נתיחה וImmunostaining של דמותי דיסקים מ Melanogaster דרוזופילה

המטרה הכוללת של הליך זה היא לנתח דיסקים דמיוניים מזחלי דרוזופילה עבור אימונוהיסטוכימיה, זה מושג על ידי הסרת קומפלקס הראש המורכב מהפה, הווים, העין והדיסקים הטנאליים והמוח מהזחלים. השלב השני הוא לתקן את קומפלקס הראש ולדגור עליו עם נוגדנים ראשוניים ומשניים. לאחר מכן, העין והדיסקים הטנאליים מופרדים ממתחם הראש.

השלב האחרון הוא הרכבת הדיסקים הדמיוניים בחומר נגד הלבנה על מגלשת זכוכית. בסופו של דבר, מדווחים פלואורסצנטיים או LAC Z וצביעת נוגדנים יכולים לחשוף את הביטוי המרחבי והזמן של גנים וחלבונים בתוך הרקמות הדמיוניות באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית. אם כי ניתן להשתמש בטכניקה זו כדי לספק תובנה לגבי לוקליזציה של גנים וחלבונים בדיסק הדמיוני האנטן.

ניתן למרוח אותו גם על רקמות דמיוניות אחרות, כגון רגל הכנף, ועצירה. הנה. כדי להתחיל בניסוי, מלאו צלחת פטרי בגודל 35 מילימטר במאגר דיסקציה. מניחים 10 עד 20 זחלים בצלחת הפטרי ומניחים להם לשחות במשך חמש דקות.

כדי לנקות את עצמה עם מזיק, הפיפטה שלך יוצרת מאגר אחד גדול של מאגר חיתוך באמצע לוחית חיתוך על בסיס סיליקון. הניחו שלוש בריכות קטנות יותר המקיפות את הבריכה הגדולה והשתמשו במלקחיים כדי להעביר את הזחלים לבריכה התחתונה. לאחר מכן, באמצעות מלקחיים מספר חמש, העבירו זחלים נקיים בודדים מהבריכה הקטנה למאגר הגדול יותר של מאגר הדיסקציה.

כדי להתחיל בדיסקציה גסה, השתמש בזוג מלקחיים אחד כדי לתפוס את ווי הפה ובזוג המלקחיים השני כדי לתפוס את הזחלים בעדינות. בשליש אורך גופו מחזיק את וו הפה יציב. משוך במהירות את שאר הגוף בעזרת זוג מלקחיים שני.

שחררו את הזחל מהמלקחיים ואפשרו למעיים להישפך החוצה, מה שמאפשר לדיסקים הדמיוניים להישאר באישור הרגיל שלהם. לאחר מכן תפסו את ווי הפה והשתמשו בזוג המלקחיים האחרים כדי להסיר את שני השלישים התחתונים של הזחלים, כולל המעיים הפנימיים. לאחר מכן, הסר בעדינות את בלוטות הרוק, דיסקי הרגליים ורקמות אחרות.

הרקמות היחידות שאמורות להישאר הן כמות קטנה של קוטיקולה מעל. ווי הפה, דיסקי העין והעשר, חצאי המוח והגנגליון הגחוני. לאחר 20 דקות לכל היותר, העבירו את כל הרקמות המנותחות לפרפורם אלדהיד ליזין מצורעת.

קיבוע תאריך או PLP. אל תאפשר לדיסקים דמיוניים להישאר במאגר החיתוך למשך יותר מ-20 דקות, אחרת הם יתפרקו לאחר הדיסקציה. העבירו את הרקמות המנותחות במרווחים של 100 מיקרוליטר לזכוכית שעון המכילה PLP קר.

השתמש בזוג מלקחיים כדי להבטיח שהרקמות המנותחות שקועות לחלוטין. דגירה של רקמות מנותחות בקיבוע PLP קר למשך 45 דקות בטמפרטורת החדר ללא תסיסה. לאחר מכן, העבירו 100 מיקרוליטר של רקמות מנותחות מ-PLP למאגר כביסה.

ודא שהרקמות שקועות לחלוטין ודגר אותן בטמפרטורת החדר ללא תסיסה למשך 45 דקות. לאחר מכן העבירו את הרקמות המנותחות לצינור מיקרו פוגה של 1.5 מיליליטר. הסר את מאגר הכביסה והחלף אותו ב-100 מיקרוליטר של תמיסת חסימה.

דגרו את הרקמות בטמפרטורת החדר עם סיבוב עדין על מסובב שולחן למשך 10 דקות. לאחר החסימה, הסר את התמיסה והחלף אותה ב-100 מיקרוליטר של תמיסת נוגדנים ראשונית בסרום עיזים רגיל של 10%. דגרו את הרקמות בטמפרטורת החדר עם סיבוב עדין למשך 16 שעות בהתאם לחוזק הנוגדן.

