איתור של אלטרנטיבי שחבור במהלך המעבר אפיתל- mesenchymal

המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא לזהות שינויים בשחבור חלופי במהלך EMT. זה מושג על ידי שימוש במודל EMT הניתן להשראה שבו ביטוי חלבון ההיתוך מתפתל. בתאי האפיתל של החלב האנושי מעוררים תאים לעבור EMT בטיפול בטמוקסיפן כשלב שני.

הביטוי של איזופורמים של אחוי מנותח על ידי R-T-P-C-R כמותי באמצעות ערכות פריימר ספציפיות לאיזופורמים, החושפים שינויי שחבור חלופיים ברמת ה-RNA. לאחר מכן, שפע החלבון המתאים לכל איזופורם נקבע על ידי ספיגה חיסונית על מנת לאשר את הביטוי של איזופורמים של חיבור ברמת החלבון, מתקבלות תוצאות המראות שינויים בשחבור חלופי בגנים מעניינים במהלך EMT, בהתבסס על ניתוחי R-T-P-C-R כמותיים וניתוחי ספיגה חיסונית, שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום שחבור חלופי RN ו-EMT, כגון כיצד שחבור חלופי מוסדר במהלך EMT וכיצד ויסות זה משפיע על תהליכים פתולוגיים הקשורים ל-EMT ו-EMT. ההשלכות של טכניקה זו עומדות כלפי טיפול בסרטן מכיוון ש-EMT ממלא תפקיד חשוב בקידום פלישת גידול וגרורות.

אם כי שיטה זו יכולה לספק תובנה לגבי שחבור חלופי במהלך EMT. השיטה לזיהוי MRA ספציפי לאיזופורמים יכולה להיות מיושמת גם במערכות אחרות, כגון חקר שחבור חלופי בהתמיינות נוירונים ומוות תאי התוכנית. השלב הראשון הוא צלחת תאים המבטאים את הטוויסט של חלבון היתוך ER זרע את התאים לתבנית תרבית רקמה של 10 סנטימטר בשכפול הבא, להכין ולהגן על תמיסת הטמוקסיפן כדי לגרום למעבר המזנכימלי האפיתל או לתאים לטפל ב-EMT עם 20 ננו-מולרי טמוקסיפן המכיל מדיה לקבוצת ביקורת שאינה מטופלת בטמוקסיפן להוסיף 0.01% אתנול לקבוצה נוספת של תאים יומיים לאחר הדגירה.

צלם תמונות תחת מיקרוסקופ אור בהגדלה של פי 10 כדי לתעד שינויים מורפולוגיים. לאחר מכן, שטפו את התאים ב- PBS קר. מגרדים את התאים ממחצית אחת של הצלחת למאגר ליזה RNA לבידוד RNA ואת החצי השני ב-100 מיקרוליטר של מאגר ריפה קר כקרח לניתוח חלבונים, מעבירים את התאים משתי הקבוצות כפי שהוצג קודם לכן ומטפלים ברציפות עם 20 ננו-מולרי טמוקסיפן או רכב.

חזור על שלבים אלה כל יומיים עד היום ה-14 שבו תאי ER טוויסט שטופלו בטמוקסיפן אמורים להראות מורפולוגיה מזנכימלית בצורת ציר. ואילו בקרות המטופלות ברכב צריכות לשמור על האבן המרוצפת כמו מורפולוגיה אפיתלית. כאן משמש NNA של ארבעה אקסונים כדוגמה לזיהוי הכללת אקסון.

תכנן פריימר קדימה בתוך האקסון המשתנה שלוש ופריימר הפוך בתוך האקסון המכונן הסמוך. המאפשר את ההגברה הספציפית של האקסון המשתנה כלל איזופורם כדי להגביר באופן ספציפי אירועי דילוג על אקסון. פריימרים עיצוביים המשתרעים על הצומת של האקסון המכונן שתיים ואקסון ארבע שאחרת היו נהרסים כאשר נכללים אקסון משתנה שלוש.

תכנן את הפריימר השני בתוך האקסון המכונן ארבע כדי לזהות את סך התעתיקים של הגן ולהימנע מתוצרי PCR המוגברים מ-DNA גנומי או פריימרים NA.Design prem בתוך שני אקסונים מכוננים כאשר הם מוכנים. עוקב אחר נהלי מיצוי RNA סטנדרטיים כדי לבודד את ה-RNA מדגימות התאים שנאספו קודם לכן. קבע את הריכוז והאיכות של RNA על ידי ספיגת UV כדי לסנתז את הגדיל הראשון CD NA להגדיר תגובות טרנסקריפטאז הפוך בנפח סופי של 20 מיקרוליטר.

בצע תגובות RT ב-42 מעלות צלזיוס למשך שעה, ולאחר מכן דגירה ב-70 מעלות צלזיוס למשך חמש דקות. להשבית את אנזים ה-RT בזמן אמת. PCR הגדיר תגובות של 20 מיקרוליטר המורכבות מ-10 מיקרוליטר של תערובת מאסטר ירוקה סייבר, 0.1 עד 1.0 מיקרוליטר של תבנית CD NA וחמישה פריימרים קדימה ואחורה.

