Name: נתיחה וImmunostaining של דמותי דיסקים מ Melanogaster דרוזופילה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-09-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 10 s
Description: למד נתיחה ו-immunostaining של דמותי דיסקים מ-Drosophila melanogaster לחקר ביולוגיה התפתחותית. שיטה זו מאפשרת הדמיה של ביטוי גנים וחלבונים במיקרוסקופ פלואורסצנטי.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

ברצוננו להודות לדונלד מוכן וקווין משה להוראת JPK הליך נתיחת דיסק דמותי המקורי. אנו מודים גם לבונים Weasner לדיסק באברי המין באיור 1 ואת דיסק עין באיור 2 א, ברנדון Weasner לאיור 3, מרכז Bloomington דרוזופילה המלאי לכתמי זבוב ובנק Hybridoma התפתחותית לימודים לנוגדנים. CMS כבר נתמך על ידי מלגה מהמכון הלאומי לבריאות (NIH) GCMS הדרכת גרנט (T32-GM007757), פרנק וו Putnam מלגת המחקר, ורוברט בריגס מלגת המחקר. JPK נתמך על ידי מענק מהעין הלאומית (R01 EY014863)

.1 הכנת הזחלים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למלא צלחת פטרי 35 מ&quot;מ עם חיץ לנתיחה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים זחלים בצלחת פטרי ולאפשר להם לשחות סביב לכמה דקות (שלב ניקוי עצמי). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את הזחלים לבריכה של חיץ לנתיחה על צלחת לנתיחה מבוססת סיליקון. בריכה זו צריכה להיות בקצה אחד של הצלחת. הצלחת לנתיחה כוללת פתרון סיליקון שכבר שפכו וקשוחים בתוך צלחת פטרי זכוכית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות פסטר-pipet, למקם בריכה גדולה יותר של חיץ לנתיחה באמצע הצלחת לנתיחה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות # 5 מלקחיים, להעביר זחל ניקה אחת מהברכה הקטנה לבריכה הגדולה יותר של חיץ לנתיחה. </li></ol> .2 גס Dissection של זחלים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעוד הזחל הוא עדיין בתוך הבריכה הגדולה של חיץ נתיחה לאחוז את הזחל עם המלקחיים. זוג אחד של מלקחיים יש להשתמש כדי לתפוס את הפה הווים בעוד זוג המלקחיים האחר משמש להחזיק עניםאל עדיין (לתפוס את הזחל בעדינות ב1/3 אורך גוף). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החזק לייצב את זוג מלקחיים המכילים את הציפורן ליד הפה הווים תוך משיכת מהירות שאר הגוף משם עם הזוג הנוסף של מלקחיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כשהזחל מתחיל לקרוע לגזרים אתה תרגיש שחרור קל במתח. שחרר את הזחל מהמלקחיים ולאפשר ל&quot; אומץ &quot;של הזחל לשפוך החוצה. זה מאפשר לדיסקים דמותי להישאר בקונפורמציה הרגילה שלהם ומונע מהם להיות מעוות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עם זוג אחד של מלקחיים לתפוס את הפה הווים שוב להחזיק את הקצה הקדמי של הזחל במקום. באמצעות זוג מלקחיים האחר להסיר את תחתון 2/3 של הזחלים כוללים את האומץ הפנימי. הערה: מורכב המכילים את הפה הווים, דיסקי עיניים מחושים, אונות מוח, גנגליון הגחון, בלוטות הרוק, כמה דיסקי רגל, והציפורן שמעליה יישארו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עם זוג המלקחיים בעדינות להסיר ציפורן שמעליה, בלוטות רוק, דיסקי רגל ורקמות אחרות. הערה: רק רקמה שצריכה להישאר הוא הפה הווים, דיסקי עיניים מחושים, אונות מוח, וגנגליון הגחון (איור 3). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלבים 2.1-2.5 עם זחלים נוספים ל15-20 דקות. הערה: דיסקים דמותי שנותרו במאגר לנתיחה לתקופות זמן ארוכים יותר נוטים לבזות וסופו של דבר יופיעו כפחות מדגימות אידיאלי להצטלם. לפיכך, לאחר מקסימום של 20 דקות כל הרקמות גזורים יש להעביר למקבע PLP (ראה להלן). </li></ol> 3 קיבוע והכתמה של רקמות עם נוגדנים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות pipetman P-200, להעביר את הרקמות גזורים לזכוכית שעון המכילה מקבע קר Paraformaldehyde-ליזין-periodate (PLP). מגבלת נפח של חיץ נתיחה הועבר ל50 μl כדי למזער דילול של PLP. הקפד לחתוך את הקצה בסכין גילוח כדי שפתיחת הקצה היא גדולה מספיק כדי להכיל את הרקמות גזורים. בעזרת זוג מלקחיים אומחט טונגסטן להבטיח שהרקמות גזורים שקועות לחלוטין במטרה לקיבוע נאות להתרחש. דגירה רקמות גזורים במקבע PLP קר 45 דקות. דגירה זה יכול להתרחש בRT ללא תסיסה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות pipetman P-200, להעביר את הרקמות גזורים לשטוף חיץ (RT) באמצעות עוד טיפ צהוב לחתוך ל45 דקות. מגבלת נפח של PLP הועבר ל50 μl כדי למזער דילול של המאגר לשטוף. הערה: כל הרקמות גזורים צריכה להיות שקועות לחלוטין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר 20-30 סטים של רקמה גזור ל1.5 מ&quot;ל צינור microfuge. הערה: אם מספרים גדולים יותר של מתחמי דיסק עיניים מחושים משולבים בתוך הצינור, יש אפשרות שהרקמה בחלק התחתון של הצינור לא תהיה חשופה כראוי לנוגדנים. לקבלת תוצאות אופטימליות לא יותר מ 20-30 מתחמי דיסק עיניים מחושים צריכים להיות נוכחים בתוך צינור אחד. הרקמה גזור יישב לחלק התחתון של צינור microfuge. צעדים לכן, שבלאחר מכן use pipetman להסיר ולהחליף חיץ לשטוף, פתרון חסימה, ונוגדנים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר חיץ לשטוף ולהחליף עם של פתרון חסימת 100 μl: 10% עזים בסרום נורמלי בחיץ לשטוף. לדגור על RT עם סיבוב עדין על הכתף בראש טבלה ל10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר פתרון חסימה ולהחליף עם של נוגדנים עיקריים 100 μl כי כבר מדוללת כראוי ב10% עזים בסרום נורמלי. לדגור על RT עם סיבוב עדין ל16 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר נוגדנים ראשוניים ולהחליף עם 750 μl של חיץ לשטוף. מניחים צינורות על nutator ולאפשר לnutate ב RT עבור 10 דקות. הערה: הנוגדן הראשוני ניתן לשמור (חנות ב 4 ° C), ושימוש חוזר מאוחר יותר. שימוש חוזר בנוגדנים מספר פעמים יכול לעזור בהפחתה מחייבת שאינו ספציפי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאפשר ראשים ליישב לתחתית של התחתית, ולאחר מכן להסיר חיץ לשטוף ולהוסיף של נוגדנים משני שכבר מדולל כראוי ב10% בסרום נורמלי 100 μl. לדגור על RT עם סיבוב עדין ל2̵1; 4 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר פתרונות נוגדנים משני מרקמות ולהחליף עם 500 μl של חיץ לשטוף. לאפשר לרקמות להתיישב לתחתית של התחתית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות P-200 וקצה צהוב לחתוך, להעביר את כל הרקמות גזורים לבריכה של חיץ לשטוף שהושם על הצלחת לנתח. בעוד שתמשיך לשלב הבא של נתיחה בסדר, רקמות דגירה בחיץ לשטוף. זה עוזר להסיר נוגדנים משני עודפים. </li></ol> .4 פיין Dissection של Eye-מחושים דיסק מכלולים והרכבה על גבי שקופיות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בזוג אחד של מלקחיים כדי לאחוז לציפורן על ידי ווי הפה עם צד הגחון של המתחם פונה כלפי מטה. עם זוג שני של מלקחיים להסיר את שתי אונות המוח על ידי סגירת המלקחיים השניה במרחב שבין דיסקי המוח והעין (איור 3, חץ אדום) ובמהירות משך את המוח מהפה הווים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעוד המשך אחיזת ווי הפה, לצבוט אתהרקמה הקרובה ככל האפשר לחיבור בין סעיף המחושים של דיסק העין מחושים ופי הווים (איור 3, חץ כחול). הערה: מתחמי דיסק העיניים מחושים צריכים להיות חופשיים של כל הרקמות (איור 1 א). המשך עד שכל הרקמה הרצויה הרצויה שיכול להיות ממוקמת על גבי שקופיות כבר גזור. פרוטוקול זה יכול להיות מותאם לבודד את הכנף, הבוכניות, רגל ודיסקים באברי המין דמותי (איור 1 ב-E). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף שתי חתיכות קטנות של נייר טישו (גודל של coverslips) כ 3 ב. בנפרד על הצלחת לנתח. מניחים בשקופית זכוכית על הצלחת - שתי החתיכות של נייר טישו צריכה להיות תחת הקצוות של השקופית. זה ימנע את השקופית מלהידבק לבסיס סיליקון של המנה לנתח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות P-20 עם קצה חתוך, להוסיף 9 μl סוכן אנטי הלבנה לאמצע שקופית מיקרוסקופ הזכוכית. זה מונע הלבנה של הרקמה כאשר צפו עם ניאוןאור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השימוש באותו קצה חתוך, לאסוף את כל דיסקי העיניים מחושים ולהוסיף אותם לירידה של מגיב נגד הלבנה. למזער את הכמות של חיץ לשטוף שמתבצע מעל. נסה להגביל את הכמות של חיץ לשטוף ל10 μl או פחות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בזוג מלקחיים כדי להפריד ולהפיץ את דיסקי עיניים מחושים בתוך הטיפה של מגיב נגד הלבנה. לאפשר דיסקים כדי לדגור במגיבים נגד הלבנה למשך מספר דקות. הערה: דיסקים יהפכו ברורים כמו הרקמה סופגת מגיב נגד ההלבנה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות מכחול עדין בעדינות להוריד את coverslip לדגימה. זה מונע ההיווצרות של בועות אוויר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חנות מחליקה ב-20 ° C עד מוכן לצפייה בדיסקים דמותי עיניים מחושים או אחרים באמצעות אור או מיקרוסקופ פלואורסצנטי. </li></ol>

