדולות הנדרשות לבידוד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לוותר על 10 מיליליטר מהפתרונים הבאים ל15 צינורות צנטריפוגה מיליליטר לניקוי הלהבים של homogenizer. אתנול, 70% (2 צינורות), מים כיתה HPLC (צינור 1) ומים HPLC כיתה מכילים כ 200 μl של RNase משם או inactivator ribonuclease המקביל. </li></ol&gt; 2. כירורגיה, Dissection לבלב ולתפעול <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח 1-2 מיליליטר של isoflurane לתוך צנצנת המכילה מגבות גזה כותנה או נייר. עכברים מונחים על פלטפורמה המונעת מהם להגיע למקור של isoflurane. הוספת isoflurane הטרי לצנצנת לפני הרדמת כל עכבר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניח בעדינות את העכבר לתוך הצנצנת המכילה את isoflurane. מכסה את הצנצנת ולנטר את ההשפעות של ההרדמה על ידי בעדינות לסובב את הצנצנת קדימה ואחורה. בעל החיים הוא מורדם פעם אחת זה באינו מסוגל לעמוד ב&#39;משלו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאישור של הרדמה, להסיר את החיה מהצנצנת ולהחיל קמצוץ הבוהן משרד. אם העכבר אינו מגיב לקמצוץ הבוהן, המשך לשלב 2.5. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם העכבר מגיב לקמצוץ הבוהן, ולאחר מכן לחזור על השלבים 2.2-2.3. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את החיה מורדמת על גבי הספסל במצב המועדים. לנקוע את צוואר הרחם של העכבר על ידי הצבת בחוזקה עם יד שמאל על צוואר הרחם של העכבר. לנוing יד ימין לתפוס את זנבו של העכבר ובמהירות למשוך כלפי מעלה בזווית של כ 45 ° ללנקוע את צוואר הרחם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאבטח את הפגר למשטח (חתיכת רמה של קלקר מכוסה במגבות נייר) על ידי פירסינג כל אחת מארבע כפות רגליו של בעל החיים למשטח השטוח באמצעות מחטים תת עורי 25 מד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש במכשירי ניתוח סטרילי, לחתוך את הבטן של העכבר פתוח ובמהירות להסיר את הלבלב של העכבר. השתמש במלקחיים כדי להחזיק את הלבלב ולחתוך אותו מהטחול והמעי הדק באמצעות מספריים האביב. היזהר לא למתוח את הלבלב במהלך ההסרה מהעכבר. שיבוש של הרקמה יכול לשחרר ribonuclease. הערה: הזמן שנדרש כדי להסיר את הלבלב של העכבר הוא קריטי. אדם מיומן אמור להיות מסוגל לנתח את הלבלב בכ -1 דקות או פחות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את הלבלב כולו לתוך צינור 50 מיליליטר המכיל 8 מיליליטר של מגיב תמוגה קר כקרח. שווי הצינור ובקצרה לנער לטבול tissue למגיב ולהמשיך לשלב הבא ללא דיחוי. היחס של מגיב תמוגה לרקמה הוא קריטי. ראה סעיף תוצאות עבור השוואה של שלמות RNA מבודדת באמצעות כרכים שונים של מגיב תמוגה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Homogenize במשך 5 שניות. חשוב ללחוץ על להבי homogenizer לחלק התחתון של צינור צנטריפוגות כדי לאפשר לרקמות להיות מורמות אל תוך הלהבים להומוגניזציה יעילה. </li></ol> 3. הסרת רקמות מעוכלת שים לב: בעקבות הומוגניזציה, פיסות קטנות של רקמה תישאר במגיבה תמוגה. זה יותר חשוב לי lyse הרקמה להשאיר כמה רקמות מעוכלות ולא מעל homogenizing והשפלה סיכון של RNA במהירות. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברה 2 מיליליטר של מגיב תמוגה מכיל לבלב lysed לצינור microcentrifuge 2 מיליליטר. לאסוף שני צינורות microcentrifuge של homogenate לבידוד. מחק את homogenate שנותר או בחנות ב -80 מעלות צלזיוס למחקרים עתידיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סנטrifuge ב 4 ° C, G 12,000 × למשך 5 דקות עד גלולה הרקמות מעוכלת. זהו צעד קריטי כמו שריד של רקמה מעוכלת לפתרונות הבאים של RNA צפוי לזהם את המדגם עם ribonuclease (שלב 5.13). