Name: חזותי אנדוציטוזה בתיווך clathrin של רצפטורים מצמידים חלבון G בהחלטה חד אירוע באמצעות TIRF מיקרוסקופית (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-10-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 40 s
Description: חקור את דינמיקת שקעי clathrin בודדים בתאים חיים באמצעות מיקרוסקופיית TIRF. שיטה זו מאפשרת ניתוח כמותי של אנדוציטוזה בתיווך clathrin ותיאום מנגנוני ספיגת חלבונים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים רוצים להודות לד"ר C. Szalinski, H. Teng ו-M. Bruchez על העזרה עם Imaris, R. Vistein ו-D. Shiwarski על העזרה הטכנית והייעוץ, ולד"ר M von Zastrow, Dr. T Kirchhausen, Dr. D Drubin ו-Dr. W Almers על ריאגנטים ודיון מועיל. המימון הניתן על ידי מענק T32 NS007433 ל-SLB ו-NIH DA024698 ו-DA036086 ל-MAP.

<ol><li>McMahon, H. T., Boucrot, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanism+and+physiological+functions+of+clathrin-mediated+endocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanism and physiological functions of clathrin-mediated endocytosis.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 12 (8), 517-533 (2011).</li>
<li>Kaksonen, M., Toret, C. P., Drubin, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Modular+Design+for+the+Clathrin-+and+Actin-Mediated+Endocytosis+Machinery%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A Modular Design for the Clathrin- and Actin-Mediated Endocytosis Machinery.</a> Cell. 123 (2), (2005).</li>
<li>Taylor, M. J., Perrais, D., Merrifield, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+High+Precision+Survey+of+the+Molecular+Dynamics+of+Mammalian+Clathrin-Mediated+Endocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biology%22%5BJournal%5D)">A High Precision Survey of the Molecular Dynamics of Mammalian Clathrin-Mediated Endocytosis.</a> PLoS Biology. 9 (3), (2011).</li>
<li>Ungewickell, E., Branton, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assembly+units+of+clathrin+coats%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Assembly units of clathrin coats.</a> Nature. 289 (5796), 420-422 (1981).</li>
<li>Bliek, A. M., Meyerowrtz, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamin-like+protein+encoded+by+the+Drosophila+shibire+gene+associated+with+vesicular+traffic%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Dynamin-like protein encoded by the Drosophila shibire gene associated with vesicular traffic.</a> Nature. 351 (6325), (1991).</li>
<li>Hinshaw, J. E., Schmid, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamin+self-assembles+into+rings+suggesting+a+mechanism+for+coated+vesicle+budding%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Dynamin self-assembles into rings suggesting a mechanism for coated vesicle budding.</a> Nature. 374 (6518), (1995).</li>
<li>Merrifield, C. J., Perrais, D., Zenisek, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coupling+between+Clathrin-Coated-Pit+Invagination%2C+Cortactin+Recruitment%2C+and+Membrane+Scission+Observed+in+Live+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Coupling between Clathrin-Coated-Pit Invagination, Cortactin Recruitment, and Membrane Scission Observed in Live Cells.</a> Cell. 121 (4), 593-606 (2005).</li>
<li>Grabs, D., Slepnev, V. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+SH3+domain+of+amphiphysin+binds+the+proline-rich+domain+of+dynamin+at+a+single+site+that+defines+a+new+SH3+binding+consensus+sequence%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+biological+chemistry%22%5BJournal%5D)">The SH3 domain of amphiphysin binds the proline-rich domain of dynamin at a single site that defines a new SH3 binding consensus sequence.</a> The Journal of biological chemistry. 272 (20), 13419-13425 (1997).</li>
<li>Tosoni, D., Puri, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TTP+Specifically+Regulates+the+Internalization+of+the+Transferrin+Receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">TTP Specifically Regulates the Internalization of the Transferrin Receptor.</a> Cell. 123 (5), 875-888 (2005).</li>
<li>Puthenveedu, M. A., von Zastrow, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cargo+Regulates+Clathrin-Coated+Pit+Dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Cargo Regulates Clathrin-Coated Pit Dynamics.</a> Cell. 127 (1), 113-124 (2006).</li>
<li>Soohoo, A. L., Puthenveedu, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Divergent+modes+for+cargo-mediated+control+of+clathrin-coated+pit+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Divergent modes for cargo-mediated control of clathrin-coated pit dynamics.</a> Molecular Biology of the Cell. 24 (11), 1725-1734 (2013).</li>
<li>Posor, Y., Eichhorn-Gruenig, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatiotemporal+control+of+endocytosis+by+phosphatidylinositol-3%2C4-bisphosphate%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Spatiotemporal control of endocytosis by phosphatidylinositol-3,4-bisphosphate.</a> Nature. 10, (2013).</li>
<li>Mettlen, M., Stoeber, M., Loerke, D., Antonescu, C. N., Danuser, G., Schmid, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endocytic+accessory+proteins+are+functionally+distinguished+by+their+differential+effects+on+the+maturation+of+clathrin-coated+pits%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Endocytic accessory proteins are functionally distinguished by their differential effects on the maturation of clathrin-coated pits.</a> Molecular Biology of the Cell. 20 (14), 3251-3260 (2009).</li>
<li>Loerke, D., Mettlen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cargo+and+dynamin+regulate+clathrin-coated+pit+maturation%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biology%22%5BJournal%5D)">Cargo and dynamin regulate clathrin-coated pit maturation.</a> PLoS Biology. 7 (3), (2009).</li>
