Name: gDNA העשרה על ידי טכנולוגיה מבוססת Transposase לניתוח NGS של הרצף השלם של BRCA1, BRCA2, ו -9 גנים המעורבים בתיקון נזק לדנא (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-10-06T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 15 s
Description: למד פרוטוקול מהיר לניתוח רצף של 11 גנים בו-זמנית באמצעות טכנולוגיית טרנספוזאז לעשרת gDNA. השיטה מאפשרת זיהוי וריאציות גנטיות בתיקון נזק ל-DNA בפחות משבועיים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים לליגת הסרטן דה קוט ד'אור ולמרכז ז'ורז'-פרנסואה לקלרק על תמיכתם הכספית. אנו מודים לפיליפ באסטבל על עריכת כתב היד.

<ol><li>Cornelisse, C. J., Cornelis, R. S., Devilee, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genes+responsible+for+familial+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Pathol.+Res.+Pract%22%5BJournal%5D)">Genes responsible for familial breast cancer.</a> Pathol. Res. Pract. 192 (7), 684-693 (1996).</li>
<li>Culver, J., Lowstuter, K., Bowling, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessing+breast+cancer+risk+and+BRCA1%2F2+carrier+probability%5BTitle%5D)+AND+%22Breast+Dis%22%5BJournal%5D)">Assessing breast cancer risk and BRCA1/2 carrier probability.</a> Breast Dis. 27, 5-20 (2007).</li>
<li>Cox, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Common+variants+of+the+BRCA1+wild-type+allele+modify+the+risk+of+breast+cancer+in+BRCA1+mutation+carriers%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Mol.+Genet%22%5BJournal%5D)">Common variants of the BRCA1 wild-type allele modify the risk of breast cancer in BRCA1 mutation carriers.</a> Hum. Mol. Genet. 20 (23), 4732-4747 (2011).</li>
<li>Maia, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+BRCA2+cis-regulation+in+normal+breast+and+cancer+risk+amongst+BRCA2+mutation+carriers%5BTitle%5D)+AND+%22Breast+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Effects of BRCA2 cis-regulation in normal breast and cancer risk amongst BRCA2 mutation carriers.</a> Breast Cancer Res. 14 (2), 63(2012).</li>
<li>Anczuków, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BRCA2+deep+intronic+mutation+causing+activation+of+a+cryptic+exon%3A+opening+toward+a+new+preventive+therapeutic+strategy%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">BRCA2 deep intronic mutation causing activation of a cryptic exon: opening toward a new preventive therapeutic strategy.</a> Clin. Cancer Res. 18 (18), 4903-4909 (2012).</li>
<li>Brewster, B. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+fifteen+novel+germline+variants+in+the+BRCA1+3%27UTR+reveals+a+variant+in+a+breast+cancer+case+that+introduces+a+functional+miR-103+target+site%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Mutat%22%5BJournal%5D)">Identification of fifteen novel germline variants in the BRCA1 3'UTR reveals a variant in a breast cancer case that introduces a functional miR-103 target site.</a> Hum. Mutat. 33 (12), 1665-1675 (2012).</li>
<li>Roy, R., Chun, J., Powell, S. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BRCA1+and+BRCA2%3A+different+roles+in+a+common+pathway+of+genome+protection%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">BRCA1 and BRCA2: different roles in a common pathway of genome protection.</a> Nat Rev Cancer. 12 (1), 68-78 (2012).</li>
<li>Ma, X. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((First+evidence+for+the+contribution+of+the+genetic+variations+of+BRCA1-interacting+protein+1+%28BRIP1%29+to+the+genetic+susceptibility+of+cervical+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">First evidence for the contribution of the genetic variations of BRCA1-interacting protein 1 (BRIP1) to the genetic susceptibility of cervical cancer.</a> Gene. 524 (2), 208-213 (2013).</li>
<li>Haanpää, M., Pylkäs, K., Moilanen, J. S., Winqvist, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+the+need+for+routine+clinical+testing+of+PALB2+c.1592delT+mutation+in+BRCA+negative+Northern+Finnish+breast+cancer+families%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Med.+Genet%22%5BJournal%5D)">Evaluation of the need for routine clinical testing of PALB2 c.1592delT mutation in BRCA negative Northern Finnish breast cancer families.</a> BMC Med. Genet. 14, 82(2013).</li>
