Name: Culturing Elegans Caenorhabditis בAxenic נוזלית מדיה ובריאה של תולעים מהונדסים ידי microparticle הפצצה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-08-02T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 26 s
Description: למד לגדל Caenorhabditis elegans בתרבית נוזלית אקסנית ללא חיידקים. שיטה זו מאפשרת חקר צרכים תזונתיים וסינכרון אוכלוסיות תולעים למחקר מדויק בביולוגיה התפתחותית ונוירומדע.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי המכון הלאומי לHealthGrants DK85035 וDK074797 (IH).

<ol><li>Kamath, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+functional+analysis+of+the+Caenorhabditis+elegans+genome+using+RNAi%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Systematic functional analysis of the Caenorhabditis elegans genome using RNAi.</a> Nature. 421, 231-237 (2003).</li>
<li>Nass, R., Blakely, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Caenorhabditis+elegans+dopaminergic+system%3A+opportunities+for+insights+into+dopamine+transport+and+neurodegeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+review+of+pharmacology+and+toxicology%22%5BJournal%5D)">The Caenorhabditis elegans dopaminergic system: opportunities for insights into dopamine transport and neurodegeneration.</a> Annual review of pharmacology and toxicology. 43, 521-544 (2003).</li>
<li>Lapierre, L. R., Hansen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lessons+from+C+elegans+signaling+pathways+for+longevity%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+endocrinology+and+metabolism+TEM%22%5BJournal%5D)">Lessons from C elegans signaling pathways for longevity.</a> Trends in endocrinology and metabolism TEM. 23, 637-644 (2012).</li>
<li>Kenyon, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+plasticity+of+aging+insights+from+long-lived+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The plasticity of aging insights from long-lived mutants.</a> Cell. 120, 449-460 (2005).</li>
<li>Vanfleteren, J. R., Braeckman, B. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+life+span+determination+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiology+of+aging%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of life span determination in Caenorhabditis elegans.</a> Neurobiology of aging. 20, 487-502 (1999).</li>
<li>Poole, R. J., Bashllari, E., Cochella, L., Flowers, E. B., Hobert, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Genome-Wide+RNAi+Screen+for+Factors+Involved+in+Neuronal+Specification+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+genetics%22%5BJournal%5D)">A Genome-Wide RNAi Screen for Factors Involved in Neuronal Specification in Caenorhabditis elegans.</a> PLoS genetics. 7, e1002109(2011).</li>
<li>Stiernagle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maintenance+of+C+elegans+WormBook+the+online+review+of+C%5BTitle%5D)+AND+%22elegans+biology%22%5BJournal%5D)">Maintenance of C elegans WormBook the online review of C.</a> elegans biology. , 1-11 (2006).</li>
<li>Win, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Validated+Liquid+Culture+Monitoring+System+for+Lifespan+Extension+of+Caenorhabditis+elegans+through+Genetic+and+Dietary+Manipulations%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+and+disease%22%5BJournal%5D)">Validated Liquid Culture Monitoring System for Lifespan Extension of Caenorhabditis elegans through Genetic and Dietary Manipulations.</a> Aging and disease. 4, 178-185 (2013).</li>
<li>Clegg, E. D., LaPenotiere, H. F., French, D. Y., Szilagyi, M. Use of CeHR Axenic Medium for Exposure and Gene Expression Studies. East Coast Worm Meeting. , (2002).</li>
<li>Severance, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+analysis+reveals+novel+genes+essential+for+heme+homeostasis+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+genetics%22%5BJournal%5D)">Genome-wide analysis reveals novel genes essential for heme homeostasis in Caenorhabditis elegans.</a> PLoS genetics. 6, e1001044(2010).</li>