<li>Axelrod, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-substrate+contacts+illuminated+by+total+internal+reflection+fluorescence%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Cell-substrate contacts illuminated by total internal reflection fluorescence.</a> The Journal of Cell Biology. 89 (1), 141-145 (1981).</li>
<li>Merrifield, C. J., Feldman, M. E., Wan, L., Almers, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+actin+and+dynamin+recruitment+during+invagination+of+single+clathrin-coated+pits%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Imaging actin and dynamin recruitment during invagination of single clathrin-coated pits.</a> Nature Cell Biology. 4 (9), 691-698 (2002).</li>
<li>Ehrlich, M., Boll, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endocytosis+by+random+initiation+and+stabilization+of+clathrin-coated+pits%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Endocytosis by random initiation and stabilization of clathrin-coated pits.</a> Cell. 118 (5), 591-605 (2004).</li>
<li>Yarar, D., Waterman-Storer, C. M., Schmid, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+dynamic+actin+cytoskeleton+functions+at+multiple+stages+of+clathrin-mediated+endocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">A dynamic actin cytoskeleton functions at multiple stages of clathrin-mediated endocytosis.</a> Molecular Biology of the Cell. 16 (2), 964-975 (2005).</li>
<li>Rappoport, J. Z., Kemal, S., Benmerah, A., Simon, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+clathrin+and+adaptor+proteins+during+endocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22American+journal+of+physiology.+Cell+physiology%22%5BJournal%5D)">Dynamics of clathrin and adaptor proteins during endocytosis.</a> American journal of physiology. Cell physiology. 291 (5), (2006).</li>
<li>Doyon, J. B., Zeitler, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+and+efficient+clathrin-mediated+endocytosis+revealed+in+genome-edited+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Rapid and efficient clathrin-mediated endocytosis revealed in genome-edited mammalian cells.</a> Nature Cell Biology. 13 (3), 331-337 (2011).</li>
<li>Hopp, T. P., Prickett, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Short+Polypeptide+Marker+Sequence+Useful+for+Recombinant+Protein+Identification+and+Purification%5BTitle%5D)+AND+%22Bio%2FTechnology%22%5BJournal%5D)">A Short Polypeptide Marker Sequence Useful for Recombinant Protein Identification and Purification.</a> Bio/Technology. 6 (10), 1204-1210 (1988).</li>
<li>Miesenböck, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+secretion+and+synaptic+transmission+with+pH-sensitive+green+fluorescent+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins.</a> Nature. 394 (6689), 192-195 (1998).</li>
<li>Saffarian, S., Cocucci, E., Kirchhausen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+Dynamics+of+Endocytic+Clathrin-Coated+Pits+and+Coated+Plaques%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biology%22%5BJournal%5D)">Distinct Dynamics of Endocytic Clathrin-Coated Pits and Coated Plaques.</a> PLoS Biology. 7 (9), (2009).</li>
<li>Yudowski, G., Puthenveedu, M., Henry, A., von Zastrow, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cargo-Mediated+Regulation+of+a+Rapid+Rab4-Dependent+Recycling+Pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Cargo-Mediated Regulation of a Rapid Rab4-Dependent Recycling Pathway.</a> Molecular Biology of the Cell. 1, 1-11 (2009).</li>
<li>Batchelder, E. M., Yarar, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+Requirements+for+Clathrin-dependent+Endocytosis+at+Sites+of+Cell-Substrate+Adhesion%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Differential Requirements for Clathrin-dependent Endocytosis at Sites of Cell-Substrate Adhesion.</a> Molecular Biology of the Cell. 21 (17), 3070-3079 (2010).</li>
<li>Mattheyses, A. L., Atkinson, C. E., Simon, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+Single+Endocytic+Events+Reveals+Diversity+in+Clathrin%2C+Dynamin+and+Vesicle+Dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">Imaging Single Endocytic Events Reveals Diversity in Clathrin, Dynamin and Vesicle Dynamics.</a> Traffic. 12 (10), 1394-1406 (2011).</li>
<li>Aguet, F., Antonescu, C. N., Mettlen, M., Schmid, S. L., Danuser, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+analysis+of+low+signal-to-noise+images+link+dynamin+and+AP2+to+the+functions+of+an+endocytic+checkpoint%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Advances in analysis of low signal-to-noise images link dynamin and AP2 to the functions of an endocytic checkpoint.</a> Dev Cell. 26 (3), 279-291 (2013).</li>
<li>Boucrot, E., Howes, M. T., Kirchhausen, T., Parton, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Redistribution+of+caveolae+during+mitosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Redistribution of caveolae during mitosis.</a> J Cell Sci. 124, 1965-1972 (2011).</li>
<li>Bhaya, D., Davison, M., Barrangou, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-Cas+systems+in+bacteria+and+archaea%3A+versatile+small+RNAs+for+adaptive+defense+and+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+review+of+genetics%22%5BJournal%5D)">CRISPR-Cas systems in bacteria and archaea: versatile small RNAs for adaptive defense and regulation.</a> Annual review of genetics. 45, 273-297 (2011).</li>
<li>Boch, J., Scholze, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Breaking+the+Code+of+DNA+Binding+Specificity+of+TAL-Type%5BTitle%5D)+AND+%22III+Effectors.+Science%22%5BJournal%5D)">Breaking the Code of DNA Binding Specificity of TAL-Type.</a> III Effectors. Science. 326 (5959), 1509-1512 (2009).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

