בVivo Microinjection וElectroporation של אשך העכבר

מאמר זה מתאר microinjection וelectroporation של אשך עכבר in vivo כטכניקת transfection לתאי עכבר אשכים ללמוד תהליכים ייחודיים של יצירת תאי זרע. הפרוטוקול המובא כרוך בצעדים של הכנת זכוכית נימים, microinjection באמצעות צינור efferent, וtransfection ידי electroporation.

מטרת הליך זה היא לבצע מיקרו-הזרקה של מבנים גנטיים לתוך אשך העכבר, ולאחר מכן אלקטרופורציה של InVivo. זה מאפשר ביצוע ניתוח גנים מקיף עם התמקדות בזרע ותפקוד האשכים. זה מושג על ידי קבלת גישה תחילה לאשך דרך חתך בטן ישירות מעל בלוטות PrepU.

השלב השני הוא הכנת צינור הזרימה המחובר לאשך למיקרו-הזרקה על ידי שחרור הכלי מרקמת השומן שלו. לאחר מכן, צינור אף אוזן גרון מנוקב עם פיפטה מיקרו-הזרקה טעונה, ותמיסת המבנה הגנטי של הכתם ניתנת לצינורות הברזל של האשכים. השלב האחרון הוא טרנספקציה אלקטרופורציונית רב-צדדית של האשך.

בסופו של דבר, האשך המועבר מופק לאחר שלושה ימים על מנת להעריך את הטרנספקציה על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי או על ידי מדידות לומינומטר בהתאם למבני הגנים המדווחים המנוצלים. שילוב זה של טכניקת פעולת אינטלקט מיקרו-הזרקה לאשך עכבר כשיטות טרנספקציה חולפות בהחלט יספק יתרונות רבים על פני גישות קיימות כמו בעלי חיים טרנסגניים או עכברי נוק-אאוט. זה מבטיח ביצועים מהירים, עלות נמוכה וצורך במיומנויות טכניות מתונות בלבד.

גישה מתודולוגית זו יכולה להיות חכמה לטכניקה זמינה בתחום חקר פוריות הגבר. זה עשוי להיות מועיל בעיקר לטיפול בספקטרום רחב של נושאים הנוגעים לגני ניסוי ותהליכי פוריות. זה יהיה אפשרי במיוחד כאשר משתמשים בשיטה זו לניתוח גנטי בצורה של רווח של כל ניסויי אובדן התפקוד.

יש להניח שהוא יהיה שימושי מאוד גם לחקירת אלמנטים רגולטוריים של, למשל, גנים ספציפיים לזרע. כדי להתחיל בהליך, יש להרדים עכבר זכר בן שישה עד שמונה שבועות עם תערובת אחד לאחד של 10% קטמין ו-2% קסילזין תת עורית. לאחר מכן ודא שהעכבר נמצא בהרדמה עמוקה על ידי צביטה בבוהן.

מרחו משחה על העיניים כדי למנוע יובש. לאחר מכן, הסר את שיער הבטן בעזרת מכונת גילוח חשמלית וחטא את אזור הניתוח לאחר מכן. בצע חתך גחוני ישירות מעל בלוטות PrepU במרכז אזור הבטן.

לשם כך, משוך את העור ובצע חתך עורי רוחבי קטן. לאחר מכן המשיכו לאורך שכבת שרירי הבטן. משוך את רפידות השומן הבטני בזהירות כדי לחשוף את האשך המצורף והנח אותו על נייר סטרילי על הבטן.

לאחר מכן, השתמש במיקרוסקופ סטריאו כדי למצוא את צינור אף אוזן גרון להזרקת מיקרו. זהו צומת כלי הדם העדין בין האשך לאפידידימוס, והוא ממוקם בסמוך לעורק האשכים. הסר את רקמת השומן המכסה את צינור אף אוזן גרון בעזרת מלקחיים עדינים.

לאחר מכן, הנח את צינור השחרור על רצועת נייר סטרילית, וודא שהצינור נראה בקלות מבלי לפגוע בסביבה. בהמשך, חבר את פיפטת המיקרו-הזרקה, שהועמסה בתמיסת הפלסמיד הצבעונית בעבר ליחידת מזרק המיקרו מניפולטור. לאחר מכן, הנח את מחט המיקרו הזרקה במקביל לצינור EENT כשהקצה מצביע לכיוון אשך ה-REIT.

