Name: הידרוגל Nanoparticle קציר של פלזמה או שתן לגילוי חלבונים שפע נמוך (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-08-07T20:45:00.000+00:00
Duration: 10 min 5 s
Description: גלו שיטה לקציר וריכוז ביומרקרים בנפח נמוך מנוזלי גוף באמצעות ננו-חלקיקי הידרוג'ל פונקציונליים. שיטה זו משפרת רגישות זיהוי בבדיקות חלבון סטנדרטיות ומאפשרת אבחון מדויק יותר.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

מייקל הנרי, אוניברסיטת העיר דבלין, באדיבותו סייע באיסוף הנתונים וניתוח שמוצג באיור 5. עבודה זו נתמכה בחלקה על ידי (1) אוניברסיטת ג&#39;ורג מייסון, (2) האיטלקי IstitutoSuperiore di Sanita &#39;במסגרת איטליה / ארה&quot;ב הסכם שיתוף פעולה בין משרד בריאות האמריקאי ולשירותי אנוש, אוניברסיטת ג&#39;ורג מייסון, והמשרד האיטלקי לבריאות הציבור, (3) NIH, מענקי תכנית IMAT 1R21CA137706-01 ו1R33CA173359-01 לLAL, ו( 4) קרס Nanosciences, Inc .

פלזמה ובשתן אנושיים נאספו מתורמים מתנדבים בריאים, עם כתב הסכמה מדעת, הבאים באוניברסיטת ג&#39;ורג מייסון מוסדי המועצה לביקורת שאושרה פרוטוקולים. תורמים חולקו שווים בשווים בין זכרים ונקבות קווקזי בין גילאי 25 ו42. דוגמאות נותחו בנפרד ולא אספו. .1 Nanoparticle עיבוד דגימות סרום או פלזמה סמנים ביולוגיים בשפע פוטנציאל נמוך בפלזמה נלכדים, בפתרון, עם חלקיקי הידרוג&#39;ל. החלקיקים מתווספים לפלזמה, מודגרות, מופרדת על ידי צנטריפוגה, שטף, והחלבונים שנתפסו הם eluted. חלבוני eluted מיובשים תחת זרימת חנקן עבור סידור במורד הזרם המוני ספקטרומטריית והזדהות. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל 500 μl של סרום 1: 2 עם 50 מ&quot;מ TrisHCl pH 7 (500 סרום μl + 500 μl TrisHCl) בצינור microcentrifuge. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 500 μL (NIPAm / AAC) nanop ליבה של פולימאמרים. דגירה של 15 דקות ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספין המדגם ב 16,100 XG, 25 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות בצנטריפוגה מצוידת בהרוטור קבוע זווית. להסיר ולסלק supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 500 thiocyanate μl נתרן (25 מ&quot;מ) לגלולה. Resuspend חלקיקים על ידי מרץ pipetting למעלה ולמטה מספר פעמים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספין המדגם ב 16,100 XG, 25 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות בצנטריפוגה עם הרוטור זווית קבוע. להסיר ולסלק supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 500 μl מים MilliQ לגלולת החלקיק. Resuspend חלקיקים על ידי מרץ pipetting למעלה ולמטה מספר פעמים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספין המדגם ב 16,100 XG, 25 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות בצנטריפוגה עם הרוטור זווית קבוע. להסיר ולסלק supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן חיץ elution טרי: הוסף 700 μl אצטוניטריל 300 אמוניום הידרוקסיד μl בצינור נקי. זהירות: הידרוקסיד אמוניום הוא מאכל. השתמש עם אוורור מתאים. הערה: חיץ elution חייב להיות הכנהared מייד לפני השימוש. אל תאחסן את חיץ elution. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 300 μl של חיץ elution לגלולת החלקיק. Resuspend חלקיקים על ידי מרץ pipetting למעלה ולמטה מספר פעמים. דגירה של 15 דקות ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספין המדגם ב 16,100 XG, 25 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות בצנטריפוגה עם הרוטור זווית קבוע. הסר ולשמור את eluate בצינור נקי, שכותרתו microcentrifuge. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלבים 1.9-1.10. לשלב את שני eluates לתוך צינור microcentrifuge אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ייבש את eluates תחת זרימת חנקן בסעפת מאייד חנקן ב42.1 ° C, עם זרימת אוויר מוגדרת 8 (איור 2F). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחסן את eluate המיובש ב RT לO / אחסון N, או ב -20 מעלות צלזיוס עבור אחסון לטווח ארוך, לפני ספקטרומטריית מסה, מערבי סופג, או מבחני ELISA (אופציונליים). </li></ol> .2 עיבוד Nanoparticle של דגימות שתן שתן נורמלי מכיל פחות מ 30 מ&quot;ג / ד&quot;ל חלבון ופחות מ 1 + דם. עם זאת, מחלות רבות / תנאים עשויות לשנות את הרמות נורמליות של חלבון בשתן ודם של. כדי לסייע בקביעת הנפח האופטימלי של חלקיקים כדי להוסיף לדגימת השתן, בדיקת שתן מבוצעת לפני קציר חלקיק. סמנים ביולוגיים שתן עשויים להתקיים בריכוזים נמוכים מאוד, שעשויה לדרוש אופטימיזציה של היחס של חלקיקים לנפח שתן. הליך זה מתאר את קצירת חלקיק של דגימות שתן לניתוח כתם מערבי במורד הזרם. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף דגימות שתן בכוס פלסטיק נקייה, יבשה. היקף מינימאלי 22 מ&quot;ל נדרש. שתן חנות דגימות ב -80 ° C עד מוכן לנתח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להפשיר את השתן הקפוא ב RT או על 4 מעלות CO / N. מערבבים בקצרה על מיקסר מערבולת. יוצקים לפחות 22 מ&quot;ל של שתן לתוך צינור פוליפרופילן תחתון 50 מ&quot;ל חרוטי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספין השתן בצנטריפוגה עם הרוטור את הנדנדה ב3,700 XG במשך 15 דקות. למזוג השתן, מבלי להפריע גלולה, לpolypr תחתון 50 מ&quot;ל חרוטי נקיצינור opylene. זורק את הכדור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע בדיקת שתן באמצעות רצועה רב אנליטי &quot;מדיד שתן&quot; מגיב. הערה: לאחסן את הרצועות מגיב במכל סגור היטב הרחק מאור שמש ולחות 17, 18 ישירים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את הרצועה מגיב, עם הפנים כלפי מעלה, על מגבת נייר נקיה ויבשה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בפיפטה חד פעמית כדי לשאוב 1 מ&quot;ל של השתן מוכן בשלב 2.3. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להגדיר טיימר למשך 2 דקות, אבל לא להפעיל אותו. מהירות לוותר 1 - 2 טיפות של שתן על כל משטח בדיקה של הרצועה מגיב. מייד להתחיל את הטיימר. הערה: אל להטביע את הרצועה מגיב ישירות במכל השתן. מחווני צבע / הכימיים ברצועה מגיב עלולים לדלוף החוצה של הרצועה מגיב לתוך מיכל השתן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזמן מצויינים על גבי מיכל הרצועה מגיב, רשום את התוצאות איכותיות עבור analytes השונים ברצועה מגיב על ידי השוואת הצבע של הרצועות מגיב פרט לאינדיקה בצבעים המקבילהtors על המכל מגיב. תוצאות שתן נורמליות אופייניות הן: (רגילות או שליליות) לדם, חלבון, לויקוציטים, ניטריט, גלוקוז, קטון, בילירובין, וurobilinogen; pH שתן (5.5-7.0); משקל סגולי (1.001-1.020). הערה: רמות חלבון גבוה בדגימת שתן עשויות להתחרות עם החלבון של עניין לאתרי קישור על חלקיקים. על מנת למקסם את קצירת חלבון עם חלקיקים, חלקיק הנפח / יחס נפח השתן יכול להיות מותאם לכל אחד תחרות גבול מחלבונים שפע גבוהים, או יכול להיות מותאם למסוק חלבונים שקיימים בריכוזים נמוכים מאוד. אם ערך חלבון בשתן הוא 1+ או גדול יותר, להוסיף כרכי 2x של חלקיקים בשלב 2.5 להלן. אם אנליטי של עניין הוא חלבון נפוץ מאוד נמוך, ייתכן שיהיה צורך להגדיל את ההיקף של חלקיקים עד 2 מ&quot;ל (איור 3). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברה 20 מ&quot;ל של השתן הבהיר מצעד 2.3 לתוך צינור פוליפרופילן נקי 50 מ&quot;ל תחתון חרוטי. האם לאלהפריע כל פסולת / גלולה שיכולה להיות בחלק התחתון של צינור השתן. הוסף 200 μl של חלקיקים לדגימת שתן 20 מ&quot;ל. מערבבים בקצרה על מיקסר מערבולת. הערה: אם ערך חלבון בשתן הוא 1+ או גדול יותר, להוסיף 400 μl של חלקיקים ל20 מ&quot;ל שתן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה את תערובת שתן / חלקיק ל30 דקות ב RT, ללא נדנדה / ערבוב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספין ההשעיה שתן / חלקיק בצנטריפוגה מצוידת ברוטור את נדנדה ב3,700 XG עבור 10 דקות. הערה: אם גלולה היא לא צנטריפוגה הבאה נראית לעין, לסובב את הדגימות ל2 נוספות - 7 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להסיר ולסלק supernatant. מוסיף המים 500 μl MilliQ לגלולת החלקיק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend חלקיקים על ידי מרץ pipetting למעלה ולמטה מספר פעמים. מעבירים את פתרון nanoparticle לצינור microcentrifuge 1.5 מ&quot;ל נקי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספין חלקיקים בצנטריפוגה מצוידת בהרוטור קבוע זווית ב16,100 XG 10 דקות. הערה: אם גלולה היא לא מספק מתה גלויגעיית צנטריפוגה, לסובב את הדגימות ל2 נוספות - 7 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להסיר ולסלק supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלבים 2.8 ו2.11 (פעמיים) עם 200 μl 18 MilliQ מים כדי לשטוף את חלקיקים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן חיץ elution טרי: הוסף 970 μl אצטוניטריל ל30 אמוניום הידרוקסיד μl בצינור נקי. זהירות: הידרוקסיד אמוניום הוא מאכל. השתמש עם אוורור מתאים. הערה: חיץ elution חייב להיות מוכן מייד לפני השימוש. אל תאחסן את חיץ elution. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף חוצץ elution 20 μl לגלולת החלקיק. Resuspend חלקיקים על ידי מרץ pipetting למעלה ולמטה מספר פעמים. דגירה של 15 דקות ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספין דגימות החלקיק ב16,100 XG 10 דקות. הסר ולשמור את supernatant ב, צינור microcentrifuge 1.5 מ&quot;ל נקי. אל תפריע לגלולת החלקיק. זורק את הכדור בפסולת הביולוגית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את הדגימות במעמד במנדף הכימי. פתח את הכובעים, וincubate ב RT למשך 30 דקות. לחלופין, למקם את הדגימות תחת זרימת חנקן ב40 מעלות צלזיוס עד יבשה (1 - שעה 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 15 μl חיץ טריס-גליצין SDS מדגם (2x) לדגימות. חום ב100 מעלות צלזיוס בגוש חום יבש ל5 דקות עם הכובעים פתוחים או עד שהנפח שנותר בצינור היא לא יותר מ 20 μl. שים לב: אין להשתמש באמבט מים רותח. לחות מאמבט המים תהיה למנוע אידוי של החיץ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את הכובע על הצינורות. הסר את הצינורות מהגוש החום. המדגם יכול להיות מאוחסן ב-80 מעלות צלזיוס או בשימוש באופן מיידי לניתוח כתם מערבי במורד הזרם. </li></ol>

