Name: מערכת תרבות עכבר העוברי שלם מעי ל Ex Vivo מניפולציה של מסלולי איתות והדמית חיה תלת ממדית של פיתוח שליה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-09-04T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 46 s
Description: למד שיטת תרבית איברים שלמים של מעי עוברי בעכבר לחקר מסלולי איתות והדמיה חיה תלת ממדית. השיטה מאפשרת לחקור תהליכי התפתחות של וילי במודל Ex Vivo.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

אנו מודים לד"ר דבורה ל. גומוצ'יו כיועצת שלנו ועל תמיכתה שלא תסולא בפז בהגדרת התרבית ושיטות ההדמיה. אנו מודים גם לד"ר ג'ים ברודי, לד"ר הונג-שיאנג לו, לד"ר שרלוט מיסטרטה ולד"ר אן גרוס על תרומתם לפיתוח מערכת תרבית איברי המעי השלם. דיונים מועילים על הדמיה סיפקו עצות מצוינות מד"ר צ'יפ מונטרוז, מייקל צ'רווינסקי וסשה משינצ'י. כל ההדמיה בוצעה במעבדה למיקרוסקופיה וניתוח תמונה באוניברסיטת מישיגן. תמיכה במימון ניתנה על ידי NIH R01 DK065850.

הערה: כל העכברים טופלו באנושיות תוך שימוש בפרוטוקולים שאושרו על ידי אוניברסיטת מישיגן בית הספר לרפואת היחידה לבעלי חיים במעבדה לרפואה ובהתאם להנחיות ועדת האוניברסיטה על שימוש וטיפול של בעלי חיים. מערכת האיברים תרבות .1 שלמה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנה של תקשורת ותרבות צלחות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בשכונת תרביות רקמה, להסיר 5 מ&quot;ל של תקשורת BGJb ממניות הבקבוק ולהוסיף 5 מ&quot;ל של העט / סטרפטוקוקוס. הכן מלאי עבודה של תקשורת בצינור חרוטי 50 מ&quot;ל, על ידי הוספת 1 מ&quot;ל של 5 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​חומצה אסקורבית ל49 מ&quot;ל של תקשורת BGJb (עם פן / סטרפטוקוקוס). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן צלחת תרבות 6 היטב על ידי הוספת 1 מ&quot;ל מתחת לכל של transwells. הערה: אם לא השתמש בכל 6 transwells, להעביר transwells נוסף לצלחת 6 היטב סטרילי טרי לשימוש מאוחר יותר. הוסף 3 מ&quot;ל של עבודה תקשורת BGJb לכל אחת משלוש צלחות פטרי 10 סנטימטר סטרילי. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנה לנתיחה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> משרים כלים לנתח בetha 70%נול ולהיות בטוחים כדי לשמור על הכלים נקיים תוך כדי העבודה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את האזור לנתח עם דלי קרח גדול ולמקם את צלחת תרבות 6 היטב ו10 פטרי מנות סנטימטר עם תקשורת BGJb על קרח. לעבוד על קרח ככל האפשר, תוך ביתור והכנת המעיים לתרבות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרדימי נקבת עכברים בוגרים בתא עם isofluorane (100 μl) לפני euthanization נקע בצוואר הרחם לאסיף מעיים של העובר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר קצירת העוברים מאמם, לביים כל עובר על פי זהירות לTheiler בימוי תרשים 13. אין לסמוך על ימים שלאחר משגל-כדי לקבוע את הגיל של כל עובר כוריאציות של עד 24 שעות בשלב התפתחותי הם נצפו באופן שיגרתי בהמלטה אחת. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Dissection של מעיים של העובר <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים עוברים על ידי עריפת ראש לפני הסרת מעיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתח כל מעי בשל 1x Dulbecco פוספט שנאגר מלוח (DPBS) ולאחר מכן PLACe אותו לתוך צלחת פטרי 10 סנטימטר עם העבודה תקשורת BGJb. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוציא בזהירות את הטחול מהבטן והלבלב מהבטן והעליון תריסריון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעדינות להפריד את omentum דואג להשאיר את omentum המצורף ככל האפשר ומפריד את הקשרים רק מספיק כדי לאפשר למעי להיות יישר. הערה: למעיים מבוגרים מן E14.5 או אלה שתרבית יותר מ24 שעות, בעדינות להפריד את המעי ל3 חלקים שווים, כדי לאפשר לתוכן luminal לזרום דרך המעי ולהיות מגורש מקצות החתך. עם זאת, לתרבויות התחילו לפני E13.5, לחכות עד אחרי 24 שעות של culturing לפני פרידת 3 המגזרים של המעי כדי לאפשר serosa לגדול כראוי על פני האורך של המעי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש pipet פה כדי להעביר את חתיכות מעיים על transwells של צלחת התרבות (1.1.2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעדינות למקם מחדש את המעיים לפי צורך, כך שהם ישר transwell. הערה: ברגע שהמעיים מתחילים לנוע תוכן luminal דרך הצינור, סטיות כל במעי יגרמו גיבוי ונזק למעי. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תרבות וטיפול <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את המדיה מתחת transwell, להוסיף 700 μl של תקשורת טיפול (עבודה תקשורת עם חלבונים הוסיפו רקומביננטי או מעכבים תרופתיים) תחת transwell. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 300 μl של תקשורת טיפול ירידה מבחינת על גבי המעיים ולאפשר לו לספוג דרך transwell. למקם מחדש את המעיים על פי צורך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שינוי בתקשורת טיפול לפחות פעם ביום או לעתים קרובות יותר בהתאם לזמן מחצית החיים של מגיב הטיפול. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנת חרוזים agarose חלבון ספוגה למקור מקומי של מגיב טיפול <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend חרוזים agarose במכל האחסון שלהם ולהעביר את חרוזים agarose 100 μl לתוך צינור 1.5 מ&quot;ל microfuge. