Name: Enhanced צפון כתם איתור של RNA קטן מינים ב תסיסנית (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-08-21T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 39 s
Description: למד את פרוטוקול Northern Blot המשופר לזיהוי מולקולות RNA קטנות ב-Drosophila melanogaster. השיטה כוללת חילוץ RNA, אלקטרופורזה על ג'ל אקרילמיד והיברידיזציה עם בדיקות אנטיסנס רדיואקטיביות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי המכון הלאומי דה לה סנטה et de la המשוכלל והנדיר Médicale, המרכז הלאומי דה לה המשוכלל והנדיר Scientifique, האוניברסיטה לדה שטרסבורג, Hôpital דה שטרסבורג, האגודה לשפוך la משוכלל ונדיר sur le הסרטן, המכון הלאומי du הסרטן, סוכנות הידיעות Nationale de la המשוכלל והנדיר ואלזס האזור. פייטרו Laneve כבר נתמך על ידי Fondation לשפוך la המשוכלל והנדיר Médicale. נכון לעכשיו, הוא מקבל מלגת Istituto Italiano Tecnologia (IIT). עלויות פרסום נתמכות על ידי רשת Neurex (TriNeuron - תכנית Interreg IV העליון הריין)

אוסף 1 לדוגמא <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ניתוק 2 התאים של שניידר למחצה חסיד, (1-5 x 10 6 תאים בממוצע), על ידי pipetting ולמסוק אותם על ידי צנטריפוגה (1 דקות 100 XG). במקרה של במבחנה תאים חסיד תרבותיים, trypsinize אותם בתנאים סטנדרטיים או ישירות לאסוף אותם מצלחות לסכום נוח של מגיב מיצוי RNA, על ידי עזרה של מגרד תא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאוסף עובר, לגדול זני דרוזופילה בכלובי זבוב ועוברים לתת להצטבר על צלחות הטלת ביצים. נגבו את העוברים על ידי מכחול במים מזוקקים (DH 2 O), להשליך פסולת על ידי סינון מסננת, לשטוף ולשחזר עוברים ב48 בקבוקון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כטכניקה חלופית, לנתח באופן ידני רקמות / איברים. לבודד אשכים (מערכת מועדפת לניתוח Pirna) מבטן דרוזופילה בופר פוספט (PBS) תחת סטראו (הגדלה 20X), על ידי שימוש במחטים לנתיחה או מלקחיים כמו מולualized בסאליבן et al 49. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העלי homogenize דגימות על התמכרות של 0.5 כרכים של מגיב מיצוי RNA. </li></ol> 2 הפקת RNA / ניתוח <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ההוראות של היצרנים הבאים לבצע בידוד RNA באמצעות חומרים כימיים מסחריים. זהירות! סוכני מיצוי RNA הם בדרך כלל רעילים ומאכל. לחלופין, להחיל פרוטוקול מבוסס K proteinase לבידוד RNA 50, כדלקמן: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל דגימות לתוך 400 μl של Stop מיקס ולדגור על RT במשך 15 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשחזר רכיבי hydrosoluble ידי פנול הסטנדרטי: כלורופורם: אלכוהול isoamyl ועקירות כלורופורם ועל ידי אתנול (EtOH) ממטרים / כביסה. אוויר יבש הדגימות וresuspend לdiethylpyrocarbonate (DEPC) -treated מזוקק פעמיים (dd) H 2 O. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעריך ריכוז RNA על ידי מדידת spectrophotometric UV. כמו כן להבטיח את טוהר RNA הוא גבוה, קרוב ל2.0, basעורך על 260 / קריאה 280. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדוק הכנת RNA על denaturing agarose ג&#39;ל כדלקמן: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בכוס נקייה, לפזר 1.2 גרם Agarose ב82 מ&quot;ל של DEPC-DDH 2 O, תחת בחישה מתמדת. מרתיחים עד שהיא נמסה לחלוטין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אפשר פתרון ג&#39;ל להתקרר; כאשר הטמפרטורה מגיעה 60 ° C להוסיף 10 מ&quot;ל של 10X חומצה 4-morpholinepropanesulfonic (מגבים) חיץ לריכוז סופי 1X (FC), ו -8 מ&quot;ל של 37% פורמלדהיד עד 3% FC. זהירות! פורמלדהיד הוא חומר מסרטן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יוצקים את הג&#39;ל לתוך תא אלקטרופורזה אופקי. לאפשר את הג&#39;ל לביסוס מתחת למכסת מנוע לשעה לפחות 1. בעקבות מיצוק, להטביע את הג&#39;ל לתוך מגבים 1X. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Aliquot 2 מיקרוגרם של מדגם RNA ו1 מיקרוגרם של סולם (השתמש סמן RNA כאשר הערכה מדויקת היא רצויה). הוסף 3 כרכים של צבע agarose טעינה (ALD) לרנ&quot;א ולסולם. מחממים על 70 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות וקרירות באופן מיידי על קרח. CAUTION! תוכן של ALD (רומיד ethidium ופוראמיד, ראה חומרים) הוא mutagen ומאכל, בהתאמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טען את הדגימות ולהפעיל את הג&#39;ל על 50 V כ 1 שעות עם מחזור חיץ מדי פעם. בדוק את דפוס חלוקה RNA על ידי ההדמיה UV או הדמיה ג&#39;ל. להכיר להקות דיסקרטיות המתאימות ל28S ו18S rRNAs ולtRNAs (ראה איור 1). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המשך צפון Assay או RNA חנות ב -80 מעלות צלזיוס. </li></ol> .3 Denaturing Acrylamide ג&#39;ל הכנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש במנגנון קטן אנכי electrophoretic לצעד חלוקה זו (גודל צלחת על 8 סנטימטר x 9 סנטימטר, מ&quot;מ 0.75 עובי מסרק). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרכיב משקפיים נקיים יחד במסגרת ליהוק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 10 מ&quot;ל של 10 acrylamide% / bis-acrylamide (19: 1) פתרון במגבי 1X, 7 מ אוריאה. מייד לפני המזיגה, להוסיף 10% persulfate אמוניום 100 μl ו10 μl של TEMED ומהירות לערבב הפתרון. זהירות! Acrylamide הוא רעיל למערכת עצבים וקרצינוגן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יוצקים את הג&#39;ל בין לוחות זכוכית והכנס את המסרק היטב בזהירות כדי למנוע בועות. בואו ג&#39;ל לפלמר ב RT לפחות 45 דקות לפני השימוש. לחלופין, לאחסן O ג&#39;ל / N, עטוף בניירות מסנן ספוג מים ואטומים בניילון נצמד. </li></ol> הכנת .4 דוגמא <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Aliquot .5-20 מיקרוגרם של RNA הכולל לכל דגימה. אם הנפח עולה על 3-4 μl, ואקום לייבש את המדגם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקביעת גודל, לרוץ aliquot (20-30 CPS) של סולם נמוך לטווח radiolabeled במקביל לדגימות, כסמן (ראה סעיף 4.3 ו4.4 להכנה). פנקו אותו במקביל לדגימות, כפי שמתואר בשלב 4.5. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סולם: להגדיר תגובה קדימה פוספט באמצעות 0.1 מיקרוגרם של סולם 10 נ&quot;ב צעד. לדגור על 37 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות ולעצור את התגובה על ידי הוספת חומצת ethylenediaminetetraacetic (EDTA) ל20 מ&quot;מ FC. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטהר על ידי משקעים EtOH / כביסה, ייבוש באוויר וresuspend DDH 2 O (כ -100 μl). זהירות! 32 P הוא מקור רדיואקטיבי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לכל דגימה להוסיף נפח שווה של צבע acrylamide הכחול (ABD). לפגל על ידי חימום על 80 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות ומגניבות על קרח עד טעינה. זהירות! פוראמיד (תוכן בABD) הוא מאכל. </li></ol> .5 Electrophoretic פלזמה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את לוחות זכוכית מתמיכת הליהוק וכראוי להרכיב אותם בתא אלקטרופורזה. מלא את שני החדר הפנימי וחיצוני עם מספיק מאגר פועל (RB). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להסיר בעדינות את המסרק ומראש להפעיל את הג&#39;ל על 200 V עבור 10 דקות. לפני דגימות טעינה, לשטוף את פיקדונות אוריאה מהבארות על ידי התזה כמה RB באמצעות מזרק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בעצות שטוחות לזהירות דגימות רבד מצעד 4.5 בחלק התחתון של כל טוב. בדקו את חיבורי האנודה וקתודה, כדי למנוע ריצה הפוכה. לאחר הדגימות להיכנס לג&#39;ל ב100 V למשך 5 דקות, אניncrease המתח 200 V. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאורך חלוקה של כ 7 סנטימטר, 45 דקות-טווח ארוך מספיק. הימנע bromophenol כחול (פיגמנט מעקב בABD) לעלות על גדותיו את הג&#39;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דמיינו בג&#39;ל RNAs הארוך המופרד על ידי רומיד ethidium מכתים (EtBr), כצעד אופציונאלי: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחתוך 2 סנטימטר מהחלק העליון של ג&#39;ל ובקצרה לשטוף את הפרוסה בDDH 2 O. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה הפרוסה ג&#39;ל ב RT ל15 דקות עם רועד עדין בRB, EtBr 0.5 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​FC. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Destain ג&#39;ל ל15 דקות בRB, לדמיין rRNAs ארוך על ידי קרינת UV או הדמיה ג&#39;ל. הגעה לטעינת RNA ואיכות (ראה תרשים 1, לוח 7). זהירות! Ethidium ברומיד הוא mutagen. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בינתיים להמשיך סופג את החלק התחתון של ג&#39;ל המכיל מיני RNA קטנים. </li></ol> .6 ג&#39;ל סופג <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותך 6 חתיכות של נייר סופג כדי שיתאים לשטח הסופג וחתיכת uncharge שווה ערךקרום ניילון ד. לחלח גיליונות נייר, קרום ו2 רפידות סופגות בRB. הקפד לספוג לחלוטין את הרפידות על ידי סחיטתם שוב ושוב בRB. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להסיר את הג&#39;ל מהמכשירים ולפתוח את המשקפיים על ידי ממוצע של מרית. השתמש בחותך נקי כדי להסיר את הבארות. הנח גיליון נייר Whatman הרטוב על הג&#39;ל בעדינות להרים את זה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את קרום הניילון על פניו חופשיות של ג&#39;ל. סמן פינה כדי לכוון את המסנן בהתאם לטעינת מדגם. השלם את &quot;הכריך&quot; (חתיכות 3 נייר בכל צד). מרדדים מוט פלסטיק על פני השטח הכתם, כדי להסיר כל בועות אוויר אפשריות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את הכתם בין שתי רפידות סופגות ולאחר מכן בקלטת הסופג. להרכיב את הקלטת במודול הסופג, למלא את התא עם RB ולבדוק את הכיוון הנכון (קרום הניילון חייב להישאר בין ג&#39;ל והתחנה הסופי החיובית). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר ב20 V עבור 20 דקות. הערה: על מנת להבטיח תנאים הומוגנית, לאחר 10 דקות לפתוח את המודול וr הסופגסוב הכריך ידי 180 ° לפני השלמת ההעברה. </li></ol> .7 ממברנה Crosslinking <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 6 מ&quot;ל של תמיסה הטרי Crosslinking (XLS). להרוות 10 סנטימטר x 10 סנטימטר (גדול מקרום ניילון) פיסת נייר סופג עם XLS. זהירות! HCl (מרכיב של XLS) הוא מאכל מאוד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפרק את הכתם ולמקם את הקרום על נייר סינון 3MM הרטוב. הערה: RNA לא חייב להיות במגע ישיר עם הנייר הרווי. הנח את המסנן ונייר בין שני לוחות זכוכית ולעטוף בניילון נצמד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחממים את הקרום ב60 מעלות צלזיוס למשך 2 שעות, ואחריו DDH 2 O כביסה. אחסן ב-20 ° C או להמשיך לכלאה. </li></ol> .8 ממברנה Prehybridization <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם טעינת RNA נבדקה (צעד אופציונאלי 5.5), ישירות להמשיך לכלאה. או אחר, לחתוך 1 סנטימטר לחלק העליון של מסנן הניילון, כדי למנוע hybridizatio צולב בדיקהns לRNAs הארוך המופרד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחממים 10 מ&quot;ל של הכלאה פתרון (HS) על 37 מעלות צלזיוס. לפגל 1 מ&quot;ג של זרע סלמון על 95 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות, מגניב על קרח ולהוסיף לHS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה המסנן בHS ב37 ˚ C במשך שעה לפחות 1, תחת סיבוב בתנור הכלאה. בדוק שRNA-הצד של המסנן עומד בפני HS. </li></ol> .9 Probe סינתזה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את התגובה קדימה פוספט ב10 pmol של מולקולת אנטיסנס קצרה ספציפית, כפי שמתואר ב4.3. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 5 כרכים של טריס-EDTA-NaCl (TEN) חיץ לתגובה ולטהר פריימר שכותרתו מנוקלאוטידים מאוגדים על ידי כרומטוגרפיה הדרת ג&#39;ל על עמודי G-25 Sephadex (או גם על ידי המשקעים EtOH). פעילות בדיקה ניתן להעריך על ידי נוזל נצנץ מתפרצות. </li></ol> 10. ממברנה הכלאה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החלף את HS מותש עם טרי 10 מ&quot;ל aliquot (שהוכן והושלם כפי שתואר לעיל). מחממים את הבדיקה בC 95 מעלות עבור 10 דקות, מגניב על קרח ולהוסיף לHS רומן. דגירה המסנן על 37 מעלות צלזיוס ON. </li></ol> כביסה 11. ממברנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשחזר את פתרון ההכלאה ולאחסן אותו ב-20 מעלות צלזיוס בתיבת מיגון רדיואקטיביות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש לשטוף את המסנן בכביסה חוצץ (WB) ולשטוף אותו ביסודיות ל10 דקות ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש גייגר מילר גלאי לבדיקת רדיואקטיביות שיורית בפינות המסנן. כאשר פליטת רקע היא סביב 5 CPS, להמשיך קרום אקספוזיציה. </li></ol> 12. גילוי אותות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחשוף את המסנן על סרטי autoradiography או על גבי מסך תרמי מולקולרי. לחשוף אותות על ידי עיבוד צילום או המרה דיגיטלית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתח את עוצמת הלהקה על ידי תוכנה ייעודית כימות (ImageJ או Optiquant). </li></ol> 13. ממברנה חישוף <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להסיר אותות עיקריים, להטביע את הקרום ב500 מ&quot;ל רותח פתרון חישוף, אז לדגור על RT דקות 1. המשך לרומן הכלאה (מראש) או לאחסן את המסנן ב-20 מעלות צלזיוס. </li></ol>

המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים פיננסיים מתחרים.

למרות ההערכה של המתוחכם משתרג דרכו RNA מסדיר נוירוגנזה שלנו עולה בהתמדה, ההשלכות מכניסטית של circuitries מבוסס RNA המשפיע על ביולוגיה של תאי גזע עצבי, הבחנה עצבית / אינטגרציה פונקציונלית, פיתוח של פתולוגיות וסוגי הסרטן עצביים להישאר שלא נחקרו. התחזוקה של רשתות כגון דרך הממלכות עושה את הפוטנציאל של מערכות גנטיות כתסיסנית סייעה לפענח מסלולים סלולריים שלא נחקרו, שבו RNAs noncoding הקצר וגורמי שעתוק נחשבים שחקנים מולקולריים גדולים. בתצוגה זו, הפרופיל של רמות ביטוי RNA הקטנות ...

ביוכימיה RNA חוותה התקדמות מרהיבה בשנים האחרונות 1. ההבנה שלנו של פוטנציאל RNA בבקרת ביטוי גנים כבר פרצה על ידי זיהוי של ribo-רגולטורי noncoding החזקים 2, על ידי הגילוי של מנגנונים מבוססי RNA רומן הרגולציה 3,4 ועל ידי אפיון מעמיק יותר של אירועים שלאחר התעתיק כבר ידועים 5. כל הביולוגיה RNA יחד מחקרים אלה אפשרו לעשות באופן דרמטי את הסצנה, הפך נושא המחקר מרכזי בנוף המדעי הנוכחי. בפרט, בשנים האחרונות אנחנו מקבלים תחושה של ההשפעה המתפשטת של &quot;עולם RNA&quot; בנוירוביולוגיה המולקולרית 6, אחד מתחומי המחקר הדינמיים ביותר במדעי החיים מודרניים. בעשור האחרון של המאה שעברה, התרחיש המדעי הכולל כבר מהפכה על ידי הגילוי של התערבות RNA 7,8 ושל RNAs הרגולציה הקטן 9,10ביחס מסוים ל11 מייקרו RNA, באופן אנדוגני הביע RNAs noncoding הקטן מעורב בשליטה כמעט את כל הפונקציות הסלולריות כרגולטורי pleiotropic וקומבינטורית של ביטוי גנים. כמעט 10 שנים לאחר הגילוי ראשוני מירנה בelegans Caenorhabditis ידי אמברוס והמעבדות של Ruvkun, תשומת לב מחודשת הפכה לשדה כאשר מספרים גבוהים של miRNAs זוהו בדרוזופילה ובתאים אנושיים, כמו גם 12-15. מאז, הודות לגישות מהונדסים תכליתיות, melanogaster דרוזופילה יש התבלט כהקשר ביולוגי יקר ערך עבור להתעמק ביוסינתזה ופעילות מירנה. דרוזופילה miRNAs חשפו פונקציות שונות בתהליכי חרקים ספציפיים או אבולוציונית משומרת, פורש מהזדקנות לחילוף חומרים, מסלולי איתות , התנהגות, וכמובן, נוירוגנזה. לאורך כיוון זה, אנו חשפו לאחרונה קישור רומן 16 בשיתוף המסקרןrrelation מתרחש בין GCM / דאיית גן האדון ומסלול RNA. גורם שעתוק זבוב GCM / Glide 17-19 מהווה דוגמא ייחודית של הקובע גורל תא, אשר מכתיב את בחירת הגורל העצבית גליה לעומת בmultipotent לטוס מבשרים עצביים 20. עשרים שנה מחקר ארוך בנושא זה באופן ברור הדגיש את התרחשותם של מספר רב של תשומות והחופפות של רגולציה ביטוי גנים מתכנסת על GCM / להחליק 21-28 להקים את רמות הסף הנדרשות לאיזון היחס העדין בין עמיתים עצביים וגליה במהלך התפתחות עצבית. גילינו כי רגולציה, באמצעות מיקוד לפי Dmel-miR279 מייצגת רמת שליטה נוספת שתרמה לכוונון עדין שלאחר תעתיק של GCM / להחליק ביטוי 16. שיפורים מתודולוגיים ספציפיים בעולם, קווי מחקר אלה נדרשים: לאורך שנים, במספר טכנולוגיות שפותחו במקור כדי לנתח מסורתיתRNAs itional הוסב לכימות RNAs לא קטן קידוד, כמו כמבחני הגנה RNAse, מערכי cDNA 29-31, שיטות PCR בזמן אמת 32-35 ורצף 36,37. בצד השני, כיול של גישות טכניות טפח התקדמות רציפה בתחום. צפון הכתם assay (NB, או assay כתם ג&#39;ל RNA) מהווה דוגמא מייצגת: הוא מועסק במידה רבה לפרופיל הצטברות RNA, שכן הוא מבטיח שני quantitation רמת הביטוי, כמו גם קביעת גודל. עם זאת, רגישות העניים המהותית של השיטה היא להגביל כאשר הוא שיחול על מקלטי קנס ביטוי גנים נמוכים בשפע, כמו RNAs הקצר. תוצאה מזיקה היא הדרישה של כמויות גדולות של רנ&quot;א הכל, מה שהופך את היישום שלה קשה לדגימות ביולוגיות ספציפיות. מסיבות כאלה, וריאנטים NB ספציפיים לגילוי RNA קטן פותחו 38-40: אנו ניצלנו proc NB השתפרedure 41 (ENB, משופר צפון כתם), ואילו הבהרת הגומלין הנ&quot;ל בין Dmel-miR279 וGCM / דאייה. שיטה זו מסתמכת על צעד כימי crosslinking מבוסס על הפעילות של נגזר Carbodiimide [1-אתיל 3-carbodiimide (3-dimethylaminopropyl), EDC] לתקן חומצות גרעין על תמיכה מוצקה. Carbodiimide הוא מקשר צלב צדדי הידוע לזרז את הקמתה של אגרות חוב אמיד בין קבוצות carboxyl או פוספט מופעלות וקבוצות האמינים 42. מאפיין זה יכול להיות מנוצל לזוג קוולנטית RNA הקטן באמצעות קבוצת 5&#39;-הידרוקסיל מונו פוספורילציה לאמין קבוצות על פני השטח של קרום ניילון. תצורת הקובץ המצורף וכתוצאה מכך מגדילה את הנגישות של חומצות גרעין המשותקים ו, בתורו, את היעילות של הכלאת בדיקה-יעד, וכתוצאה מכך שיפור גילוי מדהים 43. הטכניקה מניחה relevanc מסויםדואר במחקרים מולקולריים דרוזופילה, שבו ההתרחשות של כיתות רומן וייחודיות של RNAs noncoding הקטן מתגלה 44. בין אלה, rasiRNAs 45,46 מהווים תת סוג ספציפי של RNAs אינטראקציה-piwi (piRNAs 47), מעורב בהשתקת גני רצף ספציפי. פרטים אופרטיביים של שיטה זו מתוארים באופן מלא ומדמיינים להלן, ביחס לניתוח של מייקרו RNA Dmel-miR279 וDmel-miR286 ו, בפעם הראשונה, של אחד rasiRNA, rasi4. אנחנו דחפתי למצבים קיצוניים ששיטה זו, אשר אפשרה לנו לחשוף את המטרות הביעו גרוע מכמויות מינימליות של RNA (מיקרוגרם פחות מ 1).