<li>Southey, M. C., Teo, Z. L., Winship, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PALB2+and+breast+cancer%3A+ready+for+clinical+translation%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Clin.+Genet%22%5BJournal%5D)">PALB2 and breast cancer: ready for clinical translation.</a> Appl. Clin. Genet. 6, 43-52 (2013).</li>
<li>Ulahannan, D., Kovac, M. B., Mulholland, P. J., Cazier, J. B., Tomlinson, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Technical+and+implementation+issues+in+using+next-generation+sequencing+of+cancers+in+clinical+practice%5BTitle%5D)+AND+%22Br.+J.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Technical and implementation issues in using next-generation sequencing of cancers in clinical practice.</a> Br. J. Cancer. 109, 827-835 (2013).</li>
<li>Hernan, I., Borràs, E., de Sousa Dias, M., Gamundi, M. J., Mañé, B., Llort, G., Agúndez, J. A., Blanca, M., Carballo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+genomic+variations+in+BRCA1+and+BRCA2+genes+by+long-range+PCR+and+next-generation+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Diagn%22%5BJournal%5D)">Detection of genomic variations in BRCA1 and BRCA2 genes by long-range PCR and next-generation sequencing.</a> J. Mol. Diagn. 14, 286-293 (2012).</li>
<li>Knierim, E., Lucke, B., Schwarz, J. M., Schuelke, M., Seelow, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+comparison+of+three+methods+for+fragmentation+of+long-range+PCR+products+for+next+generation+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Plos+One%22%5BJournal%5D)">Systematic comparison of three methods for fragmentation of long-range PCR products for next generation sequencing.</a> Plos One. 6, e28240(2011).</li>
<li>de Sousa Dias, M., Hernan, I., Pascual, B., Borràs, E., Mañé, B., Gamundi, M. J., Carballo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+novel+mutations+that+cause+autosomal+dominant+retinitis+pigmentosa+in+candidate+genes+by+long-range+PCR+amplification+and+next-generation+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Vis%22%5BJournal%5D)">Detection of novel mutations that cause autosomal dominant retinitis pigmentosa in candidate genes by long-range PCR amplification and next-generation sequencing.</a> Mol. Vis. 19, 654-664 (2013).</li>
<li><a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Breast+Cancer+Linkage+Consortium.+Cancer+Risks+in+BRCA2+Mutation+Carriers%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Natl.+Cancer+Inst%22%5BJournal%5D)">The Breast Cancer Linkage Consortium. Cancer Risks in BRCA2 Mutation Carriers.</a> J. Natl. Cancer Inst. 91, 1310-1316 (1999).</li>
<li>Levy-Lahad, E., Friedman, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+risks+among+BRCA1+and+BRCA2+mutation+carriers%5BTitle%5D)+AND+%22Br.+J.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Cancer risks among BRCA1 and BRCA2 mutation carriers.</a> Br. J. Cancer. 96 (1), 11-15 (2007).</li>
<li>Risch, H. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Population+BRCA1+and+BRCA2+mutation+frequencies+and+cancer+penetrances%3A+a+kin-cohort+study+in+Ontario%2C+Canada%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Natl.+Cancer+Inst%22%5BJournal%5D)">Population BRCA1 and BRCA2 mutation frequencies and cancer penetrances: a kin-cohort study in Ontario, Canada.</a> J. Natl. Cancer Inst. 98 (23), 1694-1706 (2006).</li>
<li>Slater, E. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PALB2+mutations+in+European+familial+pancreatic+cancer+families%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Genet%22%5BJournal%5D)">PALB2 mutations in European familial pancreatic cancer families.</a> Clin. Genet. 78, 490-494 (2010).</li>
<li>Brennan, G. T., Relias, V., Saif, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BRCA+and+pancreatic+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22J.O.P%22%5BJournal%5D)">BRCA and pancreatic cancer.</a> J.O.P. 14 (4), 325-328 (2013).</li>
</ol>

למחברים אין ניגודי אינטרסים להצהיר עליהם.