הפעל PCR בזמן אמת עם 40 מחזורים בשלושה עותקים. בדוק את עקומות הדיסוציאציה וודא שנצפה שיא יחיד עבור כל ערכת פריימר. השג את ערכי מחזור הכימות על ידי חישוב ערכי הנגזרת השנייה של עקומות ההגברה.

חשב את הכמות היחסית של mRNAs יעד בדגימות מושרות בהשוואה לדגימה הלא מושרית באמצעות שיטת דלתא דלתא CQ כפי שמוצג בנוסחה זו. השאירו את התאים שנאספו לניתוח חלבון על קרח למשך כ-10 דקות לפני צנטריפוגה ואיסוף הסופרנטנט. לאחר קביעת ריכוז החלבון, יש לדלל את הדגימות בטעינת SDS, לחצץ ולטעון 20 עד 40 מיקרוגרם חלבונים לג'לים של 10% SDS.

הפעל ג'לים של עמודי SDS ב-20 מיליאמפר למשך 1.5 שעות. לאחר זמן זה, העבירו חלבונים לממברנות PVDF במערכת העברה רטובה בארבע מעלות צלזיוס למשך שלוש שעות ב 85 וולט. התאם את זמן ההעברה בהתאם למשקל המולקולרי של חלבוני היעד.

לאחר מכן, חסמו את הממברנה בחלב דל שומן של 5% למשך 30 דקות עד שעה. בטמפרטורת החדר, דגרו על הממברנה עם נוגדן ראשוני בארבע מעלות צלזיוס למשך הלילה. הנוגדן העיקרי מזהה את האפיטופ באזור ציפוי האקסון המכונן ומזהה איזופורמים של פרוסות בו זמנית על סמך גדלי החלבון השונים שלהם.

במקביל, עקוב אחר EMT על ידי ספיגה חיסונית. לסמני EMT. השתמש ב-eec, אהרן, גמא קטנין ואוקלודין כסמני אפיתל ופיברונקטין n קדרין ומנטון כסמנים מזנכימליים.

למחרת יש לשטוף את הממברנה שלוש פעמים עם TBST במרווחים של חמש דקות. לאחר מכן, דגרו את הממברנה עם נוגדן משני מצומד HRP בדילול של 1 עד 10,000 למשך שעה בטמפרטורת החדר. לאחר זמן זה, יש לשטוף את הממברנה שלוש פעמים עם TBST במרווחים של חמש דקות.

לבסוף, דמיין את החלבונים עם מערכת זיהוי כימילומינסנציה וחשוף את הממברנה לסרט רדיוגרפיה אוטומטית. EMT המושרה על ידי טוויסט התאפיין במעבר מפנוטיפ אפיתל דמוי אבן מרוצפת לפנוטיפ פיברובלסטי מוארך, המציג היעדר סמני אפיתל, e cadherin, גמא קטנין ואוקלודין, והגברת הוויסות של סמנים מזנכימליים, פיברונקטין n קדרין ווימנטין. יתר על כן, EMT הוערך על ידי אובדן לוקליזציה של EC cadherin בצמתים של תאי התא המתוארים.

להלן עיצובי הפריימר לזיהוי איזופורמים של חיבור CD 44. מיקומי הפריימר מסומנים על ידי החצים הצבעוניים השונים. התוצאות מניתוחי Q-R-T-P-C-R מצביעות על ירידה משמעותית ב-CD 44 V mRNA ועלייה ב-CD 44 s mRNA לאחר 14 יום של טיפול ב-TAM.

לעומת זאת, התעתיק הכולל של CD 44 נותר ללא שינוי במהלך EMT בהתאם לתוצאות של Q-R-T-P-C-R, רמת החלבון של CD 44 V ירדה בצורה מדהימה, בעוד שהביטוי של חלבון CD 44 s היה מווסת מאוד בזמן השתתפות בהליך זה. חשוב לזכור שזירוז מוצלח של אף אוזן גרון הוא קריטי מאוד. לפיכך, יש לאשר בקפידה את אף אוזן גרון בשיטות שונות כגון זיהוי שינויים בביטוי המורפולוגיה של התא של סמני אף אוזן גרון ולוקליזציה של RIN על פני התא.

בעקבות נוהל זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כמו בדיקת ניהול מדווח שחבור כדי לענות על שאלות נוספות כמו, כיצד אלמנטים פועלים אלה וגורמי העסקה משפיעים על ויסות שחבור חלופי לאחר פיתוחו? טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום ביולוגיה של RNA, ביולוגיה התפתחותית וביולוגיה של סרטן לחקור ויסות שחבור חלופי בתהליכי EMT במהלך התפתחות תקינה וגרורות סרטניות.