<table><tbody><tr><td>הרכב סופי/שם</td><td></td><td>קטלוג החברה (מלאי)</td><td>הערות<</td></tr><tr>TD colspan="4">צנטריפוגה לדרישות כלליות</td></tr><tr><td>, 5418</td><td>Eppendorf</td><td>5418 000.017</td><td></td></tr><tr><td>Decontaminant, RNase Away</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>83931</td><td>למרוח על זכוכית/כלי פלסטיק, לנגב ולשטוף</td></tr><tr><td>מעכב RNase, DEPC</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5758</td><td>מסוכן //// 1609-47-8</td></tr><tr><td colspan="4"></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ סטריאו להכנת דגימה, M60</td><td>Leica&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1X מאגר</td><td></td><td></td><td></td>PBS</tr><tr><td>137 מ"מ NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3014</td><td>7647-14-5&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>2.7 מ"מ KCl</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>P9541</td><td>7447-40-7&nbsp;</td></tr><tr><td>10 מ"מ Na2HPO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3264</td><td>7558-79-4&nbsp;</td></tr><tr><td>1.8 מ"מ KH2PO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9791</td><td>7778-77-0&nbsp;</td></tr><tr><td colspan="4">RNA EXTRACTION/ANALYSIS</td></tr><tr><td>UV-VIS ספקטרופוטומטר</td><td>Thermo Scientific</td><td>Nanodrop 2000</td><td></td></tr><tr><td>Gel Imager, ChemiDoc XRS+</td><td>Biorad</td><td>170-8265</td><td></td></tr><tr><td>אלקטרופורזיות אופקיות, Mini-Sub Cell GT</td><td>BioRad</td><td>170-4487EDU</td><td></td></tr><tr><td>מגיב מיצוי RNA, TRIzol Reagent</td><td>Life Technologies</td><td>15596026</td><td>מסוכן</td></tr><tr><td>PCA (25:24:1), 1:1 למיצוי</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>77617</td><td>136112-00-0</td></tr><tr><td>Chlorophorm, 1:1 למיצוי</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C2432</td><td>67-66-3&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>EtOH, 2.5 כרך למשקעים, 70% לשטיפת</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>59844</td><td>64-17-5&nbsp;</td></tr><tr><td>Gene Ruler 1Kb DNA</td><td>Ladder Thermo Scientific</td><td>SM0311</td><td></td></tr><tr><td>Stop Mix</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>300 mM NaOAc, pH 5.5</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2889</td><td>127-09-3</td></tr><tr><td>1x תמיסת</td><td></td><td></td><td></td>RSB</tr><tr><td>2% נתרן דודציל סולפט (SDS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71736</td><td>לעולם אל תקרר SDS כדי למנוע&nbsp; משקעים //// 151-21-3</td></tr><tr><td>2 מ"ג/מ"ל Proteinase K</td><td>Roche Applied Science</td><td>0-3115828001</td><td>EC 3.4.21.64 9</td></tr><tr><td>10X Reticulocyte Standard Buffer (RSB)</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>100 mM Tris-Cl, pH 7.4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T5941</td><td>1185-53-1&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>100 מ"מ NaCl</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>S3014</td><td>7647-14-5&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>30 מ"מ MgCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8266</td><td>7786-30-3</td></tr><tr><td>דנטורינג אגרוז ג'ל</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1.2% אגרוז</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>A9539</td><td>תן לג'ל להתמצק למשך שעה לפחות //// 9012-36-2</td></tr><tr><td>10X MOPS Buffer</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.2M מלח נתרן MOPS, pH 7</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M9381</td><td>אל תבלבלו מלח נתרן MOPS עם MOPS //// 71119-22-7</td></tr><tr>צבע <td></td><td></td><td></td><td>טעינת אגרוז</td></tr><tr><td>1x MOPS מאגר</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>3% פורמלדהיד</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>F8775</td><td>מסוכן //// 50-00-0</td></tr><tr><td>50% פורממיד</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>47670</td><td>מסוכן //// 75-12-7</td></tr><tr><td>אתידיום ברומיד (EtBr) 30 &mu; גרם/מ"ל</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>E1510</td><td>מסוכן //// 1239-45-8</td></tr><tr><td>ברומופנול כחול&nbsp;</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>B0126</td><td>115-39-9&nbsp;</td></tr><tr><td colspan="4"> פיצול RNA</td></tr><tr><td>קטן טיפים לטעינת ג'ל שטוח Life</td><td>Technologies</td><td>LC1002</td><td></td></tr><tr><td>Savant SpeedVac רכז</td><td>Thermo Scientific&nbsp;</td><td>DNA120</td><td></td></tr><tr><td>אלקטרופורזה אנכית, תא טטרה Mini-PROTEAN&nbsp;</td><td>Biorad</td><td>165-8000</td><td></td></tr><tr><td>ג'ל</td><td></td><td></td><td></td>אקרילאמיד</tr><tr><td>10% אקרילאמיד/ביס-אקרילאמיד (19:1)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3449</td><td>מסוכן. תן לג'ל להתפלמר במשך 45 דקות לפני השימוש</td></tr><tr><td>1x TBE Buffer (או 1x MOPS Buffer)</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>7 M אוריאה</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>U6504</td><td>57-13-6</td></tr><tr><td>0.1% אמוניום פרסולפט</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>215589</td><td>7727-54-0&nbsp;</td></tr><tr><td>0.1% TEMED</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9281</td><td>110-18-9</td></tr><tr><td>Gene Ruler סולם DNA בטווח נמוך במיוחד (10 bp-step)</td> <td>Thermo Scientific</td><td>SM1211</td><td>Label 0.1 &mu; g, כמתואר בתגובת "תיוג הבדיקה"</td></tr><tr><td>Acrylamide Blue Dye&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>50% פורממיד</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>47670</td><td>מסוכן //// 75-12-7</td></tr><tr><td>ברומופנול כחול</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>B0126</td><td>115-39-9&nbsp;</td></tr><tr><td>מאגר ריצה (RB)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1x מאגר MOPS&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>חלופה RB: 1x מאגר</td><td></td><td></td><td></td>TBE</tr><tr><td>1x מאגר</td><td></td><td></td><td></td>TBE</tr><tr><td>5X TBE</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>445 