<ol><li>Aebersold, R., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+spectrometry-based+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mass spectrometry-based proteomics.</a> Nature. 422 (6928), 198-207 (2003).</li>
<li>Gerszten, R. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Challenges+in+translating+plasma+proteomics+from+bench+to+bedside%3A+update+from+the+NHLBI+Clinical+Proteomics+Programs%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Lung+Cell+Mol+Physiol%22%5BJournal%5D)">Challenges in translating plasma proteomics from bench to bedside: update from the NHLBI Clinical Proteomics Programs.</a> Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 295 (1), L16-L22 (2008).</li>
<li>Merrell, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+low-abundance%2C+low-molecular-weight+serum+proteins+using+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomol+Tech%22%5BJournal%5D)">Analysis of low-abundance, low-molecular-weight serum proteins using mass spectrometry.</a> J Biomol Tech. 15 (4), 238-248 (2004).</li>
<li>Petricoin, E. F., Belluco, C., Araujo, R. P., Liotta, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+blood+peptidome%3A+a+higher+dimension+of+information+content+for+cancer+biomarker+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">The blood peptidome: a higher dimension of information content for cancer biomarker discovery.</a> Nat Rev Cancer. 6 (12), 961-967 (2006).</li>
<li>Camerini, S., Polci, M. L., Liotta, L. A., Petricoin, E. F., Zhou, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+the+selective+isolation+and+enrichment+of+carrier+protein-bound+low-molecular+weight+proteins+and+peptides+in+the+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics+Clin+Appl%22%5BJournal%5D)">A method for the selective isolation and enrichment of carrier protein-bound low-molecular weight proteins and peptides in the blood.</a> Proteomics Clin Appl. 1 (2), 176-184 (2007).</li>
<li>Geho, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fractionation+of+serum+components+using+nanoporous+substrates%5BTitle%5D)+AND+%22Bioconjug+Chem%22%5BJournal%5D)">Fractionation of serum components using nanoporous substrates.</a> Bioconjug Chem. 17 (3), 654-661 (2006).</li>
<li>Sennels, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+analysis+of+human+blood+serum+using+peptide+library+beads%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Proteomic analysis of human blood serum using peptide library beads.</a> J Proteome Res. 6 (10), 4055-4062 (2007).</li>
<li>Zheng, X., Baker, H., Hancock, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+the+low+molecular+weight+serum+peptidome+using+ultrafiltration+and+a+hybrid+ion+trap-Fourier+transform+mass+spectrometer%5BTitle%5D)+AND+%22J+Chromatogr+A%22%5BJournal%5D)">Analysis of the low molecular weight serum peptidome using ultrafiltration and a hybrid ion trap-Fourier transform mass spectrometer.</a> J Chromatogr A. 1120 (1-2), 173-184 (2006).</li>
<li>Marshall, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Processing+of+serum+proteins+underlies+the+mass+spectral+fingerprinting+of+myocardial+infarction%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Processing of serum proteins underlies the mass spectral fingerprinting of myocardial infarction.</a> J Proteome Res. 2 (4), 361-372 (2003).</li>
<li>Fredolini, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concentration+and+Preservation+of+Very+Low+Abundance+Biomarkers+in+Urine%2C+such+as+Human+Growth+Hormone+%28hGH%29%2C+by+Cibacron+Blue+F3G-A+Loaded+Hydrogel+Particles%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Res%22%5BJournal%5D)">Concentration and Preservation of Very Low Abundance Biomarkers in Urine, such as Human Growth Hormone (hGH), by Cibacron Blue F3G-A Loaded Hydrogel Particles.</a> Nano Res. 1 (6), 502-518 (2008).</li>
<li>Luchini, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Smart+hydrogel+particles%3A+biomarker+harvesting%3A+one-step+affinity+purification%2C+size+exclusion%2C+and+protection+against+degradation%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Lett%22%5BJournal%5D)">Smart hydrogel particles: biomarker harvesting: one-step affinity purification, size exclusion, and protection against degradation.</a> Nano Lett. 8 (1), 350-361 (2008).</li>
<li>Patanarut, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+and+characterization+of+hydrogel+particles+containing+Cibacron+Blue+F3G-A%5BTitle%5D)+AND+%22Colloids+Surf+A+Physicochem+Eng+Asp%22%5BJournal%5D)">Synthesis and characterization of hydrogel particles containing Cibacron Blue F3G-A.</a> Colloids Surf A Physicochem Eng Asp. 362 (1-3), 8-19 (2010).</li>
<li>Tamburro, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multifunctional+core-shell+nanoparticles%3A+discovery+of+previously+invisible+biomarkers%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Chem+Soc%22%5BJournal%5D)">Multifunctional core-shell nanoparticles: discovery of previously invisible biomarkers.</a> J Am Chem Soc. 133 (47), 19178-19188 (2011).</li>
<li>Anderson, N. L., Anderson, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+human+plasma+proteome%3A+history%2C+character%2C+and+diagnostic+prospects%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">The human plasma proteome: history, character, and diagnostic prospects.</a> Mol Cell Proteomics. 1 (11), 845-867 (2002).</li>
<li>Fredolini, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoparticle+technology%3A+amplifying+the+effective+sensitivity+of+biomarker+detection+to+create+a+urine+test+for+hGH%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Test+Anal%22%5BJournal%5D)">Nanoparticle technology: amplifying the effective sensitivity of biomarker detection to create a urine test for hGH.</a> Drug Test Anal. 1 (9-10), 447-454 (2009).</li>
<li>Longo, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Core-shell+hydrogel+particles+harvest%2C+concentrate+and+preserve+labile+low+abundance+biomarkers%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Core-shell hydrogel particles harvest, concentrate and preserve labile low abundance biomarkers.</a> PLoS One. 4 (3), e4763(2009).</li>
<li>Luchini, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoparticle+technology%3A+addressing+the+fundamental+roadblocks+to+protein+biomarker+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Nanoparticle technology: addressing the fundamental roadblocks to protein biomarker discovery.</a> Curr Mol Med. 10 (2), 133-141 (2010).</li>
<li>Luchini, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+Analyte+Harvesting+Nanoparticle+Technology+to+the+Measurement+of+Urinary+HGH+in+Healthy+Individuals%5BTitle%5D)+AND+%22J+Sports+Med+Doping+Stud%22%5BJournal%5D)">Application of Analyte Harvesting Nanoparticle Technology to the Measurement of Urinary HGH in Healthy Individuals.</a> J Sports Med Doping Stud. 2 (6), (2012).</li>