השימוש הנרחב במכשירי NGS וטכנולוגיות סיפקו הזדמנויות חדשות בחקר הסרטן והפרעות גנטיות. בנוסף לרצף הגנום כולו או רצף RNA, הניתוח של כמות גדולה של רצפי gDNA נבחרו בחולים רבים בו זמנית מציע סיכויים רבים באבחנה. כאן, פיתחנו עיצוב ספציפי (זמין על פי דרישה) באמצעות טכנולוגיית Nextera ללמוד 11 גנים שלמים ב24 מטופלים בו זמנית עם מכשיר בינוני רצף תפוקה (טבלה של חומרים / ציוד). פרוטוקול זה מאפשר דור מהיר של נתונים, שמאפשר תגובה מהירה לחששותיהם של חולים עם סיכון נמוך לשגיאה. כפי שמודגם <stron...

בשנת 2010, כמעט 1.5 מיליון בני אדם (בעצם נשים) פיתחו סרטן השד ברחבי העולם. ההערכה היא כי 5 עד 10% מהמקרים הללו היו תורשתיים. לפני כמעט 20 שנים, BRCA1 ו BRCA2 זוהו כמעורב בשד תורשתי וסרטן השחלות 1. מאז לפני כ -15 שנים, אזורי קידוד BRCA1 ו BRCA2 היו רצף כדי לקבוע את הנטייה הגנטית לסרטן שד וסרטן השחלה. שינויים בBRCA1 ו BRCA2 מתגלים ב10 עד 20% ממשפחות שנבחרו 2 מצביעים על כך שהניתוח של אזורים אלה אינו מספיק להקרנה יעילה. לאחרונה, ניתוח רצפי קידוד שאינו (אמרגן, אינטרונים, 3-&#39;UTR) של BRCA1 ו BRCA2 הדגיש כי מוטציות חדשות / וריאציות יכולות להיות קשורות לסיכון גבוה יותר לסרטן השד 3-6. חלבוני BRCA1 ו BRCA2 מעורבים בתיקון הומולוגי רקומבינציה (HHR), אשר הושלם על ידי מספר רב של שותפים 7. בעוד שינויים בBRCA1 או BRCA2 לגרום פגמים בתיקון DNA, שותפים האחרים עשויים גם להשפיע על הסיכון לסרטן השד. השערה זו נראית אומתו מאז BRIP1 8 ויש לי PALB2 9 השפעה מוכחת על סרטן צוואר רחם וסרטן שד, בהתאמה. בנוסף, שני גנים אחרים &quot;מתון בסיכון&quot; לסרטן שד רגישות, כספומט וCHEK2, יכולים להיות גם למדו באופן שגרתי 10. בהמשך למחקרים הללו, החלטנו לפתח פרוטוקול לנתח 11 גנים (ATM, BARD1, BRCA1, BRCA2, BRIP1, CHEK2, PALB2, RAD50, RAD51C, RAP80, וTP53) ב24 מטופלים בו זמנית באמצעות מאוד קל ויחסית פרוטוקול מהיר המבוסס על טכנולוגיית transposase, עם העשרה ורצף על מכשיר תפוקה בינוני. תודהלטכניקה זו, אנו רצף גנים שלמים כבר מההתחלה של האמרגן לסוף 3&#39;-UTR, פרט לRAP80, שאזור intronic של 2,500 נ&quot;ב לא היה מכוסה (Chr5: 176,381,588-176,390,180). זה מייצג כולל של כ 1000300 נ&quot;ב למד עם 2,734 בדיקות. בדרך כלל, רצפי exonic BRCA1 ו BRCA2 מנותחות סנגר רצף, אשר צריך 1.5 חודשים פחות מ 20 חולים. עם הפרוטוקול הנוכחי (איור 1), באותו הזמן, 11 גנים שלמים יותר מ75 חולים יכולים להיות מנותחים.

