Name: בVivo Microinjection וElectroporation של אשך העכבר (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-08-23T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 39 s
Description: למד שיטת מיקרו-הזרקה ואלקטרופורציה באשך העכבר לחקר ספרמטוגנזה ותפקוד אשכיים. פרוטוקול זה מאפשר שיבוש גנים מהיר ויעיל במחקר ביולוגיה רפרודוקטיבית.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים בירגיט Westernstroeer של המרכז של רפואת הפוריות והאנדרולוגי באוניברסיטת מינסטר להוראת microinjection האשכים. חוץ מזה, אנחנו מודים לאורסולה Antkewitz ופטרה Reckling לקבלת סיוע טכני. אנו מודים לקרן המחקר הגרמנית (DFG) לתמיכה בעבודה זו (WE2458 / 10-1). &#160;

כל הניסויים בבעלי החיים שבוצעו אושרו על ידי הוועדה המקומית האתיקה (Landesamt für Landwirtschaft, Lebensmittelsicherheit und Fischerei, מקלנבורג מערב פומרניה-, גרמניה). .1 פלסמיד הכנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להכנת פלסמיד, שימוש ערכות פלסמיד טיהור (ראה טבלת חומרים) או בשיטות דומות עם חיץ הסרת רעלן הפנימי כדי שניתן תהיה להימנע מתגובות חיסוניות של בעלי החיים. בצע את ההוראות של המדריך. להעסיק DDH 2 O כדי לדלל את פתרון פלסמיד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחסל את הפסולת על ידי ספינינג פתרון DNA במהירות המרבית (20,000 XG). ואז לאסוף את supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקבוע את ריכוז פלסמיד עם ספקטרופוטומטר (ראה חומרים). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאם את ריכוז פלסמיד עם DDH 2 O ל 1-3 מיקרוגרם (DNA) / μl. הערה: ריכוזים נמוכים יפחיתו את יעילות transfection, ואילו ריכוזים גבוהים יותר עלולים לגרום לפתרון הזרקה צמיג מדי. חוץ מזה,יעילות transfection תלוי בגודל של פלסמיד ולהיבדק בנפרד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני הזריקה, להכין תערובת פתרון עם לפלסמיד μl דוגמא 40 יחד עם 5 μl PBS (10x) ו -5 ירוקים μl מהיר (0.5%). גרין המהיר נחוץ למעקב אחר תהליך ההזרקה. רצוי, להשתמש PCR-צינורות קיר דקים או Parafilm. הערה: בהתאם לגודל של האשך, בהיקף של 20-50 μl יהיה צורך לכל אשך. </li></ol> 2 הכנת Microinjection פיפטה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בנימי ורוסיליקט (ראה טבלת חומרים) להכנת טפטפות microinjection. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> משוך נימי זכוכית עם חולץ נימים אנכי (ראה טבלת חומרים). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשבור את קצה נימים עם מלקחיים על ידי ברכות פסים. טיפ הוא בדרך כלל 50-80 מיקרומטר בקוטר ואורכו כ 1 סנטימטר. נסה להימנע מטיפים שהם ארוכים מדי כמו אלה הם לא נוקשה מספיק כדי לחדור את הרקמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבסוף, sharpen הקצה ב30 מעלות ל45 ° זווית באמצעות beveler micropipette (ראה טבלת חומרים). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טען את פיפטה microinjection עם לערבב פתרון הזרקה (ראה פלסמיד הכנה). ליישם את הפתרון לחלק האחורי של נימי הזכוכית עם מזרק קטן. הערה: נסה להימנע מבועות אוויר בעת טעינה, אחרת אלה יהיו להזריק לתוך אבוביות הזרע יחד עם פתרון פלסמיד, ולכן יפחית את המוליכות כמו גם ואולי לגרום נזק לרקמות. </li></ol> .3 הרדמה וניתוח <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע את הפעולה בתנאי ספטית על ידי שימוש בחומר סטרילי (כלומר, מזרק, מחט, מכשירי ניתוח, וכו &#39;). זה יקטין זיהום של בעלי החיים ולהבטיח שיעורי הישרדות טובים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בעכברי זכרים לelectroporation בגיל 6-8 שבועות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לאתחל טיפול משכך כאבים לאחר ניתוח, לספק את העכבר עם משככי כאבים הוסיף שתיית מים ביום לפני הניתוח. זה התחתures שיכוך כאבים מקדים במקרה של hypodipsia סבירות גבוהה שלאחר ניתוח (צריכת מים פחת). לשם כך, לחשוף את מי שתייה עם למשל השעיה איבופרופן ילדים (20 מ&quot;ג / מ&quot;ל). גם מי שתיית תרופות צריכים להיות מסופק ביום אחד ושתיים מהתאוששות בריכוז זהה. משמעות הדבר היא מנה יומית של 7.5 מ&quot;ג / קילוגרם, תקף למשקל 5 מ&quot;ל / מי שתיית ד וגוף של 25g במשך 8 שבועות בגילי C57BL / 6J. משטר משכך כאבים זה מבטיח הקלה על כאב בסיסית והתאוששות מואצת יחד עם גבוהה רווחה 26. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להכנת ההרדמה עובדת פתרון ביום של ניתוח, לערבב 10% Ketamin ו2% Xylazin ב1: 1 (ראה טבלת חומרים). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להרדים את החיה, להחיל משקל גוף 0.25 מ&quot;ל / 100 מ&quot;ג תת עורי הרדמה (Ketamin = 0.125 גר &#39;/ קילוגרם; Xylazin = 0.025 גר&#39; / קילוגרם). השתמש באתר הזרקה בין האגן וגפיים על מנת למנוע נזק לאיברים ולפציעתם של העכברים. בדרך כלל, יש צורך ב10 דקותעד העכבר בהרדמה עמוקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כסה את עיני עכבר עם משחה וטרינר כדי למנוע יובש במהלך הרדמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחן את מעצר הרדמה עמוק, שניכר על ידי היעדר מוחלט של תגובה. לשם כך, פשוט צובט את הבוהן של בעלי החיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להתחיל את הניתוח, להסיר שיער בבטן עם מכונת גילוח חשמלי או דומה ולחטא את אזור הפעולה עם sterilium או דומה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעשות חתך הגחון ישירות מעל בלוטות preputial במרכז אזור הבטן. באותו מקום, למשוך ראשון עור משם ולערוך בו קיצוץ רוחבי עורית קטנה של כ 8-14 מ&quot;מ. לאחר מכן, ימשיך לאורך שכבת שרירי הבטן. הערה: הנגע צריך להיות קטן ככל האפשר כדי להפחית את הפגיעה בבעלי החיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> משוך את רפידות שומן בבטן בזהירות כדי לחשוף את האשכים המצורפים והנח אותו על וילון לפני מוכן עמיד למים חד פעמי נייר ממש ליד אתר החתך (איור 2 א). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשתמש במשקפת לfind צינור efferent כמטרת ההזרקה. Efferent ductus מזוהה כצומת כלי דקה שבין האשכים ויותרת האשך. הוא ממוקם בסמוך לעורק אשכים הבולט. Ductus פועל כמעט בזווית של ° 45 לעורק ובעליל נכנס epididymidis Caput. הערה: בהתאם לגילו של העכבר, ductus בדרך כלל נקבר ברקמת שומן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש במלקחיים עדינים כדי לנקות את צינור efferent של רקמת השומן הזה. אחרי זה, למקם את ductus שוחרר ברצועת נייר סטרילי כדי להבטיח את הנראות ברורות של הצינור מבלי לפגוע בסביבה. </li></ol> .4 Microinjection וDNA Application <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חבר את פיפטה microinjection, אשר נטענה עם פתרון פלסמיד ליחידת micromanipulator / מזרק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את המחט המקבילה microinjection לצינור efferent עם הקצה והצביע לעבר אשך ךטה&quot; (איור 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בפינצטה בסדר ולהפשיט את הצינור מעל פיפטה microinjection. ודא שהנימים נשמרות במקביל לצינור תוך משיכתו מעל. הערה: הליך זה הוא נוח יותר מאשר לחדור לספינה על ידי הזזת המחט עם micromanipulator. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כוון את המחט בזהירות לכיוון האשכים ולעצור בדיוק כפי שחודר אשך ךטה&quot; ישירות מתחת לalbuginea Tunica (איור 2 ג). הערה: במקרה של overreaching אשך ךטה&quot;, פתרון פלסמיד ידלוף למרחב הבין. זה מוביל בדרך כלל לכישלון של transfecting אבוביות זרע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להזרקה של פתרון פלסמיד לנצל microinjector עם ההגדרות הבאות: pi: 100 hPa ti,: 0.2 שניות, ומחשב: 0 hPa (איור 2 ד). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפקח על כל תהליך ההזרקה על ידי התבוננות האשך מילוי מעמד בעזרת הצבע הירוק. תשמור על עצמך כי האשך מלא רק עד 2/3 שלה נפח עם plפתרון asmid (איור 2E). הערה: אם נפח ההזרקה הוא חריגה, רקמת האשך עלולה להיפגע. </li></ol> .5 Electroporation של אשך <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לאפשר electroporation היעיל, לספוג את האלקטרודות פינצטה בPBS (1x). הדבר מבטיח מוליכות נאותות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצורה חלקה לסחוט את האשך בין האלקטרודות הרטובות (איור 2F). מדוד את ההתנגדות החשמלית עם electroporator. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל נוכחי לאשך. לבצע שמונה פולסים מרובעים של 40 V ב 4 אתרי אשך שונים עם משך קבוע של 50 זמן דופק אלפיות שני ו950 מרווח זמן אלפיות שני. </li></ol> .6 סגירת פצעים ולאחר ניתוח <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר electroporation נגמר, הנח את האשכים בחזרה במיקום המקורי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לתפור את שכבת שרירים הפנימית עם תפר כירורגים (ראה חומרים). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סגור את העור על ידי שימוש בקטעי תפר (ראה טבלת חומרים). משוך את שנינות העור עדפינצטה h. ודא שלא לכלול את השכבה השרירית. הנח את קטעים, כל אחד במרחק של לא יותר מ 5 מ&quot;מ. הערה: מאחר ותפר כירורגים יכול להיבלע על ידי העכבר, קליפים תפר הם העדיפו לסגירת הנגע בעור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אפשר העכבר כדי להתאושש מהרדמה על מגבות נייר סטרילי להציב בכלוב סטרילי ריק עכבר, המזג על משטח חם 37 מעלות צלזיוס. הכרית צריכה להבטיח את ההתחממות של חצי אחד של כלוב יצירת שיפוע חום. לחיה זו מאפשרת לחפש את האזור הבודד, הכי הנוח בשל מגוון הטמפרטורה בכלוב. בנוסף, לכסות את העכבר עם גיליון של מגבת נייר סטרילי, כך שלחץ יכול להצטמצם עוד יותר. הערה: מאחר שמשטח גופו של העכבר הוא גבוה מרגיל ביחס למסת גוף, בהשוואה לבעלי חיים גדולים יותר, תמיכת התרמית היא בעלת חשיבות מיוחדת לשחזור מוצלח של מכרסמים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר בעלי החיים המופעלים התעוררו באופן מלא, להעביר it להמשך התאוששות בכלוב עכבר חדש מצויד לחלוטין. אין לשים את החיה חזרה לכלוב שלה ישן או לקבוצה של עכברים. ודא שהכלוב הוא נקי וסטרילי ככל האפשר כדי למנוע זיהום פצע. לפקח על תהליך ההתאוששות כולו. כדי להעביר את העכבר בחזרה למתקן הטיפול בבעלי החיים, לחכות עד שהוא התאושש לחלוטין ונראה שהתנהג בצורה נורמלית. הערה: per- נוסף ואסטרטגיות לאחר ניתוח נדונים על ידי אל פריצ&#39;ט-Corning KR et 6. </li></ol>