<li>Eslami, A., Lujan, J., Western, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((blotting%3A+sample+preparation+to+detection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">blotting: sample preparation to detection.</a> J Vis Exp. (44), (2010).</li>
<li>Gallagher, S., Chakavarti, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunoblot+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Immunoblot analysis.</a> J Vis Exp. (16), (2008).</li>
<li>Penna, A., Cahalan, M., , <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Western+Blotting+using+the+Invitrogen+NuPage+Novex+Bis+Tris+minigels%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Western Blotting using the Invitrogen NuPage Novex Bis Tris minigels.</a> J Vis Exp. (7), 264(2007).</li>
<li>Bosch, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+urinary+human+growth+hormone+%28hGH%29+using+hydrogel+nanoparticles+and+isoform+differential+immunoassays+after+short+recombinant+hGH+treatment%3A+preliminary+results%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pharm+Biomed+Anal%22%5BJournal%5D)">Analysis of urinary human growth hormone (hGH) using hydrogel nanoparticles and isoform differential immunoassays after short recombinant hGH treatment: preliminary results.</a> J Pharm Biomed Anal. 85, 194-197 (2013).</li>
<li>Fredolini, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigation+of+the+ovarian+and+prostate+cancer+peptidome+for+candidate+early+detection+markers+using+a+novel+nanoparticle+biomarker+capture+technology%5BTitle%5D)+AND+%22AAPS+J%22%5BJournal%5D)">Investigation of the ovarian and prostate cancer peptidome for candidate early detection markers using a novel nanoparticle biomarker capture technology.</a> AAPS J. 12 (4), 504-518 (2010).</li>
<li>Longo, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+biomarker+harvesting+nanotechnology+identifies+Bak+as+a+candidate+melanoma+biomarker+in+serum%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Dermatol%22%5BJournal%5D)">A novel biomarker harvesting nanotechnology identifies Bak as a candidate melanoma biomarker in serum.</a> Exp Dermatol. 20 (1), 29-34 (2010).</li>
<li>Luchini, A., Longo, C., Espina, V., Petricoin, E. F. 3rd, Liotta, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoparticle+technology%3A+Addressing+the+fundamental+roadblocks+to+protein+biomarker+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mater+Chem%22%5BJournal%5D)">Nanoparticle technology: Addressing the fundamental roadblocks to protein biomarker discovery.</a> J Mater Chem. 19 (29), 5071-5077 (2009).</li>
<li>Douglas, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+hydrogel+microparticles+to+sequester+and+concentrate+bacterial+antigens+in+a+urine+test+for+Lyme+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">The use of hydrogel microparticles to sequester and concentrate bacterial antigens in a urine test for Lyme disease.</a> Biomaterials. 32 (4), 1157-1166 (2010).</li>
<li>Prakash, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interlaboratory+reproducibility+of+selective+reaction+monitoring+assays+using+multiple+upfront+analyte+enrichment+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Interlaboratory reproducibility of selective reaction monitoring assays using multiple upfront analyte enrichment strategies.</a> J Proteome Res. 11 (8), 3986-3995 (2012).</li>
<li>Choi, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Implication+of+lipocalin-2+and+visfatin+levels+in+patients+with+coronary+heart+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Implication of lipocalin-2 and visfatin levels in patients with coronary heart disease.</a> Eur J Endocrinol. 158 (2), 203-207 (2008).</li>
<li>Hughes, A. D., Clunn, G. F., Refson, J., Demoliou-Mason, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Platelet-derived+growth+factor+%28PDGF%29%3A+actions+and+mechanisms+in+vascular+smooth+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Gen+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Platelet-derived growth factor (PDGF): actions and mechanisms in vascular smooth muscle.</a> Gen Pharmacol. 27 (7), 1079-1089 (1996).</li>
<li>Izycki, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serum+levels+of+IGF-I+and+IGF-II+in+patients+with+lung+cancer+during+chemotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Oncol%22%5BJournal%5D)">Serum levels of IGF-I and IGF-II in patients with lung cancer during chemotherapy.</a> Exp Oncol. 26 (4), 316-319 (2004).</li>
<li>Jalosinski, M., Karolczak, K., Mazurek, A., Glabinski, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effects+of+methylprednisolone+and+mitoxantrone+on+CCL5-induced+migration+of+lymphocytes+in+multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neurol+Scand%22%5BJournal%5D)">The effects of methylprednisolone and mitoxantrone on CCL5-induced migration of lymphocytes in multiple sclerosis.</a> Acta Neurol Scand. 118 (2), 120-125 (2008).</li>
<li>Kitazume, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+insights+into+beta-galactoside+alpha2%2C6-sialyltransferase+secretion+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Glycobiology%22%5BJournal%5D)">Molecular insights into beta-galactoside alpha2,6-sialyltransferase secretion in vivo.</a> Glycobiology. 19 (5), 479-487 (2009).</li>
<li>Saito, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increase+in+hepatic+NKT+cells+in+leukocyte+cell-derived+chemotaxin+2-deficient+mice+contributes+to+severe+concanavalin+A-induced+hepatitis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Increase in hepatic NKT cells in leukocyte cell-derived chemotaxin 2-deficient mice contributes to severe concanavalin A-induced hepatitis.</a> J Immunol. 173 (1), 579-585 (2004).</li>
<li>Struyf, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PARC%2FCCL18+is+a+plasma+CC+chemokine+with+increased+levels+in+childhood+acute+lymphoblastic+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">PARC/CCL18 is a plasma CC chemokine with increased levels in childhood acute lymphoblastic leukemia.</a> Am J Pathol. 163 (5), 2065-2075 (2003).</li>
<li>Michael, I. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+tissue+kallikrein+5+is+a+member+of+a+proteolytic+cascade+pathway+involved+in+seminal+clot+liquefaction+and+potentially+in+prostate+cancer+progression%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Human tissue kallikrein 5 is a member of a proteolytic cascade pathway involved in seminal clot liquefaction and potentially in prostate cancer progression.</a> J Biol Chem. 281 (18), 12743-12750 (2006).</li>
</ol>

