Name: במבחנת כינונה מחדש של מכלולי אור קציר של צמחים ואצות ירוקות (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-10-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 55 s
Description: למד כיצד לכונן מחדש מכלולי אור קציר של צמחים ואצות ירוקות במבחנה. השיטה כוללת חילוץ פיגמנטים מעלי תרד וביטוי חלבון APA ב-E. coli לניתוח ספקטרוסקופי.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי מועצת המחקר האירופית על ידי מענק התחלתי/קונסולידטור של ERC ל-RC ועל ידי הקרן ההולנדית למחקר על חומר (FOM) באמצעות תוכנית FOM (10TM01).

המחברים מצהירים שאין ניגוד עניינים

חלבוני קרום הם לא כל כך קלים ללמוד. בידוד של חלבונים בממברנה ילידים הוא מסובך בשל צורך solubilize bilayer השומנים עם חומרי ניקוי, אשר יכול לגרום נזק לחלבון ולהסיר cofactors החיוני. חלבונים אלו עשויים גם להיות נוכחים ברמות נמוכות בממברנות ביולוגיות, או להיות מעורב עם חלבונים הקשורים באופן הדוק, כמו במקרה של מתחמי קצירת האור, שגורם לטיהור של מתחמים בודדים קשים. ביטוי חלבון Heterologous בE. coli ובכינון מחדש חוץ גופית מציע את האפשרות להימנע מבעיות אלה. במבחנה הכינון מחדש וטיהור של תוצאות חלבונים מקופלות במתחמים שיש להם מאפיינים דומים מאוד לאלו של מתחמי ילידי 20,21,23 ולכן יכול לשמש כדי לחקור מתחמים שלא יכול להיות מטוהר להומוגניות 24 - 27. שיטה זו משתמשת בתרד, אשר בקלות attainabבכל ימות שנה le, כמקור לסך הכנות פיגמנט וקרוטנואידים. עבור חלק reconstitutions של חלבונים האם של אצות, שימוש בפיגמנטים מטוהרים מאצות הוא מועדף בשל יצירות פיגמנט שונות. / היחס ב Chl וChl היחס / מכונית נשארים זהה, ללא קשר למקור פיגמנט. חשוב להבין כי היעילות של הכינון מחדש היא בדרך כלל סביב 35% 28. לכן יש צורך להסיר את הפיגמנטים שאינם כבולים וapoprotein פרש מהפתרון לאחר הכינון מחדש. פרוטוקול טיהור שני שלבים מוצג בפרוטוקול זה (ראה גם תוצאות). עם זאת, יש לציין כי צעד שיפוע סוכרוז אינו מאפשר הפרדת apo- והולו-חלבון המלאה. עבור רוב הניתוחים זה לא בעיה, כפי שapoprotein אינו מכיל פיגמנטים ולכן אינו מפריע למדידות פונקציונליות. עם זאת, במקרה זה יש צורך להסיר apoprotein באופן מלא מfrפעולה המכילה את הקומפלקס מחדש (לדוגמא, כדי לחשב את הפיגמנט לstoichiometry חלבון), ניתן להשתמש בעמודת מטבע אניוני (ראה Passarini et al. 2009 29 לפרטים נוספים). היכולת לקפל חלבוני קצירת אור רקומביננטי עם פיגמנטים מבודדים במבחנה מספק הזדמנות &quot;לתמרן&quot; מתחמים על ידי שינוי &quot;הסביבה&quot; הכינון מחדש בדרכים שונות, וכך לשנות את המאפיינים של המתחם וכתוצאה מכך. לדוגמא, שינוי בהרכב פיגמנט במהלך הכינון מחדש יכול לגרום מורכב עם הרכב פיגמנט שונה. תכונה זו יכולה להיות מנוצלת כדי ללמוד את