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברה 1 מיליליטר של supernatant לתוך צינור microcentrifuge 2 מיליליטר. להמשיך בבידוד באופן מיידי ולאחסן את הצינור לשכפל ב -80 ° C לשימוש עתידי. מניחים את כל הצינורות המכילים homogenate על קרח רטוב תוך שתמשיך לשלב הבא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השלך את מגיב תמוגה נותר לתוך כלי קיבול פסולת כימית מתאים. </li></ol> 4. ניקוי של להבי Homogenizer <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני שתמשיך לבידוד הבא, לנקות את להבי homogenizer ידי הצבת אותם ב10 מיליליטר של 70% אתנול. הפעל את homogenizer במשך לכ20 שניות כדי להסיר כל גושים של רקמה שעלולה להיתפס בלהבים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש קצה 200 pipet μl כדי להסיר כל חתיכות שתישארנה בלהבי homogenizer. </li&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלב 4.1 במים, inactivator RNase הכללי ו70% אתנול. ייבש את פיר homogenizer עם קים נקייה לנגב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלב 2.1 לבידוד הלבלב של בעלי החיים שנותרו, RNA שמירה מבודד מכל חיה נפרדת ולא איגום RNA. </li></ol> 5. בידוד RNA הסעיף הבא הוא זהה לפרוטוקול ערכת הטיהור. היתרון של ערכת הטיהור הוא שזה יבודד רנ&quot;א הכל כולל RNA הקטן. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם אתם משתמשים בפתרון homogenate קפוא, להפשיר על קרח רטוב ולתת לעמוד על RT במשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 200 μl של כלורופורם, מכסה את הצינור ולנער במרץ ביד ל15 שניות. בואו הצינור עומד על RT במשך 2-3 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה במשך 15 דקות ב 12,000 XG, 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעביר את השכבה העליונה המימית לתוך צינור microcentrifuge. הוסף 1.5 כרכים של isopropanol ומערבבים היטב על ידי pipetting מעלה ומטה מספר פעמים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר עד 700 μl של המדגם לעמודת ספין שממוקם בצינור אוסף 2 מיליליטר. סגור את המכסה וצנטריפוגות ב 8,000 XG במשך 15 שניות ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחק את הזרימה דרכו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלבים 5.5-5.6, תוך שימוש בשאר המדגם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 700 μl הצפת RWT לעמודת הספין. צנטריפוגה במשך 15 שניות ב8,000 x גרם. מחק את הזרימה דרכו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Pipet 500 μl הצפת הרשתית לעמודת הספין. צנטריפוגה במשך 15 שניות ב8,000 XG לשטוף את העמודה. מחק את הזרימה דרכו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 500 μl הצפת הרשתית לעמודת הספין. צנטריפוגה למשך 2 דקות ב 8,000 XG לייבש את העמודה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את טור הספין לצינור microcentrifuge 1.5 מיליליטר. Pipet 80 ללא מים ribonuclease μl ישירות על גבי קרום טור ספין. צנטריפוגה 1 דקות ב8,000 XG לelute RNA. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת מעכב RNase μl 1 לפתרון RNA. אחסן ב-80 ° C או להמשיך ל5.13. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לאמת את השלמות של RNA, לחשב את conce RNA הראשוןיחס ntration ו260/280 באמצעות ספקטרופוטומטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל חלק מפתרון RNA כ 500 ng / μl עם מים כיתה ביולוגיה מולקולרית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקבוע את Integrity RNA (כלומר, רין) באמצעות ניתוח אלקטרופורזה נימים. כ 5 μl של פתרון RNA הוא מספיק לניתוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Aliquot פתרון RNA (ראה איור 2) ולאחסן ב -80 ° C. </li></ol>