מ"מ Tris-base</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1503</td><td>77-86-1&nbsp;</td></tr><tr><td>445 מ"מ חומצה בורית</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>B7901</td><td>10043-35-3</td></tr><tr><td>20 מ"מ EDTA</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>EDS</td><td>60-00-4&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr>תמיסת <td></td><td></td><td></td><td>צביעת ג'ל</td></tr><tr><td>אתידיום ברומיד 0.5 &mu; g/ml</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E1510</td><td>מסוכן //// 1239-45-8</td></tr><tr><td>1x כתם RB</td><td></td><td></td><td>למשך 15 דקות עם EtBr, נמנע למשך 15 דקות w/o EtBr</td></tr><tr><td colspan="4">BLOTTING</td></tr><tr><td>3MM נייר Whatman</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z270849</td><td></td></tr><tr><td>קרום ניילון ניטרלי, Hybond NX</td><td>GE Healthcare Life Science</td><td>RPN203T</td><td>Photosensitive</td></tr><tr><td colspan="4">CROSSLINKING</td></tr><tr><td>תמיסת קישור צולבת (XLS)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1% 1-methylimidazole (v/v)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>336092</td><td>הכינו תמיד מנה טרייה של XLS //// 616-47-7</td></tr><tr><td>12.5 mM HCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H1758</td><td>מסוכן //// 7647-01-0</td></tr><tr><td>3.1% EDC (w/v)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>3450</td><td>25952-53-8&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td colspan="4">(PRE)-HYBRIDIZATION</td></tr><tr><td>מונה נצנוץ נוזלי&nbsp;</td><td>Beckmann</td><td>LS 6500</td><td></td></tr><tr><td>זרע סלמון גזוז, 0.1 מ"ג/מ"ל&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>AM9680</td><td></td></tr><tr><td>rasi4 בדיקה</td><td></td><td></td> אנטי-חושית <td>5' CGGUGUUCGACAGUUCCUCGGG -3'5s-rRNA</td></tr> <tr><td>בדיקה אנטי-חושית</td><td></td><td></td><td>5'-CAACACGCGGTGTTCCCAAGCCG-3'Dmel-miR279</td></tr> <tr>בדיקה <td></td><td></td><td>אנטי-חושית</td><td>5'-TTAATGAGTGTGTGGATCTAGTCA-3'Dmel-miR286</td></tr> <tr>בדיקה <td></td><td></td><td>אנטי-חושית</td><td>5'- AGCACGAGTGTTCGGTCTAGTCA-3'ערכת</td></tr> <tr><td>טיהור, Illustra MicroSpin G-25 עמודות</td><td>GE Healthcare Life Science</td><td>27-5325-01</td><td></td></tr> <tr><td>(Pre)-Hybridization Solution (HS)</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>0.5% SDS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71736</td><td>151-21-3&nbsp;</td></tr><tr><td>5x הפתרון</td><td></td><td></td><td></td>של דנהרדט</tr><tr><td>20X SSPE</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>3.6 M NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3014</td><td>7647-14-5&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>0.2 M נתרן פוספט</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>342483</td><td>7601-54-9&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>20 מ"מ EDTA (pH 8.0)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>EDS</td><td>&nbsp; 60-00-4&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>50x Denhardt's Solution</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1% Ficoll 400 (w/v)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F2637</td><td>26873-85-8</td></tr><tr><td>1% Polyvinylpyrrolidone</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>PVP40</td><td>9003-39-8</td></tr><tr><td>1% BSA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7906</td><td>9048-46-8&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>1X TEN Buffer</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10 מ"מ Tris-Cl (pH 8.0)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1503</td><td>77-86-1&nbsp;</td></tr><tr><td>100 מ"מ NaCl</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>S3014</td><td>7647-14-5&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>1 מ"מ EDTA (pH 8.0)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>EDS</td><td>60-00-4&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>תיוג</td><td></td><td></td><td></td>בדיקה</tr><tr><td>0.4 &mu; M אוליגונוקלאוטיד</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1.5 &mu; l Ci/&mu; l [&gamma;-32P] ATP</td><td>Perkin Elmer</td><td>NEG002A</td><td>מסוכן //// 51963-61-2</td></tr><tr><td>1x T4 Polynucleotide Kinase Buffer</td><td>Biolabs</td><td>B0201</td><td></td></tr><tr><td>T4 Polynucleotide Kinase 0.5 יחידות/&mu; l</td><td>Biolabs</td><td>M0201</td><td>EC 2.7.1.78</td></tr><tr><td colspan="4">כביסה</td></tr><tr><td>גלאי גייגר מולר</td><td>קנברה תעשיות</td><td>MCB2/CPS &ndash; </td><td></td></tr><tr><td>EM77021 מאגר כביסה (WB), 2x SSPE</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>מאגרי</td><td></td><td></td><td></td>כביסה מחמירים</tr><tr><td>0.2x SSPE</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2x SSPE, 0.5% SDS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.2x SSPE, 0.5% SDS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4" >זיהוי אותות</td></tr><tr><td>מערכת PharosFX Plus Biorad</td><td></td><td>170-9460</td><td></td></tr><tr><td>תמונה J</td><td>כמות זמינה</td><td></td><td></td>בחינם</tr><tr><td>סרטי רנטגן</td><td></td><td></td><td></td> Biorad</tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>אחד</td></tr>, BioMax XAR Sigma-Aldrich F5888 <tr><td>מפתח רגיש לאור לסרטי רנטגן</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7042</td><td></td></tr><tr><td>Fixer לסרטי רנטגן</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7167</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">הפשטה</td></tr><tr><td>תמיסת</td><td></td><td></td><td></td>הפשטה</tr><tr><td>10 מ"מ Tris-HCl pH 8.8</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>T1503</td><td>77-86-1&nbsp;</td></tr><tr><td>5 מ"מ EDTA</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>EDS</td><td>60-00-4&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>0.1% SDS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71736</td><td>הוסף SDS לאחר הרתיחה כדי למנוע קצף //// 151-21-3</td></tr></tbody></table>