ההשפעה שיש לי פיגמנטים שונים על המבנה והיציבות של המתחם. בדרך כלל הכנת פיגמנט המתקבלת מתרד יש שיעור כלורופיל / b של 3: 1 וChl יחס / מכונית של 2.9: 1. יחס זה בדרך כלל מייצר חלבון מחדש עם אותם המאפיינים כמו nיצירתי אחד. עם זאת, התאמה של היחס / b Chl על ידי התוספת של Chl מטוהר או ב יכולה להשפיע על הכריכה של פיגמנטים שונים בשל שונה הסלקטיביות של אתרי הקישור 30-33. זה אפשרי משום שרוב אתרי פיגמנט מחייבים הם לא לגמרי סלקטיבית לChl או Chl ב, אבל יכול להכיל את שניהם, אם כי עם זיקה שונה 10,30,34. באופן דומה, אתרי קישור קרוטנואידים הוצגו גם להיות מסוגל להכיל מיני Xanthophyll יותר מאחד 8,35 - 38. reconstitutions שונה של CP26, אחר מורכב פיגמנט חלבון של צמחים גבוהים יותר, תוך שימוש ביצירות פיגמנט שונים מוצג בטבלה 2 39. reconstitutions אלה שמשו כדי להעריך את הזיקה של אתרי קישור לפיגמנטים מסוימים 39. זה מעניין לציין כי על מנת להשיג מורכב עם אותו ג פיגמנטomposition כילידים אחד, Chl היחס / b של תערובת פיגמנט חייב להיות 3: 1. זה נראה להיות מקרה לכל מתחמי LHC של צמחים גבוהים יותר 20,40. השילוב של ביולוגיה מולקולרית עם טכניקת הכינון מחדש מאפשר את התכונות של מורכב Chl מחייב להיחקר ביתר פירוט. החשיבות של תחומים חלבון שונים על היציבות וקיפול של מתחמים, או מעורבותם באינטראקציות בין חלבונים, נקבעה על ידי מקצץ apoprotein או ביצוע mutagenesis האקראי 8,41 - 44. ניתן לשנות שאריות חומצת אמינו בודדת חשובות לתיאום של פיגמנטים שונים דרך מכוון mutagenesis אתר על מנת לנתח את המאפיינים של פיגמנטים בודדים או להעריך את תרומתם לתפקוד והיציבות של 10,28,29,45 המורכבים - 52. איור 6 מראה מחדש Lhcb4 (CP29) עםמוטציה של היסטידין בעמדת 216 53. השוואה של הרכב הפיגמנט של wildtype ומתחמי מוטציה מראה כי המוטציה גורמת לאובדן של אחד Chl מולקולה, המצביע על כך באתר הממוקד להכיל Chl במתחם WT. ההבדלים של ספקטרום הקליטה של ​​WT ומוטציה, על נורמליזציה לתוכן פיגמנט, גם מציג את מאפייני הקליטה של ​​פיגמנט שאבד. במקרה זה, ההבדל שניתן לראות בשיא העיקרי ב680 ננומטר, המצביע על כך Chl מתואם על ידי His216 סופג באורך גל זה (לפרטים נוספים על מוטציה זו והתכונות ספקטרוסקופיות לראות Mozzo et al. 2008 53). גם ניתוח מוטציה יכול לשמש כדי לקבוע את ההשפעה של הסביבה על התכונות ספקטרוסקופיות של פיגמנטים 54. לסיכום, יכולים בקלות להיות משוחזר חלבוני קצירת אור במבחנה וכתוצאה מכך פיגמנט-proteiמתחמי n עם מאפיינים דומים מאוד למתחמי ילידים. בדרך זו, את הקשיים של בידוד חלבוני ילידים בוטלו, גם בעת מתן הכנת חלבון עם תשואה גבוהה וטוהר למחקר נוסף. חשיבותו של יחס 3: / b Chl 1 בהפקת מורכבת אותנטי יודגש, ודוגמאות של wildtype מחדש וLHCs מוטציה ניתנות להמחשת יישומים של הטכניקה.