כאן אנו מתארים את השימוש בTIRFM לדמיין אנדוציטוזה בתיווך clathrin (CME) ברמה של CCPs הבודד בתאים חיים בזמן אמת. CME הוא אירוע מהיר ודינמי מאוד מתווך על ידי ההשפעה המצטברת של אירועים בודדים רב מרחב ובזמן נפרד. רוב מבחני המשמשים כיום, כגון מדידות ביוכימיים של הפנמה באמצעות biotinylation משטח או ליגנד המחייב, זרימת cytometry או מבחני תאים קבועים למדידת כמות חלבונים הפנימו, או הלוקליזציה מיקרוסקופית אלקטרונים של חלבונים, לעקוב אחר שינויי הרכב בלוקליזציה חלבון בנקודות זמן קבועות . שיטו...

התהליך של אנדוציטוזה בתיווך clathrin (CME) תלוי בהגעה מתוזמן היטב של מרכיבים הרבים של מכונות endocytic בתיווך clathrin לאסוף מטען ולתפעל את קרום הפלזמה לתוך שלפוחית ​​1-3. CME הוא ביוזמת חלבוני עיוות קרום ומטען מתאם שמגיעים יחד באתרים המתהווים של אנדוציטוזה 1. חלבונים אלה לגייס clathrin חלבון מעיל, אשר מרכיבה לתוך מבנה דמוי כלוב שיוצר את הבור מצופה clathrin (מק&quot;ס) 4. ברגע שהמפלגה הקומוניסטית הסיני מורכב במלואו לצורה כדורית, scission קרום, בעיקר באמצעות פעולה של GTPase הגדול, dynamin, יוצר שלפוחית ​​חופשית מצופה clathrin (CCVs) 5,6. הפנמה זו מעוררת פירוק מהיר של מעיל clathrin, המאפשר רכיבים לשימוש חוזר לסבבים רבים של CME. הגילוי והאפיון של החלבונים המעורבים בCME כבר מושרשים בbioch המסורתיוטכניקות emical, גנטיות, מיקרוסקופיה 4-6,8. מבחני אלה הובהרו התפקידים ונקודות אינטראקציה של מרכיבי endocytic אלה. למרות שמאוד שימושי להגדרת מרכיבים חיוניים של מכונות סחר, מבחני אלה מוגבלים מאוד בלכידת ההתנהגות הדינמית של רכיבי CME או ריכוז מטען. זוהי מגבלה קריטית, שכן CME הוא מונע על ידי ההרכבה כוריאוגרפיה של קבוצות של מודולים חלבון בצעדים מוגדרים, וכן שינויים קטנים בדינמיקה של אירועי endocytic בודדים יכולים להיות השלכות מצטברות גדולות באנדוציטוזה. יתר על כן, הנתונים אחרונים מצביעים על כך שCCPs הבודד עשוי להיות שונה הן בהרכב ובהתנהגות, המצביעה על כך הרגולציה הפיזיולוגית של תהליך זה היא מאוד במרחב ובמוגבל 9-14 בזמן. לדמיין אירועי endocytic פרט, לכן, הוא חיוני כדי להבין מדוע יש חלבונים מרובים מיותרים מעורבים בCME וb איך אפשר לבקר את החלבונים האלהאותות פיסיולוגיים y להסדיר הפנמת מטען. כאן אנו מתארים את השימוש בסך פנימית השתקפות מיקרוסקופ פלואורסצנטי (TIRFM) להתבונן CME ברמה של הדינמיקה של CCPs הבודד בתאים חיים. TIRFM מסתמך על ההבדל במקדם שבירה בין coverslip הזכוכית וסביבת הנוזל של תאי 15,16. כאשר אור העירור מכוון לתאים של יותר מ הזווית הקריטית, זה בא לידי ביטוי באופן פנימי, יצירת גל חולף ששומר על שדה דק של תאורה המשתרע כ 100 ננומטר מעל coverslip. הדבר מבטיח כי מולקולות הניאון רק בתחום צר זה שמחים. למעשה, זה מאפשר העירור של מולקולות ניאון על או ליד קרום הפלזמה, וממזער את הקרינה מחלקי הפנים של התא. זה מספק רזולוציה יחס וציר z אות לרעש גבוהה באופן משמעותי כדי לחזות אירועים בקרום פלזמה, שיתוףmpared למצבים נפוצים יותר כגון epifluorescence הקונבנציונלי או מיקרוסקופ פלואורסצנטי confocal. אנו גם מתארים, במבוא וברמה מעשית, השימוש בפלטפורמת ניתוח תמונה נפוץ לנתח ולכמת תכונות מורפולוגיות פשוטות ודינמיקה של אירועי endocytic המטען אישיים.