בנג'מין אספינה הוא עובד של Ceres Nanosciences, Inc. המייצרת ריאגנטים המשמשים במאמר זה. לאנס ליוטה, אלסנדרה לוצ'יני ווירג'יניה אספינה מחזיקים בפטנטים (פטנט אמריקאי 7,935,518 ו/או 8,497,137) על טכנולוגיית הננו-חלקיקים המשמשת במאמר זה. כעובדי האוניברסיטה הם זכאים לקבל תמלוגים מהפטנטים הללו בהתאם למדיניות האוניברסיטה. לאנס ליוטה ואלסנדרה לוצ'יני הם בעלי מניות ב-Ceres Nanosciences ומכהנים במועצה המדעית המייעצת.

רלוונטיות קליני הוא חשב מדגם סרום או פלזמה להכיל נמוך שפע במחזור חלבונים ופפטידים אשר יכול לספק מקור מידע עשיר על מצבו של האורגניזם כולו. למרות ההבטחה של פרוטאומיקה סרום, יש שלושה חסמים פיסיולוגיים בסיסיים ורציניים סיכול גילוי סמן ביולוגי ותרגום לתועלת קלינית 10, 11, 16, 25. .1 סמנים ביולוגיים לאבחון חשובים עשויים להת...

למרות השלמת רצף הגנום האנושי, התקדמות משמעותית לא נעשתה בסמנים ביולוגיים לזיהוי ניבוי של מחלה בשלב מוקדם, או שמתאם עם תוצאה טיפולית, או הפרוגנוזה 1. אחת סיבות לחוסר ההתקדמות היא שרבים סמנים ביולוגיים שעלולים להיות משמעותיים קיימות בריכוז מתחת לגבול הגילוי של ספקטרומטריית מסה המוסכמת ופלטפורמות גילוי סמן ביולוגי אחרות. ספקטרומטריית מסה (MS) וניטור תגובה מרובה (MRM) יש רגישות זיהוי בדרך כלל גדול יותר מ50 ng / ml בעוד רוב analytes שנמדד על ידי immunoassays במעבדה נפילה קלינית בטווח שבין 50 pg / ml ו10 ng / ml . משמעות דבר היא כי סמנים ביולוגיים רבים, במיוחד בשלב המוקדם של מחלה יכולים לא להיות מזוהים על ידי MS הקונבנציונלי וMRM 2. בנוסף הנוכחות של חלבונים גבוה שפע כגון אלבומין ואימונוגלובולינים בנוזלים ביולוגיים מורכבים לעתים קרובות להסוות על ידי EXC מיליארדים פינמוך שפע ESS, חלבוני משקל מולקולריים נמוכים ופפטידים 3, 4. מסיבה זו מספר צעדי הכנה מדגם נדרשים לפני רצף ספקטרומטריית מסה והזדהות. צעד הכנה אחד כזה מעסיק הדלדול של חלבונים גבוה שפע עם עמודות דלדול זמינות מסחרי 5-8. לרוע המזל שלב זה מוביל להפחתה של התשואה של סמנים ביולוגיים מועמד בגלל שהם קשורים לעתים קרובות שאינם קוולנטית עם חלבונים נשאים שהוסרו. אתגר נוסף הוא מיוצג על ידי היציבות של סמנים ביולוגיים מועמד לשעבר vivo פעם אחת הדגימות שנאספו. חלבונים הם נושא לשפלה על ידי פרוטאזות אנדוגני או אקסוגני 9. חלקיקי הידרוג&#39;ל יכולים להתעלות מעל אתגרים קריטיים אלה על ידי הגברת ריכוז הסמן הביולוגי המשוערת לרמה בטווח של assay, תוך הגנה על החלבון מן השפלה 10-13. חשוב לציין הבLMW חלבונים בדם הם תערובת של חלבונים ללא פגע קטנים, כמו גם שברים של חלבונים גדולים. חלבונים המופקים מרקמות גדולות יותר מ60 kDa הם גדולים מדי כדי להיכנס לזרם הדם באופן פסיבי דרך הקרום במרתף של כלי דם, אבל הם יכולים להיות מיוצגים בדם כפפטידים או שברי חלבון 14. המטרה שלנו היא למדוד סמנים ביולוגיים חדשניים במחזור שיכול להיות מועמדים לגילוי מוקדם של מחלה, ריבוד מטופל לטיפול, ומעקב אחר התגובה לטיפול. חלקיקים שלנו נוצרו כדי לשלול באופן סלקטיבי נוגדנים גבוה שפע ואלבומין, בעת לכידתו זמנית חלבונים ופפטידים קטנים יותר ומתרכזים אותם ל100 פי תלוי בהתחלת הנפח. הקבוצה שלנו זיהתה שורה של צבעים אורגניים קטנים אשר יכול לפעול בהצלחה פיתיונות מולקולריים גבוהה כזיקה לחלבונים ופפטידים. הוא חשב חלבון צבען מחייב להיות בגלל שילוב של אינטראקציה הידרופובי ואלקטרוסטטיים. הטבעות ריחניות בצבע Interleave עם חלבונים באמצעות כיסים הידרופובי על פני השטח חלבון 11. הפיתיונות, תלוי בכימיה שלהם, להראות זיקה מסוימת לשיעורים נבחרים של analytes. הפיתיונות להתחרות עם החלבונים מובילים, כגון אלבומין, לחלבונים או פפטידים. חלבונים / פפטידים המשקל מולקולריים נמוכים נלכדו בחלקיקים. חלבוני משקל מולקולריים גבוהים כגון אלבומין ואימונוגלובולינים מנוע מלהיכנס לחלקיק בגלל יכולת הסנון בשל נקבובית המגבילה של הידרוג&#39;ל 11 (איור 1). חלקיקי הידרוג&#39;ל מסונתזים על ידי פילמור ממטרים ביוזמת persulfate אמוניום 11. N-isopropylacrylamide (NIPAm), שיתוף מונומרים של חומצה אקרילית (AAC) וallylamine (AA) וצולב מקשר N, N&#39;-Methylenebisacrylamide (BIS) מותר להגיב ב70 מעלות צלזיוס במשך 6 שעות בתנאים לדלל 11, 13. הזיקה גבוהה מחייבת חלבון של פולי (N-isopropylacrylamide-שיתוף אקריליק חומצה) (פולי (NIPAm-CO-AAC) nanoparticlesis מושגת על ידי קוולנטית שילוב צבעים המכיל אמינו (כלומר., צבעי sulfonatedanthraquinonetriazine) לחלקיקים דרך תגובת amidation בוצעה בממסים מימיים או אורגניים בהתאם למאפיינים הידרופילי / הידרופובי של הצבעים 11, 13 חילוף. Nucleophilic של הקבוצות האמינים בחלקיק עם אטום כלוריד של צבע anthraquinonetriazine מנוצל ליצירת פולי המכילים צבע (NIPAm -co-Allylamine) (AA) חלקיקים 11, 12. תהליך פילמור שני שלבים הוא מנוצל כדי ליצור חלקיקי הידרוג&#39;ל המכילים מעטפת חיצונית של חומצת vinylsulfonic (VSA) 11, 13. יכולים להיות מיושמים חלקיקי הידרוג&#39;ל לנוזלים ביולוגיים שונים, ובכלל זה כל דם, פלזמה, סרום, נוזל השדרתי, זיעה, ושתן. בצעד אחד, בפתרון, nanoparticles לבצע מהיר (תוך דקות) תפיסה וריכוז של משקל מולקולרי נמוך analytes 10, 11, 13, 15-18. חלבונים eluted לאחר מכן מהחלקיקים וזוהו באמצעות מערביים סופג 19-21, ספקטרומטריית 10, 11, 13, 15, 18, ​​22 המוני, 23, immunoassays / 10 ELISA, 11, 15, 18, ​​או microarray חלבון שלב הפוך 16, 24 מבחני. חלקיקים פונקציונליות עם פיתיון כימי, והצגת ארכיטקטורת פגז ליבה או ליבה, לכידה ולהתרכז חלבונים המבוססים על מאפייני physicochemical פיתיון / פגז. צבעים שונים שולבו בחלקיקים ולכן יהיו ללכוד תת שונה של חלבונים עם משתנה יעילות המבוססת על זיקת הצבע, pH של התמיסה, ונוכחות / היעדרות של מתחרות חלבונים גבוהים בשפע 13. יתר על כן, כמות חלקיקים ביחס להיקף הפתרון תשפיע על תשואת החלבון מהחלקיקים. היבטים אלה שלקציר nanoparticle הידרוג&#39;ל הם הפגינו באמצעות שלושה פיתיונות nanoparticle שונים לחלבוני קצירה מדגימות פלזמה שמכילות כמויות גדולות של חלבון, ומדגימות שתן שבדרך כלל לא מכילות כמויות גדולות של חלבון. בפרוטוקול זה אנו מדגימים קצירה וריכוז אלפא גורם נמק גידול (TNFα) מדגימות פלזמה באמצעות פולי (NIPAm-CO-AAC), midi (NIPAm / צבע), וחלקיקי קליפת core- (פולי (NIPAm-CO-VSA)) . חלקיקי midi (NIPAm / צבע) מוצגים להתרכז אנטיגן מיני Mycobacterium שנוסף לדגימות שתן אנושיות, לחקות אנשים נגועים שחפת Mycobacterium.

<table><tbody><tr><td>ננו-חלקיקי הידרוג'ל</td><td>Ceres Nanoscience</td><td>CS003</td><td>חלקיקי ESP NanoTrap</td></tr><tr><td>18 M&Omega;-cm מים</td><td></td><td></td><td>מסוג 1 ריאגנט מים Tris</td></tr><tr><td>HCl, 50 מ"מ pH 7.0</td><td>VWR</td><td>IC816116</td><td>50 מ"מ, pH 7</td></tr><tr><td>אצטוניטריל</td><td>BDH</td><td>BDH1103-4LP</td><td>זמין מ- VWR</td></tr><tr><td>אמוניום הידרוקסיד NH4OH</td><td>BDH</td><td>BDH3014</td><td>זמין מ-VWR, נבדק ב-28-30% NH3</td></tr><tr><td>נתרן תיוציאנט 25 מ"מ</td><td>Acros Organics</td><td>419675000</td><td>לדגימות סרום/פלזמה</td></tr><tr><td>רצועות ריאגנט שתן מולטי-אנליט</td><td>סימנס</td><td>2161</td><td>לדגימות שתן</td></tr><tr><td>Tris-Glycine SDS מאגר דגימה (2X)</td> <td>Life Technologies</td><td>LC2676</td><td>השתמש ב-RT כדי למנוע משקעים</td></tr> <tr><td>של SDSחממת אמבטיה יבשה (100 oC) עם בלוק חימום</td><td>Barnstead</td><td>11-715-125DQ</td><td>אין להחליף אמבט מים רותחים</td></tr><tr><td>סעפת מאייד חנקן</td><td>Organomation Associates</td><td>Microvap118</td><td>לדגימות סרום/פלזמה</td></tr><tr><td>צנטריפוגה, רוטור מתנדנד מסדרת</td><td>Sorvall</td><td>Legend</td><td>קיבולת צינור 50 מ"ל, צנטריפוגה rcf 3,700 x g</td></tr><tr><td>, רוטור זווית קבועה</td><td>Eppendorf</td><td>5424</td><td>קיבולת מיקרוצנטריפוגה 1.7 מ"ל, RCF 16,000 x G</td></tr><tr><td>50 מ"ל צנטריפוגה חרוטית&nbsp; צינורות</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>14-432-22</td><td>עם מכסי בורג לדגימות שתן</td></tr><tr><td>1.5 מ"ל צינורות מיקרוצנטריפוגה</td><td>אפנדורף</td><td>22363204</td><td></td></tr><tr><td>מערבל מערבולת</td><td>פישר סיינטיפיק פישר סיינטיפיק</td><td>50-949-755</td><td></td></tr><tr><td>טיימר</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>S04782</td><td>שניות/דקות</td></tr></tbody></table>