<ol><li>Reuter, K., Schlatt, S., Ehmcke, J., Wistuba, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fact+or+fiction%3A+In+vitro+spermatogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Spermatogenesis%22%5BJournal%5D)">Fact or fiction: In vitro spermatogenesis.</a> Spermatogenesis. 2, 245-252 (2012).</li>
<li>Hunter, D., Anand-Ivell, R., Danner, S., Ivell, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Models+of+in+vitro+spermatogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Spermatogenesis%22%5BJournal%5D)">Models of in vitro spermatogenesis.</a> Spermatogenesis. 2, 32-43 (2012).</li>
<li>Zizzi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((fluorescent+protein+as+indicator+of+nonviral+transient+transfection+efficiency+in+endometrial+and+testicular+biopsies%5BTitle%5D)+AND+%22Microsc.+Res.+Tech%22%5BJournal%5D)">fluorescent protein as indicator of nonviral transient transfection efficiency in endometrial and testicular biopsies.</a> Microsc. Res. Tech. 73, 229-233 (2010).</li>
<li>Williams, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Introduction+of+foreign+genes+into+tissues+of+living+mice+by+DNA-coated+microprojectiles%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Introduction of foreign genes into tissues of living mice by DNA-coated microprojectiles.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 88, 2726-2730 (1991).</li>
<li>Bockmann, R. A., de Groot, B. L., Kakorin, S., Neumann, E., Grubmuller, H., Kinetics, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((statistics%2C+and+energetics+of+lipid+membrane+electroporation+studied+by+molecular+dynamics+simulations%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">statistics, and energetics of lipid membrane electroporation studied by molecular dynamics simulations.</a> Biophys. J. 95, 1837-1850 (2008).</li>
<li>Pritchett-Corning, K. R., Luo, Y., Mulder, G. B., White, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Principles+of+rodent+surgery+for+the+new+surgeon%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Principles of rodent surgery for the new surgeon.</a> J. Vis. Exp. (47), (2011).</li>
<li>Brinster, R. L., Avarbock, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Germline+transmission+of+donor+haplotype+following+spermatogonial+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Germline transmission of donor haplotype following spermatogonial transplantation.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 91, 11303-11307 (1994).</li>
<li>Schlatt, S., Von, S. V., Schepers, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Male+germ+cell+transplantation%3A+an+experimental+approach+with+a+clinical+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Br.+Med.+Bull%22%5BJournal%5D)">Male germ cell transplantation: an experimental approach with a clinical perspective.</a> Br. Med. Bull. 56, 824-836 (2000).</li>
<li>Walantus, W., Castaneda, D., Elias, L., Kriegstein, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+utero+intraventricular+injection+and+electroporation+of+E15+mouse+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">In utero intraventricular injection and electroporation of E15 mouse embryos.</a> J. Vis. Exp. (6), (2007).</li>
<li>Matsui, A., Yoshida, A. C., Kubota, M., Ogawa, M., Shimogori, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+in+utero+electroporation%3A+controlled+spatiotemporal+gene+transfection%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Mouse in utero electroporation: controlled spatiotemporal gene transfection.</a> J. Vis. Exp. (54), (2011).</li>
<li>Blackshaw, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+electroporation+of+developing+mouse+retina%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">In vivo electroporation of developing mouse retina.</a> J. Vis. Exp. (52), (2011).</li>
<li>Yomogida, K., Yagura, Y., Nishimune, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electroporated+transgene-rescued+spermatogenesis+in+infertile+mutant+mice+with+a+sertoli+cell+defect%5BTitle%5D)+AND+%22Biol.+Reprod%22%5BJournal%5D)">Electroporated transgene-rescued spermatogenesis in infertile mutant mice with a sertoli cell defect.</a> Biol. Reprod. 67, 712-717 (2002).</li>
<li>Ryoki, S., Park, H., Ohmori, Y., Shoji-Tanaka, A., Muramatsu, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+integrase+facilitates+long-lasting+foreign+gene+expression+in+vivo+in+mouse+spermatogenic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biosci.+Bioeng%22%5BJournal%5D)">An integrase facilitates long-lasting foreign gene expression in vivo in mouse spermatogenic cells.</a> J. Biosci. Bioeng. 91, 363-367 (2001).</li>
<li>Umemoto, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+transfer+to+mouse+testes+by+electroporation+and+its+influence+on+spermatogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Androl%22%5BJournal%5D)">Gene transfer to mouse testes by electroporation and its influence on spermatogenesis.</a> J. Androl. 26, 264-271 (2005).</li>