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלא את הנפח הנותר של הצינור עם סטרילי 1x Phosphate שנאגר מלוח (PBS) ומערבבים את החרוזים כדי לשטוף אותם. מניחים את צינור microfuge במעמד לכמה דקות כדי לאפשר חרוזים להתיישב לתחתית ואז pipet את PBS מעל גבי חרוזים. למלא את צינור microfuge עם סטרילי 1x PBS ולחזור על תהליך השטיפה פעמיים נוספת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את החלבון של עניין בשתי פעמים הריכוז רצוי לטיפול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים 5 μl של חרוזים agarose נשטפו עם 5 μl של מניית חלבון 2x ועדינות להתסיס את חרוזים בחלבון. מניחים את הצינור על קרח במשך שעה 1, ערבוב בעדינות כל דקות 10-15. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש לשטוף את חרוזים קצר בסטרילי 1x PBS לפני הצבת חרוזים במעיים. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מיקום של חרוזים agarose <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניח בעדינות את חרוזים agarose על גבי המעיים באמצעות pipet פה עם מחטי נימים משכו. מניחים את חרוזים בזהירות רבה כטיפול אגרסיבי יפגע המעי ולמנוע התפתחות סיסי באזור הפגוע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח חרוזי פעמיים רבים ככל נדרשים לניתוח מאז המעיים יעברו תנועות peristaltic וכמחצית מהחרוזים להציב יגלגל את המעיים על פני זמן culturing. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קיבוע של מעיים בתרבית <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוציא בזהירות את תקשורת הטיפול מלמטה transwell ולאפשר את המעיים לייבוש באוויר במשך 3 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 1 מ&quot;ל של מקבע תחת transwell למשך 2 דקות, לאחר מכן לכסות את החלק העליון של המעי עם 2 מ&quot;ל של מקבע למשך שארית זמן הקיבעון. לתקן עם 4% O paraformaldehyde / N ב 4 מעלות צלזיוס או לשעה 2 ב RT. </li></ol></li></ol> .2 הדמיה של מעיים קבועים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הדמיה Wholemount <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את המעיים שלמים (עם הקרינה אנדוגני) בשקופית עם של 1x DPBS 100 μl. שימוש במלקחיים כדי לסדר בעדינות את המעיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש במטלית מעבדה כדי להסיר בזהירות את DPBS ומייד להוסיף של גליצרול 70% 100 μl כדי להפוך את מו הרקמהמחדש שקוף ולהגדיל את העומק האפשרי של הדמיה. הערה: אם חדירה נוספת של המעי היא רצויה, במקום הרכבה המעי ב70 גליצרול%, להשרות את המעי בכמה טיפות של תמיסת המוקד ברורה ל10-30 דקות. Pipet את פתרון המוקד ברור והר המעי עם הר ברור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טובלים כל אחת מארבע הפינות של coverslip לפלסטלינה ולהרים כמות קטנה של חומר שישמש כמפרידים בין השקופיות וcoverslip כדי לשמור על coverslip ממשטח את המעי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאטום את coverslip לשקופית עם VALAP מומס מיושם עם מקלון צמר גפן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תמונת המעיים משני מיקרוסקופ confocal זקוף או הפוך. נא עיין בדיון לפרטים נוספים. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חתך Vibratome של מעיים קבועים (עבור תצוגת חתך רוחב של מבני מעיים) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעיים להטביע בagarose 7% בתבניות פלסטיק קטנים (10 x 10 x 15 מ&quot;מ) ולאפשר ללוקי agarose ללצנן ולחזק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להסיר בלוקים agarose מתבניות הפלסטיק ואובניים agarose הדבק לשלב איסוף vibratome עם דבק מיידי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלא את שלב האיסוף עם קרח הקר 1x DPBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחתוך חלקים בעובי בין 100-150 מיקרומטר. עבור חלקים עבים יותר להשתמש בפתרוני סליקה (שתוארו בסעיף 2.1.2) כדי לחזות עמוק יותר לתוך החתך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יוצקים vibratome חלקים מהשלב האיסוף לתוך באר של צלחת 6 היטב לאחסון ב 4 ° C.. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מכתים immunofluorescence של רקמות קבועות, מחולק vibratome <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח 5-12 חלקים vibratome לכל גם לתוך צלחת 24 גם עם 1x DPBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר 1x DPBS ולהוסיף 500 μl של פתרון permeabilization בכל טוב. נער בעדינות את הדגימות ל25 דקות ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר permeabilization, לשטוף את הדגימות 3 פעמים עם 1x PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חסום את הדגימות לפחות 30 דקות ב500 μl של חסימת פתרון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר חסימה, דוארXchange פתרון החסימה עם 500 μl של הנוגדנים עיקריים בדילול מלא בחסימת פתרון ולשמור את הדגימות על 4 מעלות CO / N. הערה: דילולים הנוגדן הראשוניים שפועלים היטב על חלקים קפואים ופרפין בדרך כלל עובדים גם על vibratome סעיפים מדי, לעומת זאת נוגדנים הדורשים אחזור אנטיגן גרעיני בדרך כלל לא עובד טוב עם פרוטוקול זה (למשל, BrdU). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למחרת, לשטוף את הדגימות 3 פעמים במשך 15 דקות בכל פעם עם פתרון חסימה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר כביסה, להחיל 500 μl של הנוגדנים משני בדילול מלא בחסימת פתרון. לעטוף את צלחת 24 גם בנייר אלומיניום כדי להגן fluorophores מן האור ולטלטל את הדגימות ל45 דקות לשעה 2 ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף את הדגימות 3 פעמים עם 1x PBS ל15 דקות כל אחד והר חלקי vibratome בשקופיות כפי שתואר בסעיף 2.4. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרכבה חלקי vibratome <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן שקופיות עבור vibratome הרכבה על ידי חיתוך פרוסות דקות של כפול STIקלטת ck ומציב אותם בצדי המגלשות הארוכים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזהירות להניח 5-10 חלקי vibratome בין הקלטת דו המקל בשקופיות בירידה של של 1x PBS 100 μl. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפתוח את כל החלקים ולהפיץ אותם לשכבה אחת על פני השקופית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את כל agarose עודף או חתיכות לא אחידות שימנע coverslip מיושב שטוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשתמש בזהירות רקמת מעבדה כדי לספוג את עודף 1x PBS מכל רחבי חלקי vibratome. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף טיפה של מדיום גובר מימיים על גבי חלקי vibratome ולאחר מכן coverslip. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותם את coverslips על השקופיות עם נמס VALAP מיושם עם מקלון צמר גפן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תמונת חלקי vibratome משני מיקרוסקופ confocal זקוף או הפוך. נא עיין בדיון לפרטים נוספים על בחירה של מערכת הדמיה. </li></ol></li></ol> .3 הדמיה חיה של מעיים שלמים מעיים שנקטפו מן fetuseים לאחר E12.5, עם omentum המחובר נותר בשלמותו, לפתח בהצלחה villi בתרבות שימוש במערכת לעיל. לכן, מערכת זו vivo לשעבר מאפשרת הלכידה של תמונות z-סעיף חיים של המעיים פיתוח שניתן לשחזר לתצוגה תלת ממדית של המורפוגנזה לאורך זמן. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדרת הדמיה חיה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בדבק מיידי לדבוק קרום פוליקרבונט פרט למסך רשת בסדר. זה מספק פיגום תמיכה כדי להחזיק את המעי במקום מתחת לעדשת הטבילה של המיקרוסקופ confocal הזקוף. נא עיין בסעיף הדיון לפרטים נוספים על בחירה של מיקרוסקופי הדמיה לחיות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את מסך הרשת במרכז גם צלחת תרבות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את המעי גזור על הממברנה פוליקרבונט ולהוסיף טיפה של דבק מיידי בכל צד. השתמש אך ורק מספיק דבק להדביק המעי, אבל זה לא מעיל! </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף חופשי תקשורת ותרבות של פנול אדום מתחת לפוליקרבונטקרום במרכז גם מצלחת התרבות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוסיף מים עד לשפה החיצונית של צלחת התרבות כדי לספק לחות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מאז המעי העוברי עובר גלים כמו נפיחה של התכווצות בתרבות, להוסיף של 1 100 μl: פתרון 5 של xylazine ב1x PBS עד 3 מ&quot;ל של תקשורת כדי לשלוט בתנועה של המעי תוך הדמיה. מינון זה לשלוט בתנועות מעיים במשך כ8-10 שעה מבלי להתפשר על פיתוח סיסי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לתצוגה רוחבית של המעי, להטביע את המעיים חיים בפתרון agarose 3-4% ולחתוך חלקים עבים (150-500 מיקרומטר) על vibratome. התאם את הנוקשות של agarose עם הקשיחות של המעי נחתך ואמפיריים נקבע השלב ההתפתחותי. באופן כללי, פתרון agarose 3% עובד היטב עבור מעיים צעירים מן E14.5 ופתרון 4% עובד היטב עבור המעיים E15-E16. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדביק את חלקי vibratome לקרום פוליקרבונט מודבקים מסך רשת (כמו בסעיף 3.1.1) והתרבות כפי שתוארה בסעיף 3.1.2-3.1.6. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנהל את ההדמיה בשידור החי באמצעות מיקרוסקופ שני פוטונים confocal הקרינה (לייזר עירור בין 690-1,040 ננומטר) על עמדה זקופה עם שולחן מתכונן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לייזר שני פוטונים מכוון ל900 ננומטר מספק חדירה עמוקה עם הרזולוציה הטובה ביותר עבור אותות GFP. זה מפחית את נזק לרקמות בזמן ההדמיה. בנוסף, הגדרת כוחו של הלייזר לפליטה הנמוכה ביותר האפשרית מפחיתה נזק לרקמות. בדרך כלל כדי להשיג עירור טוב של GFP, להשתמש 12% כוח בליזר שני פוטונים. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Grosse, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+dynamics+in+fetal+intestinal+epithelium%3A+implications+for+intestinal+growth+and+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Cell dynamics in fetal intestinal epithelium: implications for intestinal growth and morphogenesis.</a> Development. 138, 4423-4432 (2011).</li>
<li>Walton, K. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hedgehog-responsive+mesenchymal+clusters+direct+patterning+and+emergence+of+intestinal+villi%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Hedgehog-responsive mesenchymal clusters direct patterning and emergence of intestinal villi.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109, 15817-15822 (2012).</li>
<li>Wells, J. M., Melton, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vertebrate+endoderm+development%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Vertebrate endoderm development.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. 15, 393-410 (1999).</li>
<li>Hashimoto, H., Ishikawa, H., Kusakabe, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+vascular+networks+during+the+morphogenesis+of+intestinal+villi+in+the+fetal+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Kaibogaku+zasshi+Journal+of+anatomy%22%5BJournal%5D)">Development of vascular networks during the morphogenesis of intestinal villi in the fetal mouse.</a> Kaibogaku zasshi Journal of anatomy. 74, 567-576 (1999).</li>
<li>Mathan, M., Moxey, P. C., Trier, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphogenesis+of+fetal+rat+duodenal+villi%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Anat%22%5BJournal%5D)">Morphogenesis of fetal rat duodenal villi.</a> Am J Anat. 146, 73-92 (1976).</li>