<table><tbody><tr><td>MiSeq</td><td>Illumina</td><td>SY-410-1001</td><td>רצף / מכשיר תפוקה בינונית</td></tr><tr><td>Nextera ערכת העשרה</td><td>Illumina</td><td>FC-123-1208</td><td>טכנולוגיה מבוססת טרנספוזאז</td></tr><tr><td>300 מחזורים מחסנית</td><td>Illumina</td><td>15033624</td><td></td></tr><tr><td>AMPure חרוזים</td><td>בקמן קולטר</td><td>A63881</td><td>חרוזי טיהור מגנטי</td></tr><tr><td>מעמד מגנטי</td><td>Alpaqua</td><td>A32782</td><td></td></tr><tr><td>96 בארות צלחות</td><td>Life Technologies</td><td>4306737</td><td></td></tr><tr><td>MIDI 96 בארות צלחות</td><td>Biorad</td><td>AB0859</td><td></td></tr><tr><td>Microseal A</td><td>Biorad</td><td>MSA-5001</td><td>אטם זה נחוץ רק להגברת PCR. ניתן להשתמש בחותמות סטנדרטיות אחרות לאורך כל הניסוי</td></tr><tr><td>MiSeq</td><td>Illumina</td><td></td><td>מסופק עם מכשיר הריצוף תוכנת Experiment Manager כתובת אינטרנט: http://designstudio.illumina.com/NexteraRc/project/new כלי אתר היצרן</td></tr></tbody></table>

gdna העשרה על ידי טכנולוגיה מבוססת transposase לניתוח ngs של הרצף השלם של brca1, brca2, ו -9 גנים המעורבים בתיקון נזק לדנ"א

gDNA Enrichment by a Transposase-based Technology for NGS Analysis of the Whole Sequence of BRCA1, BRCA2, and 9 Genes Involved in DNA Damage Repair

השימוש הנרחב בדור הבא של הרצף נפתח אפיקים חדשים לחקר סרטן ואבחון. NGS יביא כמויות עצומות של נתונים חדשים על הסרטן, ובמיוחד סרטן גנטיקה. ידע נוכחי ותגליות עתידיות יעשו את זה צריך ללמוד מספר עצום של גנים שיכולים להיות מעורב בנטייה גנטית לסרטן. בהקשר זה, פיתחנו עיצוב Nextera ללמוד 11 גנים שלמים מעורבים בתיקון נזק לדנ&quot;א. פרוטוקול זה פותח כדי ללמוד בבטחה 11 גנים (ATM, BARD1, BRCA1, BRCA2, BRIP1, CHEK2, PALB2, RAD50, RAD51C, RAD80, וTP53) מאמרגן ל3&#39;-UTR ב24 מטופלים בו זמנית. פרוטוקול זה, המבוסס על טכנולוגיית transposase והעשרת gDNA, נותן יתרון גדול במונחים של זמן להודות אבחון הגנטי כדי לדגום ריבוב. פרוטוקול זה ניתן להשתמש בבטחה עם gDNA דם.

תוצאות QC המדגם היכולת של שיטה זו כדי לקבוע רצפים של גני המטרה מבוססת על איכות gDNA (איור 2 א) והאיכות של צעד tagmentation. אם tagmentation אינו מספיק (איור 2, פנל עליון), הרצף לא יהיה משביע רצון. כפי שצוין לעיל, לאחר טיהור tagmentation, gDNA יש tagmented לרסיסים מ150 נ"ב ל1,000 נ"ב עם רוב הברים ברחבי -300 נ"ב (איור 2, פנל תחתון). <p class="jove_content" style="...

העשרת gDNA לריצוף NGS היא כלי קל ורב עוצמה לחקר מוטציות חוקתיות. במאמר זה, אנו מציגים את ההליך לניתוח פשוט של הרצף המלא של 11 גנים המעורבים בתיקון נזק ל-DNA.

gDNA העשרה על ידי טכנולוגיה מבוססת Transposase לניתוח NGS של הרצף השלם של BRCA1, BRCA2, ו -9 גנים המעורבים בתיקון נזק לדנ"א

The widespread use of Next Generation Sequencing has opened up new avenues for cancer research and diagnosis. NGS will bring huge amounts of new data on ...