<li>Muramatsu, T., Shibata, O., Ryoki, S., Ohmori, Y., Okumura, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Foreign+gene+expression+in+the+mouse+testis+by+localized+in+vivo+gene+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Biophys.+Res.+Commun%22%5BJournal%5D)">Foreign gene expression in the mouse testis by localized in vivo gene transfer.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 233, 45-49 (1997).</li>
<li>Hibbitt, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+gene+transfer+by+electroporation+allows+expression+of+a+fluorescent+transgene+in+hamster+testis+and+epididymal+sperm+and+has+no+adverse+effects+upon+testicular+integrity+or+sperm+quality%5BTitle%5D)+AND+%22Biol.+Reprod%22%5BJournal%5D)">In vivo gene transfer by electroporation allows expression of a fluorescent transgene in hamster testis and epididymal sperm and has no adverse effects upon testicular integrity or sperm quality.</a> Biol. Reprod. 74, 95-101 (2006).</li>
<li>Yamazaki, Y., Yagi, T., Ozaki, T., Imoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+gene+transfer+to+mouse+spermatogenic+cells+using+green+fluorescent+protein+as+a%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Zool%22%5BJournal%5D)">In vivo gene transfer to mouse spermatogenic cells using green fluorescent protein as a.</a> J. Exp. Zool. 286, 212-218 (2000).</li>
<li>Dhup, S., Majumdar, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenesis+via+permanent+integration+of+genes+in+repopulating+spermatogonial+cells+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Transgenesis via permanent integration of genes in repopulating spermatogonial cells in vivo.</a> Nat. Methods. 5, 601-603 (2008).</li>
<li>Huang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+transfection+of+testicular+germ+cells+and+transgenesis+by+using+the+mitochondrially+localized+jellyfish+fluorescent+protein+gene%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">In vivo transfection of testicular germ cells and transgenesis by using the mitochondrially localized jellyfish fluorescent protein gene.</a> FEBS Lett. 487, 248-251 (2000).</li>
<li>Majumdar, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+rapid+generation+of+transgenic+animals+to+evaluate+testis+genes+during+sexual+maturation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Reprod.+Immunol%22%5BJournal%5D)">A method for rapid generation of transgenic animals to evaluate testis genes during sexual maturation.</a> J. Reprod. Immunol. 83, 36-39 (2009).</li>
<li>Yomogida, K., Yagura, Y., Tadokoro, Y., Nishimune, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dramatic+expansion+of+germinal+stem+cells+by+ectopically+expressed+human+glial+cell+line-derived+neurotrophic+factor+in+mouse+Sertoli+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biol.+Reprod%22%5BJournal%5D)">Dramatic expansion of germinal stem cells by ectopically expressed human glial cell line-derived neurotrophic factor in mouse Sertoli cells.</a> Biol. Reprod. 69, 1303-1307 (2003).</li>
<li>Ike, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transient+expression+analysis+of+the+mouse+ornithine+decarboxylase+antizyme+haploid-specific+promoter+using+in+vivo+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Transient expression analysis of the mouse ornithine decarboxylase antizyme haploid-specific promoter using in vivo electroporation.</a> FEBS Lett. 559, 159-164 (2004).</li>
<li>Gonzalez-Gonzalez, E., Lopez-Casas, P. P., Del, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+silencing+by+RNAi+in+mouse+Sertoli+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Reprod.+Biol.+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Gene silencing by RNAi in mouse Sertoli cells.</a> Reprod. Biol. Endocrinol. 6, 29(2008).</li>
<li>Tang, H., Kung, A., Goldberg, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+murine+lactate+dehydrogenase+C+%28Ldhc%29+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Biol.+Reprod%22%5BJournal%5D)">Regulation of murine lactate dehydrogenase C (Ldhc) gene expression.</a> Biol. Reprod. 78, 455-461 (2008).</li>
<li>Yomgogida, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mammalian+testis%3A+a+target+of+in+vivo+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Growth+Differ%22%5BJournal%5D)">Mammalian testis: a target of in vivo electroporation.</a> Dev. Growth Differ. 50, 513-515 (2008).</li>
<li>Hayes, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Evaluation+of+Analgesic+Regimens+for+Abdominal+Surgery+in+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Assoc+Lab+Anim+Sci%22%5BJournal%5D)">An Evaluation of Analgesic Regimens for Abdominal Surgery in Mice.</a> J Am Assoc Lab Anim Sci. 6, 18-23 (2000).</li>
</ol>