<ol><li>Chen, C., Ridzon, D. A., Broomer, A. J., Zhou, Z., Lee, D. H., Nguyen, J. T., Barbisin, M., Xu, N. L., Mahuvakar, V. R., Andersen, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+quantification+of+microRNAs+by+stem-loop+RT-PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Real-time quantification of microRNAs by stem-loop RT-PCR.</a> Nucleic Acids Res. 33, e179(2005).</li>
<li>Chirgwin, J. M., Przybyla, A. E., MacDonald, R. J., Rutter, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+biologically+active+ribonucleic+acid+from+sources+enriched+in+ribonuclease%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Isolation of biologically active ribonucleic acid from sources enriched in ribonuclease.</a> Biochemistry. 18, 5294-5299 (1979).</li>
<li>Chomczynski, P., Sacchi, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-step+method+of+RNA+isolation+by+acid+guanidinium+thiocyanate-phenol-chloroform+extraction%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction.</a> Anal Biochem. 162, 156-159 (1987).</li>
<li>Griffin, M., Abu-El-Haija, M., Abu-El-Haija, M., Rokhlina, T., Uc, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simplified+and+versatile+method+for+isolation+of+high-quality+RNA+from+pancreas%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Simplified and versatile method for isolation of high-quality RNA from pancreas.</a> Biotechniques. 52, 332-334 (2012).</li>
<li>Iyer, V. R., Eisen, M. B., Ross, D. T., Schuler, G., Moore, T., Lee, J. C., Trent, J. M., Staudt, L. M., Hudson Jr, J., Boguski, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+transcriptional+program+in+the+response+of+human+fibroblasts+to+serum%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The transcriptional program in the response of human fibroblasts to serum.</a> Science. 283, 83-87 (1999).</li>
<li>Lenstra, J. A., Beintema, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+amino+acid+sequence+of+mouse+pancreatic+ribonuclease.+Extremely+rapid+evolutionary+rates+of+the+myomorph+rodent+ribonucleases%5BTitle%5D)+AND+%22European+journal+of+biochemistry++FEBS%22%5BJournal%5D)">The amino acid sequence of mouse pancreatic ribonuclease. Extremely rapid evolutionary rates of the myomorph rodent ribonucleases.</a> European journal of biochemistry FEBS. 98, 399-408 (1979).</li>
<li>Mullin, A. E., Soukatcheva, G., Verchere, C. B., Chantler, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+in+situ+ductal+perfusion+to+facilitate+isolation+of+high-quality+RNA+from+mouse+pancreas%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Application of in situ ductal perfusion to facilitate isolation of high-quality RNA from mouse pancreas.</a> Biotechniques. 40, 617-621 (2006).</li>
<li>Rio, D. C., Ares, M., Hannon, G. J., Nilsen, T. W. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRio%2C+DC+%22RNA+A+Laboratory+Manual%22">RNA A Laboratory Manual</a>. , Cold Springs Harbor Laboratory Press. Cold Springs Harbor, NY. (2011).</li>
<li>Streit, S., Michalski, C. W., Erkan, M., Kleeff, J., Friess, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Northern+blot+analysis+for+detection+and+quantification+of+RNA+in+pancreatic+cancer+cells+and+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Northern blot analysis for detection and quantification of RNA in pancreatic cancer cells and tissues.</a> Nat Protoc. 4, 37-43 (2009).</li>
<li>Zmuda, E. J., Powell, C. A., Hai, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+murine+islet+isolation+and+subcapsular+kidney+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments++JoVE%22%5BJournal%5D)">A method for murine islet isolation and subcapsular kidney transplantation.</a> Journal of Visualized Experiments JoVE. , (2011).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