<li>Rajagopal, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Haem+homeostasis+is+regulated+by+the+conserved+and+concerted+functions+of+HRG-1+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Haem homeostasis is regulated by the conserved and concerted functions of HRG-1 proteins.</a> Nature. 453, 1127-1131 (2008).</li>
<li>Nass, R., Hamza, I. Chapter 1 Unit 1 9. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aNass%2C+R+%22The+nematode+C.+elegans+as+an+animal+model+to+explore+toxicology+in+vivo%3A+solid+and+axenic+growth+culture+conditions+and+compound+exposure+parameters.+Current+protocols+in+toxicology+editorial+board%2C+Mahin+D.+Maines%22">The nematode C. elegans as an animal model to explore toxicology in vivo: solid and axenic growth culture conditions and compound exposure parameters. Current protocols in toxicology editorial board, Mahin D. Maines</a>. , (2007).</li>
<li>Schweinsberg, P. J., Grant, B. D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((elegans+gene+transformation+by+microparticle+bombardment+WormBook+the+online+review+of+C%5BTitle%5D)+AND+%22elegans+biology%22%5BJournal%5D)">elegans gene transformation by microparticle bombardment WormBook the online review of C.</a> elegans biology. , 1-10 (2013).</li>
<li>Rao, A. U., Carta, L. K., Lesuisse, E., Hamza, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lack+of+heme+synthesis+in+a+free-living+eukaryote%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Lack of heme synthesis in a free-living eukaryote.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102, 4270-4275 (2005).</li>
<li>Szewczyk, N. J., Kozak, E., Conley, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemically+defined+medium+and+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+biotechnology%22%5BJournal%5D)">Chemically defined medium and Caenorhabditis elegans.</a> BMC biotechnology. 3, 19(2003).</li>
<li>Szewczyk, N. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delayed+development+and+lifespan+extension+as+features+of+metabolic+lifestyle+alteration+in+C+elegans+under+dietary+restriction%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+experimental+biology%22%5BJournal%5D)">Delayed development and lifespan extension as features of metabolic lifestyle alteration in C elegans under dietary restriction.</a> The Journal of experimental biology. 209, 4129-4139 (2006).</li>
<li>White, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HRG1+is+essential+for+heme+transport+from+the+phagolysosome+of+macrophages+during+erythrophagocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+metabolism%22%5BJournal%5D)">HRG1 is essential for heme transport from the phagolysosome of macrophages during erythrophagocytosis.</a> Cell metabolism. 17, 261-270 (2013).</li>
<li>Chen, C., Samuel, T. K., Sinclair, J., Dailey, H. A., Hamza, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+intercellular+heme-trafficking+protein+delivers+maternal+heme+to+the+embryo+during+development+in+C+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">An intercellular heme-trafficking protein delivers maternal heme to the embryo during development in C elegans.</a> Cell. 145, 720-731 (2011).</li>
<li>Praitis, V., Casey, E., Collar, D., Austin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Creation+of+low-copy+integrated+transgenic+lines+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Creation of low-copy integrated transgenic lines in Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 157, 1217-1226 (2001).</li>
<li>Berezikov, E., Bargmann, C. I., Plasterk, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Homologous+gene+targeting+in+Caenorhabditis+elegans+by+biolistic+transformation%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+acids+research%22%5BJournal%5D)">Homologous gene targeting in Caenorhabditis elegans by biolistic transformation.</a> Nucleic acids research. 32, e40(2004).</li>
<li>Semple, J. I., Biondini, L., Lehner, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generating+transgenic+nematodes+by+bombardment+and+antibiotic+selection%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Generating transgenic nematodes by bombardment and antibiotic selection.</a> Nature Methods. 9, 118-119 (2012).</li>
</ol>