הידרוג&#39;ל nanoparticle קציר של פלזמה או שתן לגילוי חלבונים שפע נמוך

Hydrogel Nanoparticle Harvesting of Plasma or Urine for Detecting Low Abundance Proteins

גילוי סמן ביולוגי חדשני משחק תפקיד משמעותי במאמץ לספק גילוי מחלה יותר רגיש וספציפי. למרבה הצער רב סמנים ביולוגיים נמוך שפע שקיימים בנוזלים ביולוגיים לא ניתן לאתר בקלות עם ספקטרומטריית או immunoassays כי הם נמצאים בריכוז נמוך מאוד, הם יציבים, ולעתים קרובות הם רעולי פנים על ידי חלבונים גבוה שפע כגון אלבומין או אימונוגלובולינים המוניים. פיתיון המכיל פולי (N-isopropylacrylamide) (NIPAm) חלקיקים מבוססים מסוגלים להתגבר על מחסומים פיסיולוגיים אלה. בצעד אחד שהם מסוגלים ללכוד, להתרכז ולשמור על סמנים ביולוגיים מנוזלי גוף. analytes משקל מולקולרי הנמוך להיכנס לליבה של החלקיק ונתפס על ידי צבעים שונים אורגניים כימיים, המשמשים כפיתיונות חלבון זיקה גבוהה. חלקיקים הם מסוגלים להתרכז החלבונים של ריבית על ידי צווים שונים של גודל. גורם ריכוז זה מספיק כדי להעלות את רמת החלבון באופן שהחלבונים הם בתוךגבול גילוי של ספקטרומטרים הנוכחיים המוניים, מערבי סופג, וimmunoassays. ניתן מודגרות חלקיקים עם שפע של נוזלים ביולוגיים והם יכולים להעשיר מאוד את הריכוז של חלבוני משקל מולקולריים נמוכים ופפטידים ואילו בניכוי אלבומין וחלבונים במשקל מולקולרי גבוהים אחרים. הנתונים שלנו מראים כי הגברה של פי 10,000 בריכוז של אנליטי מסוים ניתן להשיג, מה שמאפשר ספקטרומטריית המסה וimmunoassays כדי לזהות סמנים ביולוגיים לגילוי בעבר.

גודל הידרוג'ל Nanoparticle ואחידות חלקיקי midi (NIPAm-AAC) שהופקו בתשואה גבוהה במיוחד ושחזור בין ובתוך קבוצות. יש לי החלקיקים יציבות colloidal טוב מאוד ב RT בזמן הנדרש עבור לכידה, אחסון, וelution של חלבונים (לפחות 48 hr), וממטרי חלקיק לא נצפו (איור 1) 11. יציבות colloidal עשויה להיות חשובה מאוד לספיגת חלבון / פפטיד מהיר על ידי חלקיקים. <p class="jove_content" style...

לא ניתן לזהות בקלות מספר סמנים ביולוגיים פתולוגיים בטכניקות הנוכחיות בגלל ריכוזם הנמוך בנוזלים ביולוגיים, נוכחותם של אנזימים מפרקים וכמויות גדולות של חלבונים בעלי משקל מולקולרי גבוה. ננו-חלקיקי הידרוג'ל מתפקדים כימית יכולים לקצור, לשמר ולרכז חלבונים בשפע נמוך המאפשרים זיהוי של סמנים ביולוגיים שלא ניתן היה לזהות בעבר.

הידרוג&#39;ל Nanoparticle קציר של פלזמה או שתן לגילוי חלבונים שפע נמוך

Novel biomarker discovery plays a crucial role in providing more sensitive and specific disease detection. Unfortunately many low-abundance biomarkers ...