<li>Burns, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Requirement+for+fibroblast+growth+factor+10+or+fibroblast+growth+factor+receptor+2-IIIb+signaling+for+cecal+development+in+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Requirement for fibroblast growth factor 10 or fibroblast growth factor receptor 2-IIIb signaling for cecal development in mouse.</a> Dev Biol. 265, 61-74 (2004).</li>
<li>Pabst, O., Schneider, A., Brand, T., Arnold, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mouse+Nkx2-3+homeodomain+gene+is+expressed+in+gut+mesenchyme+during+pre-+and+postnatal+mouse+development%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">The mouse Nkx2-3 homeodomain gene is expressed in gut mesenchyme during pre- and postnatal mouse development.</a> Dev Dyn. 209, 29-35 (1997).</li>
<li>Pabst, O., Zweigerdt, R., Arnold, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+disruption+of+the+homeobox+transcription+factor+Nkx2-3+in+mice+results+in+postnatal+lethality+and+abnormal+development+of+small+intestine%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Targeted disruption of the homeobox transcription factor Nkx2-3 in mice results in postnatal lethality and abnormal development of small intestine.</a> Development. 126, 2215-2225 (1999).</li>
<li>Kaestner, K. H., Silberg, D. G., Traber, P. G., Schütz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mesenchymal+winged+helix+transcription+factor+Fkh6+is+required+for+the+control+of+gastrointestinal+proliferation+and+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Development%22%5BJournal%5D)">The mesenchymal winged helix transcription factor Fkh6 is required for the control of gastrointestinal proliferation and differentiation.</a> Genes & Development. 11, 1583-1595 (1997).</li>
<li>Madison, B. B., McKenna, L. B., Dolson, D., Epstein, D. J., Kaestner, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FoxF1+and+FoxL1+link+hedgehog+signaling+and+the+control+of+epithelial+proliferation+in+the+developing+stomach+and+intestine%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">FoxF1 and FoxL1 link hedgehog signaling and the control of epithelial proliferation in the developing stomach and intestine.</a> J Biol Chem. 284, 5936-5944 (2009).</li>
<li>Karlsson, L., Lindahl, P., Heath, J. K., Betsholtz, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Abnormal+gastrointestinal+development+in+PDGF-A+and+PDGFR-%28alpha%29+deficient+mice+implicates+a+novel+mesenchymal+structure+with+putative+instructive+properties+in+villus+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Abnormal gastrointestinal development in PDGF-A and PDGFR-(alpha) deficient mice implicates a novel mesenchymal structure with putative instructive properties in villus morphogenesis.</a> Development. 127, 3457-3466 (2000).</li>
<li>Mao, J., Kim, B., Rajurkar, M., Shivdasani, R., Mcmahon, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hedgehog+signaling+controls+mesenchymal+growth+in+the+developing+mammalian+digestive+tract%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Hedgehog signaling controls mesenchymal growth in the developing mammalian digestive tract.</a> Development. 137, 1721-1729 (2010).</li>
<li>Theiler, K. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aTheiler%2C+K+%22The+house+mouse.+Development+and+normal+stages+from+fertilization+to+4+weeks+of+age%22">The house mouse. Development and normal stages from fertilization to 4 weeks of age</a>. , 2, Springer-Verlag. (1989).</li>
<li>Hamilton, T. G., Klinghoffer, R. A., Corrin, P. D., Soriano, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolutionary+divergence+of+platelet-derived+growth+factor+alpha+receptor+signaling+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Evolutionary divergence of platelet-derived growth factor alpha receptor signaling mechanisms.</a> Mol Cell Biol. 23, 4013-4025 (2003).</li>
<li>Muzumdar, M. D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+global+double-fluorescent+Cre+reporter+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">A global double-fluorescent Cre reporter mouse.</a> Genesis. 45, 593-605 (2007).</li>
<li>Goodrich, L. V., Milenkovic, L., Higgins, K. M., Scott, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Altered+neural+cell+fates+and+medulloblastoma+in+mouse+patched+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Altered neural cell fates and medulloblastoma in mouse patched mutants.</a> Science. 277, 1109-1113 (1997).</li>
<li>Fu, Y. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtome-free+3-dimensional+confocal+imaging+method+for+visualization+of+mouse+intestine+with+subcellular-level+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Microtome-free 3-dimensional confocal imaging method for visualization of mouse intestine with subcellular-level resolution.</a> Gastroenterology. 137, 453-465 (2009).</li>
</ol>