המחברים מצהירים שאין אינטרסים כלכליים מתחרים או ניגוד העניינים.

בפרוטוקול זה אנו מציגים mCeHR הותאם axenic נוזל מדיה המאפשרת לג המהיר דור elegans עם ייצור של מספר רב של תולעים. מדיה זו מציגה מספר יתרונות כמו התולעים גדלים בלי לזהם E. coli או תוצרי לוואי וחיידקים יכול להיות מנוצלים במחקרים תזונתיים וטוקסיקולוגי. שימושו של ע &#39; יש חיידק או חיידקים אחרים במחקרים מסוג זה יש כמה חסרונות. למשל, הצמיחה של החיידקים יכולה להשתנות בתנאים שונים והחיידקים יכולים לעכל מולקולות שנמצאים assayed, ובלבלו את הפרשנ...

נמטודות הקרקע, elegans Caenorhabditis, הוא אורגניזם מודל רב עוצמה המשמש במחקרים רבים מתחום הגנטיקה לטוקסיקולוגיה. כתוצאה מגודלו 1 מ&quot;מ, זמן דור המהיר של ארבעה ימים, קל טיפוח, ומספרי צאצאים גדולים, נמטודות אלה כבר נוצלו במספר מסכי גנטיים תרופתיים 1, 2. חוקרים לנצל את תולעת זה כדי לזהות מולקולות ומסלולים נשמרים במערכות בעלי חוליות. מסלולים אלה כוללים אותות מוות של תאים, מסלולים של הזדקנות ואת חילוף חומרים, ואת מערכת העצבים 3-6. בנוסף, השקיפות של ג elegans מאפשר לדור של קווים מהונדסים באמצעות כתבי חלבון פלואורסצנטי, אשר ניתן דמיינו ישירות לנתח דפוסי ביטוי גנים ולוקליזציה חלבון. במחקרים רבים נמטודות זה תרבית על משטח המבוסס על אגר מוצק באמצעות מדיום גידול נמטודות צלחות (NGM) או בליטרתרבויות iquid זרע עם Escherichia coli כמקור מזון 7,8. מקורות מזון של חיידקים אלה יכולים לבלבל את מחקרים ביוכימיים ורעלים עם הפרעות מחיידקי תוצרי המשפיעים על הפרשנות של תוצאות. על מנת להימנע מתופעות הרכבה אלה, ג יכול להיות מתורבת elegans בתקשורת נוזלית axenic כי הוא נטול חיידקים כמקור מזון. שימוש בתקשורת זו, אנו תרבית בהצלחה מיליוני תולעים מסונכרנים היטב עבור רבים ג הסטנדרטי פרוטוקולי elegans כולל ניתוח microarray של גנים מוסדרים באופן דיפרנציאלי בג elegans נחשף לריכוזי heme שונים, וייצור של תולעים מהונדסים באמצעות הפגזת גן. מדיה זו הגדרה כימית ושונה ממתכון מקורי שגובש על ידי ד&quot;ר אריק קלג 9. השימוש במדים mCeHR זה, זיהינו בהצלחה את הגנים מעורבים בהומאוסטזיס heme, המכונה גנים כheme מגיבים (HRG ים) 10, שהייתלא היה אפשרי בתנאי גידול רגילים אשר מנצלים צלחות אגר NGM seeded עם א &#39; coli. בפרוטוקול זה אנו מתארים את ההליך להחדרה ושמירה על ג elegans גדל על E. coli לmCeHR axenic ולנצל בשיטה זו כדי לקבל מספר גדול של תולעים לייצור ג המהונדס קווי elegans באמצעות הפגזת microparticle. אנחנו גם לימודים הנוכחיים המציגים את התועלת של שימוש במדים axenic לקביעת הדרישה התזונתית של ג elegans באמצעות heme לדוגמא ירושלים. מחקרים אלה מראים כי השימוש במדים mCeHR מאפשר צמיחה מהירה של מספר גדול של ג elegans עבור יישומים במורד הזרם רבים מנוצלים על ידי חוקרי תולעת.