לאחר מכן, הסר את הנוגדן העיקרי והחלף אותו ב-750 מיקרוליטר של מאגר כביסה. הנח את הצינור על מוטטור בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות. הסר את הצינור מהמוטטור ואפשר לראשים להתיישב בתחתית הצינור.

לאחר מכן הסר את מאגר הכביסה והוסף 100 מיקרוליטר של תמיסת נוגדנים משנית בסרום 10% רגיל. דגרו את הצינור בטמפרטורת החדר עם סיבוב עדין למשך שעתיים לפחות בהתאם לחוזק הנוגדן. לאחר הדגירה, הסר את תמיסת הנוגדנים המשנית מהרקמה.

החלף אותו ב-500 מיקרוליטר של מאגר כביסה ואפשר לרקמה להתיישב בתחתית הצינור. הניחו שלוש בריכות של מאגר כביסה על צלחת חיתוך סיליקון. העבירו את כל הרקמות המנותחות לבריכה הגדולה של מאגר הכביסה שהונחה על צלחת הניתוח.

זה עוזר להסיר עודפי נוגדנים משניים כדי להתחיל בדיסקציה עדינה, למקם את הצד הגחוני המורכב של הראש כלפי מטה ולהצמיד את הציפורן לווים בפה. הניחו זוג מלקחיים שני בחלל שבין המוח לדיסק העין ומשכו במהירות את המוח הרחק מהווים של הפה כדי להסיר את שתי אונות המוח תוך כדי המשך אחיזה בווים בפה. צבט את הרקמה קרוב ככל האפשר לחיבור בין חלק האנטנה של דיסק אנטנת העין לוו הפה.

המשך עד לניתוח כל הרקמה הרצויה. לאחר מכן, הוסף שתי חתיכות קטנות של נייר טישו בגודל הכיסוי מחליק שלושה סנטימטרים זה מזה על צלחת הניתוח. הנח שקופית זכוכית על פיסות נייר אלה כדי למנוע מהשקופית להידבק לבסיס הסיליקון של כלי הניתוח.

בעזרת פיפטה P 20 גברים, הוסף תשעה מיקרוליטרים של חומר נגד הלבנה לאמצע שקופית מיקרוסקופ הזכוכית כדי למנוע הלבנה באור פלואורסצנטי של הרקמה עם אותו קצה לא חתוך, אסוף את כל הדיסקים I ו-tenal והוסף אותם לטיפה של מגיב נגד הלבנה. לאחר מכן, השתמש במלקחיים כדי להפריד ולפזר את העין ואת הדיסקים הטנאליים בתוך טיפת המגיב נגד הלבנה עד שאף דיסק דמיוני לא נוגע. בעזרת מברשת צבע עדינה הורד בעדינות את החלקת הכיסוי על טיפת החומר נגד הלבנה כדי למנוע היווצרות בועות אוויר.

לבסוף, אחסן שקופיות בטמפרטורה שלילית של 20 מעלות צלזיוס עד שיהיה מוכן לצפות ולצלם את דיסקות היונים באמצעות מיקרוסקופ אור או פלואורסצנטי. שיטה זו מייצרת באופן אמין חומר באיכות גבוהה לניתוח כפי שמועבר על ידי תמונות קונפוקליות אלה של דיסקים דמיוניים. הדיסקים טופלו בפלואורו ארבע מצומד ומצומד, שנקשר ל-f actin ולכן מתאר כל תא.

אחד המאפיינים הבולטים ביותר של הדיסק האנטלי הוא התלם המורפוגנטי, שניתן לראות אותו כשקע בתוך רקמה העוברת לאורך ציר הגחון הגבי. ככל שהתלם מתקדם על פני שדה העין, ים התאים הלא מסודרים הופך למערך מסודר של עיני יחידה המרוחקות מעת לעת או אומה טדיה. אימות ביטוי משובט וניתוח של הדיסק הדמיוני I הם יישומים אפשריים במורד הזרם של שיטה זו.

שלושת הפאנלים העליונים מציגים דיסקים שהוכתמו בנוגדנים שונים כגון איליס, A DPP, LAC Z מדווח שעתוק, וסמנים ספציפיים לתא כגון ראייה עוברית, קטלנית, לא תקינה, או vy, המקודד חלבון קושר RNA פאן-עצבי. שלושת הפאנלים התחתונים מציגים דיסקים שבהם GFP משמש לסימון אוכלוסיות של תאים. לאחר שליטה במסלול, בידוד מתחמי ראש מ-10 עד 20 זחלים ייקח כ-10 דקות, ובנוסף, הבידוד העדין של דיסק עשר היונים ממתחמים אלה ייקח כ-10 דקות גם כן.