המטרה הכוללת של הליך זה היא לקצור, לרכז ולשמר סמנים ביולוגיים בשפע נמוך ומשקל מולקולרי נמוך מנוזלים ביולוגיים בריכוזים מתאימים. עבור מבחני חלבון סטנדרטיים, זה מושג על ידי הוספת ננו-חלקיקי הידרוג'ל פונקציונליים כימית לנוזל הביולוגי, משקל מולקולרי נמוך. אנליטים נכנסים לליבת הננו-חלקיק ונלכדים על ידי צבעים כימיים אורגניים שונים, הפועלים כפיתיונות חלבון בעלי זיקה גבוהה.השלב השני הוא הפרדת החלקיקים מהנוזל הביולוגי על ידי צנטריפוגה. הננו-חלקיקים מרכזים את החלבונים המעניינים בכמה סדרי גודל. לאחר מכן נשטפים את הננו-חלקיקים במים כדי להסיר חלבונים זרים.השלב האחרון הוא לסלק את החלבונים שנלכדו מהננו-חלקיקים. בסופו של דבר, כתמים מערביים, ספקטרומטריית מסה או מבחני אמינו משמשים כדי להראות את הנוכחות או הריכוז של הסמנים הביולוגיים בשפע נמוך שלא ניתן היה לזהות בעבר. בדרך כלל, אנשים חדשים בשיטה זו יתקשו מכיוון שצריך לשטוף את הננו-חלקיקים ולהחיות אותם.מבלי לסתום את קצה הפיפט, הננו-חלקיקים אינם מחיים את ההשעיה באותה קלות כמו תא P.So עליך לזרום במרץ למעלה ולמטה על מנת להחיות כראוי את הננו-חלקיקים לאחר הדגירה הראשונה. עם ננו-חלקיקים, חשוב לשטוף את דפנות הצינור על מנת לאסוף שאריות ננו-חלקיקים שעלולות להיצמד לצינור. כדי לבצע עיבוד ננו-חלקיקים של דגימות סרום יש לדלל 500 מיקרוליטר של סרום אנושי אחד עד שניים עם 50 מילי-מולרי טריס, HCL pH שבע בצינור מיקרו צנטריפוגה.הוסף 500 מיקרוליטר של פולי ואיזופ פרופיל אקרילאמיד או פולי ניפאם קו-מונומרים של ננו-חלקיקי ליבה של חומצה אקרילית, ודגירה למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן סובב את הדגימה ב-16, 100 פעמים G ו-25 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. בצנטריפוגה המצוידת ברוטור זווית קבועה, הסר והשליך את ה-SUP natin לפני הוספת 500 מיקרוליטר של נתרן תיוציאנט למאכל לגלולה, השהה מחדש את הננו-חלקיקים על ידי פיפטינג נמרץ למעלה ולמטה מספר פעמים.סובב את הדגימה כמו קודם והשליך את הסופרנטנט לפני הוספת 500 מיקרוליטר של מילי-Q מים לכדור הננו-חלקיקים. שוב, החייאה משהה את הננו-חלקיקים על ידי פיפטינג נמרץ למעלה ולמטה מספר פעמים. לאחר שסובבתי את הדגימה שוב, היו לי 300 מיקרוליטר של אלוציאן טרי, חוצץ והשעיה מחדש בטכניקה המודגמת.דגירה למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר סיבוב אחרון של הדגימה, הסר ושמור את ה-EIT בצינור מיקרו צנטריפוגה נקי עם תווית. הוצא פעם שנייה ושלב את שני ה-EIT למיקרו צנטריפוגה אחת. שניים.לאחר מכן, יבש את ה-EITs תחת זרימת חנקן וסעפת מאייד חנקן ב-42.1 מעלות צלזיוס עם זרימת אוויר מוגדרת לשש. אחסן את ה-EIT המיובש בטמפרטורת החדר לאחסון למשך הלילה, או הוסף שלילי של 20 מעלות צלזיוס לאחסון לטווח ארוך לפני ספקטרומטריית מסה, מבחני Western Bloting או EISA לביצוע עיבוד ננו-חלקיקים של דגימות שתן. אוספים נפח מינימלי של 22 מיליליטר ומאחסנים את הדגימות בטמפרטורה שלילית של 80 מעלות צלזיוס עד שהן מוכנות לניתוח.מפשירים את השתן הקפוא בטמפרטורת החדר או בארבע מעלות צלזיוס למשך הלילה. לאחר ההפשרה, מערבבים קצרות על מערבל מערבולת. לאחר מכן שפכו לפחות 22 מיליליטר שתן לצינור פוליפרופילן תחתון חרוטי של 50 מיליליטר.לאחר מכן, סובב את השתן בצנטריפוגה עם רוטור מתנדנד החוצה ב -3, 700 פעמים G למשך 15 דקות מבלי להפריע לגלולה. שפכו את השתן לתוך צינור פוליפרופילן תחתון חרוטי נקי של 50 מיליליטר והשליכו את הגלולה. בצע בדיקת שתן באמצעות רצועת ריאגנט מקל שתן מולטי-אנליטית.הניחו את רצועת המגיב עם הפנים כלפי מעלה על מגבת נייר נקייה ויבשה. השתמש בפיפטה חד פעמית כדי לשאוב מיליליטר אחד של השתן. יש להוציא במהירות טיפה אחת עד שתיים של שתן על כל משטח בדיקה של רצועת הריאגנט.הפעל מיד טיימר שהוגדר בעבר לשתי דקות בזמן המצוין על מיכל רצועת המגיב. רשום את התוצאות האיכותיות עבור האנליטים השונים ברצועת המגיב על ידי השוואת הצבע של רצועות הריאגנט הבודדות לאינדיקטורים מקודדי הצבע המתאימים על מיכל המגיב. תוצאות שתן תקינות טיפוסיות מאופיינות ב-pH של 5.5 עד 7.0 ומשקל סגולי של 1.001 עד 1.020.השתן צריך להיות שלילי לחלבון הדם, לויקוציטים, ניטריט, גלוקוז, קטון, בילירובין ואורובילינוגן. לאחר מכן, העבירו 20 מיליליטר מהשתן המובהר לצינור פוליפרופילן תחתון חרוטי נקי של 50 מיליליטר. אל תפריע לכדורי פסולת שעלולים להיות בתחתית צינור השתן ממנו אתה מוציא את השתן.הוסף 200 מיקרוליטר של ננו-חלקיקים לדגימת השתן של 20 מיליליטר וערבב קצרות על מערבל מערבולת. לאחר מכן דגרו את תערובת ננו-חלקיקי השתן למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר מבלי להתנדנד או לערבב. סובב את תרחיף ננו-חלקיקי השתן בצנטריפוגה המצוידת ברוטור מתנדנד החוצה ב -3, 700 פעמים G למשך 10 דקות.לאחר הסרת הסופרנטנט והשלכתו, הוסיפו 500 מיקרוליטר של מי Milli Q לכדור הננו-חלקיקים. השעו מחדש את הננו-חלקיקים על ידי פיפטינג נמרץ למעלה ולמטה מספר פעמים. העבירו את תמיסת הננו-חלקיקים לצינור מיקרו צנטריפוגה נקי של 1.5 מיליליטר.לאחר מכן, סובב את הננו-חלקיקים בצנטריפוגה המצוידת ברוטור זווית קבועה ב -16, פי 100 G למשך 10 דקות. הסר והשליך את הסופרנטנט לפני שתחזור על שלבים אלה עם מים. כדי לשטוף את הננו-חלקיקים, הוסף 20 מיקרוליטר של מאגר פליטה טרי לגלולת הננו-חלקיקים והשהה מחדש את הננו-חלקיקים על ידי פיפטינג נמרץ למעלה ולמטה מספר פעמים.דגירה למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר. סובב שוב את דגימות הננו-חלקיקים לפני הסרת ה-snat מבלי לשבש את גלולת הננו-חלקיקים ולשמור את הסופרנטנט בצינור מיקרו-צנטריפוגה נקי של 1.5 מיליליטר. השלך את הגלולה לפח האשפה הביולוגית.מניחים את הדגימות במתלה במכסה אדים כימי. פותחים את הכובעים ומדגרים בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות. לחלופין, הניחו את הדגימות תחת זרימת חנקן בטמפרטורה של 40 מעלות צלזיוס עד לייבוש.הוסף 15 מיקרוליטר של מאגר דגימת טריס גליצין SDS לדגימות. מחממים בחום של 100 מעלות צלזיוס בגוש חום יבש למשך חמש דקות כשהמכסים פתוחים או עד שהנפח שנותר בצינור אינו עולה על 20 מיקרוליטר. הנח את המכסה על הצינורות והסר את הצינורות מגוש החום.ניתן לאחסן את הדגימה בטמפרטורה שלילית של 80 מעלות צלזיוס או להשתמש בה מיד לניתוח כתמים מערביים במורד הזרם. אלקטרופורזה של ג'ל כתם כסף 1D מדגימה לכידת ננו-חלקיקים וריכוז של גורם נמק גידול אלפא מפלזמה אנושית. הרצועה המייצגת את גורם נמק הגידול אלפא קיימת רק ב-EITs הננו-חלקיקים המסומנים באות P לחלקיקים, אך לא בננו-חלקיקים העל-טבעיים המתפקדים עם שני פיתיונות כימיים שונים, חומצה אקרילית או מעטפת ליבת VSA מסוגלים לקצור ריכוזים שונים של IL 17 מהכתמים המערביים של הפלזמה של הסופרנטנט והננו-חלקיק.EIT מדגים בבירור את נוכחותו של IL 17 ברצועת ה-17.5 קילו-דלטון ב-EIT, אך לא בננו-חלקיקי העל-טבעיים. קצירת דגימות שתן יכולה לחשוף אנטיגנים וציטוקינים חיידקיים בדף SDS זה המוכתם בכסף. ניתוח דגימות שתן דגימות בנתיבים U 4 ו-U 6 הם EITs ננו-חלקיקים מדגימות שתן המכילות RET, ESAT 6, חלבון הקשור למיקובקטריום טוברקולוזיס, ו-IL 2 A ציטוקין.חלבונים אלה מתוארים על ידי הרצועות הבולטות ב-15 קילודלטון. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד ניתן להשתמש בננו-חלקיקי ג'ל כדי לקצור, לרכז ולשמר סמנים ביולוגיים נטושים נמוכים בנוזלים ביולוגיים, ובמקביל להוציא מולקולות נטושות לא רצויות, ובכך להגדיל באופן דרמטי את רגישות הזיהוי של שיטות אנליטיות קיימות.