enhanced צפון כתם איתור של rna קטן מינים ב תסיסנית

Enhanced Northern Blot Detection of Small RNA Species in Drosophila Melanogaster

העשורים האחרונים היינו עדים לפיצוץ של כ מנגנוני בקרת ביטוי גני עניין מדעי ברמת RNA. ענף זה של ביולוגיה מולקולרית כבר מתודלק באופן משמעותי כתוצאה מגילוי noncoding RNAs כשחקנים מרכזיים בויסות לאחר תעתיק. כגון פרספקטיבה מהפכנית כבר מלווה ומופעלת על ידי הפיתוח של טכנולוגיות רבות עוצמה לאפיון ביטוי RNAs קצר, הן ברמת התפוקה הגבוהה (זיהוי הגנום) או כניתוח בודד מועמד (הצטברות מצב יציבה של מינים ספציפיים). למרות שכמה אסטרטגיות המדינה של אמנות זמינות כעת למינון או חזותי מולקולות שברחו כזה, assay צפון הכתם נשאר הגישה זכאית בביולוגיה מולקולרית להערכה מיידית ומדויקת של ביטוי RNA. זה מהווה צעד ראשון בדרך ליישום של, וטכנולוגיות יקרות יותר מתוחכמות, במקרים רבים, נותר שיטה מועדפת לתובנה בקלותלביולוגית RNA. כאן אנו סקירה כללית של פרוטוקול יעיל (Enhanced צפון כתם) לאיתור מייקרו RNA מתבטא בחולשה (או מיני RNA קטנים אחרים רגולטורים) מתסיסנית כל עוברים, גזורים באופן ידני רקמות / מבוגר זחל או בתאים בתרבית מבחנה. כמות מוגבלת מאוד של RNA נדרש והשימוש בחומר מתאי הזרימה cytometry-מבודדים יכולים להיות גם בחזונו.

על ידי ביצוע ההליך הכולל המתואר בטקסט ואופן סכמטי המיוצג באיור 1, אנו הערכנו ביטוי RNA הקטן מדוגמאות RNA מורכבות של מקורות שונים. בניסוי שהוצג באיור 1, RNA היה מבודד מ2 התאים של דרוזופילה שניידר על ידי מיצוי proteinase K, בדיקת תקינות ב( שלב אופציונאלי: denaturing חלוקה agarose ג'ל) ועמוס בכפול. מחצית אחת של ג'ל הייתה מחקה על קרום ניטראלי וכימי צולבים על ידי EDC; המחצית השנייה הועברה על מסנן ניילון במטען חיובי, אז UV צולב (1.2 x 10 5...

מטרתו של פרסום זה היא לדמיין ולדון בצעדים האופרטיביים של פרוטוקול צפון כתם משופר על RNA שחולץ מתסיסנית עוברים, תאים ורקמות. פרוטוקול זה שימושי במיוחד לאיתור יעיל של מיני RNA קטנים.

Enhanced צפון כתם איתור של RNA קטן מינים ב תסיסנית

The last decades have witnessed the explosion of scientific interest around gene expression control mechanisms at the RNA level. This branch of molecular ...

המטרה הכוללת של הליך זה היא לאפשר זיהוי של ביטוי RNA קטן מעוברים או רקמות או תאים של Deano gaster. זה מושג על ידי מיצוי RNA תחילה מהמקורות הביולוגיים הנבחרים. השלב השני הוא פיצול RNA על ידי אלקטרופורזה לאורך ג'ל אקרילאמיד כדי לפתור דפוסי נדידה במשקל מולקולרי נמוך.לאחר מכן, מיני ה-RNA מועברים ומקושרים כימית לתמיכה מוצקה ניטרלית. השלב האחרון הוא לתייג מולקולות מועמדות על ידי חישולן עם בדיקות אנטי-סנס ספציפיות. בסופו של דבר, רדיוגרפיה אוטומטית משמשת לחשיפת אותות המשקפים את ביטוי המולקולות המנותחות.שיטת הגוש הצפוני הבלתי פתורה הזו אינה יכולה לענות על שאלות מפתח בתחום הביולוגיה של RNA, כגון רמות המצב היציב של מולקולות RNA המתבטאות במלואן. כדי להתחיל לגדל את שני התאים של דרוזופילה שניידר לצפיפות של אחד עד חמש כפול 10 עד השישית למיליליטר. לאחר מכן נתק את התאים הדבקים למחצה על ידי פיפטינג וצנטריפוגה של התאים ב-100 GS לדקה אחת.לחלופין, צברו עוברים על צלחות הטלת ביצים. נגב את העוברים בעזרת מברשת צבע ומים מזוקקים, סנן אותם דרך מסננת כפולה, ואז שטוף ושחזר את העוברים בצינור, הוסף 100 מיקרוליטר של מיצוי RNA, מגיב ועלי. הומוגניזציה של הדגימה.בצע בידוד RNA בהתאם להוראות היצרן. לאחר מכן, העריכו את ריכוז ה-RNA על ידי ספקטרופוטומטר UV וודאו שטוהר ה-RNA קרוב ל-2.0 בהתבסס על A two 60. מעל שניים 80 קריא