<ol><li>Weismann, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Die+nachembryonale+entwicklung+der+Musciden+nach+beobachtungen+an+Musca+vomitoria+und+Sarcophaga+carnaria%5BTitle%5D)+AND+%22Zeit.+Wiss.+Zool%22%5BJournal%5D)">Die nachembryonale entwicklung der Musciden nach beobachtungen an Musca vomitoria und Sarcophaga carnaria.</a> Zeit. Wiss. Zool. 14, 187-336 Forthcoming.</li>
<li>Cohen, S. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCohen%2C+SM+%22Imaginal+disc+development%22">Imaginal disc development</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. 747-841 (1993).</li>
<li>Held, L. I. Imaginal Discs: The Genetic and Cellular Logic of Pattern Formation. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHeld%2C+LI+%22Developmental+and+Cell+Biology+Series%22">Developmental and Cell Biology Series</a>. 39, Cambridge Press. 460(2002).</li>
<li>Miall, L. C., Hammond, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+development+of+the+head+of+the+imago+of+Chironomus%5BTitle%5D)+AND+%22Trans.+Linn.+Soc.+Zool%22%5BJournal%5D)">The development of the head of the imago of Chironomus.</a> Trans. Linn. Soc. Zool. 5, 265-279 Forthcoming.</li>
<li>Kellog, V. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+development+and+homologies+of+the+mouth+parts+of+insects%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+Nat%22%5BJournal%5D)">The development and homologies of the mouth parts of insects.</a> Am. Nat. 36, 683-706 (1902).</li>
<li>Eassa, Y. E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+development+of+imaginal+buds+in+the+head+of+Pieris+brassicae+Linn.+%28Lepidoptera%29%5BTitle%5D)+AND+%22Trans.+R.+Entomol.+Soc.+Lond%22%5BJournal%5D)">The development of imaginal buds in the head of Pieris brassicae Linn. (Lepidoptera).</a> Trans. R. Entomol. Soc. Lond. 104, 39-51 (1953).</li>
<li>Bryant, P. J., Schneiderman, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+lineage%2C+growth%2C+and+determination+in+the+imaginal+leg+discs+of+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Cell lineage, growth, and determination in the imaginal leg discs of Drosophila melanogaster.</a> Dev Biol. 20, DOI. 263-290 (1969).</li>
<li>Postlethwait, J. H., Schneiderman, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+clonal+analysis+of+development+in+Drosophila+melanogaster%3A+morphogenesis%2C+determination+and+growth+in+the+wild+type+antenna%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">A clonal analysis of development in Drosophila melanogaster: morphogenesis, determination and growth in the wild type antenna.</a> Dev. Biol. 24, 477-519 (1971).</li>
<li>Anderson, D. T. The development of hemimetabolous insects. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAnderson%2C+DT+%22Developmental+Systems%22">Developmental Systems</a>. Counce, S., Waddington, C. H. , Academic Press. New York. 165-242 (1972).</li>
<li>Anderson, D. T. The development of hemimetabolous insects. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAnderson%2C+DT+%22Developmental+Systems%22">Developmental Systems</a>. Counce, S., Waddington, C. H. , Academic Press. New York. 96-163 (1972).</li>
<li>Crick, F. H. C., Lawrence, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Compartments+and+polyclones+in+insect+development%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Compartments and polyclones in insect development.</a> Science. 189, 340-347 (1975).</li>
<li>Wieschaus, E., Gehring, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clonal+analysis+of+primordial+disc+cells+in+the+early+embryo+of+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Clonal analysis of primordial disc cells in the early embryo of Drosophila melanogaster.</a> Dev Biol. 50 (2), 249-263 (1976).</li>
<li>Lawrence, P. A., Morata, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+early+development+of+mesothoracic+compartments+in+Drosophila.+An+analysis+of+cell+lineage+and+fate+mapping+and+an+assessment+of+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">The early development of mesothoracic compartments in Drosophila. An analysis of cell lineage and fate mapping and an assessment of methods.</a> Dev Biol. 56 (1), 40-51 (1977).</li>
<li>Madhaven, M. M., Schneiderman, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histological+analysis+of+the+dynamics+of+growth+of+imaginal+discs+and+histoblast+nests+during+the+larval+development+of+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Wilhelm+Roux+Archive%22%5BJournal%5D)">Histological analysis of the dynamics of growth of imaginal discs and histoblast nests during the larval development of Drosophila melanogaster.</a> Wilhelm Roux Archive. 183, 269-305 (1977).</li>
<li>Kumar, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinal+determination+the+beginning+of+eye+development%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Top+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Retinal determination the beginning of eye development.</a> Curr Top Dev Biol. 93, 1-28 (2010).</li>
<li>Kumar, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((My+what+big+eyes+you+have%3A+how+the+Drosophila+retina+grows%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">My what big eyes you have: how the Drosophila retina grows.</a> Dev Neurobiol. 71 (12), 1133-1152 (2011).</li>
<li>Golic, K. G., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+FLP+recombinase+of+yeast+catalyzes+site-specific+recombination+in+the+Drosophila+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The FLP recombinase of yeast catalyzes site-specific recombination in the Drosophila genome.</a> Cell. 59, 499-509 (1989).</li>
<li>Xu, T., Rubin, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+genetic+mosaics+in+developing+and+adult+Drosophila+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Analysis of genetic mosaics in developing and adult Drosophila tissues.</a> Development. 117 (4), 1223-1237 (1993).</li>
<li>Duffy, J. B., Harrison, D. A., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identifying+loci+required+for+follicular+patterning+using+directed+mosaics%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Identifying loci required for follicular patterning using directed mosaics.</a> Development. 125 (12), 2263-2271 (1998).</li>
<li>Ito, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Drosophila+mushroom+body+is+a+quadruple+structure+of+clonal+units+each+of+which+contains+a+virtually+identical+set+of+neurones+and+glial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The Drosophila mushroom body is a quadruple structure of clonal units each of which contains a virtually identical set of neurones and glial cells.</a> Development. 124 (4), 761-771 (1997).</li>