מרטן מיכאליס, אלכסנדר Sobczak, ויואכים מ Weitzel מועסק במכון לביולוגיה של רבייה, לייבניץ המכון לביולוגיה חוות חיות (FBN), Dummerstorf, גרמניה, מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

מחקר בתחום הביולוגיה של רבייה, במיוחד בתחום של פריון ויצירת תאי זרע באופן בלתי נמנע זכר מסתמך על אורגניזמים חיים. על מנת לבחון תפקוד אשכים, אין תרבית תאים מתאימה / מערכת במבחנה כבר נקבעה מסוגל משקף את כל השינויים מורפולוגיים המכריעים מspermatogonium דיפלואידי ל1,2 תא זרע הבשל הפלואידים. כך, הדור של בעלי חיים מהונדסים גנטי הוא לעתים קרובות הכרחי וככלי רב ערך, כגון בביולוגיה של רבייה גברית. לשם כך, מספר לא מבוטל של מהונדס, עקום החוצה ולדפוק בעכבר...

יצירת תאי זרע של יונקים נחשב לתהליך מתוחכם של תאי גזע עצמי חידוש ברציפות עוברים מיטוזה, מיוזה ובידול על מנת להתפתח לתאי זרע הפלואידים בוגרים. שינויים מורפולוגיים אלה בניצוחו של תאים מסוגים שונים ולמרות ניסיונות עמוקים, זה עדיין בלתי אפשרי לחקות את התהליכים הללו בתא התרבות 1,2. לפיכך, מחקר על יצירת תאי זרע עד עכשיו מסתמך על אורגניזמים חיים כמודלים in vivo. באופן כללי, מחקרי תפקוד הגן מבוססים בדרך כלל על בעלי חיים מהונדסים. עם זאת, יצירה והשמירה של מודל חיה מסוג זה היא זמן רב, עלות אינטנסיבית ומורכבת למדי. זה מיוחס לתהליך הרבייה הארוך הנדרש ליצירת ושמירה על transgene לאורך הדורות. בנוסף, המניפולציה הגנטית של האורגניזם כולו על ידי הגישה המהונדס או נוק אאוט הוא נוטה לגרום לליקויים פיסיולוגיים כאשר מיקוד גרםenes עם פונקציות חיוניות באזורים רבים, למשל, מחוץ לאשך או מערכתי. יתר על כן, כמה שיטות transfection חולפות קשורות עם כמה חסרונות קריטיים. לדוגמא, חסרונות אופייניים להעברת גנים בתיווך וירוס הם הפרובוקציה האפשרית של immunoreactions ותקנות בטיחות נוספות, ואילו lipofection 3 וmicroparticle הפגזה 4 עלולה לגרום נזק לרקמות ומוגבלות לעומק תא מסוים ליעילות transfection מספיק. בניגוד לכך, electroporation (EP) כדרך נוספת נפוצה של transfection החולף נראה, להוות טכניקה מבטיחה למאפשר בtransfection vivo וin vivo ניתוח גנטי עולה בקנה אחד. באופן כללי, EP נקרא תופעה דינמית שתלוי במתח הטרנסממברני מקומי עם נקבוביות בתיווך כתוצאה מכך בתוך ננו שניות. t פערים אלה יכולים להישמר במשך אלפיות השניה, מספיקo להעניק גישה לDNA, RNA או מולקולות קטנות 5. כאשר המתח שיושם הוא גבוה מדי, האופי בדרך כלל החולף של EP הוא נוטרל עקב ייצור חום ואינדוקציה של permeabilization המקיף מדי עם נזק בלתי הפיך הסוגר של התא 5. כאן, אנו מראים כי electroporation הוא מערכת transfection יעילה וחסכונית שהוא מסוגל להיות מנוצל לשינוי אשך גנטי כדי להבהיר מאפיינים גנטיים אשכי in vivo. מאמר זה עוסק הכנת פלסמיד, microinjection באמצעות צינור efferent וelectroporation הבא של אשך עכבר. הליך זה יכול להיות האמצעי של בחירה כדי להשיג transfection מהיר, ספציפי והיעיל של אבוביות זרע של אשך עכבר in vivo כדי לחקור תהליכים של יצירת תאי זרע.