<table><tbody><tr><td>DMEM/גלוקוז גבוה עם L-גלוטמין ונתרן פירובט</td><td>פישר סיינטיפיק&nbsp;</td><td></td><td></td>SH3024301</tr><tr><td>תמיסת מלח פוספט בופר (DPBS) של Dulbecco, ללא סידן, ללא מגנזיום</td><td>Gibco, מאת Life Technologies</td><td>21600-010</td><td></td></tr><tr><td>חומצה חופשית</td><td>EDTA Amresco</td><td>0322-500G</td><td></td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי</td><td>Gibco, מאת Life Technologies</td><td>10437-028</td><td></td></tr><tr><td>L-15 Medium של לייבוביץ, ללא פנול אדום</td><td>Gibco, מאת Life Technologies</td><td>21083-027</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM</td><td>Gibco, מאת Life Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>CellPURE מאת Fisher Scientific</td><td>BP2937-100</td><td></td></tr><tr><td>Effectene</td><td>Qiagen</td><td>301425</td><td>מגיב טרנספקציה</td></tr><tr><td>25 מ"מ כיסוי זכוכית Fisher</td><td>Scientific</td><td>12-545-86</td><td></td></tr><tr><td>צלוחיות מטופלות בתרבית תאי קורנינג, 25 ס"מ2</td><td>Fisher Scientific</td><td>10-126-28</td><td></td></tr><tr><td>תרבית תאים 6 בארות צלחת</td><td>Greiner Bio-One, מאת VWR</td><td>82050-896</td><td></td></tr><tr><td>מונוקלונלי ANTI-FLAG M1</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F3040-5MG</td><td></td></tr> <tr><td>[D-Ala2, N-Me-Phe4, Gly5-ol]-מלח אנקפלין אצטט (DAMGO)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E7384-5MG</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 ערכת</td> <td>תיוג חלבוןLife Technologies</td><td>A20173</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>NIH</td><td></td><td>http://rsb.info.nih.gov/ij/</td></tr> <tr><td>Imaris תוכנת ניתוח תמונות</td><td>BitPLane</td><td></td><td>http://www.bitplane.com/imaris/imaris, לניתוח אוטומטי</td></tr><tr><td>מיקרוסקופ הפוך Nikon Eclipse Ti ואביזרים נדרשים כולל קוביות פילטר ומסננים</td><td>זרוע Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TIRF עם מתאמים נדרשים עבור Nikon Eclipse Ti</td><td>Nikon</td><td></td><td>להתאמת זווית התרחשות</td></tr><tr><td>מצלמת iXon+ EMCCD ומתאמים</td><td>Andor</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

חזותי אנדוציטוזה בתיווך clathrin של רצפטורים מצמידים חלבון g בהחלטה חד אירוע באמצעות tirf מיקרוסקופית

Visualizing Clathrin-mediated Endocytosis of G Protein-coupled Receptors at Single-event Resolution via TIRF Microscopy

קולטני איתות חשובים רבים מופנמים באמצעות התהליך הנחקר היטב של אנדוציטוזיס בתיווך קלתרין (CME). בדיקות ביולוגיות מסורתיות של תאים, המודדות שינויים גלובליים באנדוציטוזיס, זיהו למעלה מ-30 רכיבים ידועים המשתתפים ב-CME, ומחקרים ביוכימיים יצרו מפת אינטראקציה של רבים מהרכיבים הללו. עם זאת, מתברר יותר ויותר כי CME הוא תהליך דינמי ביותר שהרגולציה שלו מורכבת ועדינה. בכתב יד זה, אנו מתארים את השימוש במיקרוסקופ פלואורסצנטי של השתקפות פנימית כוללת (TIRF) כדי להמחיש ישירות את הדינמיקה של רכיבי המנגנון האנדוציטי בתיווך קלתרין, בזמן אמת בתאים חיים, ברמת האירועים הבודדים המתווכים תהליך זה. גישה זו חיונית כדי להבהיר את השינויים העדינים שיכולים לשנות את האנדוציטוזיס מבלי לחסום אותה באופן גלובלי, כפי שניתן לראות בוויסות פיזיולוגי. אנו נתמקד בשימוש בטכניקה זו כדי לנתח תחום עניין מתעורר, תפקידו של הרכב המטען בוויסות הדינמיקה של בורות מצופים קלתרין מובחנים (CCP). פרוטוקול זה תואם למגוון בדיקות פלואורסצנטיות זמינות באופן נרחב, וניתן ליישם אותו להמחשת הדינמיקה של מולקולות מטען רבות המופנמות מפני השטח של התא.

שימוש בתאי החיים TIRF מיקרוסקופית יש לנו נרשם דינמיקת endocytic של μ-אופיואידים קולטן (מור), קולטן G-חלבון בשילוב (GPCR) וβ-arrestin חלבון מתאם endocytic. מבנה β-arrestin היה transfected זמני לקו תא מור ביציבות להביע באמצעות הפרוטוקול המתואר באיור 1, וצלם 96 שעה מאוחר יותר. מור בשורת התאים היציב הוא N-סופני מתויג עם GFP pH רגיש. חלבון פלואורסצנטי זה מאיר רק בנוזל החוץ תאי הניטרלי. כמו כן, מור endocytoses רק הופעל בעבר על ידי אגוניסט, ונשאר אחר מתחלק באופן שווה על ...