<table><tbody><tr><td>MgCl2&#8226; 6H2O</td><td>Sigma</td><td>M-2393</td><td></td></tr><tr><td>נתרן ציטראט</td><td>Sigma</td><td>S-4641</td><td></td></tr><tr><td>אשלגן ציטראט מונוהידראט</td><td>Sigma</td><td>P-1722</td><td></td></tr><tr><td>CuClsub2&#8226; 2H2O</td><td>Fisher</td><td>C455-500</td><td></td></tr><tr><td>MnCl2&#8226; 4H2O</td><td>Fisher</td><td>M87-100</td><td></td></tr><tr><td>ZnCl2</td><td>Sigma</td><td>Z-0152</td><td></td></tr><tr><td>Fe(NH4)2(SO4)2&#8226; 6H2O</td><td>Sigma</td><td>F-1018</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2&#8226; 2H2O</td><td>פישר</td><td>C70-500</td><td></td></tr><tr><td>אדנוזין 5 -מונופוספט, מלח נתרן</td><td>סיגמא</td><td>A-1752</td><td></td></tr><tr><td>ציטידין 5 -פוספט</td><td>סיגמא</td><td>C-1006</td><td></td></tr><tr><td>גואנוזין 2' - ו-3' -מונופוספט</td><td>סיגמא</td><td>G-8002</td><td></td></tr><tr><td>אורידין 5 -פוספט, מלח דיסודיום</td><td>סיגמא</td><td>U-6375</td><td></td></tr><tr><td>תימין</td><td>סיגמא</td><td>T0376</td><td></td></tr><tr><td>N-אצטיל גלוקוזאמין</td><td>סיגמא</td><td>A3286</td><td></td></tr><tr><td>DL-אלנין</td><td>פישר</td><td>S25648&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>p-אמינו-בנזואית חומצה</td><td>סיגמא</td><td>A-9878</td><td></td></tr><tr><td>ביוטין</td><td>סיגמא</td><td>B-4639</td><td></td></tr><tr><td>ציאנוקובלמין (B-12)</td> <td>סיגמא</td><td>V-2876</td><td></td></tr><tr><td>פולינט (Ca)</td><td>Sigma</td><td>F-7878</td><td></td></tr><tr><td>ניאצין</td><td>סיגמא</td><td>N-0761</td><td></td></tr><tr><td>ניאצינמיד</td><td>סיגמא</td><td>N-3376</td><td></td></tr><tr><td>פנטתאין</td><td>סיגמא</td><td>P-2125</td><td></td></tr><tr><td>פנטותנט (Ca)</td><td>סיגמא</td><td>P-6292</td><td></td></tr><tr><td>חומצה פטרוילגלוטמית (חומצה פולית)</td> <td>ACRCS</td><td>21663-0100</td><td></td></tr><tr><td>פירידוקסל 5'-פוספט</td><td>סיגמא</td><td>P-3657</td><td></td></tr><tr><td>פירידוקסאמין 2HCl</td><td>סיגמא</td><td>P-9158</td><td></td></tr><tr><td>פירידוקסין הידרוכלוריד</td><td>סיגמא</td><td>P-6280</td><td></td></tr><tr><td>ריבופלבין 5-PO<תת>4</תת>(Na)</td><td>Sigma</td><td>R-7774</td><td></td></tr><tr><td>תיאמין הידרוכלוריד</td><td>סיגמא</td><td>T-1270</td><td></td></tr><tr><td>DL-6,8-חומצה תיאוקטית</td><td>סיגמא</td><td>T-1395</td><td></td></tr><tr><td>KH<תת>2</תת>PO<תת>4</td><td>Sigma</td><td>P-5379</td><td></td></tr><tr><td>כולין די-חומצה ציטראט</td><td>סיגמא</td><td>C-2004</td><td></td></tr><tr><td>myo-אינוזיטול</td><td>Sigma</td><td>I-5125</td><td></td></tr><tr><td>D-Glucose</td><td>Sigma</td><td>G-7520</td><td></td></tr><tr><td>Lactalbumin הידרוליזט אנזימטי</td><td>Sigma</td><td>L-9010</td><td></td></tr><tr><td>Brain Heart Infusion</td><td>BD</td><td>211065</td><td></td></tr><tr><td>Hemin chloride</td><td>Frontier Scientific</td><td>H651-9</td><td></td></tr><tr><td>HEPES, מלח נתרן</td><td>Sigma</td><td>H-3784</td><td></td></tr><tr><td>כולסטרול</td><td>J.T. Baker</td><td>F676-05</td><td></td></tr><tr><td>MEM חומצות אמינו לא חיוניות</td><td>Invitrogen</td><td>11140-076</td><td></td></tr><tr><td>MEM תמיסת חומצות אמינו</td><td>Invitrogen</td><td>11130-051</td><td></td></tr><tr><td>חומצה Nalidixic מלח נתרן</td><td>Sigma</td><td>N4382</td><td></td></tr><tr><td>טטרציקלין הידרוכלוריד</td><td>MP ביו-רפואי</td><td>2194542</td><td></td></tr><tr><td>מערכת אספקה ביוליסטית</td><td>BioRad</td><td>165-2257</td><td></td></tr><tr><td>חלקיקי זהב (אבקת Au)&nbsp;</td><td>&nbsp; Ferro Electronic Material Systems</td><td>6420 2504, חלקיקי JZP01010KM</td><td></td></tr><tr><td>או</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>זהב 1.0 &mu; מ</td><td>BioRad</td><td>&nbsp; 165-2263</td><td></td></tr></tbody></table>

culturing elegans caenorhabditis בaxenic נוזלית מדיה ובריאה של תולעים מהונדסים ידי microparticle הפצצה

Culturing Caenorhabditis elegans in Axenic Liquid Media and Creation of Transgenic Worms by Microparticle Bombardment