<table><tbody><tr><td>צנטריפוגה</td><td>סיגמא</td><td>1-15 PK</td><td></td></tr><tr><td>ספקטרופוטומטר</td><td>Nanodrop</td><td>ND-1000</td><td></td></tr><tr><td>חולץ מיקרופיפטה</td><td>Narishige</td><td>PC-10</td><td>חולץ נימי אנכי</td></tr><tr><td>מיקרו-הזרקה נימים</td><td>קלארק</td><td>GC100-10</td><td>בורוסיליקט קיר</td></tr><tr><td>סטנדרטי מיקרופיפטה beveler</td><td>Bachofer</td><td>Typ 462</td><td>דיסק מסתובב beveler</td></tr><tr><td>אלקטרופורטור</td><td>Nepagene</td><td>CUY 21EDIT</td><td>גל מרובע אלקטרופורטור</td></tr><tr><td>פינצטה אלקטרודות</td><td>Nepagene</td><td>CUY 650P5</td><td>5 מ"מ &Oslash; אלקטרודות דיסק</td></tr><tr><td>מיקרוסקופ סטריאו</td><td>Zeiss</td><td>Stemi 2000-C</td><td></td></tr><tr><td>מקור אור קר</td><td>Zeiss</td><td>KL 1500LCD</td><td></td></tr><tr><td>משאבת מיקרו הזרקה</td><td>Eppendorf</td><td>Femtojet</td><td></td></tr><tr><td>מיקרומניפולטור</td><td>תוצרת בית</td><td></td><td>XYZ שולחן צולב</td></tr><tr><td>מכשירים כירורגיים</td><td>FST</td><td></td><td>מספריים, מלקחיים, מחזיק מחט</td></tr><tr><td>מלקחיים עדינים</td><td>FST</td><td>Dumont #5, #7</td><td>הכנת תעלות משפיעה</td></tr><tr><td>קליפ מישל מריחת מהדק</td><td>FST</td><td>מישל, 12029-12</td><td></td></tr><tr><td>קליפס תפר מישל</td><td>FST</td><td>מישל, 12040-01</td><td>7.5 x 1.75 מ"מ</td></tr><tr><td>תפר כירורגי</td><td>Catgut, Markneukirchen, גרמניה</td><td>מזרק Catgut 00</td><td></td></tr><tr><td>עם מחט 30 G</td><td>B. Braun</td><td>Omnican 40</td><td>לטעינת מיקרופיפטה ולהרדמה</td></tr><tr><td>ערכת בידוד פלסמיד</td><td>Promega</td><td>Cat. # A2495</td><td>פלסמיד Midiprep</td></tr><tr><td>פלסמיד pEGFP-C1</td><td>Clontech</td><td>Cat. #6084-1</td><td>מקדם CMV + EGFP</td></tr><tr><td>פלסמיד pDsRed2-N1</td><td>Clontech</td><td>Cat. #6084-1</td><td>מקדם CMV + DsRed2</td></tr><tr><td>צבע ירוק מהיר</td><td>Sigma</td><td>F7258-25G</td><td>לדילול ב-ddH2O</td></tr><tr><td>10%</td><td>סרום קטמין Werk, ברנבורג, גרמניה</td> תערובת <td>אורוטמין</td><td>בשיעור 1:1 עם קסילזין</td></tr><tr><td>2%</td><td>סרום קסילזין Werk, ברנבורג, גרמניה</td> תערובת <td>קסילזין</td><td>בשיעור 1:1 עם קטמין</td></tr><tr><td>סטריליום</td><td>Bode Chemie</td><td></td><td>חיטוי</td>סטריליום</tr><tr><td>משחה וטרינרית</td><td>S& K Pharma, GmbH</td><td>Kerato Biciron 5%, Augensalbe</td><td>משחה אופטית למניעת יובש בעיניים</td></tr><tr><td>To-Pro-3 יודיד</td><td>Invitrogen</td><td>T3605</td><td></td></tr><tr><td colspan="4"><חזק>10x PBS, pH 7.4</חזק></td></tr><tr><td>1.37 M NaCl</td><td>Carl Roth</td><td>3957.1</td><td></td></tr><tr><td>איבופרופן, דולורמין</td><td>ג'ונסון & Johnson Consumer Health Care גרמניה</td><td>01094902</td><td>תמיסת משכך כאבים לילדים (NSAID) לשיכוך כאבים לאחר ניתוח</td></tr><tr><td>27 מ"מ KCl</td><td>Carl Roth</td><td>6781.1</td><td></td></tr><tr><td>100 מ"מ Na2HPO4&middot; 2H2O</td><td>Carl Roth</td><td>T106.2</td><td></td></tr><tr><td>18 mM KH2PO4</td><td>Carl Roth</td><td>3904.1</td><td></td></tr></tbody></table>