מנגנון הפוטוסינתזה של צמחים ואצות כוללים חלבונים נפרד קרום שקושרים כלורופיל (CHL), ב (CHL ב) וקרוטנואידים (מכונית). מתחמי פיגמנט החלבון אלה הם פעילים בקצירת אנרגיית אור ומעביר שאנרגיית העירור למרכזי התגובה, שבו נעשה בו שימוש כדי לקדם את תשלום ההפרדה 2. הם גם מעורבים במנגנוני משוב רגולציה המגנים על מנגנון הפוטוסינתזה מפני נזק אור הגבוה 3,4. מתחמי קצירת האור (LHCs) מורכבים ממשפחה גדולה של חלבונים הקשורים בצמחים ואצות 5. הטיהור הומוגנית של כל אחד מבני המשפחה כבר מסובכת על ידי התכונות כימיות ופיסיות דומות מאוד של מתחמים. בנוסף, הליכי טיהור לעתים קרובות לגרום לאובדן של פיגמנטים או cofactors הפוטנציאלי האחר כגון שומנים. במבחנה represen הכינון מחדשts שיטה רבת עוצמה כדי להתגבר על בעיות אלה. LHC הקשורים Photosystem II (LHC-II) הוקם מחדש ראשון במבחנה על ידי Plumley ושמידט בשנת 1987 1. החוקרים שחולצו חלבון ופיגמנטים delipidated בנפרד מכלורופלסטים מפעל, ולאחר מכן בשילוב חלבון החום מפוגל עם פיגמנטים בנוכחות ליתיום Dodecyl סולפט (LDS), ואחריו שלושה מחזורים של הקפאה להפשרה 1. הם הראו שהתכונות ספקטרליות של מתחמי LHC מחדש היו מאוד דומות למתחמים מטוהרים מצמחים. קלות מחדש של מתחמי פיגמנט חלבון LHC, סביר להניח בשל כמה תכונת הרכבה עצמית טבועה, יחד עם הקושי בבידוד מתחמים מטוהרים מאורגניזמים, הובילו לאימוץ מהיר של השיטה על ידי חוקרים אחרים. הכינון מחדש של חלבונים פוטוסינתטיים ביתר בEscherichia coli (E. coli) הושג על ידי פאולסן ועמיתים בשנת 1990 6. בתוך א &#39;coli, חלבוני קרום ביטוי יתר כלולים בדרך כלל בגופי הכללה, שמתקני הטיהור שלהם. הכינון מחדש מושגת באמצעות denaturation חום של גופי ההכללה המכילים חלבון רקומביננטי בנוכחות LDS, ואחריו התוספת של פיגמנטים היוזמת את קיפול החלבונים. קיפול של מתחם LHCII הוא תהליך בן שני שלבים: ראשון, כלורופיל כרוך בדקות פחות מ 1; שני, כלורופיל b מאוגדת והתייצבה מעל 7 מספר דקות. בנוסף לאספקת תובנה הדינמיקה מתקפל, בכינון מחדש חוץ גופית בשילוב עם מכוון mutagenesis אתר אפשר זיהוי של חומצות אמינו ספציפיות חשובות ליציבות (לדוגמא, 8,9) או תיאום פיגמנט (למשל, 10). גם מניפולציה של קיפול מחדש של תנאים על ידי התאמת פרמטרים כמו הרכב פיגמנט או בדטרגנטים זיהו critica אלמנטיםl לקיפול נכון, כגון הדרישה של Xanthophylls למורכב LHCII (למשל, 1,11). בנוסף, החקירה של התכונות של פיגמנטים בודדים קשורים למתחמים הייתה אפשרית באמצעות מתחמים מחדש in vivo (למשל, 10). השיטה המתוארת כאן מתחילה עם בידוד של פיגמנטים (chlorophylls וקרוטנואידים) מתרד וreinhardtii Chlamydomonas האצה הירוק. הביטוי וטיהור של חלבון LHC מE. coli בצורה של גופי הכללה לאחר מכן מפורט, ואחריו את הכינון מחדש של LHC וטיהור שלאחר מכן לפי עמודה זיקת Ni. בשלב האחרון, מתחמים מחדש הם מטוהרים עוד יותר על ידי צנטריפוגה שיפוע סוכרוז כדי להסיר פיגמנטים חופשיים וapoprotein פרש. פרוטוקול זה מייצג הליך מותאם בשילוב כמה שינויים שהוכנסו על ידי מעבדות שונות על פניזמן 1,6,10,12 -14.