מטרת הניסוי הבא היא לנתח רצף של 11 גנים בו זמנית בפרוטוקול קל מאוד ומהיר יחסית המבוסס על טכנולוגיה מבוססת טרנספוזאז. זה מושג על ידי פעולת טרנספוזאז להשגת 300 מקטעי DNA של זוגות בסיסים הקשורים ישירות עם מתאמים. הלכידה הראשונה באמצעות בדיקות ספציפיות, מעשירה דגימות באזורי עניין.שלב זה חוזר על עצמו שוב כדי להשיג רק רצפי מטרה. בשלב הבא מתבצעת הגברת PCR על מנת להגדיל את כמות החומרים לרצף מתקבלות תוצאות המציגות וריאציות גנטיות בגנים על סמך יישור רצף וניתוח ביואינפורמטיקה. היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות כמו ריצוף סנגר, הוא היכולת הגדולה שלה המאפשרת לנו לנתח 24 תשוקות ל-11 גנים שלמים בפחות משבועיים.מי שתדגים את ההליך תהיה סנדי, טכנאית במעבדה שלי. כדי להתחיל, הכינו את כל הריאגנטים מערכת העשרת ה-DNA. כשהוא מוכן, הוסף כ-50 ננוגרם של DNA גנומי לכל באר של צלחת של 96 בארות התחל להזכיר על ידי הוספת 25 מיקרוליטר של מאגר TD ולאחר מכן חמישה מיקרוליטר של TDE מאגר אחד.לכל באר הגדר פיפטה ל -50 מיקרוליטר ופיפטה בעדינות את כל הנפח למעלה ולמטה 10 פעמים. צנטריפוגה בקצרה, ואז הניחו את הצלחת בתרמו-סייקלר כשהיא מוכנה. מערבל את תמיסת ה-ST והוסף 15 מיקרוליטר לכל באר המכילה דגימה.כוונו את הפיפטה ל-65 מיקרוליטר והעבירו בעדינות את כל הנפח למעלה ולמטה 10 פעמים בדגירה למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר לפני הצנטריפוזיה. לאחר מכן, הוסף 52 מיקרוליטר של חרוזים מגנטיים לטיהור מעורבב בעבר לכל תערובת באר ודגר למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר לפני הצנטריפוגה. לאחר שטיפת החרוזים באתנול, הסר את הצלחת מהמעמד המגנטי והוסף 22.5 מיקרוליטר של מאגר RSB.לאחר הערבוב, הניחו את הצלחת על המעמד המגנטי ודגרו למשך שתי דקות. ודאו שהנוזל נראה צלול לחלוטין. העבירו בעדינות 20 מיקרוליטר מהחטיפה לצלחת חדשה של 96 בארות.כדי להתחיל את הסבב הראשון של הגברת PCR, הוסף 20 מיקרוליטר של LP PMM וחמישה מיקרוליטר כל אחד של אינדקס אחד ואינדקס שניים לכל אחד. ובכן מערבבים ומכסים את הצלחת בסרט מיקרוס EAL דביק. לאחר הצנטריפוגה, הנח את הצלחת בתוכנית Thermocycler and Run הראשונה.לאחר טיהור וקביעת התשואה מהסבב הראשון של PCR, התחל את ההכלאה הראשונה על ידי משיכת עד 12 דגימות. בצלחת החדשה של 96 בארות כדי להבטיח שהנפח הסופי של כל בריכה לא יעלה על 40 מיקרוליטר מערבבים היטב את ה-NCT תמיסה אחת ומוסיפים 50 מיקרוליטר לכל באר. לאחר הוספת 10 מיקרוליטר CSO, מערבבים ואוטמים את הצלחת.לאחר הצנטריפוגה, הנח את הצלחת בתוכנית תרמו-סייקלר והפעל. שניים. לשטיפת ההכלאה הראשונה, הסר את הצלחת מהתרמו-סייקלר והצנטריפוגה. הסר בקצרה את מכסה הדבק בזהירות רבה.