hydrogel-nanoparticle-harvesting-plasma-or-urine-for-detecting-low

Research

JoVE Journal

Bioengineering

הנדסה ביולוגית

פיתחנו טכנולוגיה המבוססת על הסרט סיליקה mesoporous דק להתאוששות סלקטיבית של חלבונים נמוך משקל מולקולרי ופפטידים מ בסרום אדם. פיסיקלי כימי את המאפיינים של שבבי mesoporous שלנו היו מכוון היטב כדי לספק שליטה משמעותית להעשרת פפטיד ולכן פרופיל proteome סרום למטרות אבחון.

חלבון נמוך מולקולרית משקל העשרה על סרטים סיליקה mesoporous דק גילוי סמן ביולוגי

כתב יד זה מתאר פרוטוקול לבידוד אקסוזומים משתן אנושי באמצעות טכניקת משקעים שונה.

שיטת ממטרים השתנה לבודד השתן Exosomes

פרוטוקול זה מדגים כיצד להשיג רגישות לזיהוי פמטו טוחנת של חלבונים ב-10 מיקרוליטר של דם מלא תוך 30 דקות. ניתן להשיג זאת על ידי שימוש במחצלות ננו-סיביות אלקטרוסקופיות המשולבות במעבדה-על-דיסק, המציעות שטח פנים גבוה כמו גם ערבוב ושטיפה יעילים ליחס אות לרעש משופר.

האוטומטי לחלוטין צנטריפוגלי Microfluidic מכשיר לגילוי חלבון רגיש מן הדם מלא

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לטהר exosomes פלזמה והן בסרום בטהרה שיתוף מופחתת של חלבוני דם בלתי-exosomal. פרוטוקול ממוטבת כולל אולטראפילטרציה פרוטאז לטיפול, גודל אי-הכללה של כרומטוגרפיה. טיהור משופרת של exosomes הטבות במורד הזרם ניתוחים, לרבות כימות מדויקת יותר של שלפוחית ואפיון פרוטיאומיה מבנית.

עיכול חלבון אולטראפילטרציה, גודל אי-הכללה של כרומטוגרפיה כדי למטב את ניתוקה של Exosomes פלזמה דם אנושי, סרום

פרוטוקול זה מתאר את הסינתזה והניסוח של ביו-חומרים הידרוג'ל הידרוג'ל להזרקה, סופראמולקולריים (PNP). יישומים של חומרים אלה לאספקת תרופות, ייצוב ביופארמה, אנקפסולציה של תאים ואספקה מודגמים.

הידרוג'ל פולימר-ננו-חלקיקי להזרקה עבור יישומי אספקת תאים ותרופות

השימוש הידרוג'לים פוטו-הדרגתיים כדי לבודד תאים חיידקיים על ידי שימוש בכלי טפיחה אור ברזולוציה גבוהה מדווח. נהלים ניסיוניים חיוניים, תוצאות ויתרונות של התהליך נבדקים. השיטה מאפשרת בידוד מהיר וזול של חיידקים ממוקדים המציגים פונקציות נדירות או ייחודיות מקהילות או אוכלוסיות הטרוגניות.

ממשקי הידרוג'ל הניתנים לצילום להקרנת חיידקים, בחירה ובידוד

מוצג פרוטוקול לקביעת סמנים ביולוגיים בשפע נמוך מדגימות סרום מיובשות שהודגמו עם הסמן הביולוגי פפטיד משחרר פרוגסטרין (ProGRP). חרוזים מגנטיים מצופים נוגדנים משמשים לניקוי והעשרה סלקטיביים של פפטיד ProGRP פרוטאוטיפי. הפפטיד שנלכד מנותח לאחר מכן על ידי ספקטרומטריית מסה כרומטוגרפית נוזלית-טנדם.

מיקרו-דגימה בניתוח חלבונים ממוקד מבוסס ספקטרומטריית מסה של חלבונים בעלי שפע נמוך

מאמר זה מתאר מתודולוגיה לבידוד, אפיון וכימות של שלפוחיות חוץ-תאיות שמקורן בפלזמה אנושית (EV) ומציג זרימת עבודה לניתוח נטול-תוויות של פרוטאום EV באמצעות כרומטוגרפיה נוזלית-ספקטרומטריית מסה טנדם (LC-MS/MS).

בידוד, אפיון וניתוח פרוטאומי של שלפוחיות חוץ-תאיות שמקורן בפלזמה לגילוי סמנים ביולוגיים קרדיווסקולריים

פרוטוקול זה מאחד את ניתוח SDS-PAGE לפרופיל קורונה חלבוני מותאם אישית על ננו-חלקיקים, ומאפשר גילוי שכפול, ניתן להרחבה ובעלות נמוכה של חתימות ספציפיות לסרטן. התוכנית נועדה לאבחון מוקדם של אדנוקרצינומה בצינור הלבלב, ומציעה אלטרנטיבה מעשית, המותאמת ל-REASWARDED, לשיטות פרוטאומיות מורכבות הן במחקר והן בקליניות.

תהליך עבודה סטנדרטי של SDS-PAGE לפרופיל קורונה של חלבונים מותאם אישית בגילוי סרטן מוקדם

טכניקה צדדי ליתוגרפיה פלזמה פותחה כדי ליצור דפוסים משטח יציב להדרכת מצורף הסלולר. טכניקה זו יכולה להיות מיושם כדי ליצור רשתות התא כולל אלה המחקות רקמות טבעיות שימש לחקר מספר סוגי תאים שונים.

Surface פלזמה ליתוגרפיה דפוסים של יצירת רשתות Cell

גלו שיטה לקציר וריכוז ביומרקרים בנפח נמוך מנוזלי גוף באמצעות ננו-חלקיקי הידרוג'ל פונקציונליים. שיטה זו משפרת רגישות זיהוי בבדיקות חלבון סטנדרטיות ומאפשרת אבחון מדויק יותר.

הידרוג'ל Nanoparticle קציר של פלזמה או שתן לגילוי חלבונים שפע נמוך

גלה סרטונים נוספים