<table><tbody><tr><td>HisTrap HP</td><td>GE Healthcare</td><td>17-5247-01</td><td></td></tr><tr><td>בד ניילון&nbsp;</td><td></td><td></td><td>20 &mu; m נקבוביות</td></tr><tr><td>מכחול צבע של אמנים רכים&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NONIDET P-40</td><td>Sigma</td><td>74385</td><td></td></tr><tr><td>Beta-DM</td><td>Sigma</td><td>D4641</td><td></td></tr><tr><td>DNAase</td><td>ThermoScientific</td><td>EN0525</td><td></td></tr><tr><td>אבקות</td><td></td><td></td><td></td>חלב</tr><tr><td>RNAase</td><td>ThermoScientific</td><td>EN0531</td><td></td></tr><tr><td>סוניקטור</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>אוקטיל ובטא;- D-גלוקופירנוסיד</td><td>סיגמא</td><td>O8001&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>אולטרה-צנטריפוגה XL</td><td>מדיום</td> בקמן-קולטר <td></td><td></td></tr><tr><td>TAP</td><td>ראה התייחסות 17</td>מדיום LB ראה התייחסות 19 <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

במבחנת כינונה מחדש של מכלולי אור קציר של צמחים ואצות ירוקות

In Vitro Reconstitution of Light-harvesting Complexes of Plants and Green Algae

בצמחים ואצות ירוקות, אור הוא נתפס על ידי מתחמי אור הקציר (LHCs), משפחה של חלבוני קרום נפרד שירכזו chlorophylls וקרוטנואידים. בחי, חלבונים אלה מקופלים עם פיגמנטים ליצירת קומפלקסים אשר מוכנסים בקרום thylakoid של הכלורופלסט. הדמיון הגבוה בתכונות כימיות ופיסיות של בני המשפחה, יחד עם העובדה שהם יכולים בקלות לאבד את הפיגמנטים בבידוד, עושה הטיהור שלהם במדינה האם של מאתגרת. גישה חלופית כדי להשיג הכנות הומוגנית של LHCs פותחה על ידי Plumley ושמידט בשנת 1987 1, שהראה כי ניתן היה להקים מחדש מתחמים אלה במבחנה החל מפיגמנטים מטוהרים וapoproteins פרש, וכתוצאה מכך מתחמים עם מאפיינים מאוד דומים לזה של ילידים מתחמים. זה פתח את הדרך לשימוש בחלבוני רקומביננטי הביעו חיידקים במבחנה </eהכינון מחדש מ &#39;&gt;. שיטת הכינון מחדש היא חזקה מסיבות שונות: (1) ניתן להשיג הכנות טהורות של מתחמים בודדים, (2) הרכב פיגמנט יכול להיות מבוקר על מנת להעריך את תרומתם למבנה ותפקוד, (3) יכולים להיות מוטציה חלבונים רקומביננטי ללמוד פונקציונלי תפקיד של השאריות בודדות (לדוגמא, אתרי פיגמנט מחייב) או תחום חלבון (למשל, אינטראקציה בין חלבונים, קיפול). שיטה זו כבר מותאמת במספר מעבדות ומוחלת על רוב מתחמי אור הקציר. הפרוטוקול המתואר כאן מפרט את השיטה של הבנייה מחדש מתחמי אור קציר במבחנה המשמשים כיום במעבדה שלנו, ודוגמאות המתארות יישומים של השיטה מסופקות.

פרוטוקול זה מפרט את הבנייה מחדש של קומפלקסים לקצירת אור במבחנה. חלבוני הממברנה האינטגרליים הללו מתאמים כלורופיל וקרוטנואידים ואחראים לקצירת אור בצמחים גבוהים יותר ובאצות ירוקות.

In plants and green algae, light is captured by the light-harvesting complexes (LHCs), a family of integral membrane proteins that coordinate chlorophylls ...

המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא להקים מחדש קומפלקסים של חלבון פיגמנט קצירת אור במבחנה של צמחים או אצות. זה מושג על ידי מיצוי הפיגמנטים מעלי תרד או תרביות אצות, וביטוי יתר של פרוטה APA באי קולי. כשלב שני, פרוטה ה-APA מעורבב עם הפיגמנטים לקבלת קומפלקס משוחזר.לאחר מכן, קומפלקס חלבון הפיגמנט המשוחזר מטוהר מעודפי הפיגמנטים ומתקבלות תוצאות החלבון שנפרשו המראות מאפיינים ספקטרוסקופיים דומים של קומפלקס חלבון הפיגמנט המשוחזר וזה המקורי המבוסס על ספקטרום ספיגה, ספקטרום פלואורסצנטי ודאיזם מעגלי. היתרון העיקרי של הליך זה הוא בכך שהוא מאפשר לנו להשיג כמות גבוהה יחסית של קומפלקסים של חלבון פיגמנט, וגם לתפעל את הקומפלקסים באמצעות תערובות חלבון ופיגמנטים מסוג מוטציה עם הרכבים שונים המדגימים את ההליך יהיה אלברטו נה, סטודנט לתואר שני במעבדה כדי להתחיל בהליך למיצוי הפיגמנט הכולל מעלי תרד. השתמש בבלנדר כדי להומוגניזציה של חופן תרד, משאיר כ -20 גרם ב -100 מיליליטר של חיץ טחינה קרה למשך 20 שניות.מסננים את התמיסה דרך שתי שכבות של בד ניילון בקוטר גרוע של 20 מיקרומטר וצנטריפוגה את המסנן ב -1, 500 גרם למשך 10 דקות. בארבע מעלות צלזיוס. הסר את הסופרנטנט והוסף מיליליטר אחד של חוצץ כביסה קרה.השעו מחדש את הכדור המכיל את הכלורופלסטים בעזרת מכחול אמן רך. לאחר השעיית הגלולה מחדש, הוסף 50 מיליליטר כביסה, חיץ וצנטריפוגה, תמיסה ב -10, 000 גרם למשך 10 דקות. בארבע מעלות צלזיוס, הסר את הסופרנטנט והשהה בעדינות את הגלולה ב-50 מיליליטר של צנטריפוגת חיץ כביסה, תמיסה ב-10,000 גרם למשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס, הסר את הסופרנטנט לחלוטין מנקודה זו ואילך.הליך זה חייב להתבצע בחושך. כדי למנוע חמצון פיגמנט, הוסף כ-20 מיליליטר של 80% אצטון חוצץ בנתרן פחמתי כדי לחלץ את הפיגמנטים, השאירו את התמיסה על קרח למשך 10 דקות. מערבולת מבצעת מדי פעם את הרכיבים התאיים על ידי צנטריפוגה ב-12,000 גרם למשך 15 דקות בארבע מעלות צלזיוס.מיצוי פיגמנט כולל אמור לגרום לכדור לבן. אוספים את החטף למשפך מפריד. הוסף 0.4 נפחים של אתר דתיל.לנער במרץ ולהקפיד לפתוח את השסתומים כדי לאוורר את הגז. מוסיפים 0.8 נפחים של נתרן כלורי מולארי נקודה 33 ומערבבים במרץ. המתינו כ-10 דקות להפרדת השכבות.שלב האתר למעלה מכיל את הפיגמנטים שחולצו. הסר והשליך את השלב התחתון הברור. הסר את האתר על ידי שפיכתו מהחלק העליון של משפך ההפרדה למיכל זכוכית מתאים.יבש את האתר על ידי הוספת כף נתרן גופרתי נטול מים גרגירי. סובב את התמיסה ואפשר כחמש דקות לחומר היבש לספוג מים מהאתר. כאשר האתר מיובש מספיק.אמורים להיות כמה גבישים צפים חופשיים וללא גוש של הנתרן הגופרתי. שפכו את האתר למיכל זכוכית חדש, השאירו את הנתרן הגופרתי מוצק מאחורי הפיגמנטים וייבשו אותם בוואקום במהירות סיבובית עד שהאצטון מתאדה לחלוטין. אחסן את הפיגמנטים המיובשים בטמפרטורה שלילית של 80 מעלות צלזיוס.מיצוי הקרטינואיד מתרד אינו מוצג בסרטון זה, אך הפיגמנטים המיובשים מאוחסנים גם בטמפרטורה שלילית של 80 מעלות צלזיוס. קומפלקס קצירת האור או LHC לבנייה מחדש בא לידי ביטוי וטוהר מ-e coli בצורה של גופי הכללה. להצלחת הבנייה מחדש, היחס בין חלבוני הפיגמנט לכמות השימוש במאגר הוא קריטי.הליך זה צריך להתבצע באור עמום. השעו מחדש 800 מיקרוגרם של גופי הכללה של LHC בסך הכל 400 מיקרוליטר של te. בצינור פוגה של שני מיליליטר, הוסף 400 מיקרוליטר של שני x בנייה מחדש, חיץ ומערבולת.הוסף בקצרה 0.6 מיקרוליטר של מלאי אתנול CAPTA בטא מולארי של 14.8 מולארי. כדי להשיג ריכוז סופי של 10 מילימולר, מחממים את החלבון בחום של 98 מעלות צלזיוס למשך דקה אחת. מערבולת קצרה ומניחים בטמפרטורת החדר למשך שלוש דקות.