העבירו 100 מיקרוליטר של תערובת תגובה מהצלחת לצלחת באר MIDI 96 חדשה והוסיפו 250 מיקרוליטר של תמיסת Vortex SMB באר. מערבבים ואוטמים את הצלחת לפני הדגירה בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות. לאחר שטיפה והשלכת הסופנה, הוסיפו 200 מיקרוליטר של תמיסת WS מעורבבת היטב לבארות המכילות חרוזים וערבבו היטב והעבירו את כל הנפח לצלחת חדשה של 96 בארות.אוטמים את הצלחת ומניחים במחזור תרמי. הפעל את התרמו-סייקלר בטמפרטורה של 42 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. לאחר השלמתו, הנח מיד את הצלחת על המעמד המגנטי למשך שתי דקות.ודאו שהנוזל נראה צלול לחלוטין. הסר את החותם והשליך מיד את כל הסופרנטנט. הסר את הצלחת מהמעמד המגנטי.הוסף 200 מיקרוליטר של תמיסות Ws שלוש מעורבבות היטב לבארות המכילות חרוזים ומערבבים היטב. לאחר שטיפה והוצאת הסופינאט, אטמו את הצלחת וצנטריפוגה קצרה כדי למשוך את שאריות השכיבה כלפי מטה. הנח את הצלחת על המעמד המגנטי למשך שתי דקות.השלך את שאריות הספינאט. לאחר מכן, הסר את הצלחת מהמעמד המגנטי. מוסיפים 23 מיקרוליטר תערובת שהוכנה בעבר.לאחר הערבוב אוטמים את הצלחת ומשאירים למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר לפני הצנטריפוגה. לאחר העברת 21 מיקרוליטר של סאטה לצלחת חדשה של 96 בארות, הוסף ארבעה מיקרוליטר של ET, שתי תמיסה לכל אחד. מערבבים היטב ואוטמים את הצלחת לפני הצנטריפוזיה.כדי להתחיל את ההכלאה השנייה, הסר את סרט הדבק והוסף 50 מיקרוליטר NCT, 10 מיקרוליטר CSO ו-15 מיקרוליטר מים בדרגת PCR ל-25 מיקרוליטר של הספרייה. לאחר הצנטריפוגה, הנח את הצלחת בתרמו-סייקלר והפעל תוכנית. שניים. בצלחת חדשה של 96 בארות ערבב 20 מיקרוליטר של אבולוציה מהשלב הקודם.עם 25 מיקרוליטר T-C-P-M-M וחמישה מיקרוליטר PPC אוטמים את הצלחת לאחר ערבוב וצנטריפוגה. לאחר מכן, הניחו את הצלחת בתרמו-סייקלר והפעילו את התוכנית השלישית למחרת, צנטריפוגה את הצלחת ושטפו את החרוזים באתנול. הסר את הצלחת מהמעמד המגנטי והוסף 30 מיקרוליטר של מאגר RSB.מערבבים ומדגרים את הצלחת למשך שתי דקות. בטמפרטורת החדר, הנח את צלחת 96 הבאר על המעמד המגנטי ודגר במשך חמש דקות או עד שהסופרנטנט S נראה צלול לחלוטין. העבירו בעדינות 28 מיקרוליטר מהחטיפה לצלחת חדשה של 96 בארות.השלב האחרון הוא קביעת איכות הספרייה באמצעות מנתח שברים או QPCR. במהלך הריצה, צפיפות האשכול צריכה להיות בין 801,000 K למילימטר מרובע. תמונות שונות תואמות לצפיפות נמוכה, צפיפות גבוהה וצפיפות מושלמת.קל מאוד לפרש את התוצאות המתקבלות בטכנולוגיה זו כמוטציות נקודתיות או אינדל באמצעות ביואינפורמטיקה. שינוי הבסיס מצוין והרצף שנמחק או הוכנס מזוהה ישירות. לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך פחות משלושה ימים אם היא מבוצעת כראוי.