<li>Lee, T., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mosaic+analysis+with+a+repressible+cell+marker+%28MARCM%29+for+Drosophila+neural+development%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM) for Drosophila neural development.</a> Trends Neurosci. 24, 251-254 (2001).</li>
<li>Ready, D. F., Hanson, T. E., Benzer, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+the+Drosophila+retina%2C+a+neurocrystalline+lattice%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Development of the Drosophila retina, a neurocrystalline lattice.</a> Dev. Biol. 53, 217-240 (1976).</li>
<li>Wolff, T., Ready, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+beginning+of+pattern+formation+in+the+Drosophila+compound+eye%3A+the+morphogenetic+furrow+and+the+second+mitotic+wave%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The beginning of pattern formation in the Drosophila compound eye: the morphogenetic furrow and the second mitotic wave.</a> Development. 113, 841-850 (1991).</li>
<li>Heberlein, U., Wolff, T., Rubin, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+TGF+beta+homolog+dpp+and+the+segment+polarity+gene+hedgehog+are+required+for+propagation+of+a+morphogenetic+wave+in+the+Drosophila+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The TGF beta homolog dpp and the segment polarity gene hedgehog are required for propagation of a morphogenetic wave in the Drosophila retina.</a> Cell. 75, 913-926 (1993).</li>
<li>Ma, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+segment+polarity+gene+hedgehog+is+required+for+progression+of+the+morphogenetic+furrow+in+the+developing+Drosophila+eye%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The segment polarity gene hedgehog is required for progression of the morphogenetic furrow in the developing Drosophila eye.</a> Cell. 75, 927-938 (1993).</li>
<li>Heberlein, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+and+differentiation+in+the+Drosophila+eye+coordinated+by+hedgehog%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Growth and differentiation in the Drosophila eye coordinated by hedgehog.</a> Nature. 373, 709-711 (1995).</li>
<li>Dominguez, M., Hafen, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hedgehog+directly+controls+initiation+and+propagation+of+retinal+differentiation+in+the+Drosophila+eye%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Hedgehog directly controls initiation and propagation of retinal differentiation in the Drosophila eye.</a> Genes Dev. 11, 3254-3264 (1997).</li>
<li>Pignoni, F., Zipursky, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+Drosophila+eye+development+by+Decapentaplegic%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Induction of Drosophila eye development by Decapentaplegic.</a> Development. 124, 271-278 (1997).</li>
<li>Borod, E. R., Heberlein, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutual+regulation+of+decapentaplegic+and+hedgehog+during+the+initiation+of+differentiation+in+the+Drosophila+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Mutual regulation of decapentaplegic and hedgehog during the initiation of differentiation in the Drosophila retina.</a> Dev. Biol. 197, 187-197 (1998).</li>
<li>Masucci, J. D., Miltenberger, R. J., Hoffmann, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pattern-specific+expression+of+the+Drosophila+decapentaplegic+gene+in+imaginal+disks+is+regulated+by+3%27+cis-regulatory+elements%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Pattern-specific expression of the Drosophila decapentaplegic gene in imaginal disks is regulated by 3' cis-regulatory elements.</a> Genes Dev. 4, 2011-2023 (1990).</li>
<li>Blackman, R. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+extensive+3%27+cis-regulatory+region+directs+the+imaginal+disk+expression+of+decapentaplegic%2C+a+member+of+the+TGF-b+family+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">An extensive 3' cis-regulatory region directs the imaginal disk expression of decapentaplegic, a member of the TGF-b family in Drosophila.</a> Development. 111, 657-665 (1991).</li>
<li>Campos, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+analysis+of+the+locus+elav+in+Drosophila+melanogaster%3A+a+gene+whose+embryonic+expression+is+neural+specific%5BTitle%5D)+AND+%22Embo+J%22%5BJournal%5D)">Molecular analysis of the locus elav in Drosophila melanogaster: a gene whose embryonic expression is neural specific.</a> Embo J. 6 (2), 425-431 (1987).</li>
<li>Robinow, S., White, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+locus+elav+of+Drosophila+melanogaster+is+expressed+in+neurons+at+all+developmental+stages%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">The locus elav of Drosophila melanogaster is expressed in neurons at all developmental stages.</a> Dev Biol. 126 (2), 294-303 (1988).</li>
<li>Kumar, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Building+an+ommatidium+one+cell+at+a+time%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">Building an ommatidium one cell at a time.</a> Dev Dyn. 241 (1), 136-149 (2012).</li>
<li>Kimmel, B. E., Heberlein, U., Rubin, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+homeo+domain+protein+rough+is+expressed+in+a+subset+of+cells+in+the+developing+Drosophila+eye+where+it+can+specify+photoreceptor+cell+subtype%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">The homeo domain protein rough is expressed in a subset of cells in the developing Drosophila eye where it can specify photoreceptor cell subtype.</a> Genes Dev. 4 (5), 712-727 (1990).</li>
<li>Dokucu, M. E., Zipursky, S. L., Cagan, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atonal%2C+rough+and+the+resolution+of+proneural+clusters+in+the+developing+Drosophila+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Atonal, rough and the resolution of proneural clusters in the developing Drosophila retina.</a> Development. 122 (12), 4139-4147 (1996).</li>
<li>Kumar, J. P., Moses, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EGF+Receptor+and+Notch+signaling+act+upstream+of+Eyeless%2FPax6+to+control+eye+specification%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">EGF Receptor and Notch signaling act upstream of Eyeless/Pax6 to control eye specification.</a> Cell. 104, 687-697 (2001).</li>
</ol>

המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים פיננסיים מתחרים.

למרות שהליך זה במידה רבה התמקד בבידוד והטיפול הבא של דיסקי עיניים מחושים, זה ניתן לשימוש כדי לבודד ולנתח את הכנף, הבוכניות, הרגל ודיסקים באברי המין (איור 4). השינוי הנדרש היחיד של הפרוטוקול לבידוד הדיסקים הללו (בניגוד לדיסק העיניים מחושים) הוא השיטה של ​​נתיחה גסה (סעיף 2 לפרוטוקול). רגל הזוג הראשון של בית החזה (T1) נמצא בקדמי של הזחל וניתן לשחזר על ידי ביצוע הפרוטוקול לבידוד דיסק עיניים מחושים. עם זאת הדיסקים שני רגל חזה (T2) מחוברים לציפורן. כדי לבודד את הדיסקים...

במשך יותר ממאה שנת זבוב הפירות, דרוזופילה melanogaster, הייתה מערכת מובילה ללימודי פיתוח, התנהגות ופיזיולוגיה. פיתוח בזבוב יכול להיות מחולק לשני שלבים עיקריים: עובריים ופוסט עובריים עם הרבה מקום הלקיחה האחרון בתוך epithelia monolayer נקראים דיסקים דמותי 1-3. ציורים של דיסקים דמותי פורסמו לראשונה בשנת 1864 עד אוגוסט וייסמן, כחלק ממונוגרפיה הרחבה שלו על פיתוח 1 חרקים. תקליטורים אלה להתחיל בפיתוחם במהלך עובר, הם בדוגמת בשלבי הזחל, לשרוד histolysis המסיבי של שלבי גלמים המוקדמים, וסופו של דבר לגרום לאחוז גבוה של מבנים למבוגרים הנמצאים בתוך המבוגר לטוס 1-14. במהלך התפתחות זחל כל דיסק עושה כמה החלטות קריטיות לגבי גורל, צורה וגודל. בתוך instars הזחל הראשון והשני, הדיסקים המוטל עם אימוץ גורל עיקרי, establisהינג גבולות תא, אימוץ הצורה הנכונה ויוצר את המספר הדרוש של תאי 15-16. במהלך instar הזחל השלישי והשלב טרום גלמים מוקדמים, הדיסקים דמותי ממשיכים להתחלק והם בדוגמת תאים לאמץ גורל המסוף שלהם 16. במהלך ההיסטוריה המוקדמת של ביולוגיה התפתחותית דרוזופילה, דיסקים דמותי נחקרו כמעט באופן בלעדי בהקשר של התפתחות נורמלית ובמקרים המצומצמים שבו אובדן או מוטציה רווח של הפונקציה היה קיימא. השימוש בקרן רנטגן כדי לגרום רקומבינציה mitotic אפשרה למוטציות קטלניות להיות מנותחת בשיבוטי תאים בתוך רקמות זחל ומבוגרים. שיטה זו שופרה על ידי ההקדמה של שיטות מהונדסים לנתח אובדן ולהשיג של פונקצית מוטציות בשתי רקמות זחל ומבוגרים. מספר הנוגדנים, כתבי תעתיק ומלכודות חלבון לתיאור הנוף המולקולרי של סוג בר ורקמות מוטציה הוא גם constantly גובר. שימוש בסמנים מולקולריים אלה כדי לנתח אובדן ולהשיג של פונקצית שיבוטים תא שעבר מוטציה עשה את זה אפשרי יותר ויותר כדי להשיג הבנה של הדרך בה תאים שעברו מוטציה לסטות מבני דודים מהסוג הברים במהלך פיתוח בזמן אמת. כדי לנצל את הכלים וחומרים הכימיים הללו כראוי זה הוא קריטי ליש הכנות באיכות גבוהות של דיסקים דמותי שניתן לראות, צילמו וניתחו. המטרה של כתב יד זה היא לספק פרוטוקול מותאם במיוחד לבידוד והכנת המורכבת דיסק העיניים מחושים (איור 1 א). זה גם יכול לשמש בהצלחה לבודד מגוון רחב של דיסקים נוספים כוללים אלה שיוצרים כנפיים, הבוכניות, רגלי T1-T3 ואיברי המין (איור 1 ב-E). הליך זה, עם שינויים קלים, נעשה שימוש כדי לבודד דיסקים דמותי מדרוזופילה במשך כמעט שמונים שנה. כפי שתואר לעיל, שכן רוב הגנים באים לידי ביטוי במהלך multiple שלבי התפתחות ובמספר רב של רקמות, הוא לעתים קרובות בלתי אפשרי לחקור את ההשפעות שיש לי מוטציות null בכל עין כחיה מתה הרבה לפני שלב זחל instar השלישי. ארבע שיטות שעשו המחקר של רקמות מפותחות יותר כגון הרשתית באופן משמעותי יותר צייתן. הראשון הוא שיטת Flippase (FLP) / Flippase רקומבינציה היעד (FRT) של יצירת שיבוטים תא שעברו מוטציה בתוך רקמת סוג אחר פראית 17-19. במקרה זה רקמת המוטציה מזוהה על ידי היעדר סמן חזותי כגון חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) ויכולה להיות בהשוואה לרקמה הסובבת הפראית הסוג שבו GFP הוא הווה (איור 2 ד). השני הוא השיטה &quot;FLP-out&quot;, שבי transgene באה לידי ביטוי באוכלוסייה של תאים 20. במקרה זה השיבוטים התא מזוהים על ידי הנוכחות של GFP והשוואה לרקמה הסובבת הסוג בר שחסרה את כתב GFP (איור2E). השלישי הוא ניתוח הפסיפס עם טכניקת סמן תא Repressible (MARCM), המשלבת אלמנטים של שיבוט המוטציה FLP / FRT ומערכות ביטוי FLP-out 21. בשיטה