בידוד RNA מן הרקמות הribonuclease עשירים מהווה אתגר גדול לניסויים בביולוגיה מולקולריים. ריאגנטים וערכות שונים זמינים באופן מסחרי המבוססים בעיקר על שיטת thiocyanate guanidine פנול של מיצוי RNA. thiocyanate guanidine denatures חלבון ובכך מפחית את הפעילות של ribonuclease. עם זאת, הגודל העצום של ribonuclease בלבלב דורש שינויים נוספים לפרוטוקולים סטנדרטיים של בידוד RNA. פרוטוקול הוא דיווח כאן, המבוסס על שיטת thiocyanate guanidine הסטנדרטי עדיין מכיל כמה שינויים קריטיים כמו גם טיפים לבי...

בידוד של RNA עם יושרה גבוהה נדרש לניסויים בביולוגיה מולקולריים שיגרתי כגון סופג צפוני 9, qRT-PCR 1 או ביטוי פרופיל גנטי 5. רוב השיטות עכשוויות של בידוד RNA מבוססות על שינויים של פרוטוקולי thiocyanate guanidine 2, 3. Thiocyanate guanidine הוא denaturant חלבון חזק ויהיה יעיל לשבש את הפעילות של ribonuclease תחת רוב התנאים. השיטה הפופולרית של Chomczynski וסאקי 3 בשילוב פנול לפתרון תמוגה thiocyanate guanidine, צמצום זמן הבידוד לכ -4 שעות. ריאגנטים מיצוי RNA, זמינים מסחרי רבים מבוססים על Chomczynski וסאקי שיטת 3. רקמות ribonuclease עשירות כגון לבלב אנושי או עכבר מציגה אתגר נוסף לבידוד RNA. לבלב של עכבר עשוי להכיל עד 75 מ&quot;ג ribonuclease 6 שחלקם ישוחרר דוריןשיבוש גרם של רקמת הלבלב וכתוצאה מכך autolysis רקמות. שינויים של פרוטוקולי thiocyanate guanidine שימשו בהצלחה לבודד RNA מלבלב עם רמה גבוהה של יושרה 2, 4, 7, 10. עירוי של מגיב ייצוב RNA לבידוד בהנחייתם לבלב של עכברים של RNA עם רמה גבוהה של יושרה 4, 7, 10, לעומת זאת עירוי של פתרונות ללבלב דורש מיומנות רבה, עשוי לדרוש מכשירים מיוחדים כגון מיקרוסקופ לנתח ושיבוש ארכיטקטורת רקמה במהלך ההליך עלול לגרום לתמוגה תא. מרוססים רקמות עם מגיב ייצוב RNA עשוי להפריע ליישומים אחרים, כולל בידוד חלבון וצביעה היסטולוגית. יתר על כן, טכניקה זו אינה מתאימה לבידוד RNA מן הלבלב אנושי. פרוטוקולים אחרים דורשים ההכנה של פתרונות ספציפיים על ידי החוקר 2. אנו מדווחים על פרוטוקול לבודד RNA עם יושרה גבוהה מלבלב עכבר. הפרוטוקול דואר משתמש באלמנטים של שיטות שפורסמו בעבר, והוא מבוסס במידה רבה על הפרוטוקולים סטנדרטי פנול / guanidine מבוסס thiocyanate תמוגה מגיב. היא אינה דורשת ההכנה של פתרונות מיוחדים ואינו דורש עירוי של חומרים כימיים ללבלב. שלבים קריטיים עבור בידוד RNA מוצלח כוללים פנול / מבוסס guanidine מגיב תמוגה גבוהה יחס רקמות, הסרת הרקמה מעוכלת מראש לשלב הפרדה והכללת מעכב ribonuclease לפתרון RNA וכתוצאה מכך. באמצעות אלה ושינויים אחרים, אנחנו בדרך כלל לבודד RNA עם רין יותר מ 7 שישמשו לניתוח ביטוי גנים שבשגרה.

<table><tbody><tr><td>הספק Gen 500&nbsp;</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>14-261-03&nbsp;</td><td>הומוגנייזר</td></tr><tr><td>5424R</td><td>Eppendorf</td><td></td><td>מיקרוצנטיפוגה מקוררת</td></tr><tr><td>טריזול מגיב</td><td>Invitrogen</td><td>15596018</td><td>מגיב ליזה</td></tr><tr><td>סטודנט ואנאס מספריים אביב</td><td>פישר</td><td>91500-09&nbsp;</td><td>השתמש לחיתוך לבלב מרקמות מחוברות</td></tr><tr><td>מספריים כירורגיים, 6 אינץ'</td><td>פישר</td><td>08-951-20</td><td>השתמש לחיתוך מלקחיים קהים של עכבר</td></tr><tr><td></td><td>פישר</td><td>1381239</td><td>השתמש להחזקת הלבלב בזמן ניתוח</td></tr><tr><td>איזופלורן USP</td><td>Abbott Labs</td><td>4/8/5210</td> רנז <td>הרדמה</td></tr><tr><td>החוצה (40 U/&micro; l)</td> <td>Invitrogen</td><td>10777-019</td><td>Rnase inhbitor</td></tr><tr><td>Rnase Away</td><td>Ambion</td><td>10328-011</td><td>כללי Rnase inactivator</td></tr><tr><td>HPLC כיתה</td><td>מים פישר</td><td>W5-4</td><td>לשטיפת להבי הומוגנייזר</td></tr><tr><td>ביולוגיה מולקולרית כיתה מים</td><td>Hyclone</td><td>SH30538.03</td><td>Elution of RNA</td></tr><tr><td>miRNeasy Mini kit</td><td>Qiagen</td><td>217004</td><td>Purification Kit</td></tr><tr><td>2 מ"ל צינורות מיקרוצנטריפוגה, מוסמכים ללא Rnase Dnase</td><td>ארה"ב פלסטיק מדעי</td><td>1620-2700</td><td></td></tr><tr><td>15 מ"ל צינורות צנטריפוגה</td><td>פלקון</td><td>352099</td><td></td></tr><tr><td>70% אתנול</td><td>פישר</td><td></td><td></td></tr><tr><td>100% אתנול</td><td>פישר</td><td></td><td></td></tr><tr><td>200 ומיקרו; l קצות פיפט</td><td>Rainin</td><td>GPL200F</td><td>לניקוי להבי הומוגנייזר</td></tr><tr><td>כלורופורם</td><td></td><td>פישר BP1145-1</td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop</td><td>Thermo</td><td>ND-1000</td><td>ספקטרופוטומטר</td></tr><tr><td>ביואנלייזר</td><td>מנתח אלקטרופורזה נימי זריזי</td><td></td><td></td> למדידת שלמות</tr><tr><td>RNA RNAlater</td><td>Ambion</td><td></td><td>RNA מגיב ייצוב&nbsp;</td></tr><tr><td>RNeasy&nbsp; עמודות ספין&nbsp;</td>טורים של <td>Qiagen</td><td></td><td>Spin&nbsp; כחלק מערכת miRNeasy Mini</td></tr><tr><td>עכברים</td><td>Chales River</td><td>Strain C57BL/6</td><td>גילם נע בין 4 ל-12 חודשים. &nbsp;</td></tr><tr><td>עכברים&nbsp;</td><td>זן מעבדת ג'קסון</td><td>129</td><td>גילם נע בין 4 ל-12 חודשים. &nbsp;</td></tr></tbody></table>

