Name: איתור של אלטרנטיבי שחבור במהלך המעבר אפיתל- mesenchymal (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-10-09T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 48 s
Description: חקור שינויים בשחבור אלטרנטיבי במהלך מעבר אפיתל-מזנכימלי (EMT) באמצעות מודל EMT מושרה בתאי אפיתל ממאירי שד אנושיים. השיטה משלבת RT-PCR כמותי ואימונובלוטינג לניתוח איזופורמים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים רוצים להודות לוונשנג ליו על עזרתו שלא תסולא בפז בהדמיית תאים. עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מהמכונים הלאומיים לבריאות בארה"ב (R01 CA182467), האגודה האמריקאית לסרטן (RSG-09-252-01-RMC), קרן לין סייג' וקרן תקווה של אחות.

.1 תרבית תאים של EMT אינדוקציה הערה: EMT יכול להיגרם על ידי טיפול בTGFβ או ביטוי חוץ רחמי של טוויסט גורמי שעתוק, חילזון, או Zeb1 / 2 בתאי האפיתל. שתואר בפרוטוקול זה הוא מערכת EMT מושרה באמצעות ביטוי של חלבון היתוך טוויסט-ER בתאים הונצחו אנושיים החלב אפיתל (HMLE / טוויסט-ER, מתנתו של ד"ר J יאנג, UCSD) 9,11,29. עם 4 hydroxytamoxifen טיפול (TAM), טוויסט-ER חלבון היתוך translocates לגרעין לנהוג שעתוק ותוצאות במעבר EMT מלא ב12-14 ימים 9,11,29. מערכות נוספות EMT מושרה, כגון HMLE / החילזון-ER, HMLE / TGFβ, וMCF10A / TGFβ, ניתן למצוא בפרסומים הקודמים שלנו 11,30. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור על תאי HMLE / טוויסט-ER במדיום גידול של תאי אפיתל החלב סרום ללא (MEGM) ב37 מעלות צלזיוס חממה עם 5% CO 2. מעבר התאים כל 2-3 ימים שבם מגיעים למפגש 80%. דגירה תאים עם טריפסין 0.15% ב37 מעלות צלזיוס למשך 5-10 דקות, ולאחר מכן להשבית טריפסין עם עגל בסרום 5% / DMEM. ספין למטה תאי resuspend אותם בMEGM. פלייט תאים בצלחת תרבית רקמה חדשה ביחס של 1 עד 4. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפזר TAM באתנול כדי להפוך את פתרון 200 מיקרומטר. הגן על TAM מהאור והחנות ב -20 מעלות צלזיוס. לפני השימוש, טרי להוסיף TAM לתקשורת MEGM בדילול 1: 10,000 כדי להפוך את הריכוז סופי של 20 ננומטר TAM. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאינדוקציה של EMT, תאי צלחת 1.6 x 10 6 HMLE / טוויסט-ER לתוך צלחת תרבית רקמת 10 סנטימטר בשני עותקים. תרבות תאים עם 20 תקשורת ננומטר MEGM TAM המכיל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פלייט תאי 1.6 x 10 6 HMLE / טוויסט-ER לתוך צלחת 10 סנטימטר בשני עותקים ולטפל בתאים עם אתנול 0.01% כביקורת שטופל הלא TAM. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יומיים לאחר הדגירה, לצלם תחת מיקרוסקופ אור בהגדלה 10x להקליט שינויים מורפולוגיים של תאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב את המדיום מצלחת אחת של שליטה או שטופל TAMתאים. שטוף תאים עם PBS הקר, ותאי קציר על ידי מבטל מחצית מהצלחת במאגר תמוגה RNA לבידוד RNA ואת החצי השני בחיץ Ripa לניתוח חלבונים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאי מעבר מהשליטה או המנות שטופלו על ידי TAM 1.6 x 10 6 תאי ציפוי מחדש בצלחת 10 סנטימטר בשני עותקים. רציפות טיפול בתאים עם 20 ננומטר TAM או רכב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלבים 5 עד 7 פעם אחת בכל יום אחר עד היום 14, בו בזמן, תאי טוויסט-ER טופל TAM להראות מורפולוגיה mesenchymal דמוי כישור, ואילו תאי שליטת רכב שטופל לשמור על מורפולוגיה אפיתל כמו מרוצפת-. </li></ol> .2 אפיון EMT הערה: השלמת EMT הוא הצביע על ידי: (1) תא שינויים מורפולוגיים ממורפולוגיה אפיתל כמו מרוצפת למראה דמוי כישור כמו fibroblastic-; הפסד של לוקליזציה E-cadherin בצמתים תאי תאים (2); ו (3) הביטוי עבר של סמני EMT, שהוגדר על ידי האובדןשל סמנים ורווח של סמני mesenchymal אפיתל. שינויים מורפולוגיים תא נתפסו על ידי מיקרוסקופ אור בהגדלה 10x במהלך האינדוקציה EMT הזמן, שתוארו בסעיף 1 זיהוי חיסוני הקרינה של E-cadherin בתא צמתים מתואר בסעיף זה. הביטוי של סמני EMT הוא זוהה על ידי immunoblotting. סמני אפיתל נפוצים הם E-cadherin, γ-catenin, וoccludin, וסמני mesenchymal כוללים פיברונקטין, N-cadherin וvimentin. נהלים כלליים של immunoblotting מתוארים בסעיף 4. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביום 12 טיפול TAM, זרע 1 x 10 5 תאים על coverslip מעגלי מ"מ זכוכית 12 להציב גם צלחת 24 גם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 48 שעות לאחר זריעת תאים, בינוניים לשאוב ולשטוף עם PBS המחומם מראש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תקן תאים עם paraformaldehyde 4% מחוממים מראש במשך 15 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף תאים שלוש פעמים עם PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה תאים עם 0.2% טריטון X-100 בPBS ל15דקות ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף תאים שלוש פעמים עם PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה תאים בBSA / PBS 5% עבור שעה 1 ב RT לחסום הלא ספציפי מחייב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה תאים עם E-cadherin הנוגדן הראשוני ב01:50 דילול של 1% BSA / PBS בO תא humidified / N ב 4 מעלות צלזיוס. הערה: הטווח לדילול נוגדן ראשוני הוא בדרך כלל בין 01:50 ו1: 200, והדילול האופטימלי עבור כל נוגדן צריך להיקבע באופן ניסיוני. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למזוג את הנוגדן הראשוני ולשטוף תאים שלוש פעמים עם PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה תאים עם נוגדנים משני שכותרתו ניאון בדילול 1: 500 עבור שעה 1 ב RT. משלב זה על, להגן על התאים מפני אור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למזוג נוגדנים משני ולשטוף שלוש פעמים עם PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאי כתם עם 0.1-1 גר '/ מ"ל ​​DAPI או Hoechst עבור 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש לשטוף את תאי פעמים עם PBS שלוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הר coverslips עם ירידה של מדיום הרכבה, וcoverslips חותם עם לק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימו לב תאים ולקחתתמונות תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי 63X. </li></ol> צביעה עם נוגדנים נוספים ניתן לבצע על מנת לאשר את הפנוטיפ EMT. לדוגמא, N-cadherin ויקטינו שריר α-חלק יכולים להיות מוכתם ל29,31,32 פנוטיפ mesenchymal. ארגון מחדש של מבנה cytoskeletal יכול להיות במעקב על ידי צביעת תאים עם phalloidin לF-אקטין 11. בנוסף, ניתן לבצע מבחני לתנועתיות תא והתנגדות תא מוות לבחון את המאפיינים של 11 EMT. .3 איתור של isoforms Splice שימוש מבחני qRT-PCR <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עיצוב פריימר הערה: זוגות פריימר צריכים להיות מתוכננים בקפידה על מנת להגביר isoforms אחוי ברור. אקסון דילוג, אירוע שחבור החלופי הנפוצה ביותר שנצפה, מוצג כאן כדוגמא כדי להמחיש את האסטרטגיה של עיצוב פריימר. איור 1 א מציג מראש mRNA ארבעה אקסון, עם אקסון השלישי כאקסון משתנה. הכללת אקסון 3 תוצאות בהייצור של איזופורם אחוי יותר, ואילו דילוג של אקסון 3 יוצר איזופורם אחוי קצר יותר. Primers צריך להיות מתוכנן להבחין איזופורם כלול אקסון-3-ואיזופורם אקסון-3-לדלג עליו, וכדי לזהות את התמליל הכולל של mRNA זה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לצורך זיהוי של הכללת אקסון, לעצב בקפידה פריימר קדימה בתוך אקסון משתנה 3, ופריימר הפוכה בתוך אקסון המכונן הסמוך 4, המאפשר להגברה הספציפית של איזופורם-כלול אקסון משתנה. הקפד לא לתכנן שני קדימה לאחור פריימרים בתוך אותו אקסון משתנה על מנת להימנע ממוצרי PCR מוגברים מהדנ"א הגנומי או הרנ"א ראשוני. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להגביר באופן ספציפי אירועי דילוג אקסון, עיצוב אחד של פריימרים פורש הצומת של אקסון המכונן 2 ואקסון 4 שאחרת היה נהרס כאשר אקסון משתנה 3 כלול. עיצוב פריימר האחר בתוך אקסון המכונן .4 ככזה, מוצרי PCR נוצרים רק כאשר אקסון משתנה 3 הוא excludעורך ומכונן אקסון 2 ואקסון 4 לאחר מכן חברו יחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לזהות את התמלילים הכולל של הגן, עיצוב פריימרים בתוך שני אקסונים מכוננים 1 ו -2 וכך, מוצרי PCR הם מוגברים מכל isoforms. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ודאו את טמפרטורת ההתכה (TM) עבור כל פריימרים הוא כ 55 ° C, לאורכו של כל צבע יסוד הוא כ 18-22 נוקלאוטידים, ואת הגודל של מוצרי PCR הוא בין 80 ו150 זוגות בסיסים. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מיצוי RNA: חלץ RNA באמצעות כוללת ערכת בידוד RNA (ראה טבלה של חומרים). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> איסוף תאים ב350 מאגר תמוגה RNA μl. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 350 μl של 70% אתנול לlysate ומערבבים היטב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעביר את המדגם לעמודת טיהור RNA. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה ב XG 10,000 דקות 1 וזרימה דרך קלפים שנזרקו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את העמודה פעם אחת עם 500 μl שלי לשטוף חיץ RNA ופעמים עם חיץ לשטוף RNA II. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר חיץ לשטוף RNA שיוריתהשני מהטור על ידי צנטריפוגה במהירות המרבית למשך 2 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את הטור לתוך צינור 1.5 מ"ל חדש, להוסיף מים nuclease ללא 50 μl במרכז מטריצת העמודה וelute RNA על ידי צנטריפוגה במהירות המרבית. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סינתזה של cDNA הראשון הגדיל <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קבע את הריכוז ואיכות של RNA על ידי מדידת ספיגת UV. הערה: RNA באיכות טובה צריכה יחס הספיגה / 280 ננומטר 260 ננומטר של כ 2.0. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את תגובות טרנסקריפטאז (RT) המכילות 250 RNA ng סך הכל, 0.05 מיקרוגרם פריימרים hexamer האקראי, 50 pmol MgCl 2, 10 dNTP pmol, 2 μl 5 × חיץ GoScript, ואנזים RT μl 1 בנפח סופי של μl 20. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע תגובות RT ב42 מעלות צלזיוס במשך שעה 1, ואחריו דגירה ב70 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות כדי להשבית את אנזים RT. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזמן אמת PCR <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדרה 20 תגובות μl שמורכבות מתערובת הורים הירוקים SYBR 10 μl,.1-1.0 תבנית μl cDNA, וpmol 5 קדימה הפוך פריימרים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל בזמן אמת PCR עם 40 מחזורים מהשלבים הבאים: 95 מעלות צלזיוס denaturation עבור 10 שניות, 58 ° C חישול עבור 10 שניות, ו60 ° C הארכה ל30 שניות. לבצע PCR תגובות בשלושה עותקים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדקו עקומות דיסוציאציה ולוודא ששיא יחיד הוא ציין עבור כל קבוצת פריימר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השג את ערכי מחזור כימות (CQ) על ידי חישוב הערכים נגזרים השני של עקומות הגברה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחשב את הכמות היחסית (RQ) של mRNAs היעד בדגימות מושרה בהשוואה למדגם uninduced באמצעות "דלתא הדלתא Cq (ΔΔCq) 'שיטה כפי שמוצג על ידי הנוסחא הבאה. השתמש בגני משק בית, כגון GAPDH או TBP, כנקודת התייחסות. </li></ol></li></ol><img alt="משוואת 1" fo:content-width="3in" src="/files/ftp_upload/51845/51845eq1.jpg"> כדי לחשב בצורה מדויקת יותר את הערכים יחסי של isoforms אחוי, tהוא משתמש בגני התייחסות מרובים, צריך להיחשב. ניתן לנתח את התוצאות באמצעות שיטת כימות ערך המוחלט שונה שתוארה על ידי אל Pfaffl et 33,34. .4 בחינת isoforms אחוי ברמת החלבון <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> איסוף תאים ב100 חיץ Ripa קר כקרח μl. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר lysates על קרח למשך כ 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה ב XG 14,000 עבור 10 דקות ב 4 ° C, ולאסוף את supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למדוד ריכוז חלבון על ידי מבחני ברדפורד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל דגימות חלבון בחיץ טעינת SDS ולטעון 20-40 מיקרוגרם של חלבונים לתוך ג'לי SDS-PAGE 10%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל ג'לי SDS-PAGE ב20 mA ל1.5 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת חלבונים לממברנות PVDF במערכת העברה רטובה על 4 מעלות צלזיוס במשך 3 שעות ב85 V. התאם את זמן העברה על פי המשקל המולקולרי של חלבוני יעד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קרום בלוק ב5% חלב דל שומן ל30 דקות ל1 שעות ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה wi קרוםth נוגדן ראשוני על 4 מעלות CO / N. הטווח לדילול נוגדן ראשוני הוא בדרך כלל בין 1: 200 ו1: 5,000, לקבוע את הדילול האופטימלי עבור כל נוגדן באופן ניסיוני. ניתן למצוא הדילול של נוגדנים המשמשים בפרוטוקול זה ב" טבלה של חומרים כימיים וציוד ספציפיים ". <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לזהות isoforms אחוי, להשתמש בנוגדנים ספציפיים שיכירו איזופורם מסוים. לחלופין, להשתמש בנוגדן שמכיר אפיטופ באזור אקסון המכונן הקידוד ולזהות isoforms אחוי בו זמנית המבוסס על גדלי החלבון השונים שלהם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בה בעת, לפקח EMT ידי immunoblotting לסמני EMT. השימוש E-cadherin, γ-catenin, וoccludin כסמני אפיתל, ופיברונקטין, N-cadherin וvimentin כסמני mesenchymal. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פעמים קרום לשטוף שלוש עם TBS-T (50 מ"מ טריס, 150 mM NaCl, 0.05% Tween 20, pH 7.4) במרווח של 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה קרום עם נמלה משנית HRP-מצומדותibody בדילול 1: 10,000 לשעה 1 בRT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פעמים קרום לשטוף שלוש עם TBS-T במרווח 5 דק '. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דמיין חלבון עם מערכת איתור chemiluminescence ולחשוף את הקרום לסרט autoradiography. </li></ol>