בvivo microinjection וelectroporation של אשך העכבר

In Vivo Microinjection and Electroporation of Mouse Testis

תרומת וידאו ומאמר זה נותנת תיאור מקיף של microinjection וelectroporation של אשך עכבר in vivo. טכניקת transfection המסוימת הזה לתאי עכבר אשכים מאפשרת המחקר של תהליכים ייחודיים ביצירת תאי זרע. הפרוטוקול הבא מתמקד בtransfection של תאי עכבר אשכים עם בונה פלסמיד. באופן ספציפי, אנו משמשים וקטור הכתב pEGFP-C1, המבטא משופר חלבון ירוק ניאון (eGFP) וגם וקטור pDsRed2-N1 לבטא חלבון אדום ניאון (DsRed2). שני גני הכתב המקודדים היו תחת שליטתו של אמרגן ציטומגלווירוס האנושי מיידי מוקדם (CMV). לביצוע העברת גנים לתוך אשכים עכבר, בונה פלסמיד הכתב מוזרקות לתוך אשכים של עכברים חיים. לשם כך, האשכים של בעלי חיים מורדמים חשופים והאתר של microinjection מוכן. המקום המועדף שלנו שלהזרקה היא צינור efferent, עם אשך ךטה&quot; מחובר סופו של דבר כדרך תחבורה האנטומי של תאי הזרע בין האשך ויותרת האשך. בדרך זו, המילוי של אבוביות הזרע לאחר microinjection מנוהל מצוין ומבוקר בשל השימוש בפתרוני DNA מוכתם. לאחר התבוננות מילוי מספק של האשך על ידי מבנה אבובית הצבעוני שלה, האיבר electroporated. זה מאפשר ההעברה של פתרון דנ&quot;א לתוך תאי האשכים. בעקבות 3 ימים של דגירה, האשכים מוסרים ונחקרים תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי ירוק או אדום, הממחישים את ההצלחה transfection. באופן כללי, פרוטוקול זה יכול להיות מועסק להעברת דנ&quot;א או RNA- בונה לאשך עכבר חיים כדי (מעל) להביע או להפיל את הגנים, להקל בניתוח תפקוד גן vivo. יתר על כן, הוא מתאים ללימוד מושגי כתב או regula גן המשועראלמנטי טורים. לפיכך, היתרונות העיקריים של טכניקת electroporation הם ביצועים מהירים בשילוב עם מאמץ נמוך, כמו גם הציוד הטכני המתון וכישורים הנדרשים בהשוואה לטכניקות חלופיות.

ההגדרה הניסיונית לביצוע microinjection וelectroporation של אשך עכבר in vivo כפי שהוא משמש על פי הפרוטוקול מתוארת באיור 1. למרות שזה אפשרי לרכוש micropipettes תעשייתי מיוצר, העדפנו ליצור טפטפות שלנו על ידי משיכת (איור 1 א ) וbeveling (איור 1 ב) נימי זכוכית, כך שהם מצוידים הצרכים שלנו. הציוד לmicroinjection וelectroporation מתואר באיור 1 ג. מסיבות של יעילות transfection, יש חשיבות לנצל electroporator גל מרו...

מאמר זה מתאר microinjection וelectroporation של אשך עכבר in vivo כטכניקת transfection לתאי עכבר אשכים ללמוד תהליכים ייחודיים של יצירת תאי זרע. הפרוטוקול המובא כרוך בצעדים של הכנת זכוכית נימים, microinjection באמצעות צינור efferent, וtransfection ידי electroporation.

בVivo Microinjection וElectroporation של אשך העכבר

This video and article contribution gives a comprehensive description of microinjection and electroporation of mouse testis in vivo. This particular ...