למחברים אין סכסוכים כספיים לחשוף.

האופי הדינמי ואינטראקציות רקמה מורכבות של המעי המתפתח דורשים 3D להדמיה יש הערכה מלאה של אירועי המוךפו&quot;גנטי אלה. עם התפתחות טכנולוגיית הדמיה, היכולת לבחון המורפוגנזה סיסי בפירוט מפתחת / שיפור ועם זה, ההבנה של התקשורת ואינטראקציה מרחבית במהלך organogenesis היא מאוד משופרת. שיטות אלטרנטיביות לculturing כל מעיים גם נבדקו, אך מערכת transwell נשארה אמינה ביותר לזמנים ארוכים יותר ותרבות לשמירה על דפוסים אשכול וסיסי...

כל סיסי מעי מורכבים משני תאי רקמה עיקריים: שכבת פני השטח של האפיתל וליבה מזנכימלית. המעי הדק של העכבר נוצר ביום העוברי 10 כאשר יריעת אנדודרם נסגרת ונאטמת ליצירת צינור אפיתל המוקף בתאים מזנכימליים3. צינור שטוח זה של אפיתל עובר התפשטות מהירה, גדל הן באורך והן בהיקף ועובר סידורים מחדש דרמטיים הכוללים שינויים דינמיים בצורת התא1. במקביל, המזנכימה שמסביב עוברת גם תהליכים התפתחותיים רבים הכוללים היווצרות מקלעת כלי הדם, בידול שרירים חלקים וגיוס נוירונים מעיים4. במעי הדק הפרוקסימלי ביום העוברי 14.5, עיבוי (אשכולות) של תאים המגיבים לקיפוד ו-PDGF מתחילים להיווצר בסמוך לאפיתל2,5. היווצרות אשכולות מזנכימליים ממשיכה להתפשט לאורך המעי כך שהם מכסים את כל המעי הדק עד היום העוברי 16.52. כאשר נוצרים אשכולות מזנכימליים, תאי האפיתל הקרובים ביותר לאשכולות מתחילים לסגת ממחזור התא, בעוד שתאי האפיתל האחרים ממשיכים להתרבות. התאים הללו ישירות מעל הצביר המזנכימלי שנסוגו ממחזור התא מתחילים לשנות את צורתם כאשר הווילוס המתהווה מתכופף לתוך הלומן. צמיחה נוספת של הווילוס מונעת בחלקה על ידי המשך התפשטות האפיתל בין הווילי המתהווה. הצבירים המזנכימליים נשארים דבוקים היטב לאפיתל של הווילוס הגדל וממשיכים לבטא מגוון מולקולות איתות. גל הופעת הווילוס מתפשט לאורך המעי הדק בעקבות היווצרות אשכולות מזנכימליים. ככל שהמעי ממשיך לגדול והאזור הבין-וילוס משתרע בין וילי מתעוררים, נוצרים אשכולות מזנכימליים חדשים בסמוך לאפיתל הבין-וילוס וסבבים נוספים של הופעה וצמיחה של וילוסמתרחשים 6.
התפתחות מסונכרנת של האפיתל והמזנכימה חיונית למורפוגנזה של villus. מולקולות איתות מופרשות משכבה אחת לשנייה שבה קולטנים מקבלים ומתמרים את הודעת האות על מנת לתאם את ההתפתחות בין האפיתל למזנכימה. אשכולות מזנכימליים פועלים כמרכזי איתות ומבטאים מגוון מורפוגנים התפתחותיים7-10. שיבוש של היווצרות אשכול או דפוס גורם לאובדן הופעתם ודפוסם של villus. עיכוב איתות PDGF מביא לפחות אשכולות ופחות villi ואותם villi שכן נוצרים מעוותים בעקבות האשכולות החריגים11. אובדן איתות קיפוד מביא לאובדן מוחלט של היווצרות אשכול וכישלון הופעת וילוס2,12. יחד, נתונים אלה מדגימים כי אשכולות מתאמים את התפתחות אפיתל הווילוס עם הליבה המזנכימלית שלו.
באמצעות כל מערכת תרבית האיברים הזו, אנו מסוגלים לשנות את האיתות המעורב בדיבור צולב של אשכול אפיתל-מזנכימלי כדי לקבוע את תפקידם של אותות אלה במורפוגנזה של villus. חתך ושחזור אופטי קונפוקלי של שני פוטונים מאפשרים את היכולת לדמיין היווצרות צבירים והופעת וילוס בתלת מימד ולהבין טוב יותר את היחסים המרחביים בין הצבירים המזנכימליים לבין האפיתל שמעליהם על ידי הרחבת מערכת התרבית לארבעה ממדים, אנו יכולים ללכוד ערימות z של אשכולות ווילי מתפתחים לאורך זמן ולצפות באינטראקציות אלה. בסופו של דבר, היכולת לעקוב אחר התפתחות הווילוס באופן זה ולצפות בשינויים המתרחשים עם איתות משתנה תחולל מהפכה בהבנת האינטראקציות המזנכימליות של האפיתל במורפוגנזה של וילוס.