השהה מחדש 500 מיקרוגרם של סך פיגמנטי הכלורופיל המיובשים, בתוספת 80 מיקרוגרם של פיגמנטים קרטינואידים ב-30 מיקרוליטר של 100% אתנול על ידי מערבולת נמרצת. לדקה אחת. סובבו את תערובת הפיגמנטים ב-15, 800 גרם בארבע מעלות צלזיוס למשך כ-30 שניות, וודאו שאין כדור מיד לאחר הסיבוב, הוסיפו את תערובת הפיגמנט לאט לחלבון שהתקרר תוך כדי מערבולת.היזהר לא להתערבל בצורה נמרצת מדי מכיוון שהחלבון יכול לעלות על החלק העליון של הצינור. המשיכו למערבולת במשך חמש עד 10 שניות ולאחר מכן הניחו את הצינור על קרח רטוב. הוסף 94 מיקרוליטר של 20% אוקטלי, בטא D גלוקוציד או og כדי לקבל ריכוז סופי של 2% מערבולת לזמן קצר ושמור על קרח למשך 10 דקות, הוסף 90 מיקרוליטר של שתי אשלגן כלורי מולארי כדי לקבל ריכוז סופי של 150 עד 200 מיקרו טוחנות.מערבולת קצרה ושומרים על קרח למשך 20 דקות. סובב ב-15, 800 GS בארבע מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. העבירו את ה-SUP natant לצינור של 10 מיליליטר מבלי להפריע לגלולה.שמור על הנטין קר ומוגן מפני אור. התחל הליך זה על ידי הכנת עמודת SROs של מיליליטר ניקל אחד כמתואר בטקסט הפרוטוקול. הוסף שלושה עד ארבעה מיליליטר של מאגר OG לדגימת החלבון וטען את הדגימה על העמודה.שטפו את העמודה עם חמישה מיליליטר של מאגר OG, ואחריהם שני מיליליטר של מאגר שטיפה OG. יש לסלק את החלבון הקשור בשלושה מיליליטר של מאגר אלו. אוספים את ה-ellu הירוק המכיל את החלבון המחודש.שיפוע הסוכרוז מוכן כמתואר בטקסט הפרוטוקול שהוסר בזהירות מהחלק העליון של השיפוע, אותו נפח כמו זה של השבר הירוק הנרמז מעמודת ה-SROs של ניקל. טען לאט את הדגימה המחודשת מעל, היזהר להימנע מהפרעה לשיפוע. הנח את הצינור והאיזון לתוך רוטור דלי מתנדנד S SW 41 או SW 60 וסובב באולטרה-צנטריפוגה ב-200,000 Gs בארבע מעלות צלזיוס למשך 18 שעות עם תאוצה איטית ועצירה ללא הפסקות.לאחר השלמת האולטרה-צנטריפוגה, השתמש במלקחיים כדי להוציא בזהירות את השיפוע ממחזיק הצינור. הפס הירוק הוא שבריר שיש לאסוף. ספקטרום הספיגה של CP 24.חלבון קושר כלורופיל AB שנוצר מחדש במבחנה מושווה לספקטרום של הקומפלקס המקומי. הספקטרום הזהה מצביע על הרכב פיגמנט וארגון כמעט זהים. ניתן להעריך את איכות הקומפלקס המשוחזר גם על ידי ספקטרוסקופיה פלואורסצנטית.מכיוון שהפיגמנטים פולטים פלואורסצנטיות בעת עירור באורכי גל שונים, כלורופיל A ב-440 ננומטר, כלורופיל B ב-475 ננומטר וזיל ב-500 ננומטר. ספקטרום פליטות הקרינה של קומפלקס CP 24 משוחזר ומנורמל למקסימום מראה העברת אנרגיה יעילה ממילוי כלורופיל B ו-XANTHE לכלורופיל A. ניתן לזהות את נוכחותו של כלורופיל B שאינו מתואם עם החלבון על ידי כתף נוספת בסביבות 650 ננומטר. נוכחותו של כלורופיל A חופשי מובילה במקום זאת לפליטה נוספת בסביבות 675 ננומטר.ספקטרום הפליטה הפלואורסצנטית בציטוט של 475 ננומטר הן של קומפלקס CP 24 המשוחזר והן של קומפלקס CP 24 המקורי מראה שיא יחיד ב-681 ננומטר המצביע על כך שהקומפלקס המחודש מקופל כהלכה. CP 24 משוחזר והקומפלקס המקומי מראים גם ספקטרום כריזמה מעגלי דומה מאוד. ניתן לשנות שאריות של חומצות אמינו בודדות החשובות לתיאום של פיגמנטים שונים כדי לנתח את תכונותיהם של פיגמנטים בודדים או להעריך את תרומתם לתפקוד וליציבות של הקומפלקס.מוצגים כאן ספקטרום הספיגה של סוג פראי ו-CP 29 שעבר מוטציה. הקו הירוק מראה את ההבדלים בין שתי החלקות כאשר טייט, טכניקה זו כולל שיפוע SUSE, אולטרה-צנטריפוגה יכולה להיעשות תוך 24 שעות אם היא מבוצעת כראוי.