בידוד rna מן העכבר לבלב: רקמות ribonuclease עשיר

RNA Isolation from Mouse Pancreas: A Ribonuclease-rich Tissue

בידוד של RNA איכותי מרקמה עשירה בריבונוקלאז כמו לבלב עכבר מהווה אתגר. מכיוון שתפקידו העיקרי של הלבלב הוא לסייע בעיכול, לבלב עכבר עשוי להכיל 75 מ"ג ריבונוקלאז. אנו מדווחים על שינויים בפרוטוקולי ריאגנט ליזה סטנדרטיים של פנול/גואנידין תיוציאנט כדי לבודד RNA מלבלב העכבר. גואנידין תיוציאנט הוא דנטורנט חלבון חזק וישבש ביעילות את פעילות הריבונוקלאז ברוב התנאים. עם זאת, יש צורך בשינויים קריטיים בפרוטוקולים סטנדרטיים כדי לבודד בהצלחה RNA מרקמות עשירות בריבונוקלאז. השלבים העיקריים כוללים יחס גבוה של מגיב ליזה לרקמה, הסרת רקמה לא מעוכלת לפני הפרדת הפאזה והכללת מעכב ריבונוקלאז לתמיסת ה-RNA. באמצעות שינויים אלה ואחרים, אנו מבודדים באופן שגרתי RNA עם מספר שלמות RNA (RIN) גדול מ-7. ה-RNA המבודד הוא באיכות מתאימה לניתוח ביטוי גנים שגרתי. התאמה של פרוטוקול זה לבידוד RNA מרקמות עשירות בריבונוקלאז מלבד הלבלב אמורה להיות ניתנת להשגה בקלות.

תשואת רנ"א הכל מ1 מיליליטר של homogenate תמוגה היא 20-40 מיקרוגרם. יחסי 260/280 OD הם בדרך כלל סביב 2.0 ורין הם גדול יותר באופן עקבי מאשר 7.0. אם רין הוא ≤ 6, הבידוד צריך להיות חוזר ונשנה. לפעמים, רין שהוא גבוה יותר מאשר 8.0 מושגת. שתי שיטות הנפוצות ביותר של הרדמת חסד עכברים לפני ההסרה של הלבלב הן חנק CO 2 או שאיפה של isoflurane. שני טכניקות ואחריו נקע בצוואר הרחם. כיוון שניתן כי זמן הסוכן הכימי ו / או...

אנו מדווחים על הליך לבידוד RNA עם שלמות גבוהה מלבלב העכבר העשיר בריבונוקלאז.

בידוד RNA מן העכבר לבלב: רקמות ribonuclease עשיר

Isolation of high-quality RNA from ribonuclease-rich tissue such as mouse pancreas presents a challenge.  As a primary function of the pancreas is to aid ...