אנדוציטוזיס בתיווך קלת'רין, תהליך מהיר ודינמי ביותר שמפנים חלבונים רבים, כולל קולטני איתות. הפרוטוקול המתואר כאן מדמיין ישירות את הקינטיקה של אירועים אנדוציטיים בודדים. זה חיוני להבנת האופן שבו חברי הליבה של המנגנון האנדוציטי מתאמים זה עם זה, וכיצד מטען החלבון משפיע על תהליך זה.

חזותי אנדוציטוזה בתיווך clathrin של רצפטורים מצמידים חלבון G בהחלטה חד אירוע באמצעות TIRF מיקרוסקופית

Many important signaling receptors are internalized through the well-studied process of clathrin-mediated endocytosis (CME). Traditional cell biological ...

המטרה הכוללת של הליך זה היא לדמיין ולכמת את הדינמיקה של בורות מצופים קלתרין בודדים בתאים חיים. זה מושג על ידי העברה תחילה של חלבונים אנדוציטיים ומטען מתויגים פלואורסצנטית לקו תאי הדבקות. השלב הבא הוא לדמות את התאים עם השתקפות פנימית מלאה, פלואורסצנטיות או מיקרוסקופ דשא.לאחר מכן מכמתים את משך החיים של קבוצות קטנות של בורות מצופים קלתרין באופן ידני באמצעות תוכנית עיבוד וניתוח תמונה. השלב האחרון הוא לכמת את אורך החיים של בורות מצופים קלתרין על ידי זיהוי וניתוח אוטומטיים אובייקטיביים. בסופו של דבר, מיקרוסקופ דשא משמש לכימות הדינמיקה של בורות מצופים קלתרין בודדים ברזולוציה של אירוע יחיד כדי לחקור אנדוציטוזיס בתיווך קלתרין של קולטנים מצומדים לחלבון G.שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום הסחר בממברנות, כגון כיצד ההרכבה והדינמיקה של אנדוציטוזיס יכולות להשתנות בהתבסס על החלבונים האנדוציטיים השונים וחלבוני המטען הקיימים. כדי להתחיל להעביר תאי HEC 2 93 עם פלסמידים המקודדים קולטנים מצומדים לחלבון תג G או GPCRs ו/או רכיבים של מכונות קלארו. בצלחת של 12 בארות כמפורט בפרוטוקול הטקסט ביום שלאחר הטרנספקציה הוסף 0.5 מיליליטר של מי מלח חוצץ פוספט או PBS עם EDTA מילימולרי אחד לכל אחד.ובכן, אז הנח שלושה סיבובים, כיסוי סטרילי של 25 מילימטר מחליק לבארות נפרדות של שש. צלחת באר מלאו כל באר בשני מיליליטר מדיה. דחוף בעדינות את החלקת הכיסוי כלפי מטה לתחתית הבאר כדי למנוע צמיחת תאים בצד התחתון של החלקת הכיסוי.לאחר מכן, מערבבים ידנית באר של צלחת 12 הבארות כדי להרים את התאים מתחתית הבאר. הוסף מיליליטר אחד של DM EM עם 10% FBS לשליחה מחדש. לאחר מכן מחלקים את התאים המורמים מבאר אחת באופן שווה בין שלושת החלקות הכיסוי.אפשר לתאים לצמוח על החלקות הכיסוי לפחות 48 שעות לפני ההדמיה. כמו כן, ודא שהתאים מפוזרים ושטוחים להדמיה של דינמיקת הבור והמטען המצופים קלתרין. ראשית, דגרו מראש על התאים בנוגדנים כמתואר בפרוטוקול הטקסט.לאחר מכן התכוננו להעביר את החלקת הכיסוי לתא הדמיה של תאים חיים באמצעות זוג מלקחיים ומחט בגודל 25 מכופפת בקצה לתוך וו. החזק את זוג המלקחיים ביד הדומיננטית. החזק את המחט הכפופה בשנייה.סובב את המחט עד שהוו מתעקל כלפי מטה לכיוון הזכוכית. גרור בעדינות את צד וו המחט כלפי מטה על פני החלק התחתון של צלחת שש בארות עד שהוא מתחבר להחלקת הכיסוי. הקפד לא לשרוט את פני השטח של החלקת הכיסוי מכיוון שהוא ינתק תאים.הרם בעדינות את הכיסוי להחליק מתחתית הבאר. איזון את החלקת הכיסוי על קיר הבאר לתמיכה. השתמש במלקחיים כדי לאחוז בקצה החלקת המכסה ולהזיז את צד תא החלקת המכסה כלפי מעלה אל תא ההדמיה.הרכיבו את החדר והוסיפו 700 מיקרוליטר של מדיום הדמיה טרום חם. לאחר העברת החדר למיקרוסקופ, הבא את התאים למיקוד באמצעות טבילת שמן דשא תמונה אובייקטיבית של התאים במצבי תאורה קונבנציונליים, פלואורסצנטיים או קונפוקליים כדי לזהות תאים המבטאים את המבנים המתאימים כאמצעי זהירות חשוב. היו מודעים תמיד לזווית קרן הלייזר ותמיד כוונו אותה הרחק מהמתבונן.לאחר מכן, התמקדו כלפי מטה אל המשטח התחתון של תא מבטא עד שקווי המתאר של קרום הפלזמה סביב התא נעלמים והמשטח התחתון של התא מופיע. זה ניכר ביותר עם חלבון מטען מקומי של קרום פלזמה כגון קולטן אופיואידים mu. אם משתמשים באותם לייזרים להדמיה בפלואורסצנציה אפי קונבנציונלית, הגדילו את זווית השכיחות של הלייזר עד ליציאה מהמיקוד.הקרינה בחלק הפנימי של התא נעלמת ולא נראה מתאר של קרום הפלזמה סביב התא. לאחר הדשא, ודא שלייזר העירור משתקף בחזרה דרך המטרה ואינו נראה מעל המטרה. על ידי בדיקה אם נקודת הלייזר נראית לעין, מקד את המיקוד כדי לקבל תמונה חדה.לאחר זיהוי התאים, קבל תמונות לפחות כל שלוש שניות למשך 10 דקות. חזור על כל השלבים כדי ליצור תמונה של תאים נוספים. כדי להתחיל בניתוח של דינמיקה אנדוציטית, פתח את הקובץ בתמונה J.התמונות מאוחסנות כערימה אחת של קובצי TIFF.עם תעלות בין עלים. המירו את התמונות להיפר-אוספים על-ידי בחירה ב-Hyper-stacks של תמונות ו-Stack to hyper-stack בחלון הנפתח. הזן את מספר הערוצים שנרכשו.