<table><tbody><tr><td>מלקחיים לכריתת דק&nbsp;</td><td>כלים מדעיים</td><td>&nbsp; 11254-20</td><td>2 זוגות</td></tr><tr><td>70% אתנול</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1x סטרילי של Dulbecco's Phosphate-Buffered Sa Salt (DPBS)</td><td>Gibco&nbsp;</td><td>14040-133</td><td>500 מ"ל</td></tr><tr><td>6 צלחות</td><td>באר Costar</td><td>3516</td><td></td></tr><tr><td>24 צלחות</td><td>באר Costar&nbsp;</td><td>3524</td><td></td></tr><tr><td>צלחות פטרי 60 x 15 מ"מ</td><td>בז</td><td>&nbsp; </td><td></td></tr><tr><td>451007 לוחות Transwell, תוספות 24 מ"מ, ממברנות פוליקרבונט 8.0 מ"מ</td><td>קורנינג קוסטאר&nbsp;</td><td>3428</td><td>6 תוספות לצלחת</td></tr><tr><td>מדיה BGJb</td><td>Invitrogen&nbsp;</td><td>12591-038</td><td>500 מ"ל</td></tr><tr><td>PenStrep (10,000U/מ"ל פניצילין; 10,000 מ"ג/מ"ל סטרפטומיצין)</td><td>Gibco</td><td>&nbsp; 15140</td><td></td></tr><tr><td>חומצה אסקורבית</td><td>סיגמא&nbsp;</td><td>A0278</td><td>מכינים מלאי של 5 מ"ג/מ"ל, מסננים, מכילים ומאחסנים בטמפרטורה של -20 מעלות; C</td></tr><tr><td>פיפט פה (מכלול צינור שואב דראמונד 1-15 אינץ')</td> <td>פישר</td><td>&nbsp; 21-180-10</td><td>הסר את מכלול השואב והחלף אותו ב-1,000 ומיקרו; l קצה פיפט המשמש כמתאם לחיבור פיפט פסטר זכוכית בגודל 6 אינץ '.</td></tr><tr><td>6 אינץ 'זכוכית פסטר</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>צינורות צינורות נימיים</td><td>מכשירי דיוק עולמיים&nbsp;</td><td>TW100F-4</td><td>למשוך למחטים</td></tr><tr><td>4% פרפורמלדהיד</td><td></td><td></td><td>עשוי ב-1 x PBS, pH עד 7.3</td></tr><tr><td>צלחות תרבית</td><td>פלקון&nbsp;</td><td></td><td></td>353037</tr><tr><td>רשת עדינה רכישת מסך נירוסטה</td><td>בחנות</td><td></td><td></td>לחומרי בניין</tr><tr><td>ממברנות פוליקרבונט</td><td>תומאס סיינטיפיק&nbsp;</td><td>4663H25</td><td>לחלופין, לחתוך את ממברנות Corning Costar 3428 מתומכי transwell</td></tr><tr><td>רכישת דבק מיידית</td><td>בחנות לחומרי בניין</td><td>מבוססת ג'ל</td><td></td>רצוי</tr><tr><td>35 x 10 מ"מ לוחות</td><td>Falcon&nbsp;</td><td></td><td></td>351008</tr><tr><td>7% אגרוז</td><td>סיגמא</td><td>&nbsp; A9414</td><td>הכן w/v ב-1x DPBS, חימום להמסה באמבט מים</td></tr><tr><td>סיכות דקות</td><td>כלי מדע עדין&nbsp;</td><td>26002-20</td><td></td></tr><tr><td>פנול מדיה ללא אדום (DMEM)</td><td>Gibco&nbsp;</td><td>21063-029</td><td></td></tr><tr><td>קסילזין (100 מ"ג/מ"ל)</td><td>AnaSed&nbsp;</td><td>139-236</td><td></td></tr><tr><td>מטריג'ל</td><td>BD</td><td>356231</td><td>מטריצת ממברנת הבסיס, גורם גדילה מופחת, פנול נטול</td></tr><tr><td>אדום 3-4% אגרוז</td><td>סיגמא&nbsp;</td><td>A9414</td><td>הכן w/v ב-1x DPBS, חימום להתמוססות באמבט מים</td></tr><tr><td>הדמיה של מעיים קבועים</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>שם החומר/ציוד</td><td>מספר קטלוג</td><td>החברה</td><td>הערות/תיאור</td></tr><tr>רכישת<td>וזלין</td><td>בבית מרקחת</td><td></td><td>המשמש לייצור VALAP: חלקים שווים וזלין, לנולין, פרפין</td></tr><tr><td>לנולין</td><td>סיגמא&nbsp;</td><td>L7387</td><td>המשמש לייצור VALAP: חלקים שווים וזלין, לנולין,</td></tr><tr><td>פרפין פרפין</td><td>Surgipath</td><td>39601006</td><td>משמש לייצור VALAP: חלקים שווים וזלין, לנולין, פרפין</td></tr><tr><td>70% גליצרול ב-1 x PBS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Focus clear ו-Mount</td><td>Clear CelExplorer Labs Co.</td><td>&nbsp; F101-KIT</td><td></td></tr><tr><td>רכישת חימר</td><td>דוגמנות בחנות</td><td></td><td></td>לציוד אמנות</tr><tr><td>סרט</td><td></td><td></td><td></td>מקל כפול</tr><tr><td>מוליך כותנה תבניות</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>פלסטיק, 10 מ"מ x 10 מ"מ x 5 מ"מ)</td> <td>Tissue Tek&nbsp;</td><td>4565</td><td></td></tr><tr><td>שקופיות</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>כיסויים</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>מעבדה לנגב</td><td>קימברלי קלארק</td><td>34155</td><td>מוך ללא מוך עדין משימה לנגב</td></tr><tr><td>תרשים בימוי Theiler&nbsp;</td><td></td><td></td><td><a href="http://www.emouseatlas.org/emap/ema/theiler_stages/%20downloads/theiler2.pdf">http://www.emouseatlas.org/emap/ema/theiler_stages/ downloads/theiler2.pdf</a></td></tr><tr><td>Leica SP5X מיקרוסקופ קונפוקלי&nbsp;</td><td>לייקה</td><td></td><td>שימשה לביצוע ההדמיה החיה&nbsp;</td></tr><tr><td>מעמד Leica DMI 6000&nbsp;</td><td>לייקה</td><td></td><td>שימשה לביצוע ההדמיה החיה&nbsp;</td></tr><tr><td>מדיום הרכבה מימי (זהב מאריך)</td><td>בדיקות מולקולריות&nbsp;</td><td>P36930</td><td></td></tr><tr><td>שם החומר/ציוד</td><td>מספר קטלוגי של החברה</td><td></td><td>הערות/תיאור</td></tr><tr><td>צלחת 24 באר</td><td>Costar</td><td>&nbsp; 3524</td><td></td></tr><tr><td>טריטון X-100</td><td>סיגמא&nbsp;</td><td>T-8787</td><td>משמש לייצור תמיסת פרמביליזציה: 0.5% טריטון X-100 ב-1 x סרום</td></tr><tr><td></td><td></td><td>עיזים</td> PBS <td>המשמש לייצור תמיסת חסימה: 4% סרום עיזים, 0.1% Tween20 ב-1x PBS</td></tr><tr><td>Tween20&nbsp;</td><td>סיגמא</td><td>&nbsp; עמ' 9416</td><td></td></tr></tbody></table>