<ol><li>Thiery, J. P., Sleeman, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complex+networks+orchestrate+epithelial-mesenchymal+transitions%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Complex networks orchestrate epithelial-mesenchymal transitions.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 7, 131-142 (2006).</li>
<li>Yang, J., Weinberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epithelial-mesenchymal+transition+at+the+crossroads+of+development+and+tumor+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Epithelial-mesenchymal transition at the crossroads of development and tumor metastasis.</a> Dev Cell. 14, 818-829 (2008).</li>
<li>Yang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((a+master+regulator+of+morphogenesis%2C+plays+an+essential+role+in+tumor+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">a master regulator of morphogenesis, plays an essential role in tumor metastasis.</a> Cell. 117, 927-939 (2004).</li>
<li>Batlle, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+transcription+factor+snail+is+a+repressor+of+E-cadherin+gene+expression+in+epithelial+tumour+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The transcription factor snail is a repressor of E-cadherin gene expression in epithelial tumour cells.</a> Nat Cell Biol. 2, 84-89 (2000).</li>
<li>Cano, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+transcription+factor+snail+controls+epithelial-mesenchymal+transitions+by+repressing+E-cadherin+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The transcription factor snail controls epithelial-mesenchymal transitions by repressing E-cadherin expression.</a> Nat Cell Biol. 2, 76-83 (2000).</li>
<li>Comijn, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+two-handed+E+box+binding+zinc+finger+protein+SIP1+downregulates+E-cadherin+and+induces+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">The two-handed E box binding zinc finger protein SIP1 downregulates E-cadherin and induces invasion.</a> Mol Cell. 7, 1267-1278 (2001).</li>
<li>Bolos, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+transcription+factor+Slug+represses+E-cadherin+expression+and+induces+epithelial+to+mesenchymal+transitions%3A+a+comparison+with+Snail+and+E47+repressors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">The transcription factor Slug represses E-cadherin expression and induces epithelial to mesenchymal transitions: a comparison with Snail and E47 repressors.</a> J Cell Sci. 116, 499-511 (2003).</li>
<li>Eger, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DeltaEF1+is+a+transcriptional+repressor+of+E-cadherin+and+regulates+epithelial+plasticity+in+breast+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">DeltaEF1 is a transcriptional repressor of E-cadherin and regulates epithelial plasticity in breast cancer cells.</a> Oncogene. 24, 2375-2385 (2005).</li>
<li>Shapiro, I. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+EMT-driven+alternative+splicing+program+occurs+in+human+breast+cancer+and+modulates+cellular+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">An EMT-driven alternative splicing program occurs in human breast cancer and modulates cellular phenotype.</a> PLoS Genet. 7, e1002218(2011).</li>
<li>Warzecha, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+ESRP-regulated+splicing+programme+is+abrogated+during+the+epithelial-mesenchymal+transition%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">An ESRP-regulated splicing programme is abrogated during the epithelial-mesenchymal transition.</a> EMBO J. 29, 3286-3300 (2010).</li>
<li>Brown, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD44+splice+isoform+switching+in+human+and+mouse+epithelium+is+essential+for+epithelial-mesenchymal+transition+and+breast+cancer+progression%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">CD44 splice isoform switching in human and mouse epithelium is essential for epithelial-mesenchymal transition and breast cancer progression.</a> J Clin Invest. 121, 1064-1074 (2011).</li>
<li>Wang, E. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternative+isoform+regulation+in+human+tissue+transcriptomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Alternative isoform regulation in human tissue transcriptomes.</a> Nature. 456, 470-476 (2008).</li>
<li>Pan, Q., Shai, O., Lee, L. J., Frey, B. J., Blencowe, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deep+surveying+of+alternative+splicing+complexity+in+the+human+transcriptome+by+high-throughput+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Deep surveying of alternative splicing complexity in the human transcriptome by high-throughput sequencing.</a> Nat Genet. 40, 1413-1415 (2008).</li>
<li>Liu, S., Cheng, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternative+RNA+splicing+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Wiley+Interdiscip+Rev+RNA%22%5BJournal%5D)">Alternative RNA splicing and cancer.</a> Wiley Interdiscip Rev RNA. 4, 547-566 (2013).</li>
<li>Shtivelman, E., Lifshitz, B., Gale, R. P., Roe, B. A., Canaani, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternative+splicing+of+RNAs+transcribed+from+the+human+abl+gene+and+from+the+bcr-abl+fused+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Alternative splicing of RNAs transcribed from the human abl gene and from the bcr-abl fused gene.</a> Cell. 47, 277-284 (1986).</li>
<li>Krangel, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Secretion+of+HLA-A+and+-B+antigens+via+an+alternative+RNA+splicing+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Secretion of HLA-A and -B antigens via an alternative RNA splicing pathway.</a> J Exp Med. 163, 1173-1190 (1986).</li>
<li>Brickell, P. M., Latchman, D. S., Murphy, D., Willison, K., Rigby, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+a+Qa%2FTla+class+I+major+histocompatibility+antigen+gene+is+a+general+feature+of+oncogenesis+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Activation of a Qa/Tla class I major histocompatibility antigen gene is a general feature of oncogenesis in the mouse.</a> Nature. 306, 756-760 (1983).</li>
<li>Barbaux, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Donor+splice-site+mutations+in+WT1+are+responsible+for+Frasier+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Donor splice-site mutations in WT1 are responsible for Frasier syndrome.</a> Nat Genet. 17, 467-470 (1997).</li>
<li>Charlet, B. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+the+muscle-specific+chloride+channel+in+type+1+myotonic+dystrophy+due+to+misregulated+alternative+splicing%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Loss of the muscle-specific chloride channel in type 1 myotonic dystrophy due to misregulated alternative splicing.</a> Mol Cell. 10, 45-53 (2002).</li>
<li>Hutton, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Association+of+missense+and+5%27-splice-site+mutations+in+tau+with+the+inherited+dementia+FTDP-17%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Association of missense and 5'-splice-site mutations in tau with the inherited dementia FTDP-17.</a> Nature. 393, 702-705 (1998).</li>
<li>Kohsaka, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exon+9+mutations+in+the+WT1+gene%2C+without+influencing+KTS+splice+isoforms%2C+are+also+responsible+for+Frasier+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mutat%22%5BJournal%5D)">Exon 9 mutations in the WT1 gene, without influencing KTS splice isoforms, are also responsible for Frasier syndrome.</a> Hum Mutat. 14, 466-470 (1999).</li>