בפרוטוקול זה, אנו מציגים את החומרים דרושים, ואת ההליך להכנת C שונה. Legans דואר מדיה הרגלה והרבייה (mCeHR). בנוסף, הצעדים לחשיפה והתאקלמות ג elegans גדל על E. coli לaxenic תקשורת נוזלית מתוארים. לבסוף, ניסויים במורד הזרם לנצל ג axenic elegans להמחיש את היתרונות של הליך זה. היכולת לנתח ולקבוע ג הדרישה התזונתית elegans שהומחש על ידי גידול תולעים מסוג בר N2 בתקשורת נוזלית axenic עם ריכוזי heme שונים. הליך זה יכול להיות משוכפל עם חומרים מזינים אחרים כדי לקבוע את הריכוז האופטימלי לצמיחה והתפתחות או תולעת, כדי לקבוע את השפעות טוקסיקולוגי של טיפולים תרופתיים. ההשפעות של ריכוזי heme מגוונים על הצמיחה של תולעים מסוג בר נקבעו באמצעות תצפית מיקרוסקופית איכותית ועל ידי quantitating tהוא מספר התולעים שגדלו בכל ריכוז heme. בנוסף, ההשפעה של ריכוזים תזונתיים מגוונים ניתן assayed ידי ניצול תולעים המבטאים חיישני ניאון שמגיבים לשינויים בתזונתיים של עניין. יתרה מזאת, מספר גדול של תולעים יוצרו בקלות עבור הדור של elegans המהונדס ג באמצעות הפגזת microparticle.

Culturing ג elegans בעזרי axenic נוזל בינוניים בקביעה של חומרים מזינים הנדרשים על ידי תולעים, ללא הפרעה מצד מטבוליטים משניים המיוצרים על ידי א coli. תולעי wildtype N2 להתאקלם לתקשורת mCeHR בתוך שלושה דורות ולהציג צמיחה דומה לתולעים גדלו על צלחות חיידקי NGM. ואכן, התולעים אלה הופכים הרה להולדת בתוך 4 ימים לעומת 3.5 ימים לתולעים גדלו על OP50 חיידקים. אחד יתרונות של שימוש mCeHR היה לראות במחקרים שב...

סי אלגנס בדרך כלל הוא גדל על צלחות אגר מוצקות או נוזליים בתרבויות זרע עם א &#39; coli. כדי למנוע תוצרי לוואי חיידקים מבלבול מחקרי טוקסיקולוגי ותזונתיים, אנו מנוצלים מדיום נוזלי axenic, CeHR, לגדול ולסנכרן מספר רב של תולעים עבור מגוון רחב של יישומים במורד הזרם.

Culturing Elegans Caenorhabditis בAxenic נוזלית מדיה ובריאה של תולעים מהונדסים ידי microparticle הפצצה

In this protocol, we present the required materials, and the procedure for making modified&#160;C. elegans&#160;Habituation and Reproduction media ...