זו transgene יכול לבוא לידי ביטוי בתוך אוכלוסייה של תאים שנמצאים בו זמנית מוטציה למוקד גנטי בודד. כמו שיבוטים FLP-out, שיבוטים MARCM מזוהים על ידי הנוכחות של GFP והשוואה לרקמה מהסוג בר שמסביב שחסרה את סמן GFP (איור 2F). ולבסוף, ניתן לבטא את הגנים ומבני RNAi בתוך רקמות דמותי תחת שליטתו של בונה האמרגן-GAL4 ספציפי. ארבע שיטות אלה הגדילו את הריבית בלומד דיסקים דמותי מאז שיבוטים או דפוסי מוטציה או על ביטוי ניתן להשוות ישירות לרקמה מסוג בר סמוכה. השיטה המתוארת בהליך זה פותחה כך שחוקרים הלומדים את התפתחות פוסט העוברית של רקמות בוגרות בדרוזופילה,במיוחד אלה הנגזרים מדיסק העיניים מחושים, יוכל להשיג רקמה באיכות גבוהה לניתוח. למרות שחוקרים פרטיים שעשו שינויים קלים, הליבה של הליך זה (שבו אנו מתארים כאן) נותרה במידה רבה ללא שינוי. מאז קבלת רקמה באיכות גבוהה היא קריטית למחקר של הדיסקים דמותי אנו מקווים פרוטוקול זה נכתב וסרטון נלווה ישמשו כמשאב יקר ערך הוראה.

<table><tbody><tr><td>ערכת אלסטומר סיליקון Sylgard 184</td><td>Dow Corning</td><td>184 SIL ELAST KIT 0.5 ק"ג</td><td>משמש ליצירת בסיס לצלחת חיתוך</td></tr><tr><td>צלחת פטרי זכוכית Pryex 150 x 20 מ"מ</td><td>Dow Corning</td><td>3160-152CO</td><td>השתמש בכיסוי לצלחת חיתוך</td></tr> <tr><td>#5 ניתוח מלקחיים</td><td>טד פלה</td><td>525</td><td>יש לשמור על מלקחיים חדים מאוד</td></tr><tr><td>9 באר שעון זכוכית</td><td>ספקים</td><td></td> <td>Vairousמשמש לקיבוע של מתחמי דיסק דמיוניים</td></tr><tr><td>50 מ"ל בקבוק ארלנמאייר</td><td>ספקים</td><td></td><td></td>שונים</tr> מוט <tr><td>ערבוב קטן</td><td>ספקים</td><td></td> שונים <td>קטן מספיק כדי להתאים לבקבוק ארלנמאייר</td></tr><tr><td>50 מ"ל צינורות חרוטיים</td><td>ספקים</td><td></td><td></td>שונים</tr><tr><td>צינורות מיקרופוגה 1.5 מ"ל</td><td>ספקים</td><td></td> שונים <td>שקוף או כהה בהתאם ליישום</td></tr><tr><td>מתלה</td> <td>מיקרופוגהספקים שונים מסובב</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ספסל</td><td>ספקים</td><td></td> שונים <td>100 & #956; l נפח לא אמור להתיז בהגדרה נמוכה</td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Macron Chemicals</td><td>2-26555-1</td><td>משמש כקיבוע</td></tr><tr><td>נתרן פוספט Monobasic</td><td>Sigma Chemical Co</td><td>S-3139</td><td>משמש לייצור מאגרי דיסקציה וכביסה</td></tr><tr><td>נתרן פוספט</td><td>Dibasic Sigma Chemical Co</td><td>71636</td><td>משמש לייצור מאגרי דיסקציה וכביסה</td></tr><tr><td>Lysine</td><td>Acros Organics</td><td>125221000</td><td>משמש בתמיסת הקיבוע</td></tr><tr><td>Sodium Periodate</td><td>Sigma Chemical Co</td><td>S-1878</td><td>משמש בתמיסת הקיבוע</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>EMD Chemicals</td><td>MTX1568-1</td><td>משמש לניקוב דיסקים דמיוניים</td></tr><tr><td>נתרן הידרוקסיד</td><td>EM Science</td><td>SX0593-3</td><td>משמש להמסת פרפורמלדהיד</td></tr><tr><td>100% סרום עיזים רגיל</td><td>מעבדות ג'קסון</td><td>005-000-121</td><td>משמש כפתרון חוסם</td></tr><tr><td>נוגדנים</td><td>ראשוניים ספקים</td><td></td> שונים <td>מדללים בסרום עיזים 10% לפי הוראות היצרן</td></tr><tr><td>נוגדנים משניים</td><td>ספקים</td><td></td> שונים <td>מדללים בסרום עיזים 10% לפי הוראות היצרן</td></tr><tr><td>Vectashield</td><td>בדיקות מולקולריות</td><td>H-1000</td><td>מונע הלבנה של דגימות</td></tr><tr><td>שקופיות מיקרוסקופ</td><td>Fischer Scientific</td><td>48312-003</td><td></td></tr><tr><td>כיסוי זכוכית מחליק 18 x 18 מ"מ</td><td>Fischer Scientific</td><td>12-542A</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipe רקמות</td><td>ספקים</td><td></td> שונים <td>מונע מגלשות זכוכית להיצמד לבסיס סיליקון</td></tr><tr><td>מברשת Panit 000</td><td>ספקים</td><td></td> שונים <td>השתמש כדי להוריד בעדינות את הכיסוי לדגימות</td></tr></tbody></table>