in-vitro-reconstitution-light-harvesting-complexes-plants-green

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

הגישה המתוארת ההשוואתית, כמותית proteomic מטרתה קבלת תובנות לתוך הרכב של מתחמי multiprotein בתנאים שונים ומודגמת על ידי השוואת זנים שונים מבחינה גנטית. ניתוח כמותי כמויות שווה של שברים שונים מצפיפות סוכרוז שיפוע מעורבבות ונותחו על ידי ספקטרומטריית מסה.

גישה חדשה לניתוח השוואתי של multiprotein מכלולים בהתבסס על<sup&gt; 15</sup&gt; N מטבולית תיוג וכמותי ספקטרומטריית המסה

כתב יד זה מתאר שיטה פשוטה תפוקה גבוהה להרכבת חלבונים מסיסים במים עם פיגמנטים הידרופובי אשר מבוססים על אמולסיות מים-in-שמן. אנו מדגימים את היעילות של השיטה באסיפה של כלורופיל ילידים עם ארבע וריאציות של מסיס-מים כלורופיל רקומביננטי מחייבים חלבונים (WSCPs) של צמחי Brassica לידי ביטוי E. coli.

המים אמולסיות שמן: מערכת חדשה להרכבת חלבונים מסיסים במים כלורופיל מחייב עם פיגמנטים הידרופובי

כאן אנו מתארים הליך לחקר רקמות צמחים שבורות בהקפאה. דגימות עלים קפואות בלחץ גבוה שבורות בהקפאה ומצופות בשכבה כפולה, ומניבות דגימות קפואות-לחות שמורות היטב המצולמות באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים סורק בהגדלות גבוהות עם נזק מינימלי לאלומה.