מטרת הליך זה היא לבצע מיקרו-הזרקה של מבנים גנטיים לתוך אשך העכבר, ולאחר מכן אלקטרופורציה של InVivo. זה מאפשר ביצוע ניתוח גנים מקיף עם התמקדות בזרע ותפקוד האשכים. זה מושג על ידי קבלת גישה תחילה לאשך דרך חתך בטן ישירות מעל בלוטות PrepU.השלב השני הוא הכנת צינור הזרימה המחובר לאשך למיקרו-הזרקה על ידי שחרור הכלי מרקמת השומן שלו. לאחר מכן, צינור אף אוזן גרון מנוקב עם פיפטה מיקרו-הזרקה טעונה, ותמיסת המבנה הגנטי של הכתם ניתנת לצינורות הברזל של האשכים. השלב האחרון הוא טרנספקציה אלקטרופורציונית רב-צדדית של האשך.בסופו של דבר, האשך המועבר מופק לאחר שלושה ימים על מנת להעריך את הטרנספקציה על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי או על ידי מדידות לומינומטר בהתאם למבני הגנים המדווחים המנוצלים. שילוב זה של טכניקת פעולת אינטלקט מיקרו-הזרקה לאשך עכבר כשיטות טרנספקציה חולפות בהחלט יספק יתרונות רבים על פני גישות קיימות כמו בעלי חיים טרנסגניים או עכברי נוק-אאוט. זה מבטיח ביצועים מהירים, עלות נמוכה וצורך במיומנויות טכניות מתונות בלבד.גישה מתודולוגית זו יכולה להיות חכמה לטכניקה זמינה בתחום חקר פוריות הגבר. זה עשוי להיות מועיל בעיקר לטיפול בספקטרום רחב של נושאים הנוגעים לגני ניסוי ותהליכי פוריות. זה יהיה אפשרי במיוחד כאשר משתמשים בשיטה זו לניתוח גנטי בצורה של רווח של כל ניסויי אובדן התפקוד.יש להניח שהוא יהיה שימושי מא

in-vivo-microinjection-and-electroporation-of-mouse-testis

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

בשנת הזרקה תוך חדרי ברחם ו electroporation E15 של עוברי עכברים

אנו מתארים נהלים מפורטים transfection היעילה של DNA פלסמיד לתוך הסיבים של שרירי כף הרגל של עכברים חיים באמצעות electroporation ואת להדמיה הבאות של ביטוי חלבון באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי.

ה-DNA transfection של שרירי השלד היונקים באמצעות In vivo Electroporation

Transfection של תאים עכבר רשתית גנגליון על ידי In vivo Electroporation

שיטה שילוב של פלסמיד דנ"א לתוך תאים ברשתית Murine לצורך ביצוע או רווח או הפסד של מחקרים...

ב electroporation vivo של הרשתית עכבר פיתוח

העברת גן שיטה למוח עכבר בפיתוח מתואר באמצעות שיטה ניתוחית ייחודית צורה מיוחדת של אלקטרודות. זו טכניקה ייחודית זו מאפשרת transfection של DNA פלסמיד temporally מרחבית, אשר יסייעו מדעני מוח רבים בחקר התפתחות המוח.

עכבר בתוך הרחם Electroporation: ג&#39;ין מבוקרת transfection Spatiotemporal

האוזן הפנימית העכבר הוא איבר placode הנגזרות חושית אשר התפתחותית תוכנית מפורטת במהלך ההריון. אנו...

ין העברת לאוזן הפנימית על ידי פיתוח מאוס<em&gt; In vivo</em&gt; Electroporation

ב electroporation חוץ גופית של השפה Rhombic התחתון של עוברי עכברים Midgestation

אנו מתארים שיטה למסירה של הדנ א פלסמיד לתאים urothelial של העכבר שלפוחית השתן ויוו דרך השופכה צנתור אלקטרופורציה. הוא מציע דרך נוחה ומהירה ליצירת מודלים העכבר autochthonous של מחלות שלפוחית השתן.

הרומן שיטת המסירה דנ א פלסמיד העכבר Urothelium שלפוחית השתן על ידי אלקטרופורציה

כאן, אנו מציגים פרוטוקול כדי להעריך את תקינות מחסום דם-testis על ידי הזרקת אינולין-FITC לתוך האשכים. זוהי שיטה יעילה ויוו ללמוד שלמות מחסום דם testis. זה יכול להיות בסכנה על ידי אלמנטים גנטיים וסביבתיים.

שיטת In Vivo ללמוד העכבר דם Testis מכשול שלמות

מאמר זה מדווח על עיכוב in vivo של CENP-E באמצעות ניתוח בטן והזרקת GSK923295 באשכים, מודל רב ערך לחלוקה מיוטית גברית. באמצעות בדיקות אימונופלואורסצנטיות, ציטומטריית זרימה ומיקרוסקופ אלקטרונים תמסורת, אנו מראים כי עיכוב CENP-E גורם לחוסר תיאום כרומוזומים וחוסר יציבות גנומית בזרעונים של עכברים.

הערכה תפקודית של קינזין-7 CENP-E בזרעונים באמצעות עיכוב Vivo , אימונופלואורסנציה וציטומטריית זרימה

פרוטוקול זה מתאר מיקרו-הזרקה ואלקטרופורציה in vivo לעריכת גנום בתיווך קריספר מוגבלת אזורית באובידוקט העכבר.

מודלים של עכברים מהונדסים בגנום סומטי המשתמשים במיקרו-הזרקה ובאלקטרופורציה של Vivo

למד שיטת מיקרו-הזרקה ואלקטרופורציה באשך העכבר לחקר ספרמטוגנזה ותפקוד אשכיים. פרוטוקול זה מאפשר שיבוש גנים מהיר ויעיל במחקר ביולוגיה רפרודוקטיבית.

בVivo Microinjection וElectroporation של אשך העכבר

גלה סרטונים נוספים