מערכת תרבות עכבר העוברי שלם מעי ל ex vivo מניפולציה של מסלולי איתות והדמית חיה תלת ממדית של פיתוח שליה

Mouse Fetal Whole Intestine Culture System for Ex Vivo Manipulation of Signaling Pathways and Three-dimensional Live Imaging of Villus Development

רוב התהליכים המוךפו&quot;גנטי במעי של העובר כבר משתמעים מסעיפים דקים של רקמות קבועות, מתן תמונות של שינויים לאורך שלבי התפתחות. מידע תלת ממדים מסעיפים סידוריים דקים יכול להיות מאתגר לפרש בגלל הקושי של שחזור קטעי סדרתי בצורה מושלמת ושמירה על הכיוון נכון של הרקמות על סעיפי סדרתי. הממצאים אחרונים על ידי Grosse et al., 2011 מדגישים את החשיבות של שלושה מידע ממדי בהבנת המורפוגנזה של villi הפיתוח של המעי 1. שחזור תלת ממדי של תאים במעי שכותרתו בנפרד, הוכיח כי רוב תאי אפיתל במעי פנו שני משטחי הפסגה ובסיסיים. יתר על כן, השחזור תלת ממדי של שלד התא אקטין במשטח הפסגה של האפיתל הראה שחלל המעי הוא רציף ושלומן המשני הוא חפץ של יםectioning. אלה שתי נקודות, יחד עם ההפגנה של הגירה גרעינית interkinetic באפיתל במעי, שהוגדרו אפיתל במעי מתפתח כהאפיתל pseudostratified ולא רובדו כפי שחשבו בעבר 1. היכולת להתבונן האפיתל בתלת הממד הייתה זרע להוכחת נקודה זו ומגדירה מחדש המורפוגנזה אפיתל במעי של העובר. עם התפתחות טכנולוגית הדמיה רב פוטון ותוכנת שחזור תלת ממדים, היכולת לדמיין ללא פגע, פיתוח איברים משתפר במהירות. שני פוטונים עירור מאפשר חדיר פחות מזיק עמוק יותר לתוך רקמות עם רזולוציה גבוהה. שני פוטונים הדמיה ושחזור 3D של המעיים עכבר העובריים השלם בולטון et al., 2012 עזרו להגדיר את הדפוס של סיסי תולדה 2. כאן אנו מתארים מערכת תרבות איבר שלמה המאפשרת פיתוח vivo לשעבר של villi והרחבות של מערכת שהתרבות כדי לאפשרהמעיים להיות בתלת ממד הדמיה במהלך הפיתוח שלהם.

תרבות של explants של מעיים של העובר כולו מאפשרת לניתוחים של המיקום, הפצה, ומשך הזמן של מולקולות האיתות שלתאם פיתוח מעיים, כמערכת זו מאפשרת המניפולציה של האיתות עם ריאגנטים תרופתיים או חלבונים רקומביננטי. מערכת תרבות transwell (איור 1 א, לשכפל ומולטון et al., 2012) 2 מספקת ממשק אוויר נוזלי, המאפשר למקום סמים או חרוזים agarose חלבון ספוג על הרקמות ובכך לבסס את מקורות איתות מקומיים (איור 1 ב ). מעיים שנקטפו מן העוברים בE10 לE18.5 ...

טכנולוגיית הדמיה משופרת מאפשרת הדמיה תלת מימדית של איברים במהלך ההתפתחות. כאן אנו מתארים מערכת תרבית איברים שלמה המאפשרת הדמיה חיה של הווילי המתפתח במעי העכבר העוברי.

מערכת תרבות עכבר העוברי שלם מעי ל Ex Vivo מניפולציה של מסלולי איתות והדמית חיה תלת ממדית של פיתוח שליה

Most morphogenetic processes in the fetal intestine have been inferred from thin sections of fixed tissues, providing snapshots of changes over ...

המטרה הכוללת של הליך זה היא לגדל תרביות איברים שלמים של מעיים עובריים של עכברים, ex vivo, ובכך לאפשר אפנון של מסלולי איתות תאים. זה מושג על ידי קצירת מעי עכברים מעוברים בין היום העוברי 12.5 ל-18.5. השלב השני הוא למקם את המעיים בתרבית טרנסוול או בצלחת תרבית הדמיה חיה.לאחר מכן, טפל במעיים במדיה שהוכנה עם מעכבים פרמקולוגיים של מסלולי איתות תאים או מקום. הארו מהיר ספוג בחלבונים רקומביננטיים כדי לשנות את איתות התאים על גבי המעיים. השלב האחרון הוא לדמות את המעיים המתורבתים בחתכים סגולים עבים או בחור.בסופו של דבר, הדמיה קונפוקלית ואחריה שחזור תלת מימדי, משמשת כדי להמחיש כיצד אפנון מסלולי איתות תאים השפיע על התפתחות שכבות הרקמה במהלך היווצרות הווילוס. הדגמה ויזואלית של שיטה זו היא קריטית מכיוון שהרקמה העוברית עדינה מאוד ודורשת זהירות רבה במהלך דיסקציה וטיפול. כדי להתכונן לדיסקציה, יש להשרות את כלי החיתוך באתנול 70%.מניחים את צלחת שש הבארות וצלחות פטרי בגודל 10 סנטימטר עם מדיה BGJB על קרח. לאחר מכן הסר את המעיים מהעוברים שהומתו. נתחו אותם אחד אחד ב-X-D-P-B-S אחד.הסר בזהירות את הטחול מהקיבה, ואז את הלבלב מהקיבה והתריסריון העליון. לאחר מכן, הפרד בעדינות את האומנטום, השאר אותו מחובר ככל האפשר, והפריד את החיבורים רק מספיק כדי לאפשר ליישר את המעי. לאחר מכן הניחו את הדגימות בצלחת פטרי של 10 סנטימ

mouse-fetal-whole-intestine-culture-system-for-ex-vivo-manipulation

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

כאן, אנו מתארים שיטה לבידוד, תרבות ומניפולציה של לבלב העוברי של עכבר. זה מייצג...