נתיחה וimmunostaining של דמותי דיסקים מ melanogaster דרוזופילה

Dissection and Immunostaining of Imaginal Discs from Drosophila melanogaster

חלק משמעותי מפיתוח שלאחר עוברי בזבוב הפירות, דרוזופילה melanogaster, מתרחש בתוך מערכת של מבנים דמויים כיס נקראים דיסקים דמותי. תקליטורים אלה להצמיח אחוז גבוה של מבנים למבוגרים הנמצאים בתוך הזבוב הבוגר. כאן אנו מתארים פרוטוקול כי כבר מותאם להתאושש הדיסקים הללו ולהכינם לניתוח עם נוגדנים, כתבי תעתיק ומלכודות חלבון. הליך זה הוא מתאים ביותר לרקמות דקות כמו דיסקים דמותי, אבל ניתן לשנות בקלות לשימוש עם רקמות עבות יותר כגון השחלה המוח ומבוגר זחל. הפרוטוקול נכתב והסרטון נלווה ידריכו את הקורא / צופה באמצעות הנתיחה של זחלים שלישיים instar, קיבעון של רקמה, וטיפול בדיסקים דמותי עם נוגדנים. הפרוטוקול יכול לשמש כדי לנתח דיסקים דמותי מזחלי instar הראשון והשני צעירים יותר, כמו גם. היתרון של פרוטוקול זה הוא שהוא קצר יחסית ויש לה להיותen מותאם במיוחד לשימור באיכות הגבוהה של הרקמה גזור. יתרון נוסף הוא שהליך הקיבעון שמועסק עובד היטב עם המספר העצום של נוגדנים המזהים חלבוני דרוזופילה. מניסיוננו, יש מספר קטן מאוד של נוגדנים רגישים שלא עובדים היטב עם הליך זה. במצבים אלה, התרופה נראית להשתמש קוקטייל קיבעון חלופי תוך המשך פעל בהתאם להנחיות שיש לנו, שנקבעו עבור צעדים לנתיחה וincubations נוגדן.

השיטה שתוארה לעיל באופן מהימן מייצרת חומר באיכות גבוהה לניתוח עם בבדיקות באתר, כתבי תעתיק, מלכודות חלבון ונוגדנים. באיור 1 אנו מציגים דיסקי עין אנטנה, באברי המין, כנף, הבוכניות ורגל שהם התאוששו באופן שיגרתי בשיטה זו. טופלו בדיסקים אלה עם fluorophore phalloidin מצומדות-, אשר נקשר לF-אקטין ולכן מתאר כל תא. אם הרקמה תוקנה כראוי ואז תלם המוךפו"גנטי של דיסק העין, את הקצוות של הרקמה קונצנטריים מקפל בדיסקים באיברי המין, מחושים ורגליים, ואת הציר הגבי הגחון של דיס...

המבנים הבוגרים של דרוזופילה נגזרים ממבנים דמויי שק הנקראים דיסקים דמיוניים. ניתוח דיסקים אלה מספק תובנה לגבי תהליכים התפתחותיים רבים כולל קביעת רקמות, קביעת גבול תאים, התפשטות תאים, מפרט גורל התא וקוטביות תאים מישוריים. פרוטוקול זה משמש להכנת דיסקים דמיוניים למיקרוסקופ אור/פלורסנט.

נתיחה וImmunostaining של דמותי דיסקים מ Melanogaster דרוזופילה

A significant portion of post-embryonic development in the fruit fly, Drosophila melanogaster, takes place within a set of sac-like structures called ...