לימוד ההסתדרות המולקולרית של פוטוסינתזה ממברנות בתוך הרקמות ליף Freeze-שבר ידי Cryo-סריקה מיקרוסקופית אלקטרונים

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לבודד fucoxanthin כלורופיל a/c מחייב חלבונים (FCP) מ- diatoms ועד לשלב אותם בתוך ליפוזומים עם יצירות השומנים טבעית ללמוד עירור העברת אנרגיה על שינויים בהרכב יון.

בידוד, שילוב אנטנות קציר-אור של צורניות Cyclotella Meneghiniana בתוך ליפוזומים עם שומנים תילקואיד

פרוטוקול עבור הבהרה של הצמח תילקואיד חלבון הארגון מורכבים ו הלחנה אצל כחול לזיהוי יליד ג'ל אלקטרופורזה (בסון-עמוד) ותיאר 2D-מרחביות עמודים. הפרוטוקול ממוטבת עבורו תודרנית לבנה, , אבל ניתן להשתמש עבור שאר מיני צמחים עם שינויים מזעריים.

ניתוח של מתחמי חלבון ממברנה תילקואיד מאת כחול מקורי אלקטרופורזה בג'ל

אנו מציגים פרוטוקולים בזאת לבידוד לתפוקה גבוהה של פעיל מבחינה פיזיולוגית thylakoids, חלבון מבחני תחבורה עבור רוברטסונית ארגינין טווין כלורופלסט (cpTat), הפרשה (cpSec1), אות זיהוי החלקיקים (cpSRP) מסלולים.

בידוד של פעיל מבחינה פיזיולוגית Thylakoids, השימוש בהם במסגרת מבחני תחבורה אנרגיה תלוית חלבון

כאן אנו מציגים פרוטוקול כדי להפריד בין מתחמי תילקואיד solubilized על ידי הילידים בג'ל ירוק. להקות ג'ל ירוק לאחר מכן מאופיינים על ידי הזמן בקורלציה יחיד פוטון לספור (TCSPC) ומסופקים שלבים בסיסיים לניתוח נתונים.

ההפרדה של תרד תילקואיד חלבון מתחמי מאת מקורית ירוק בג'ל ואפיון הלהקה באמצעות Time-Correlated סופר פוטון יחיד

הפרוטוקול הנוכחי מתאר הדמיה אוטופלואורסצנטית שלב אחר שלב והערכה של שינויים בחלבון פיקובילין באצות אדומות בהתבסס על אנליזה ספקטרלית. זוהי שיטה נטולת תוויות ולא הרסנית להערכת הסתגלות התאית לבתי גידול קיצוניים, כאשר רק חומר נדיר זמין ותאים גדלים לאט, או בכלל לא, בתנאי מעבדה.

הדמיה אוטופלואורסצנטית להערכת פיזיולוגיה של אצות אדומות

פרוטוקול זה מתאר את השימוש בטרנספורמציה בתיווך גידולים אגרובקטריום (AMT) לשילוב גנים בעלי עניין בגנום הגרעיני של המיקרו-אצות הירוקות Chlorella vulgaris, מה שמוביל לייצור טרנספורמנטים יציבים.

Agrobacterium tumefaciens-מתווך גנטי של מיקרו-אצות ירוקות, Chlorella vulgaris

מיקרוסקופיה מולקולה בודדת approch סיפק תובנות הרומן לתוך התחבורה גרעיני.

מולקולה בודדת הדמיה התחבורה גרעיני

למד כיצד לכונן מחדש מכלולי אור קציר של צמחים ואצות ירוקות במבחנה. השיטה כוללת חילוץ פיגמנטים מעלי תרד וביטוי חלבון APA ב-E. coli לניתוח ספקטרוסקופי.

במבחנת כינונה מחדש של מכלולי אור קציר של צמחים ואצות ירוקות

גלה סרטונים נוספים