<li>Philips, A. V., Timchenko, L. T., Cooper, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disruption+of+splicing+regulated+by+a+CUG-binding+protein+in+myotonic+dystrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Disruption of splicing regulated by a CUG-binding protein in myotonic dystrophy.</a> Science. 280, 737-741 (1998).</li>
<li>Savkur, R. S., Philips, A. V., Cooper, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aberrant+regulation+of+insulin+receptor+alternative+splicing+is+associated+with+insulin+resistance+in+myotonic+dystrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Aberrant regulation of insulin receptor alternative splicing is associated with insulin resistance in myotonic dystrophy.</a> Nat Genet. 29, 40-47 (2001).</li>
<li>Spillantini, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutation+in+the+tau+gene+in+familial+multiple+system+tauopathy+with+presenile+dementia%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Mutation in the tau gene in familial multiple system tauopathy with presenile dementia.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 95, 7737-7741 (1998).</li>
<li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myotonic+dystrophy+evidence+for+a+possible+dominant-negative+RNA+mutation%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mol+Genet%22%5BJournal%5D)">Myotonic dystrophy evidence for a possible dominant-negative RNA mutation.</a> Hum Mol Genet. 4, 599-606 (1995).</li>
<li>Graubert, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recurrent+mutations+in+the+U2AF1+splicing+factor+in+myelodysplastic+syndromes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Recurrent mutations in the U2AF1 splicing factor in myelodysplastic syndromes.</a> Nat Genet. 44, 53-57 (2012).</li>
<li>Papaemmanuil, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Somatic+SF3B1+mutation+in+myelodysplasia+with+ring+sideroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Somatic SF3B1 mutation in myelodysplasia with ring sideroblasts.</a> N Engl J Med. 365, 1384-1395 (2011).</li>
<li>Yoshida, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Frequent+pathway+mutations+of+splicing+machinery+in+myelodysplasia%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Frequent pathway mutations of splicing machinery in myelodysplasia.</a> Nature. 478, 64-69 (2011).</li>
<li>Mani, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+epithelial-mesenchymal+transition+generates+cells+with+properties+of+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The epithelial-mesenchymal transition generates cells with properties of stem cells.</a> Cell. 133, 704-715 (2008).</li>
<li>Reinke, L. M., Xu, Y., Cheng, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Snail+represses+the+splicing+regulator+epithelial+splicing+regulatory+protein+1+to+promote+epithelial-mesenchymal+transition%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Snail represses the splicing regulator epithelial splicing regulatory protein 1 to promote epithelial-mesenchymal transition.</a> J Biol Chem. 287, 36435-36442 (2012).</li>
<li>Serini, G., Gabbiani, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+myofibroblast+activity+and+phenotypic+modulation%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of myofibroblast activity and phenotypic modulation.</a> Exp Cell Res. 250, 273-283 (1999).</li>
<li>Zavadil, J., Bottinger, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TGF-beta+and+epithelial-to-mesenchymal+transitions%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">TGF-beta and epithelial-to-mesenchymal transitions.</a> Oncogene. 24, 5764-5774 (2005).</li>
<li>Pfaffl, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+mathematical+model+for+relative+quantification+in+real-time+RT-PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">A new mathematical model for relative quantification in real-time RT-PCR.</a> Nucleic Acids Res. 29, e45(2001).</li>
<li>Hellemans, J., Mortier, G., De Paepe, A., Speleman, F., Vandesompele, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((qBase+relative+quantification+framework+and+software+for+management+and+automated+analysis+of+real-time+quantitative+PCR+data%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">qBase relative quantification framework and software for management and automated analysis of real-time quantitative PCR data.</a> Genome Biol. 8, R19(2007).</li>
<li>Boutz, P. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+post-transcriptional+regulatory+switch+in+polypyrimidine+tract-binding+proteins+reprograms+alternative+splicing+in+developing+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">A post-transcriptional regulatory switch in polypyrimidine tract-binding proteins reprograms alternative splicing in developing neurons.</a> Genes Dev. 21, 1636-1652 (2007).</li>
<li>Salomonis, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternative+splicing+regulates+mouse+embryonic+stem+cell+pluripotency+and+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Alternative splicing regulates mouse embryonic stem cell pluripotency and differentiation.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 107, 10514-10519 (2010).</li>
<li>Calarco, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+vertebrate+nervous+system+alternative+splicing+and+development+by+an+SR-related+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Regulation of vertebrate nervous system alternative splicing and development by an SR-related protein.</a> Cell. 138, 898-910 (2009).</li>
<li>Grabowski, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternative+splicing+takes+shape+during+neuronal+development%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Genet+Dev%22%5BJournal%5D)">Alternative splicing takes shape during neuronal development.</a> Curr Opin Genet Dev. 21, 388-394 (2011).</li>
<li>Seol, D. W., Billiar, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+caspase-9+variant+missing+the+catalytic+site+is+an+endogenous+inhibitor+of+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">A caspase-9 variant missing the catalytic site is an endogenous inhibitor of apoptosis.</a> J Biol Chem. 274, 2072-2076 (1999).</li>
<li>Srinivasula, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+an+endogenous+dominant-negative+short+isoform+of+caspase-9+that+can+regulate+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Identification of an endogenous dominant-negative short isoform of caspase-9 that can regulate apoptosis.</a> Cancer Res. 59, 999-1002 (1999).</li>
<li>Akgul, C., Moulding, D. A., Edwards, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternative+splicing+of+Bcl-2-related+genes+functional+consequences+and+potential+therapeutic+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Alternative splicing of Bcl-2-related genes functional consequences and potential therapeutic applications.</a> Cell Mol Life Sci. 61, 2189-2199 (2004).</li>
<li>Cooper, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+minigene+systems+to+dissect+alternative+splicing+elements%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Use of minigene systems to dissect alternative splicing elements.</a> Methods. 37, 331-340 (2005).</li>
<li>Cheng, C., Sharp, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+CD44+alternative+splicing+by+SRm160+and+its+potential+role+in+tumor+cell+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Regulation of CD44 alternative splicing by SRm160 and its potential role in tumor cell invasion.</a> Mol Cell Biol. 26, 362-370 (2006).</li>
</ol>

המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים פיננסיים מתחרים.

ההליך המתואר כאן מאפשר זיהוי של שחבור חלופי במודל EMT מושרה. כשינויים כאלה, דינמיים ביטוי איזופורם אחוי יכולים לנפול בפח בכל המהלך של EMT הזמן. לשיטה זו יתרונות על פני השימוש בepithelial- שונה או שורות תאים המייצגים-mesenchymal להשוואה של שחבור חלופי בגלל רקע גנטי שונה משורות תאים הקשורים לבלתי יכול להשפיע יתר על המידה שחבור חלופי. עם זאת, האינדוקציה המוצלחת של EMT חייבת להיות מאושרת בזהירות באמצעות ניתן להסיק סמני EMT שונים לפני כל מסקנות על שינויים בשחבור חלופי. יתר על כן, בנוסף...

מעבר אפיתל-mesenchymal (EMT) הוא תכנית התפתחותית שמניעה המורפוגנזה איבר ושיפוץ רקמות במהלך embryogenesis. כאשר מופעלים באופן חריג, EMT מקדם גרורות סרטני ואיבר סיסטיק 1,2. מחקרים משכנעים שתיארו את החשיבות של רגולציה תעתיק במהלך התהליך של EMT, שהוגדרו על ידי כמה גורמי שעתוק, כגון טוויסט, חילזון, וZeb, שמדחיקים את הביטוי של חלבון צומת E-cadherin adherens, וכתוצאה מכך האובדן של cobble- אבן כמו מורפולוגיה ורווח של פנוטיפ mesenchymal דמוי כישור 3-8 אפיתל. מחקרים שנעשה לאחרונה באמצעות ניתוח הגנום של RNAs חשפו כי קיים קבוצה של גני שחבור שדפוסים קשורים גם עם פנוטיפים אפיתל או mesenchymal 9,10. עבודה מהמעבדה שלנו מבחינה תפקודית מחוברת שחבור חלופי וEMT. על ידי לימוד CD44 מולקולת הידבקות פני תא, הראינו כי altern CD44שחבור יצירתי מוסדר בחוזקה במהלך EMT, ויותר מכך, שאיזופורם אחוי CD44 מיתוג סיבתי תורם לEMT 11. שחבור חלופי מהווה מודל נפוץ ומשומר של ויסות הגנים, כעד 95% מהגנים רב אקסון אדם שחבור 12-14 לחלופין. על ידי יצירת מוצרי חלבון מרובים מגן יחיד, שחבור חלופי מהווה מנגנון חיוני לגיוון חלבון, הוספת שכבה נוספת של מורכבות לגנום האנושי. ככזה, חוסר ויסות של שחבור חלופי שעלול להוביל להשפעות ביולוגיות עמוקות גורמות למחלות בבני אדם. ואכן, שחבור חלופי חריג במחלות תועד במשך למעלה מעשור 15-25, כולל אחרונים ממצאים שמוטציות בגני מקודדי מכונות הספלייסוזום נמצאות בדרך כלל בתסמונות myelodysplastic 26-28. לכן, פיתוח שיטות אמינות לזיהוי של i שחבור החלופיsoforms הוא בעלת חשיבות רבה בחקר תהליכים ביולוגיים המגוונים כולל EMT. כאן אנו מספקים פרוטוקול כדי לזהות שינויים בשחבור חלופי באמצעות מודל EMT מושרה. השיטות לעיצוב פריימרים PCR וגילוי isoforms אחוי הן מתאימות לא רק למחקר של שחבור חלופי במהלך EMT, אלא גם למחקר של שחבור חלופי בתהליכים ביולוגיים אחרים. חוקר שחבור חלופי במהלך EMT הוא הכרחי על מנת להבין טוב יותר את המנגנונים של EMT וגרורות סרטניים, ובכך להקל את הפיתוח של אסטרטגיות יעילות לטיפול בגרורות סרטן.