הזן אחד עבור זאק והזן את מספר מסגרות הסרט. תבנית ההיפר מחסנית מניבה חלון עם שני פסי גלילה. השתמש בסרגל העליון כדי לנוע בין הערוצים ובסרגל התחתון כדי לנוע בזמן.גלול לערוץ החלבון שאורך חייו ייבחן. מעבר למסגרת הראשונה של הסרט כדי להפחית את ההכללה של בורות מצופים קלתרין קיימים או CCPs שכל משך הזמן שלהם אינו נראה. צייר אזור עניין או החזר ROI סביב נקודה שנבחרה באופן אקראי.ספור את מספר המסגרות שבהן נקודה מוצגת. כדי להתחיל בניתוח עם זיהוי אובייקטים, פתח את קובץ התמונה הגולמית בתוכנת ניתוח התמונות הופיעה כברירת מחדל. תמונה צבעונית מופיעה.השתמש בחלון כוונון התצוגה כדי לכוונן את הבהירות של ערוץ. לחץ על שם הערוץ כדי לשנות את הצבע המוצג. בטל את סימון התיבה לצד הערוץ כדי למנוע את הצגתו.צור כתמים על ידי לחיצה על הסמל עם כתמים כתומים. בחר החזר ROI סביב התא באמצעותו כדי לא לכלול אזורים שיזהו באופן שגוי קצוות מובילים ופלאקים בהירים. מדוד את קוטר הנקודה כדי לספק הערכות ראשוניות עבור האלגוריתם.עברו למצב פרוסה ולחצו על הקצוות הקוטביים של נקודה כדי למדוד את קוטרה. עשו זאת עבור ארבעה או חמישה כתמים עגולים שנראים כמצביעים על מק"ס בשיא יציבותה לאחר היווצרותה לפני ההפסקה, השתמשו במדידות אלה כדי לחשב את הקוטר הממוצע עד לעשירית המיקרון הקרובה ביותר. כדי לזהות כתמים חוזרים למצב חריגה, בחר את הערוץ המתאים לזיהוי.הזן את הקוטר הממוצע הנמדד, בדרך כלל 0.3 או 0.4 מיקרון. לחץ על החץ הכחול קדימה כדי לכמת את הספוטים. סנן את הכתמים לפי איכות באמצעות התאמת המסנן כדי ללכוד כמה שיותר כתמים ללא רקע.מסנן האיכות נבחר כברירת מחדל. השתמש בעקומת האיכות כקו מנחה לקביעת סף מתאים. הזז את הסף התחתון של המסנן עם לחצן העכבר השמאלי לטבילה הראשונה הזו בעקומה.זוהי נקודת התחלה טובה למסנן. מכיוון שמיקום זה בדרך כלל מחדד את הזיהוי רק לנקודות גלויות. הסר כתמים בנקודת העריכה מתג מסך לבחירת מצב ולחץ על הנקודה לאחר שהיא הופכת לצהובה, לחץ על מחק.לאחר מכן לחץ על החץ הכחול כדי להמשיך בבניית האלגוריתם. מדוד רצועות על ידי הגדרת רצועות לבראוניז בתנועה. המק"ס לא צריכה להפגין שום תנועה מכוונת, אלא רק סחיפה מינימלית על פני קרום הפלזמה.אלגוריתם זה מתאים ביותר לתנועה זו. לאחר מכן, הגדר את המרחק המקסימלי לערך קטן כגון 0.7 מיקרון. קביעת מרחק קטן ממזערת את החיבור של נקודות סמוכות ועדיין מאפשרת מעקב מתמשך אחר נקודת תא באמצעות מק"ס או תנועת תאים.לאחר מכן הגדר את גודל הפער המרבי לאחד. זה מאפשר לרצועה להמשיך אם חסרה רק מסגרת אחת. ברצף, גדלים של יותר משלושה גורמים למסלולים שונים להיות מקושרים זה לזה באופן שגוי.השלב הבא הוא להחליף את הצפייה במסלול לזנב דרקון. גלול בסרטון תוך התבוננות באיכות הזיהוי. אם מחוברים כתמים סמוכים, הקטן את המרחק המרבי מתחת ל-0.7 מיקרון.אם כתמים נשברים בקלות רבה מדי, הגדל את גודל הפער המקסימלי. לחץ על החץ הכחול כדי ליצור רצועות. זה מוביל למסך מסלול הסינון לסינון רצועות.השתמש במסנן עוצמה כדי להסיר לוחות בהירים נוספים. לאחר מכן השתמש במסנן תזוזה כדי להסיר אנדוזומים שנכנסים לשדה הדשא. היזהר מכיוון שלכתמים ארוכים יותר תהיה גם תזוזה ארוכה יותר.לחץ על החץ הכפול הירוק כדי להשלים את הפרוטוקול. כדי לייצא נתונים, עבור ללשונית הסטטיסטיקה. לחץ על סמל התקליטון הבודד כדי לייצא את הסטטיסטיקה שנבחרה.לחץ על הסמל שנראה כמו סדרה של תקליטונים כדי לייצא את כל הסטטיסטיקות. התמקדות בקרום פלזמה דבק ובמצב קונפוקלי חושפת תא מלא בקרינה עמומה. לעומת זאת, התמקדות במרכז התא חושפת את קרום הפלזמה כטבעת של פלואורסצנטיות סביב התא.פלואורסצנטיות של מיקוד חיצוני מתגלה בעת מעבר לאפי, פלואורסצנטי או דשא קונבנציונאלי עם זווית שגויה. כאשר זווית הדשא נכונה, קרום הפלזמה חד מאוד, ברור ובהיר, ואינו ממוקד. הקרינה כבר לא משבשת את התמונה.כאשר בטא עצין נמצא בבריכה ציטוזולית, מעט מאוד נמצא בשדה הדשא והוא נראה מעורפל ומוקד חיצוני. ברגע שה-MOR מופעל על ידי אגוניסט, בטא, עצירה מגויסת לקרום הפלזמה וגם בטא עצירה וגם הקולטן מופצים מחדש למק"ס. אורך החיים של אשכולות אלה מכומת באופן ידני.באמצעות שלושת הפרמטרים לאנדוציטוזיס שהושלם, הכתמים המציינים CCPs יכולים להיעלם לחלוטין, להבהב לסירוגין, או לצבוט מבנה גדול יותר. מוצג כאן CCPs שזוהו באמצעות MAs לאחר סינון להסרת מבני פלאק לא דינמיים, כדורים לבנים מכוסים, מציינים כתמים שזוהו, כתמים עמומים יותר שלא ניתן היה לזהות במשך כל חייהם לא נכללו גם הם במסנן האיכות. לאחר שתצפה בסרטון זה, תהיה לך הבנה ממש טובה כיצד לדמיין בורות מקודדים בצנתר בודד באמצעות מיקרוסקופ דשא.