gdna-enrichment-transposase-based-technology-for-ngs-analysis-whole

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

מאמר זה מתאר GFP מבוססי...

ניתוח תיקון DNA פעמיים גדיל Break (DSB) בתאי יונקים

שיטה של ​​זיהוי נהגים לא ידועים של היווצרות הסרטן באמצעות גישה משוחדת מתוארת. השיטה...

זיהוי<em&gt; יפהפה נרדם</em&gt; הוספות Transposon בגידולים מוצקים באמצעות PCR לינקר בתיווך

מתוארת מערכת משולבת לריצוף ממוקד של הדור הבא של דגימות אונקולוגיות. מערכת חוצת פלטפורמות זו מותאמת לביופסיות גידול באיכות נמוכה ובכמות נמוכה, מתאימה לתשומות DNA נמוכות, כוללת בקרות מרובות וריאנטים מאופיינות היטב, וכוללת מתקשר וריאנט חדש המבוסס על אמצעי בקרת איכות כמותיים טרום-אנליטיים.

אינטגרציה של Wet ותהליכי ספסל יבשים מבצעת אופטימיזציה ממוקד רצף הדור הבא של איכות נמוכה וביופסיות גידול נמוכה כמות

אנו מציגים תוכנית אסטרטגית ופרוטוקול לזיהוי וריאנטים גנטיים לא מקודדים המשפיעים על קשירת ה-DNA של גורם השעתוק (TF). פרוטוקול ניסיוני מפורט מסופק לבדיקת משמרת ניידות אלקטרופורטית (EMSA) וניתוח משקעים של זיקה ל-DNA (DAPA) של קשירת TF DNA תלויה בגנוטיפ.

הקרנה עבור וריאנטים גנטיים ללא קידוד תפקודיים באמצעות ניידות Electrophoretic Shift Assay (Emsa) ו Assay משקע זיקת DNA (DAPA)

פרוטוקול זה מתווה את זרימת העבודה של הגן מבוססת על CRISPR/Cas9 עריכת המערכת עבור התיקון של מוטציות נקודה בתרבית של תאים. כאן, אנו משתמשים בגישה קומבינטורית לעריכת ג'ין עם נתונים היסטוריים אסטרטגיה ניסיוני המשכית למדידת ויאסין היווצרות באתר היעד — בעיקרו של דבר, ניתוח מוטגנזה מכוונת באתר.

מתודולוגיה סטנדרטי כדי לבדוק באתר המוטגניות כפונקציה של תיקון נקודת מוטציה על ידי CRISPR/Cas9 ו- SsODN בתאי אדם

כתב יד זה מתאר שיטה לזיהוי מוטציות בתדר נמוך ב- ctDNA, אר-תת סעיף. בשיטה זו הוא הבדיל על ידי השימוש הייחודי של תיקון שגיאות דו כיווני, רקע מיוחד המסנן, וכן הקניית מולקולרית יעיל.

זיהוי של מוטציות נדירות CtDNA באמצעות רצף הדור הבא

אנשים עם מוטציות BRCA1 יש סיכון גבוה יותר לפתח סרטן, אשר מצדיק הערכה מדויקת של הפונקציה של גרסאות BRCA1. בזאת, תיארנו פרוטוקול להערכה פונקציונלית של גרסאות BRCA1 באמצעות עורכי בסיס ציטוצין בתיווך CRISPR המאפשרים המרת C:G ממוקדת ל- T:A בתאים חיים.

הערכה פונקציונלית של גרסאות BRCA1 באמצעות עורכי בסיס בתיווך CRISPR

מאמר זה מציג שלבים חיוניים של חיסונים ואימונופרציפיטציה של כרומטין. פרוטוקולים אלה משמשים בדרך כלל כדי לחקור תהליכים תאיים הקשורים נזק DNA כדי לדמיין ולכומת את הגיוס של חלבונים מעורבים בתיקון DNA.

הדמיה וכימות נזק DNA ספציפי לאתר מבוסס אנדונוקלאז

מוצג כאן sgRNA/CAS9 endonuclease ופרוטוקול ריצוף מהדור הבא שניתן להשתמש בו כדי לזהות את המוטציות הקשורות לתיקון שבר גדיל כפול ליד מקדם CD4.

שימוש בריצוף הדור הבא כדי לזהות מוטציות הקשורות לתיקון של שבר גדיל כפול המושרה על ידי CAS9 ליד מקדם CD4

סרט הווידאו הזה מדגים 2 צבעים הר שלם הכלאה באתרו, שיטה שבאמצעותה דפוס ביטוי במרחב ובזמן של 2 גנים שונים יכולים להיות דמיינו בעוברים אפרוח צעיר. שיטה זו הוצגה לראשונה על ידי דייוויד וילקינסון, דומינגוס אנריקה, פיל אינגהם ודוד איש-Horowicz.

הר שלם כפול באתרו הכלאה של עוברים צ&#39;יק מוקדם

למד פרוטוקול מהיר לניתוח רצף של 11 גנים בו-זמנית באמצעות טכנולוגיית טרנספוזאז לעשרת gDNA. השיטה מאפשרת זיהוי וריאציות גנטיות בתיקון נזק ל-DNA בפחות משבועיים.

gDNA העשרה על ידי טכנולוגיה מבוססת Transposase לניתוח NGS של הרצף השלם של BRCA1, BRCA2, ו -9 גנים המעורבים בתיקון נזק לדנ"א

גלה סרטונים נוספים