enhanced-northern-blot-detection-small-rna-species-drosophila

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

התערבות RNA הוכח יעיל מאוד כדי לנתח את תפקוד...

RNAi הפרעה על ידי הזרקה לתוך dsRNA תסיסנית עוברים

אנו מתארים שיטה רגיש לזהות הרגולטורים postembryonic של ביטוי חלבונים לוקליזציה...

RNAi הקרנת לזהות פנוטיפים Postembryonic ב ג elegans</em

כאן אנו מתארים שלם הר...

הר כולו RNA פלורסנט<em&gt; באתר</em&gt; הכלאה של<em&gt; דרוזופילה</em&gt; עוברים

המתואר RNA בחיי עיר הכלאה פרוטוקול מאפשרת הגילוי של RNA כל עוברי דרוזופילה או רקמות גזור. באמצעות לוחות 96-ובכן microtiter tyramide אות הגברה, תעתיקים שניתן לאתר ברזולוציה גבוהה, רגישות, ואת התפוקה, בעלות נמוכה יחסית.

ברזולוציה גבוהה פלורסנט בחיי עיר הכלאה של עוברי דרוזופילה ורקמות באמצעות הגברה Tyramide אות

כאן, אנו מציגים פרוטוקול עבור ויזואליזציה, זיהוי, ניתוח ומעקב של סחר האנטי-מסוגגני mRNA בחיים Drosophila ילה מלאנוסטר תא ביצה באמצעות משואות מולקולריות, מיקרוסקופיה דיסק מסתובב, וניתוח קוד פתוח תוכנה.

חזותי ומעקב אחר mRNAs בשידור חי דרוזוסופילה מלאנוגסטר צ'יימברס

שיטה זו ממחישה את השימוש בטכניקת הכלאה הצפוני כדי לזהות miRNAs מתוך תמצית RNA מוחלטת.

ה-RNA ניתוח כתמי לזיהוי וכימות של מיקרורונאס הצמח

דרוזופילה היא מודל מבוסס היטב לחקר מולקולות מפתח המווסתות מיוגנזה. עם זאת, השיטות הנוכחיות אינן מספיקות כדי לקבוע דינמיקת שעתוק mRNA והתפלגות מרחבית בתוך סינציטיה. כדי להתמודד עם מגבלה זו, ביצענו אופטימיזציה של שיטת הכלאה פלואורסצנטית באתרה של RNA המאפשרת זיהוי וכימות של mRNA בקנה מידה של מולקולה אחת.

חקר דינמיקת שעתוק שרירים בסקאלות של מולקולות בודדות בדרוזופילה

Expand-Assisted Fluorative Fluorescence In Situ Hybridization (EASI-FISH) היא טכניקה חזקה המשלבת מיקרוסקופ הרחבה עם הכלאה פלואורסצנטית באתרה (FISH) כדי לזהות ביטוי של גנים מרובים ברקמה עבה. פרוטוקול זה מתאר את ההתקדמות האחרונה בשיטה ואת התאמתה לתיוג מערכת העצבים המרכזית של דרוזופילה השלמה.

זיהוי מולטיפלקס של ביטוי גנים במוח הדרוזופילה השלם באמצעות פלואורסצנציה איטרטיבית בסיוע הרחבה בהכלאה באתרה

הפרוטוקול מתאר שיטת פלואורסצנטיזציה רגישה לפולימורפיזמים בודדים של נוקלאוטידים בודדים (SNP-FISH) כדי להבחין בין תעתיקי RNA ריבוזומליים שמקורם בלוקוס ה-DNA הריבוזומלי של כרומוזום X או Y  ב-Drosophila melanogaster.

זיהוי FISH רגיש לפולימורפיזם נוקלאוטידי יחיד של שעתוק RNA ריבוזומלי ספציפי ללוקוס ב-Drosophila melanogaster

מאמר זה מתאר פרוטוקול יעיל לפירוק דיסק דמיוני וצביעת נוגדנים, שהוא חסכוני עם מגיבים ומקל על טיפול בדיסקים דמיוניים במספרים קטנים.

כריתה בקנה מידה קטן וצביעת נוגדנים של דיסקים דמיוניים באנטנות העיניים והכנף מ-Drosophila melanogaster

למד את פרוטוקול Northern Blot המשופר לזיהוי מולקולות RNA קטנות ב-Drosophila melanogaster. השיטה כוללת חילוץ RNA, אלקטרופורזה על ג'ל אקרילמיד והיברידיזציה עם בדיקות אנטיסנס רדיואקטיביות.

Enhanced צפון כתם איתור של RNA קטן מינים ב תסיסנית

גלה סרטונים נוספים