המטרה הכוללת של הליך זה היא לבודד RNA בעל שלמות גבוהה מהלבלב של עכבר רכס ריבונוקלאז. זה מושג על ידי הסרה מהירה של הלבלב מפגר של עכבר שהורדם. לאחר מכן, הלבלב שקע במגיב ליזה, והרקמה הומוגנית.לאחר הצנטריפוגה, ה-RNA מבודד מהסופרנטנט באמצעות פרוטוקולים סטנדרטיים ותמיסת מעכב RNA מתווספת לתמיסת ה-RNA הסופית. השלב האחרון הוא לנקות בזהירות את להבי ההומוגנייזר על ידי הסרת כל גושי הרקמה שנתפסו בלהבים, ולאחר מכן ביצוע סדרה של שטיפות אתנול ומים. בסופו של דבר, הליך זה מאפשר בידוד של RNA עבור לבלב עכבר עם מספר שלמות RNA גדול משבע שישמש לניתוח ביטוי גנים שגרתי.שמי טום שמידט ואני עובד עם RNA כבר למעלה מ-20 שנה, ובכל הזמן הזה לא חוויתי שום דבר קשה כמו בידוד RNA עם שלמות גבוהה ללבלב העכבר. הטכניקה שאנו הולכים להראות לכם היא שפותחה עבור לבלב עכבר, אך למעשה אין סיבה שלא ניתן יהיה להשתמש בה עבור מגוון רקמות אחרות, כולל רקמות מתאים אנושיים, קווי תאים או רקמות אחרות מעכבר, כולל רקמות עשירות בנוקלאז צלעות כמו הטחול. שימוש בהצעות בפרוטוקול זה יאפשר לך לבודד RNA עם שלמות גבוהה מלבלב העכבר.זה יכול לשמש עבור יישומים רבים במורד הזרם כגון QPCR, מערכי ביטוי גנים או RNA-Seq. אולה אלגמל. סטודנט בכיר לתואר שני במעבדה שלי, ידגים טכניקה זו לאחר המתת חסד של העכבר כמתואר בפרוטוקול הטקסט.אבטח את הפגר על ידי ניקוב ארבע הכפות של כל אחת מבעלי החיים למשטח ישר באמצעות מחטים היפודרמיות בגודל 25 באמצעות מכשירים כירורגיים סטריליים. חותכים את החלק האמצעי של העכבר פתוח ומסירים במהירות את הלבלב מהעכבר. השתמש במלקחיים כדי להחזיק את הלבלב ולחתוך אותו מהטחול והמעי הדק בעזרת מספריים קפיציים.היזהר לא למתוח את הלבלב במהלך ההסרה מהעכבר. שיבוש של הרקמה עלול לשחרר ריבונוקלאז. הכניסו את כל הלבלב לצינור של 50 סנטימטר מעוקב המכיל שמונה מיליליטר של מגיב ליזיס קר כקרח.מכסים את הצינור ומנערים לזמן קצר כדי לטבול את הרקמה במגיב ומיד להמשיך לשלב הבא ללא דיחוי. לאחר מכן, הומוגניזציה של הלבלב למשך חמש שניות. חשוב ללחוץ את להבי ההומוגנייזר לתחתית צינור הצנטריפוגה כדי לאפשר משיכת הרקמה לתוך הלהבים להומוגניזציה יעילה.כדי להסיר רקמה לא מעוכלת, העבירו שני מיליליטר של ריאגנט ליזה המכיל את הלבלב הליזי לצינור מיקרו צנטריפוגה של שני מיליליטר. אסוף שני צינורות מיקרו צנטריפוגות של הומוגנט לכל צנטריפוגה מבודדת בארבע מעלות צלזיוס, 12,000 פעמים G למשך חמש דקות כדי לגלול את הרקמה הלא מעוכלת. זהו שלב קריטי שכן העברת רקמה לא מעוכלת לתמיסות הבאות של RNA ככל הנראה תזהם את הדגימה בריבונוקלאז.נקה את להבי ההומוגנייזר על ידי הנחתם ב -10 מיליליטר של 70% אתנול. הפעל את ההומוגנייזר למשך כ-20 שניות כדי להסיר את כל גושי הרקמה שעלולים להיתפס בלהבים. לאחר מכן השתמש בקצה פיפטה של 200 מיקרוליטר כדי להסיר את כל החלקים שנותרו בלהבי ההומוגנייזר.נקה שוב את להבי ההומוגנייזר במים, מפעיל RNA סינתרן כללי ואתנול 70%. לבסוף, יבש את פיר ההומוגנייזר עם מגבון קים נקי. העבירו מיליליטר אחד של ה- SNA לצינור מיקרו צנטריפוגה של שני מיליליטר.