visualizing-clathrin-mediated-endocytosis-g-protein-coupled-receptors

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

המידור של חלבונים גם בתוך קרום פלזמה או אל מקומות תאיים הוא אחד מנגנון רגולטורי כי יכול מאוד להשפיע על התוצאות איתות, ולכן, כדי להבין איתות חשוב ללמוד את התנהגות במרחב ובזמן של חלבונים המעורבים. המתואר כאן מערכת מבוססת מיקרוסקופיה TIRF ללמוד התמרה האות בתאי T, אבל הוא החלים רחב.

טכניקה מיקרוסקופית TIRF הדמיה בזמן אמת סימולטני של TCR וחלבונים הקשורים אליו לשידור אותות

השתקפות פנימית מוחלטת פלואורסצנטי (TIRF) מיקרוסקופיה היא גישה חזקה כדי לבחון מבנים סמוך לפני השטח של התא על ניגודיות גבוהה ורזולוציה הזמני. אנו מדגימים כיצד TIRF יכול להיות מועסק על מנת ללמוד על הדינמיקה חלבונים בקליפת המוח של קיר סגורים תאים תאים חיידקיים פטרייתי.

ויזואליזציה של קליפת הארגון ואת הדינמיקה של מיקרואורגניזמים, באמצעות Fluorescence סה&quot;כ פנימי מיקרוסקופית השתקפות

סרטון זה מתאר את TIRF, טכניקה מבוססת מיקרוסקופיית השתקפות פנימית כוללת להמחשת דינמיקת פילמור אקטין ומיקרוטובול. השיטה מאפשרת הדמיה ברזולוציה גבוהה של דינמיקת צימוד אקטין ומיקרוטובול בזמן אמת, החיונית להבנת שיחות צולבות תאיות.