<table><tbody><tr><td>4-hydroxytamoxifen</td><td>Sigma</td><td>H7904</td><td>הכינו תמיסת מלאי על ידי המסת 4-hydroxytamoxifen באתנול ל-200 &#956;M. שמור את התמיסה ב-20 &#176; C מוגן מפני אור.</td></tr><tr><td>E.Z.N.A. ערכת בידוד RNA כוללת</td><td>אומגה ביו-טק</td><td>R6731</td><td>ערכת בידוד RNA כוללת</td></tr><tr><td>GoScript מערכת שעתוק הפוך</td><td>Promega</td><td>A5001</td><td>מגיב לבדיקת qRT-PCR</td></tr><tr><td>GoTaq qPCR Master Mix</td><td>Promega</td><td>A6002</td><td>מגיב לבדיקת qRT-PCR</td></tr><tr><td>LightCycler 480 בזמן אמת PCR</td> מערכת <td>Roche</td><td></td><td>ציוד לבדיקת qRT-PCR</td></tr><tr><td>נוגדן CD44</td><td>מו"פ D Systems</td><td>BBA10</td><td>דילול 1:1,000</td></tr><tr><td>נוגדן E-cadherin</td><td>טכנולוגיית איתות תאים</td><td>4065</td><td>1:2,500 דילול לאימונובלטינג; דילול 1:50 לאימונופלואורסצנציה</td></tr> <tr><td>וגמא;-Catenin antibody</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>2309</td><td>1:1,000 דילול</td></tr><tr><td>נוגדן אוקלודין</td><td>Santa Cruz Biotechnology Inc.</td><td>sc-5562</td><td>1:500 דילול</td></tr><tr><td>נוגדן פיברונקטין</td><td>BD Transduction Laboratories</td><td>610077</td><td>1:5,000 דילול</td></tr><tr><td>נוגדן N-cadherin</td> BD <td>Transduction Laboratories</td><td>610920</td><td>1:2,000 דילול</td></tr><tr><td>נוגדן וימנטין</td><td>NeoMarkers</td><td>MS-129-p1</td><td>1:500 דילול</td></tr><tr><td>נוגדן GAPDH</td><td>Millipore</td><td>Corporation MAB374</td><td>1:10,000 דילול</td></tr><tr><td>Amasham ECL Western Blotting Detection Reagent</td><td>GE Health Life Science</td><td>RPN2209</td><td>מערכת כימילומינסנציה</td></tr></tbody></table>

איתור של אלטרנטיבי שחבור במהלך המעבר אפיתל- mesenchymal

Detection of Alternative Splicing During Epithelial-Mesenchymal Transition

שחבור חלופי ממלא תפקיד קריטי במעבר אפיתל-מזנכימלי (EMT), תוכנית תאית חיונית המתרחשת בתהליכים פיזיולוגיים ופתולוגיים שונים. כאן אנו מתארים אסטרטגיה לאיתור שחבור חלופי במהלך EMT באמצעות מודל EMT הניתן להשראה על ידי ביטוי מדכא השעתוק טוויסט. EMT מנוטר על ידי שינויים במורפולוגיה של התא, אובדן לוקליזציה של E-cadherin בצמתים של תא-תא, וביטוי מיתוג של סמני EMT, כגון אובדן סמני אפיתל E-cadherin ו-γ-catenin ורווח של סמנים מזנכימליים N-cadherin ו-vimentin. באמצעות ערכות פריימר ספציפיות לאיזופורמים, השחבור האלטרנטיבי של mRNAs מעוניינים מנותח על ידי RT-PCR כמותי. הייצור של איזופורמים חלבונים מתאימים מאומת על ידי מבחני אימונובלוטינג. השיטה לאיתור איזופורמים של אחוי המתוארת כאן מתאימה גם לחקר שחבור חלופי בתהליכים ביולוגיים אחרים.

הנהלים שתוארו לעיל מספקים שיטה חזקה כדי לזהות שחבור חלופי במהלך EMT. תוצאות נציג של מיתוג איזופורם אחוי CD44 במהלך EMT-Induced טוויסט הן כדלקמן לדוגמא ירושלים. EMT-Induced טוויסט בתאי HMLE / טוויסט-ER התאפיין במעבר ממרצפות כמו פנוטיפ אפיתל לפנוטיפ fibroblastic מוארך (איור 2 א), העדר סמני אפיתל E-cadherin, γ-catenin וoccludin ו גברת ביטוי של פיברונקטין סמני mesenchymal, N-cadherin, וvimentin <stro...

הוכח כי ויסות שחבור חלופי תורם למעבר אפיתל-מזנכימלי (EMT), תוכנית תאית חיונית בתהליכים פיזיולוגיים ופתולוגיים שונים. כאן אנו מתארים שיטה המשתמשת במודל EMT הניתן להשראה לזיהוי שחבור חלופי במהלך EMT.

Alternative splicing plays a critical role in the epithelial-mesenchymal transition (EMT), an essential cellular program that occurs in various ...

המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא לזהות שינויים בשחבור חלופי במהלך EMT. זה מושג על ידי שימוש במודל EMT הניתן להשראה שבו ביטוי חלבון ההיתוך מתפתל. בתאי האפיתל של החלב האנושי מעוררים תאים לעבור EMT בטיפול בטמוקסיפן כשלב שני.הביטוי של איזופורמים של אחוי מנותח על ידי R-T-P-C-R כמותי באמצעות ערכות פריימר ספציפיות לאיזופורמים, החושפים שינויי שחבור חלופיים ברמת ה-RNA. לאחר מכן, שפע החלבון המתאים לכל איזופורם נקבע על ידי ספיגה חיסונית על מנת לאשר את הביטוי של איזופורמים של חיבור ברמת החלבון, מתקבלות תוצאות המראות שינויים בשחבור חלופי בגנים מעניינים במהלך EMT, בהתבסס על ניתוחי R-T-P-C-R כמותיים וניתוחי ספיגה חיסונית, שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום שחבור חלופי RN ו-EMT, כגון כיצד שחבור חלופי מוסדר במהלך EMT וכיצד ויסות זה משפיע על תהליכים פתולוגיים הקשורים ל-EMT ו-EMT. ההשלכות של טכניקה זו עומדות כלפי טיפול בסרטן מכיוון ש-EMT ממלא תפקיד חשוב בקידום פלישת גידול וגרורות.אם כי שיטה זו יכולה לספק תובנה לגבי שחבור חלופי במהלך EMT. השיטה לזיהוי MRA ספציפי לאיזופורמים יכולה להיות מיושמת גם במערכות אחרות, כגון חקר שחבור חלופי בהתמיינות נוירונים ומוות תאי התוכנית. השלב הראשון הוא צלחת תאים המבטאים את הטוויסט של חלבון היתוך ER זרע את התאים לתבנית תרבית רקמה של 10 סנטימטר בשכפול הבא, להכין ולהגן על תמיסת הטמוקסיפן כדי לגרום למעבר המזנכימלי האפיתל או לתאים לטפל ב-EMT עם 20 ננו-מולרי טמוקסיפן המכיל מדיה לקבוצת ביקורת שאינה מטופלת בטמוקסיפן להוסיף 0.01% אתנול לקבוצה נוספת של תאים יומיים לאחר הדגירה.צלם תמונות תחת מיקרוסקופ אור בהגדלה של פי 10 כדי לתעד שינויים מורפולוגיים. לאחר מכן, שטפו את התאים ב- PBS קר. מגרדים את התאים ממחצית אחת של הצלחת למאגר ליזה RNA לבידוד RNA ואת החצי השני ב-100 מיקרוליטר של מאגר ריפה קר כקרח לניתוח חלבונים, מעבירים את התאים משתי הקבוצות כפי שהוצג קודם לכן ומטפלים ברציפות עם 20 ננו-מולרי טמוקסיפן או רכב.חזור על שלבים אלה כל יומיים עד היום ה-14 שבו תאי ER טוויסט שטופלו בטמוקסיפן אמורים להראות מורפולוגיה מזנכימלית בצורת ציר. ואילו בקרות המטופלות ברכב צריכות לשמור על האבן המרוצפת כמו מורפולוגיה אפיתלית. כאן משמש NNA של ארבעה אקסונים כדוגמה לזיהוי הכללת אקסון.תכנן פריימר קדימה בתוך האקסון המשתנה שלוש ופריימר הפוך בתוך האקסון המכונן הסמוך. המאפשר את ההגברה הספציפית של האקסון המשתנה כלל איזופורם כדי להגביר באופן ספציפי אירועי דילוג על אקסון. פריימרים עיצוביים המשתרעים על הצומת של האקסון המכונן שתיים ואקסון ארבע שאחרת היו נהרסים כאשר נכללים אקסון משתנה שלוש.תכנן את הפריימר השני בתוך האקסון המכונן ארבע כדי לזהות את סך התעתיקים של הגן ולהימנע מתוצרי PCR המוגברים מ-DNA גנומי או פריימרים NA.Design prem בתוך שני אקסונים מכוננים כאשר הם מוכנים. עוקב אחר נהלי מיצוי RNA סטנדרטיים כדי לבודד את ה-RNA מדגימות התאים שנאספו קודם לכן. קבע את הריכוז והאיכות של RNA על ידי ספיגת UV כדי לסנתז את הגדיל הראשון CD NA להגדיר תגובות טרנסקריפטאז הפוך בנפח סופי של 20 מיקרוליטר.בצע תגובות RT ב-42 מעלות צלזיוס למשך שעה, ולאחר מכן דגירה ב-70 מעלות צלזיוס למשך חמש דקות. להשבית את אנזים ה-RT בזמן אמת. PCR הגדיר תגובות של 20 מיקרוליטר המורכבות מ-10 מיקרוליטר של תערובת מאסטר ירוקה סייבר, 0.1 עד 1.0 מיקרוליטר של תבנית CD NA וחמישה פריימרים קדימה ואחורה.הפעל PCR בזמן אמת עם 40 מחזורים בשלושה עותקים. בדוק את עקומות הדיסוציאציה וודא שנצפה שיא יחיד עבור כל ערכת פריימר. השג את ערכי מחזור הכימות על ידי חישוב ערכי הנגזרת השנייה של עקומות ההגברה.חשב את הכמות היחסית של mRNAs יעד בדגימות מושרות בהשוואה לדגימה הלא מושרית באמצעות שיטת דלתא דלתא CQ כפי שמוצג בנוסחה זו. השאירו את התאים שנאספו לניתוח חלבון על קרח למשך כ-10 דקות לפני צנטריפוגה ואיסוף הסופרנטנט. לאחר קביעת ריכוז החלבון, יש לדלל את הדגימות בטעינת SDS, לחצץ ולטעון 20 עד 40 מיקרוגרם חלבונים לג'לים של 10% SDS.הפעל ג'לים של עמודי SDS ב-20 מיליאמפר למשך 1.5 שעות. לאחר זמן זה, העבירו חלבונים לממברנות PVDF במערכת העברה רטובה בארבע מעלות צלזיוס למשך שלוש שעות ב 85 וולט. התאם את זמן ההעברה בהתאם למשקל המולקולרי של חלבוני היעד.לאחר מכן, חסמו את הממברנה בחלב דל שומן של 5% למשך 30 דקות עד שעה. בטמפרטורת החדר, דגרו על הממברנה עם נוגדן ראשוני בארבע מעלות צלזיוס למשך הלילה. הנוגדן העיקרי מזהה את האפיטופ באזור ציפוי האקסון המכונן ומזהה איזופורמים של פרוסות בו זמנית על סמך גדלי החלבון השונים שלהם.במקביל, עקוב אחר EMT על ידי ספיגה חיסונית. לסמני EMT. השתמש ב-eec, אהרן, גמא קטנין ואוקלודין כסמני אפיתל ופיברונקטין n קדרין ומנטון כסמנים מזנכימליים.למחרת יש לשטוף את הממברנה שלוש פעמים עם TBST במרווחים של חמש דקות. לאחר מכן, דגרו את הממברנה עם נוגדן משני מצומד HRP בדילול של 1 עד 10,000 למשך שעה בטמפרטורת החדר. לאחר זמן זה, יש לשטוף את הממברנה שלוש פעמים עם TBST במרווחים של חמש דקות.לבסוף, דמיין את החלבונים עם מערכת זיהוי כימילומינסנציה וחשוף את הממברנה לסרט רדיוגרפיה אוטומטית. EMT המושרה על ידי טוויסט התאפיין במעבר מפנוטיפ אפיתל דמוי אבן מרוצפת לפנוטיפ פיברובלסטי מוארך, המציג היעדר סמני אפיתל, e cadherin, גמא קטנין ואוקלודין, והגברת הוויסות של סמנים מזנכימליים, פיברונקטין n קדרין ווימנטין. יתר על כן, EMT הוערך על ידי אובדן לוקליזציה של EC cadherin בצמתים של תאי התא המתוארים.להלן עיצובי הפריימר לזיהוי איזופורמים של חיבור CD 44. מיקומי הפריימר מסומנים על ידי החצים הצבעוניים השונים. התוצאות מניתוחי Q-R-T-P-C-R מצביעות על ירידה משמעותית ב-CD 44 V mRNA ועלייה ב-CD 44 s mRNA לאחר 14 יום של טיפול ב-TAM.לעומת זאת, התעתיק הכולל של CD 44 נותר ללא שינוי במהלך EMT בהתאם לתוצאות של Q-R-T-P-C-R, רמת החלבון של CD 44 V ירדה בצורה מדהימה, בעוד שהביטוי של חלבון CD 44 s היה מווסת מאוד בזמן השתתפות בהליך זה. חשוב לזכור שזירוז מוצלח של אף אוזן גרון הוא קריטי מאוד. לפיכך, יש לאשר בקפידה את אף אוזן גרון בשיטות שונות כגון זיהוי שינויים בביטוי המורפולוגיה של התא של סמני אף אוזן גרון ולוקליזציה של RIN על פני התא.בעקבות נוהל זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כמו בדיקת ניהול מדווח שחבור כדי לענות על שאלות נוספות כמו, כיצד אלמנטים פועלים אלה וגורמי העסקה משפיעים על ויסות שחבור חלופי לאחר פיתוחו? טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום ביולוגיה של RNA, ביולוגיה התפתחותית וביולוגיה של סרטן לחקור ויסות שחבור חלופי בתהליכי EMT במהלך התפתחות תקינה וגרורות סרטניות.