לאחר מכן השתמש בפינצטה עדינה כדי להפשיט את הצינור מעל פיפטת המיקרו-הזרקה. ודא שהפיפטה נשמרת במקביל לתעלה תוך כדי משיכתה. כוון את המחט בזהירות לכיוון האשך ועצור בדיוק כשהיא חודרת לאשך REIT ישירות מתחת לטוניקה אלבוגינאה.

לאחר מכן, הגדר את הפרמטרים של מזרק המיקרו. לאחר מכן, התחל להזריק את תמיסת מבנה הגן. עקוב אחר כל תהליך ההזרקה על ידי התבוננות במצב מילוי האשכים.

בעזרת תמיסת הפלסמיד הצבעונית, בנה את האשךהוא רק עד שני שליש מנפחו. כדי לאפשר אלקטרופורציה יעילה. השרו את אלקטרודות הפינצטה בפעם אחת PBS כדי להבטיח מוליכות נאותה.

לאחר מכן סחטו את הבדיקה מעט בין האלקטרודות הרטובות ומדדו את ההתנגדות החשמלית בעזרת האלקטרו פרטה. לאחר מכן, הגדר את האלקטרו כראוי וודא שניתן להפעיל זרם על האשך עם מספר כולל של שמונה פולסים מרובעים. בארבעה אתרי אשכים שונים, בצע את האלקטרופורציה באופן מקיף סביב האשך כולו.

לאחר סיום האלקטרופורציה, הנח את האשך בחזרה לבטן קרוב ככל האפשר למיקומו המקורי. אז השכבה השרירית הפנימית הייתה תפר כירורגי נספג. לאחר מכן סגור את העור בעזרת קליפס תפרים.

אפשר לעכבר להתאושש מההרדמה. בקופסה סטרילית שחוממה על כרית חום של 37 מעלות צלזיוס, שהוכנה עם כמה מגבות נייר. הכרית אמורה להבטיח התחממות של מחצית אחת בלבד מהכלוב וליצור שיפוע חום.

בנוסף, כסו את העכבר בדף נוסף של מגבת נייר כדי להפחית עוד יותר את הלחץ. לאחר שהחיה מתעוררת במלואה, העבירו אותה לכלוב חדש נקי ומאובזר לחלוטין. אבל התאוששות נוספת, עקוב אחר תהליך ההתאוששות עד שתחזיר את העכבר למתקן החיות.

איור זה מראה את כל אשכי ההר שלושה ימים לאחר אלקטרופורציה in vivo על ידי זיהוי פלואורסצנטי, האשכים המועברים של עכבר C 57 שחור שישה מראים חלבון פלואורסצנטי ירוק משופר או חלבון פלואורסצנטי אדום מוצג. להלן החלקים ההיסטולוגיים של אשך. שלושה ימים לאחר אלקטרופורציה חד צדדית עם PE eeg, FPC אחד, תאי הצינוריות הזעיריים הטרנספטנטיים מודגמים על ידי פלואורסצנטיות ירוקה, יחד עם המבנה המאורגן הכדורי האופייני שלהם.

הגרעינים שלהם היו מכתמים נגדיים עם שניים פרו שלושה בכחול. בזמן שאתה מבצע הליך זה, חשוב לזכור שתהליכי זיהוי צינור אף אוזן גרון ושחרור רקמת השומן שלו הם מתוחכמים למדי. לכן, אתה יכול להתאמן תחילה על בעלי חיים מתים לפני שתשיג חוויה אמיתית in vivo.

בעקבות האנטי-הליך של אלקטרופורציה במיקרו-הזרקה וקצירת בדיקה סופית, ניתן לבצע טכניקות רבות כמו ספינת Q-R-T-P-C-R ו-Western Blotting. לפיכך, שינינג של גן הבודק הם דפוסי ביטוי חלבון כמו גם שינויים לאחר תרגום הם מובנים מאליהם. אז באמצעות הכלים האלה, מגוון עצום של נושאים עשויים להיות מותקפים כמו זרע זרע, למשל, עם המנגנונים והתקנות המורכבים הבסיסיים שלו.