המטרה הכוללת של הליך זה היא להציג ולהצמיח אלגנטיות ים במדיה נוזלית CENIC עבור יישומים רבים במורד הזרם. זה מושג על ידי הלבנת תולעי קבר מצלחות אגר מורעבות. השלב השני של ההליך הוא העברת הביציות המשוחררות ל-M-C-E-H-R עם אנטיביוטיקה ולאפשר להן להתפתח לשלב החמור, שעשוי להימשך שבעה עד 10 ימים.השלב השלישי הוא הלבנת הקברים ומתן אפשרות להם להתפתח פעם שנייה לשלב הקבר ללא אנטיביוטיקה נוספת. השלב האחרון הוא סנכרון תולעי הגרזן וניצולן למחקרים תזונתיים הבוחנים גדילה והתפתחות של תולעים. בסופו של דבר, התוצאות מראות כי אלגנטיות פראית מסוג C גדלה היטב במדיה נוזלית של Axe וניתן להשתמש במדיה M-C-E-H-R כדי לבחון את הצרכים התזונתיים של התולעים ללא תוצרי לוואי חיידקיים.היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות כמו גידול תולעים על צלחות אגר או במדיה נוזלית עם חיידקים, הוא שניתן לבדוק את ההשפעות של אלמנטים תזונתיים או רעלים מבלי לבלבל תוצרי לוואי של חיידקים. בדרך כלל, אנשים חדשים בשיטה זו יתקשו בגלל הכנת המדיה וההתאמה הראשונית של התולעים למדיה הנוזלית של EMIC. הליך זה מתאר הכנת מדיה נוזלית M-C-E-H-R-A המאפשרת ל-C אלגנטיות לצמוח ללא מקור מזון חיידקי.באמצעות טכניקה סטרילית קפדנית מתחת למכסה המנוע, מערבבים את רכיבי ה-M-C-E-H-R בסדר הבא. התחילו עם כולין, חומצה דיאק ציטראט, והמשיכו עם הוויטמינים וגורם הגדילה. מערבבים את אצטול המיאו, הכלוריד האנושי, ואחרונים מוסיפים מים DI מסננים את תערובת M-C-E-H-R דרך מסנן של 0.22 מיקרון עם יניקה.לאחר מכן בסדר הבא, הוסף את חומצת הגרעין, ערבב את תערובת המינרלים, לקט, אלבומין, הידרוליזט, חומצות אמינו חיוניות, חומצות אמינו לא חיוניות, אשלגן פוספט, deg, ערימת גלוקוז, מלח נתרן ומי DI. כעת מסננים את התערובת שוב עם יניקה. לאחר הסינון, הוסף כולסטרול למדיה ולאחר מכן בדוק את ה-pH של כמות גדולה של מדיה.ה-pH צריך להיות בין 6 ל-6.5. אם התמיסה נעשתה כהלכה, הוסף נפח של 20% מהחלב המפוסטר למדיה M-C-E-H-R בטכניקה סטרילית קפדנית. אחסן את המדיה בארבע מעלות צלזיוס.הכינו 10 צלחות NGM 60 מילימטר מלאות בתולעי GR שצרכו את רוב ה-OP 50 E קולי הזמין. שוטפים את התולעים הללו לצינור חרוטי של 50 מיליליטר. השתמש בחמישה מיליליטר של מאגר M תשע לכל צלחת, אפשר לתולעים להתיישב ואז הסר בזהירות את הסופרנטנט.חזור על זה, שטוף פעמיים נוספות על ידי הוספת מאגר M nine, לאפשר לתולעים להתיישב ולהסיר את הסופרנטנט, ואז להוסיף שישה נפחים של 0.1 נתרן כלורי רגיל למצטבר התולעים עכשיו בהשוואה לתרחיף התולעת, הכינו תערובת של נפח אחד של חמישה נתרן הידרוקסיד רגיל ושני נפחים של אקונומיקה טרייה. פתרון: הלבינו את התולעים על ידי הוספת תערובת זו לתרחיף. המערבולת הבאה, התערובת עד להמסת התולעים החמורות ונשארות רק ביצים בתרחיף.זה לוקח בין חמש ל-10 דקות. השתמש במיקרוסקופ ניגודיות פאזה עם מטרה של פי 10 כדי לנטר תגובה זו בצינור. לאחר בידוד הביצים, גלולה אותן ב-800 גרם למשך 45 שניות ובארבע מעלות צלזיוס, שאפו את הסופרנטנט ושטפו את הכדור פעמיים ב-10 מיליליטר מים סטריליים במכסה המנוע, חזרו על הצנטריפוגה והשאיפה לשטיפות אלו.