מיקרוסקופ TIRF להמחשת דינמיקת צימוד אקטין ומיקרוטובול

סרטון וידאו זה מדגים טכניקת מיקרוסקופ פלואורסצנטי של השתקפות פנימית כוללת ברזולוציה גבוהה (TIRF) להדמיה בזמן אמת של היווצרות וסגירת פאגוזומים במהלך פגוציטוזה בתיווך מקרופאגים של תאי דם אדומים מסוג IgG (RBCs) המחוברים לפני השטח של צלחת תחתית זכוכית. המקרופאגים מרחיבים את הפסאודופודיה סביב ה-RBCs ובולעים אותם בתוך הפאגוזומים, ומנתקים אותם מפני השטח של הזכוכית.

הדמיה מבוססת מיקרוסקופיה TIRF של היווצרות וסגירת פגוזום

מקור: Winkle, C. C., et al. שימוש במתודולוגיות משולבות להגדרת תפקיד אספקת קרום הפלזמה במהלך הסתעפות אקסון ומורפוגנזה עצבית. J. Vis. Exp. (2016)סרטון זה מדגים מיקרוסקופיה פלואורסצנטית של השתקפות פנימית כוללת (TIRF) להמחשת אירועים אקסוציטיים בנוירונים בקליפת המוח. סמן חלבון פלואורסצנטי ירוק רגיש ל-pH (GFP) זוהר עם איחוי שלפוחית, עם עירור TIRF סלקטיבי הלוכד אקסוציטוזיס קרום-פרוקסימלי בהדמיית זמן-lapse.

מיקרוסקופיה פלואורסצנטית של השתקפות פנימית כוללת להדמיה של אירועים אקזוציטיים 

פרוטוקול זה מתאר כיצד להשתמש במיקרוסקופ פלואורסצנטי של השתקפות פנימית כוללת כדי לדמיין ולעקוב אחר קולטנים בודדים על פני תאים חיים ובכך לנתח את הניידות הרוחבית של הקולטן, גודל קומפלקסי הקולטנים וכן לדמיין אינטראקציות קולטן-קולטן חולפות. ניתן להרחיב פרוטוקול זה לחלבוני ממברנה אחרים.

רזולוציה גבוהה ניתוח Spatiotemporal של קולטן Dynamics ידי המולקולה בודדת מיקרוסקופ פלואורסצנטי

מאמר זה מספק שיטה לחקירת דינמיקת שלפוחית נוירוטרנסמיטר בתאי נוירובלסטומה, באמצעות מבנה synaptobrevin2-pHluorin ומיקרוסקופיה פלואורסצנטית של השתקפות פנימית כוללת. מדווחת גם האסטרטגיה שפותחה לעיבוד תמונה וניתוח נתונים.

TIRFM וGFP-בדיקות pH רגיש להערכת נוירוטרנסמיטר שלפוחיות Dynamics בתאי SH-SY5Y נוירובלסטומה: הדמיה נייד וניתוח נתונים

אנו מתארים מערך ניסיוני להמחשה עם היווצרות וסגירה חסרת תקדים של פגוזומים ברזולוציה גבוהה בתלת מימד במקרופאגים חיים, באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי של השתקפות פנימית כוללת. הוא מאפשר ניטור של בסיס הכוס הפגוציטית, הפסאודופודים המתרחבים, כמו גם המיקום המדויק של החתך הפגוזומי.

&quot;Assay סגירת Phagosome&quot; לדמיין גיבוש Phagosome בשלושה ממדים באמצעות סך פנימית השתקפות מיקרוסקופ פלואורסצנטי (TIRFM)

תיוג תחום תאי של חלבון הממברנה עם fluorophore pH רגיש, superecliptic pHluorin (ספטמבר), מאפשר לוקליזציה, ביטוי subcellular, וסחר שייקבע. הדמיה ספטמבר- שכותרתו חלבונים עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי השתקפות פנימית מוחלטת (TIRFM) מאפשרת כימות של רמות חלבון בקרום ER ו פלזמה הפריפריה.

ניצול רצפטורים-tagged pHluorin לפקח subcellular לוקליזציה וסחר

אנו מציגים פרוטוקול ליישום מיקרוסקופיה של השתקפות הפרעות ומיקרוסקופיה כוללת-פנימית-השתקפות-פלואורסצנטית להדמיה בו-זמנית של מיקרו-טובולים דינמיים וחלבונים הקשורים למיקרו-טובולים המסומנים באופן פלואורסצנטי.

השתקפות הפרעה סימולטנית ומיקרוסקופיה פלואורסצנטית של השתקפות פנימית כוללת להדמיה מיקרוטובולים דינמיים וחלבונים נלווים

פרוטוקול זה הוא מדריך להדמיה של אקטין דינמי ומיקרוטובולים באמצעות בדיקת מיקרוסקופיה פלואורסצנטית פנימית במבחנה (TIRF).

הדמיה של אקטין ודינמיקת צימוד מיקרוטובול במבחנה על ידי מיקרוסקופיה פלואורסצנטית של השתקפות פנימית כוללת (TIRF)

חקור את דינמיקת שקעי clathrin בודדים בתאים חיים באמצעות מיקרוסקופיית TIRF. שיטה זו מאפשרת ניתוח כמותי של אנדוציטוזה בתיווך clathrin ותיאום מנגנוני ספיגת חלבונים.

חזותי אנדוציטוזה בתיווך clathrin של רצפטורים מצמידים חלבון G בהחלטה חד אירוע באמצעות TIRF מיקרוסקופית

גלה סרטונים נוספים