detection-alternative-splicing-during-epithelial-mesenchymal

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

שיטה פשוטה מתוארת לאינדוקציה של אפיתל למעבר mesenchymal (EMT) במגוון רחב של סוגי תאים. שיטות לניתוח של תאים במדינות EMT ידי immunocytochemistry כלולים.

אינדוקציה וניתוח של אפיתל לmesenchymal מעבר

כאן אנו מתארים פרוטוקול שנועד לבחון את ההשפעה של שחבור סוטה על עמידות לתרופות בגידולים מוצקים דם ממאירות. למטרה זו, נתחנו את פרופילי transcriptomic דגמים הוריים ועמידים במבחנה באמצעות RNA-seq והקמתי שיטה המבוססת qRT-PCR כדי לאמת גני מועמדים.

שימוש-רצף RNA כדי זיהוי וריאנטים אחוי Novel הקשורות עמידות לתרופות ב<em&gt; במבחנה</em&gt; מודלי סרטן

דו"ח זה מתאר שיטת Bioengineering לתכנן ולבנות גורמי שחבור מלאכותיים רומן (ASFs) כי דווקא לווסת את השחבור של גני המטרה בתאי יונקים. שיטה זו ניתן להרחיב עוד להנדס גורמים מלאכותיים שונים כדי לתפעל היבטים אחרים של חילוף החומרים RNA.

הנדסה גורמים מלאכותיים כדי לתמרן באופן ספציפי שחבור אלטרנטיבי בתאים אנושיים

אנו מציגים כאן שיטה תרבית תאים עבור גרימת מעברים-אפיתל mesenchymal (MET) בתאים סרקומה מבוסס על ביטוי אקטופי בשילוב של בני המשפחה microRNA-200 ו grainyhead דמוי 2 (GRHL2). שיטה זו מתאימה יותר להבנת ההשפעה הביולוגית של גמישות פנוטיפית על תוקפנות הסרטן וטיפולים.

אינדוקציה של מעברי אפיתל- mesenchymal בתאי סרקומה

בחיי עיר הכלאה (איש) פרוטוקול המשתמשת oligonucleotides antisense קצר כדי לזהות דפוסים חלופיים pre-mRNA splicing בסעיפים מוח העכבר מתואר.

ניתוח כמותי של שחבור חלופי Pre-mRNA בסעיפים מוח העכבר באמצעות ה-RNA בחיי עיר הכלאה Assay

אנו מתארים זרימת עבודה שיטתית כדי לחקור איתות TGF-β ו- EMT הנגרמת על ידי β TGF על ידי לימוד ביטוי החלבון והגנים המעורבים במסלול איתות זה. השיטות כוללות סופג מערבי, בדיקת כתב לוציפראז, qPCR, וכתמי כשל חיסוני.

לימוד TGF-β איתות ו TGF-β-induced אפיתל-ל-mesenchymal מעבר בסרטן השד ותאים נורמליים

פרוטוקול זה מציג כלי מהיר ושימושי להערכת תפקידו של חלבון עם פונקציה לא אופיינית בוויסות חיבור חלופי לאחר טיפול כימותרפי.

שימוש בכלי המיני-דג'ן E1A לחקר שינויי ההסתבכות של mRNA

אנו מתארים שיטות לחקור TGF-β2-induced EndMT בתאי אנדותל על ידי התבוננות בשינויים במורפולוגיה של התא ובחינת הביטוי שינויי סמן הקשורים EndMT באמצעות כתמי כשל חיסוני. עריכת גנים CRISPR/Cas9 תוארה ושימשה לרוקן את חילזון קידוד הגנים כדי לחקור את תפקידה ב- EndMT הנגרמת על ידי TGF-β2.

אנדותל בתיווך TGF-β למעבר מסנצ'ימלי (EndMT) וההערכה הפונקציונלית של אפקטי EndMT באמצעות עריכת גנים CRISPR/Cas9

שחבור חלופי (AS) ופוליאדנילציה חלופית (APA) מרחיבים את מגוון האיזופורמים של שעתוק ותוצרים. כאן אנו מתארים פרוטוקולים ביואינפורמטיים לניתוח מבחני RNA-seq בתפזורת ו-3' של ריצוף קצה כדי לזהות ולהמחיש AS ו-APA המשתנים בין תנאי ניסוי.

זיהוי שחבור חלופי ופוליאדנילציה בנתוני RNA-seq

המבחן אור / חושך המעבר הוא אחד המבחנים הנפוצים ביותר למדוד התנהגות כמו חרדה בעכברים. כאן, אנו מציגים סרט שמראה נהלים מפורט על איך אנו עורכים את הבדיקה.

אור / חושך מעבר מבחן עכברים

חקור שינויים בשחבור אלטרנטיבי במהלך מעבר אפיתל-מזנכימלי (EMT) באמצעות מודל EMT מושרה בתאי אפיתל ממאירי שד אנושיים. השיטה משלבת RT-PCR כמותי ואימונובלוטינג לניתוח איזופורמים.

איתור של אלטרנטיבי שחבור במהלך המעבר אפיתל- mesenchymal

גלה סרטונים נוספים