לאחר מכן, השעו מחדש את גלולת הביצה עם מדיה M-C-E-H-R והעבירו את הביצים המשוחררות לבקבוק תרבית רקמות. הוסף 100 מיקרוגרם למיליליטר טטרציקלין לביצים בבקבוק. שלב זה צריך להתבצע במכסה מנוע זרימה למינרית.באמצעות טכניקות סטריליות קפדניות, העבירו את התרביות הנוזליות לאינקובטור של 20 מעלות צלזיוס ותרבו אותן על פלטפורמה מסלולית. שייקר במהירות של 70 סל"ד עוקב אחר התפתחות התולעים מדי יום. לאחר שבעה עד 10 ימים, התולעת צריכה להתפתח לשלב Ravi, להעביר את התולעים לצינור חרוטי ולגלול אותן ב-800 גרם למשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס ברוטור דלי מתנדנד.לאחר שאיבת הסופרנטנט השעו מחדש את כדור התולעת בנפח אחד של 0.1 נתרן כלורי מולארי ואפשרו לתולעים להתיישב על הקרח למשך חמש דקות. כעת, חזור על הליך ההלבנה הנ"ל ותרבית את הביצים במדיה הנוזלית הצננית. כמו קודם, חיוני להשתמש בטכניקות סטריליות בעת טיפוח בן הברית של התולעים.הימנעות משימוש באנטיביוטיקה מבטיחה שתרביות האלגנטיות של הים אכן נקיות מחיידקים מזהמים. כאשר תהליך התרבות חוזר על עצמו, הדור השני פולט את הטטרציקלין מהתקשורת. בשלב זה ניתן להכין תרביות מסונכרנות לסנכרון.הוסיפו 10 מיליליטר של מאגר M nine לביצים ששוחררו לאחר הלבנה של תולעי GR, ואפשרו להן לבקוע בן לילה ב-20 מעלות צלזיוס על פלטפורמה מסלולית. שייקר למחרת, גלו את הזחלים ב-800 גרם למשך חמש דקות והשעו מחדש את זחלי ה-L. ב -10 מיליליטר M-C-E-H-R, העבירו את המתלים לבקבוק של 25 סנטימטר מרובע והגדילו אותם עד לצפיפותם המקסימלית.בדיקת צמיחת התולעים כל כמה ימים הכרחית כדי להבטיח שהתולעים לא יהיו צפופות מדי וידלדלו את חומרי המזון הזמינים בתקשורת. כדי לאחסן תרבית תולעי גרזן, יש להשעות כדור תולעים ב-0.5 מיליליטר של מאגר S בבקבוקוני אחסון, להוסיף נפח אחד של מאגר S עם 30% גליצרול. לאחר מכן מעבירים את הבקבוקונים ל-80 מעלות צלזיוס שליליות, ולאחר מכן אחסון לטווח ארוך בחנקן נוזלי כדי להפשיר את התולעים דוגרות על הבקבוקון ב-37 מעלות צלזיוס עד שכמעט כל הקרח נמס, מה שלוקח כשתי דקות.לאחר מכן, בתנאים סטריליים, העבר אותם בחזרה למדיה M-C-E-H-R. יתרון אחד של שימוש ב-M-C-E-H-R נראה במחקרים שבחנו את הדרישה התזונתית המדויקת להתפתחות תולעים. תולעים גודלו ב-M-C-E-H-R בתוספת כמויות הולכות וגדלות של הם כדי לקבוע רמות נמוכות ואופטימליות ורעילות של הם.בנוסף, נעשה שימוש בזן מדווח מגיב הם הפוך כדי להעריך בעקיפין את מצב ההם של התולעים בטווח ריכוזים קטן יותר. תולעים אלה שגדלו בארבעה הם מיקרו-מולארי הראו פלואורסצנטיות גבוהה המצביעה על כך שהתולעים היו בסביבת הם נמוכה. כאשר ריכוז הם הוגדל לשמונה מיקרומולר, ביטוי ה-GFP ירד.כאשר ריכוז הם הוגדל ל-10 מיקרומולר, התולעים הראו מעט מאוד ביטוי GFP, וב-20 מיקרו-מולרי של הם, הן לא הראו ביטוי GFP. בזמן ניסיון הליך זה, חשוב לזכור להשתמש בטכניקות סטריליות קפדניות כדי להבטיח שהתרביות אמיות וכדי למנוע זיהום חיידקי. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להיות מסוגל לגרום ל-M-C-E-H-R להקים ולתחזק תרבויות אלגנטיות ים קסנקס שניתן להשתמש בהן למספר רחב של יישומים, הדורשים מספר רב של אלגנטיות ים.