הניחו את כל הצינורות המכילים הומוגנט על קרח רטוב תוך כדי המשך לשלב הבא. המשך עם בידוד ה-RNA מיד ואחסן את צינור השכפול במינוס 80 מעלות צלזיוס לשימוש עתידי. השלך את מגיב הליזיס שנותר לתוך מיכל פסולת כימית מתאים.הסעיף הבא משתמש בערכת טיהור RNA. היתרון של ערכת הטיהור הוא שהיא תבודד את ה-RNA הכולל, כולל RNA קטן. התחל בבידוד על ידי הוספת 200 מיקרוליטר כלורופורם לתמיסת ההומוגנאט.יש לסגור את השפופרת ולנער נמרצות ביד למשך 15 שניות. לאחר מכן הניחו לצינור לעמוד בטמפרטורת החדר למשך שתיים-שלוש דקות לאחר צנטריפוגה למשך 15 דקות בטמפרטורה של 12, 000 פעמים G וארבע מעלות צלזיוס. העבירו את השכבה המימית העליונה לצינור מיקרו צנטריפוגה.הוסף 1.5 נפחים של איזופרופנול וערבב היטב על ידי פיפטינג למעלה ולמטה מספר פעמים. העבירו עד 700 מיקרוליטר מהדגימה לעמוד סיבוב המונח בצינור איסוף של שני מיליליטר. סגור את המכסה והצנטריפוגה ב 8, 000 פעמים G למשך 15 שניות בטמפרטורת החדר ולאחר מכן השליך את הזרימה.לאחר מכן, הוסף 700 מיקרוליטר של RWT חיץ לעמודת הסיבוב ולצנטריפוגה. כמו קודם, השליכו את הזרימה דרך פיפטה 500 מיקרוליטר של RPE חיץ לתוך עמוד הסיבוב והצנטריפוגה שוב כדי לשטוף את העמוד. לאחר השלכת הזרימה, הוסף עוד 500 מיקרוליטר של RPE חיץ לצנטריפוגת עמוד הסיבוב למשך שתי דקות ב-8,000 פעמים G.To לייבש את העמודה, להעביר את עמוד הסיבוב לפיפטה של צינור מיקרו צנטריפוגה של 1.5 מיליליטר 100 מיקרוליטר מים חופשיים של גרעין הצלעות ישירות על צנטריפוגת קרום עמוד הסיבוב למשך דקה אחת ב-8, 000 פעמים G כדי להוציא, את ה-RNA.לאחר מכן הוסף מיקרוליטר אחד של מעכב RNA לתמיסת ה-RNA והמשך לקבוע את שלמות ה-RNA באמצעות ניתוח אלקטרופורזה נימית כמתואר בהשוואת פרוטוקול הטקסט של מספר שלמות ה-RNA או RIN של RNA שבודד מלבלב העכבר מגלה מתאם ישיר בין נפח ריאגנט הליזיס המשמש בהומוגניזציה לבין שלמות ה-RNA. התוצאות מצביעות על כך שיש להשתמש בשמונה מיליליטר של ריאגנט ליזה בפרוטוקול זה, מעכב ריבונוקלאז נוסף לתמיסה המימית של RNA ושלמות ה-RNA הושוותה לאחר הפשרת הקפאה. ה-RIN לתמיסה של RNA עם מעכב היה 7.3 פלוס או מינוס 0.15 בהשוואה ל-2.9 פלוס או מינוס 0.65 עבור תמיסה שלא הכילה מעכב כדי לבחון את האפשרות שהפשרה חוזרת של הקפאה תפגע במעכב הריבונוקלאז ותהפוך אותו ללא יעיל.נבדקה תמיסה של RNA המכילה מעכב ריבונוקלאז. תמיסות ה-RNA שהוקפאו והופשרו עד חמש פעמים עדיין ייצרו RIN של שבע ומעלה. בעוד שהתמיסות שהוקפאו והופשרו שש פעמים או יותר ייצרו RIN מתחת לשבעה ראשוניים אקראיים, CDNA סונתז מה-RNA והביטוי של שלושה גנים לניהול משק בית נמדד על ידי QPCR.באמצעות טכניקות סטנדרטיות, הנתונים מאמתים שימוש מוצלח ב-RNA של לבלב עכבר בטכניקה סטנדרטית של ביולוגיה מולקולרית. לאחר הכשרה מתאימה, סטודנטים לתואר שני ופוסט-דוקטורנטים אמורים להיות מסוגלים להשלים טכניקה זו תוך כ-30 דקות. ואני רק רוצה לספר לכם קצת על האופן שבו אנחנו משתמשים בו.אנו חוקרים מודלים של עכברים טרנסגניים של סרטן הלבלב ואנו משתמשים בטכניקה זו כדי לבודד RNA. ואז כשנקבל את הרנ"א, נחקור את ביטוי הגנים של מיקרו-רנ"א בבעלי חיים אלה.