המטרה הכוללת של הליך זה היא לנתח דיסקים דמיוניים מזחלי דרוזופילה עבור אימונוהיסטוכימיה, זה מושג על ידי הסרת קומפלקס הראש המורכב מהפה, הווים, העין והדיסקים הטנאליים והמוח מהזחלים. השלב השני הוא לתקן את קומפלקס הראש ולדגור עליו עם נוגדנים ראשוניים ומשניים. לאחר מכן, העין והדיסקים הטנאליים מופרדים ממתחם הראש.השלב האחרון הוא הרכבת הדיסקים הדמיוניים בחומר נגד הלבנה על מגלשת זכוכית. בסופו של דבר, מדווחים פלואורסצנטיים או LAC Z וצביעת נוגדנים יכולים לחשוף את הביטוי המרחבי והזמן של גנים וחלבונים בתוך הרקמות הדמיוניות באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית. אם כי ניתן להשתמש בטכניקה זו כדי לספק תובנה לגבי לוקליזציה של גנים וחלבונים בדיסק הדמיוני האנטן.ניתן למרוח אותו גם על רקמות דמיוניות אחרות, כגון רגל הכנף, ועצירה. הנה. כדי להתחיל בניסוי, מלאו צלחת פטרי בגודל 35 מילימטר במאגר דיסקציה. מניחים 10 עד 20 זחלים בצלחת הפטרי ומניחים להם לשחות במשך חמש דקות.כדי לנקות את עצמה עם מזיק, הפיפטה שלך יוצרת מאגר אחד גדול של מאגר חיתוך באמצע לוחית חיתוך על בסיס סיליקון. הניחו שלוש בריכות קטנות יותר המקיפות את הבריכה הגדולה והשתמשו במלקחיים כדי להעביר את הזחלים לבריכה התחתונה. לאחר מכן, באמצעות מלקחיים מספר חמש, העבירו זחלים נקיים בודדים מהבריכה הקטנה למאגר הגדול יותר של מאגר הדיסקציה.כדי להתחיל בדיסקציה גסה, השתמש בזוג מלקחיים אחד כדי לתפוס את ווי הפה ובזוג המלקחיים השני כדי לתפוס את הזחלים בעדינות. בשליש אורך גופו מחזיק את וו הפה יציב. משוך במהירות את שאר הגוף בעזרת זוג מלקחיים שני.שחררו את הזחל מהמלקחיים ואפשרו למעיים להישפך החוצה, מה שמאפשר לדיסקים הדמיוניים להישאר באישור הרגיל שלהם. לאחר מכן תפסו את ווי הפה והשתמשו בזוג המלקחיים האחרים כדי להסיר את שני השלישים התחתונים של הזחלים, כולל המעיים הפנימיים. לאחר מכן, הסר בעדינות את בלוטות הרוק, דיסקי הרגליים ורקמות אחרות.הרקמות היחידות שאמורות להישאר הן כמות קטנה של קוטיקולה מעל. ווי הפה, דיסקי העין והעשר, חצאי המוח והגנגליון הגחוני. לאחר 20 דקות לכל היותר, העבירו את כל הרקמות המנותחות לפרפורם אלדהיד ליזין מצורעת.קיבוע תאריך או PLP. אל תאפשר לדיסקים דמיוניים להישאר במאגר החיתוך למשך יותר מ-20 דקות, אחרת הם יתפרקו לאחר הדיסקציה. העבירו את הרקמות המנותחות במרווחים של 100 מיקרוליטר לזכוכית שעון המכילה PLP קר.השתמש בזוג מלקחיים כדי להבטיח שהרקמות המנותחות שקועות לחלוטין. דגירה של רקמות מנותחות בקיבוע PLP קר למשך 45 דקות בטמפרטורת החדר ללא תסיסה. לאחר מכן, העבירו 100 מיקרוליטר של רקמות מנותחות מ-PLP למאגר כביסה.ודא שהרקמות שקועות לחלוטין ודגר אותן בטמפרטורת החדר ללא תסיסה למשך 45 דקות. לאחר מכן העבירו את הרקמות המנותחות לצינור מיקרו פוגה של 1.5 מיליליטר. הסר את מאגר הכביסה והחלף אותו ב-100 מיקרוליטר של תמיסת חסימה.דגרו את הרקמות בטמפרטורת החדר עם סיבוב עדין על מסובב שולחן למשך 10 דקות. לאחר החסימה, הסר את התמיסה והחלף אותה ב-100 מיקרוליטר של תמיסת נוגדנים ראשונית בסרום עיזים רגיל של 10%. דגרו את הרקמות בטמפרטורת החדר עם סיבוב עדין למשך 16 שעות בהתאם לחוזק הנוגדן.לאחר מכן, הסר את הנוגדן העיקרי והחלף אותו ב-750 מיקרוליטר של מאגר כביסה. הנח את הצינור על מוטטור בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות. הסר את הצינור מהמוטטור ואפשר לראשים להתיישב בתחתית הצינור.לאחר מכן הסר את מאגר הכביסה והוסף 100 מיקרוליטר של תמיסת נוגדנים משנית בסרום 10% רגיל. דגרו את הצינור בטמפרטורת החדר עם סיבוב עדין למשך שעתיים לפחות בהתאם לחוזק הנוגדן. לאחר הדגירה, הסר את תמיסת הנוגדנים המשנית מהרקמה.החלף אותו ב-500 מיקרוליטר של מאגר כביסה ואפשר לרקמה להתיישב בתחתית הצינור. הניחו שלוש בריכות של מאגר כביסה על צלחת חיתוך סיליקון. העבירו את כל הרקמות המנותחות לבריכה הגדולה של מאגר הכביסה שהונחה על צלחת הניתוח.זה עוזר להסיר עודפי נוגדנים משניים כדי להתחיל בדיסקציה עדינה, למקם את הצד הגחוני המורכב של הראש כלפי מטה ולהצמיד את הציפורן לווים בפה. הניחו זוג מלקחיים שני בחלל שבין המוח לדיסק העין ומשכו במהירות את המוח הרחק מהווים של הפה כדי להסיר את שתי אונות המוח תוך כדי המשך אחיזה בווים בפה. צבט את הרקמה קרוב ככל האפשר לחיבור בין חלק האנטנה של דיסק אנטנת העין לוו הפה.המשך עד לניתוח כל הרקמה הרצויה. לאחר מכן, הוסף שתי חתיכות קטנות של נייר טישו בגודל הכיסוי מחליק שלושה סנטימטרים זה מזה על צלחת הניתוח. הנח שקופית זכוכית על פיסות נייר אלה כדי למנוע מהשקופית להידבק לבסיס הסיליקון של כלי הניתוח.בעזרת פיפטה P 20 גברים, הוסף תשעה מיקרוליטרים של חומר נגד הלבנה לאמצע שקופית מיקרוסקופ הזכוכית כדי למנוע הלבנה באור פלואורסצנטי של הרקמה עם אותו קצה לא חתוך, אסוף את כל הדיסקים I ו-tenal והוסף אותם לטיפה של מגיב נגד הלבנה. לאחר מכן, השתמש במלקחיים כדי להפריד ולפזר את העין ואת הדיסקים הטנאליים בתוך טיפת המגיב נגד הלבנה עד שאף דיסק דמיוני לא נוגע. בעזרת מברשת צבע עדינה הורד בעדינות את החלקת הכיסוי על טיפת החומר נגד הלבנה כדי למנוע היווצרות בועות אוויר.לבסוף, אחסן שקופיות בטמפרטורה שלילית של 20 מעלות צלזיוס עד שיהיה מוכן לצפות ולצלם את דיסקות היונים באמצעות מיקרוסקופ אור או פלואורסצנטי. שיטה זו מייצרת באופן אמין חומר באיכות גבוהה לניתוח כפי שמועבר על ידי תמונות קונפוקליות אלה של דיסקים דמיוניים. הדיסקים טופלו בפלואורו ארבע מצומד ומצומד, שנקשר ל-f actin ולכן מתאר כל תא.אחד המאפיינים הבולטים ביותר של הדיסק האנטלי הוא התלם המורפוגנטי, שניתן לראות אותו כשקע בתוך רקמה העוברת לאורך ציר הגחון הגבי. ככל שהתלם מתקדם על פני שדה העין, ים התאים הלא מסודרים הופך למערך מסודר של עיני יחידה המרוחקות מעת לעת או אומה טדיה. אימות ביטוי משובט וניתוח של הדיסק הדמיוני I הם יישומים אפשריים במורד הזרם של שיטה זו.שלושת הפאנלים העליונים מציגים דיסקים שהוכתמו בנוגדנים שונים כגון איליס, A DPP, LAC Z מדווח שעתוק, וסמנים ספציפיים לתא כגון ראייה עוברית, קטלנית, לא תקינה, או vy, המקודד חלבון קושר RNA פאן-עצבי. שלושת הפאנלים התחתונים מציגים דיסקים שבהם GFP משמש לסימון אוכלוסיות של תאים. לאחר שליטה במסלול, בידוד מתחמי ראש מ-10 עד 20 זחלים ייקח כ-10 דקות, ובנוסף, הבידוד העדין של דיסק עשר היונים ממתחמים אלה ייקח כ-10 דקות גם כן.