מערכת ל<em&gt; Vivo לשעבר</em&gt; Culturing של לבלב עוברי

מאמר זה ולהציג את הווידאו הנלווה הפרוטוקול שלנו ליצירת רקמות מהונדסות מעי בעכבר, באמצעות גישת organoid יחידות על פיגום.

הנדסת רקמות של המעי בדגם Murine

כאן אנו מפתחים את הכלים הדרושים...

Ex vivo הדמיה חיה של חלוקות תא יחיד בNeuroepithelium מאוס

בסרטון זה, אנו מתארים את המתודולוגיה להקמת מערכת תרבית איברי מעיים ex vivo כדי לחקור את יחסי הגומלין בין מקטעי רקמת מעיים של עכבר לבין חיידקי מעיים ספציפיים. המכשיר מורכב משני זוגות של יציאות קלט-פלט, הראשון מחבר את לומן רקמת המעי ומספק את המתלה החיידקי הספציפי לתוכו, והשני מספק ברציפות מדיה לבארות המכשיר כדי לשמור על כדאיות רקמת ex vivo.

מערכת תרבית איברי מעיים Ex Vivo לחקר אינטראקציות מיקרוביוטה מארחת

שיטת התרבות תלת ממדים שתוארה בפרוטוקול זה משחזרת פיתוח לבלב מאבות מפוזרים עוברי לבלב של עכבר, כולל הרחבתן משמעותית, בידול והמורפוגנזה לתוך איבר מסועף. שיטה זו ניתנת להדמיה, התערבות ומניפולציה תפקודיות של הנישה.

במבחנה הלבלב Organogenesis ממפוזר אבות עכבר עובריים

תרבית הטיפות הזקופות ex vivo היא אלטרנטיבה לטכניקות הניסוי הנוכחיות in vitro ו-in vivo. פרוטוקול זה קל לביצוע ודורש כמויות קטנות יותר של ריאגנטים, תוך מתן אפשרות לתפעל ולחקור כלי דם עובריים, מורפוגנזה ואורגנוגנזה.

שימוש<em&gt; Ex Vivo</em&gt; תרבויות הזקופה טיפה של איברים העובר שלמים לחקר תהליכים התפתחותיים בעכבר organogenesis

כאן, פרוטוקול למסוק, לתחזק ולטפל organoids הקטנה עכבר מעיים עם דפוסים מולקולריים הקשורים הפתוגן (PAMPs) ו חיידקי ליסטריה מתואר, כמו גם דגש על ביטוי גנים וטכניקות נורמליזציה ראויות חלבון.

ה<em&gt; Ex Vivo</em&gt; גירוי קולטן הכרת תרבות תבנית של עכבר המעיים Organoids

אנו מתארים פרוטוקול במבחנה Microbiome במעיים שיתוף תרבות villi מעיים במשך תקופה ארוכה באמצעות אדם בטן-על-שבב מערכת microphysiological.

עמית תרבות Microbiome חי עם Microengineered אדם המעיים villi בתוך גוט-על-שבב מכשיר microfluidic

פרוטוקול זה מתאר את הבידוד והתרבות של תאי מעי דק בעכברים מעורבים. תרבויות מעיים העיקריות אלה מאפשרות החקירה של מסלולי איתות שבבסיס הפרשת פפטיד בטן באמצעות מספר הטכניקות.

תרבויות עיקריות מעורבות של Murine מעי דק המיועד לחקר הפרשת הורמון גוט וההדמיה של תא חי תאי Enteroendocrine

הפרוטוקול הנוכחי מתאר הקמת מערכת אורגנואידית של המעי הגס כדי לחקור את הפעילות והתפקוד של תאי גזע המעי הגס במודל נוקאאוט של קלודין-7.

תרבית תלת-ממדית של קריפטות המעי הגס של מורין לחקר תפקוד תאי גזע במעיים ex vivo

כאן אנו מתארים בניית מערכת מודל בסיסית תלת ממדית (3D) של קו תאי מעי ופרוטוקול הטמעת פרפין להערכה מיקרוסקופית קלה של מקבילות מעיים קבועות. צביעה של חלבונים נבחרים מאפשרת ניתוח של פרמטרים חזותיים מרובים מניסוי יחיד לשימוש פוטנציאלי במחקרי סינון תרופות פרה-קליניים.

מערכת מודל מעי תלת-ממדית בסיסית (3D) עם מרכיב חיסוני

למד שיטת תרבית איברים שלמים של מעי עוברי בעכבר לחקר מסלולי איתות והדמיה חיה תלת ממדית. השיטה מאפשרת לחקור תהליכי התפתחות של וילי במודל Ex Vivo.

מערכת תרבות עכבר העוברי שלם מעי ל Ex Vivo מניפולציה של מסלולי איתות והדמית חיה תלת ממדית של פיתוח שליה

גלה סרטונים נוספים