rna-isolation-from-mouse-pancreas-a-ribonuclease-rich-tissue

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

הלבלב Murine איילט בידוד

תיאור מפורט של בידוד איון עכבר מתואר באמצעות הטכניקה של cannulation באתר הלבלב ductal וטפטוף של שילוב של מטוהר collagenase ופרוטאז הניטראלי.

העכבר איילט בידוד נגרהנס באמצעות שילוב של collagenase המטוהר ופרוטאז הניטראלי

אנו מציגים כאן פרוטוקול לבידוד איים ממודל העכבר של סוכרת מסוג 2, Leprdb ופרטים על בדיקת תאים חיים למדידת הפרשת אינסולין מאיים שלמים המשתמשת במיקרוסקופ 2 פוטונים.

Lepr<sup&gt; Db</sup&gt; עכבר דגם של סוכרת מסוג 2: בידוד לבלב וLive- תא 2-פוטון הדמיה של איי שלמים

מבחני מושבה במבחנה כדי לזהות עצמית והתחדשות והבחנה של ובתאים מבודדים לבלב בעכברים בוגר הם המציאו. מבחנים אלה, אבות לבלב להצמיח מושבות תאים בחלל 3 ממדים במדיום methylcellulose המכיל מוצק למחצה. פרוטוקולים לטיפול תאים בודדים ואפיון של מושבות בודדות מתוארים.

מבחני מושבת Vitro לאפיון ובתאי Tri-עצמה מבודדת מלבלב Murine למבוגרים

אנו מתארים פרוטוקול בזאת לבידוד איים שלמים מעכברים בילוד. Pancreata היו מעוכל חלקית עם collagenase, ואחריו כביסה בחירה ידנית. 20 - 80 אשכולות איון ניתן להשיג לכל לבלב מעכברים שזה עתה נולדו, אשר מתאימים מספר מחקרי איון.

בידוד יעיל של איי פונקציונלית מן היילודים עכבר לבלב

זה פרוטוקול בידוד של איון תיאר תוואי הרומן של הזרקה הקולגן כדי לעכל את רקמת אקסוקרינית הליך מעבר הדרגתי פשוטה כדי לטהר את איונים מעכברים. זה כרוך בעיכול אנזימטי, הפרדת הדרגתי/טיהור, ואיסוף ביד איון. בידוד מוצלח יכול להניב 250 – 350 באיכות גבוהה, באופן מלא של איונים לכל עכבר.

פרוטוקול פשוט יעילות גבוהה לבידוד איון הלבלב של עכברים

אנו מתארים שיטה בידודו של תאים האנדוקרינית הלבלב עובריים, neonatal ופוסט ואחריו רצפי RNA בתא יחיד. שיטה זו מאפשרת ניתוח של השושלת האנדוקרינית הלבלב פיתוח, תא dynamics הטרוגניות, transcriptomic.

Transcriptomic תא בודד ניתוחים של תאים בלבלב האנדוקרינית העכבר

כאן, אנו מתארים את immunoprecipitation של ריבוזומים ו-RNA הקשורים מאוכלוסיות לבחור של בוגרים זכר תאים הנבט באמצעות מערכת ריבוtag. הרבייה אסטרטגי ולimmunoprecipitation התוצאה הנקייה, התוצאות להתרבות להודיע על תא הנבט translatome ולספק תובנה לתוך מנגנונים של פנוטיפים מוטנטים.

ריבותג Immunoprecipitation בתאי הנבט של העכבר הגברי

הטוהר והיושרה של ה-RNA המבודד הוא צעד חיוני בהתלות RNA. כאן, אנו מציגים שיטה מעשית, מהירה וזולה כדי לחלץ RNA מכמות קטנה של רקמת הלבלב שלא ניזוקה.

מיצוי RNA מהיר וחסכוני של רקמת הלבלב חולדה

פרוטוקול זה מתאר את הבידוד של תאי אנדותל עכבר מלבלב שלם.

בידוד תאי אנדותל של לבלב עכבר

מחקר זה פיתח שיטה פשוטה לחילוץ יעיל של איים ראשוניים תפקודיים ותאי אקינר מהלבלב בעכבר, ומציע כלי חשוב לחקר תקשורת בין-תאית בפתוגנזה של סוכרת מונעת מדלקת לבלב חריפה.

שיטה פשוטה ומהירה לבידוד סימולטני של איים ראשוניים ותאי אצינר ראשוניים בלבלב מעכברים

למדו לבודד RNA באיכות גבוהה מלבלב עכבר עשיר בריבונוקלאזות. השיטה מבטיחה RNA עם מספר שלמות גבוה מ-7 לניתוח ביטוי גנים שגרתי.

בידוד RNA מן העכבר לבלב: רקמות ribonuclease עשיר

גלה סרטונים נוספים