culturing-caenorhabditis-elegans-axenic-liquid-media-creation

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

וידאו זה מדגים את הטכניקה של microinjection לתוך בלוטת המין של C. elegans כדי ליצור חיות טרנסגניות.

הדור של Stable טראנסגנטי C. elegans שימוש Microinjection

תולעים טראנסגנטי משמשים בדרך...

דור טראנסגנטי ג elegans על ידי שינוי Biolistic

סרטון זה מתאר את העקרונות מאחורי הטיפול ב-RNAi ב-C. elegans ומדגים פרוטוקול להשמדת lin-35 בזן תולעים מהונדס.

ציפוי RNAi עבור C. elegans Feeding: טכניקה להשראת ביטוי dsRNA מטרה ב- E. coli

אנו מתארים שיטות ללמוד היבטים של amylopathies...

<em&gt; Elegans Caenorhabditis</em&gt; מערכת מודל לחקר Amylopathy

אנו מתארים כאן פרוטוקול מתוקן לתרבות בקנה מידה גדולה של ג העוברי elegans תאים. עוברי ג elegans תאים בתרבית במבחנה באמצעות שיטה זו, מופיעים כדי לבדל ולשחזר את הביטוי של גנים באופן ספציפי בתא. טכניקות הדורשות גישה ישירה לתאים או בידוד של סוגי תאים ספציפיים מרקמות האחרות יכולות להיות מיושמות על ג elegans תאים בתרבית.

שיטה לCulturing עוברי<em&gt; ג elegans</em&gt; תאים

פרוטוקול זה מתאר הליך מהיר וצריכת חומר נמוך לשילוב של מערכים חוץ-כרומוזומליים טרנסגניים בגנום Caenorhabditis elegans באמצעות קרינה אולטרה סגולה (UV). יתר על כן, פרוטוקול זה מתאים במיוחד לקווים טרנסגניים המשדרים מערכים חוץ-כרומוזומליים בקצב גבוה.

פרוטוקול מהיר לשילוב מערכים חוץ-כרומוזומליים עם קצב העברה גבוה לגנום C. elegans

פרוטוקול זה מתאר כיצד ללמוד תהליכים תאיים במהלך ההמרה גורל התא ב Caenorhabditis elegans ויוו. באמצעות בעלי חיים מהונדס, המאפשר ביטוי יזם מונחה חום-שוק של נוירון בתדר גורל שעתוק הגורם צ'ה-1 מציאה RNAi בתיווך דלדול של כרומטין מווסת גורם לין-53 נבט לתא נוירון התכנות יכול להיות שנצפו אין ויוו.<br...

היישום של RNAi חום-הלם-induced בביטוי פקטור שעתוק כדי לתכנת בתאי הנבט את הנוירונים C . elegans

אלגנס נמטודה מתיחה גנטית Caenorhabditis יכול לשמש מודל פשוט וזול לגילוי תרופות. מתואר כאן פרוטוקול לזיהוי טיפולי נגדים המעכבים את האיתות במורד הזרם של חלבוני RAS ו- EGFR.

זיהוי מעכבי EGFR ו- RAS באמצעות אלגנים של Caenorhabditis

נמטודות אנטומופתוגניות חיות בסימביוזה עם חיידקים ויחד הן מדביקות בהצלחה חרקים על ידי ערעור מערכת החיסון המולדת שלהן. כדי לקדם את המחקר על הבסיס הגנטי של זיהום נמטודות, מתוארות שיטות לשמירה ומניפולציה גנטית של נמטודות אנטומופתוגניות.

תרבות ומניפולציה גנטית של נמטודות אנטומופתוגניות

פרוטוקול זה מתאר שיבוש של 96 קידוחים של קאנורהבדיטיס אלגאן (Caenorhabditis elegans ) המיושבים בחיידקים בעקבות שיתוק קר והלבנת פני השטח כדי לסלק חיידקים חיצוניים. התרחיף המתקבל מצופה על לוחות אגר כדי לאפשר כימות מדויק בתפוקה בינונית של עומס חיידקים במספר גדול של תולעים בודדות.

שימוש בנתונים של תולעת בודדת כדי לכמת את ההטרוגניות באינטראקציות של Caenorhabditis elegans-Bacterial

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לתרבית נמטודות בודדות על מדיה מוצקה למעקב אחר פרמטרים פיזיולוגיים לכל החיים וכימות פלואורסצנטי. מערכת תרבית זו כוללת מחסום חומצה פלמיטית סביב בארות תולעים בודדות כדי למנוע מבעלי חיים לברוח, ומאפשרת שימוש בהתערבויות מרתיעות, כולל חיידקים פתוגניים וגורמי עקה כימיים.

תרבות ארוכת טווח של Caenorhabditis elegans בודדים על מדיה מוצקה לניטור פלואורסצנטי אורכי והתערבויות מרתיעות

למד לגדל Caenorhabditis elegans בתרבית נוזלית אקסנית ללא חיידקים. שיטה זו מאפשרת חקר צרכים תזונתיים וסינכרון אוכלוסיות תולעים למחקר מדויק בביולוגיה התפתחותית ונוירומדע.

Culturing Elegans Caenorhabditis בAxenic נוזלית מדיה ובריאה של תולעים מהונדסים ידי microparticle הפצצה

גלה סרטונים נוספים