dissection-immunostaining-imaginal-discs-from-drosophila

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

פרוטוקול זה מדגים את הטכניקה לנתיחה משמש לבידוד דיסקים דמותי מן הזחלים תסיסנית בשלב instar 3. שיטות לתיקון רקמות אחרי אומר והסרה של הזרוע, רגל, עין ודיסקים הם הוכיחו ישירות על שקופיות מיקרוסקופ להדמיה הבאים.

Dissection של דיסקים דמותי מן הזחלים 3 תסיסנית Instar

אנו מתארים רומן אדום חלבון פלואורסצנטי (RFP) כתב כי באה לידי ביטוי במיוחד...

RFP כתב רומן על סיוע ויזואליזציה של דיסק העין דמותי ב תסיסנית</em

Dissection והדמיה של אזורי פעיל תסיסנית Neuromuscular צומת

תסיסנית גלמי אימונוהיסטוכימיה בטן

נתיחה ואימונוהיסטוכימיה של זחל, גלמים ומבוגרים<em&gt; דרוזופילה</em&gt; רשתיות

בעת צביעת דיסקים דמיוניים של דרוזופילה, לעיתים קרובות מתבצעת דיסקציה גסה בה הדיסקים חשופים אך נשארים מחוברים לגוף. לאחר המוכתמים, הדיסקים המעניינים מבודדים ומורכבים. הפרוטוקול לדוגמה מדגים הליך לדיסקציה והרכבה של דיסק דמיוני בכנף.

דרוזופילה דיסקציה דמיונית של הזחל: שיטה להתבוננות בהתפתחות אפיתליה

מטרת טכניקה זו היא לאפשר לחוקרים לבצע דיסקציה, צביעה חיסונית והרכבה של דיסקים של עין גולם מדרוזופילה מלנוגסטר בכל גיל.

נתיחה והתקנה<em&gt; דרוזופילה</em&gt; גלמי דיסקי העין

פרוטוקול זה מדגים כיצד ליצור מסומן פלורסנטי, גידולים המשובטים מוגדר גנטית בעין תסיסנית / דיסקים דמותי מחושים (EAD). הוא מתאר כיצד לנתח את EAD והמוח מן הזחלים instar השלישי וכיצד לעבד אותם לחזות ולכמת שינויים בהתבטאות גנים הפולשנות הגידול.

ה<em&gt; תסיסנית</em&gt; דגם גידול דיסק דמותי: ויזואליזציה וכימות של ביטוי גנים סרטניים הפולשנות שימוש פסיפסים גנטי

כאן, אנו מספקים פרוטוקול דיסקציה הנדרש כדי לצלם בשידור חי את הגונד הזכר העוברי המנוח של דרוזופילה . פרוטוקול זה יאפשר תצפית על תהליכים תאיים דינמיים בתנאים רגילים או לאחר מניפולציה מהונדסת או פרמקולוגית.

דיסקציה והדמיה חיה של דרוזופילה גונד העוברית המאוחרת

אנו מתארים פרוטוקול למדידת מגעים בין תאים בשכבות אפיתל סמוכות בדיסקים דמיוניים חיים של כנפי דרוזופילה באמצעות גישה מבוססת בנייה מחדש של GFP.

מערכת ביטוי כפול מבוססת השלמת GFP להערכת מגע תא-תא בתיווך ציטונמים בדיסקים דמיוניים חיים של כנף דרוזופילה

מאמר זה מתאר פרוטוקול יעיל לפירוק דיסק דמיוני וצביעת נוגדנים, שהוא חסכוני עם מגיבים ומקל על טיפול בדיסקים דמיוניים במספרים קטנים.

כריתה בקנה מידה קטן וצביעת נוגדנים של דיסקים דמיוניים באנטנות העיניים והכנף מ-Drosophila melanogaster

למד נתיחה ו-immunostaining של דמותי דיסקים מ-Drosophila melanogaster לחקר ביולוגיה התפתחותית. שיטה זו מאפשרת הדמיה של ביטוי גנים וחלבונים במיקרוסקופ פלואורסצנטי.

נתיחה וImmunostaining של דמותי דיסקים מ Melanogaster דרוזופילה

גלה סרטונים נוספים