Name: במבחנה דגם לחקר נייד פתופיזיולוגיה בLeukodystrophy הסלולרי Globoid (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-10-21T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 45 s
Description: חקור את השתנות המיקרוגליה לתאי גלובואיד במחלת קראבה באמצעות תרביות תאים ראשוניות וטיפול בציקלין. שיטה זו מאפשרת הערכת יכולת הפאגוציטוזה ותובנות לגבי אסטרוציטים ומיקרוגליה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה בחלקה על ידי מענקים מהאגודה הלאומית לטרשת נפוצה (RG 5001-A-3 ל-S.J.C.), המכונים הלאומיים לבריאות (NS065808 ל-E.R.B.; NS078392 ל-S.J.C.), קרנות סטארט-אפ ממרכז הבריאות UConn (ל-SJC) וקרן משפחת קים (UCHC בתמיכה ב-K.I.C).

כל הנהלים הקשורים בעלי חיים בוצעו בהתאם למדיניות על צער בעלי חיים טיפול ושימוש בחי מעבדה שנקבע על ידי המשרד למעבדת צער בעלי חיים (NIH), ורק עם אישור מהוועדה המוסדי הטיפול בבעלי חיים והשימוש (IACUC) מאוניברסיטת מרכז לבריאות קונטיקט. .1 הכנת תרבויות גליה מעורבות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעקר את כל המכשירים לפני השימוש. הוסף 3 מ&quot;ל של התמיסה קרה כקרח סטרילי של האנק המאוזן מלח (HBSS) המכילה לא קטיונים (Mg 2 + או Ca 2 +) לשלוש 60 מ&quot;מ צלחות פטרי סטרילי שמרו על קרח כדי לשמור על הקור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבודד את קליפת המוח מגורי עכבר P0-P2 לאחר לידה, כפי שתואר קודם לכן 17,18. הערה: מבנים קורטיקליים, כגון hippocampi, אינם כלולים בתרבויות אלה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוציא בזהירות את קרומי המוח ולאחר מכן להעביר את קליפת המוח המבודדים לHBSS הטרי ולנתק את רקמות אנזימים, באמצעות neערכה לנתיחה רקמות אוראל על פי הפרוטוקול של היצרן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צלחת התאים לתוך T-175 צלוחיות סטרילי ודגירת הלילה בתקשורת [בינוני הנשר (DMEM) עם 10% בסרום שור העובר (FBS) המכיל פניצילין / סטרפטומיצין 1x שונה Dulbecco]. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החלף את כל אמצעי התקשורת ביום שלמחרת עם תקשורת טרי. תמשיך לדגור תרבויות, עם שינויי מדיה רגילים, למשך כ 3 שבועות או עד monolayer סלולרי שהוקם. הערה: monolayer זה יהיה מורכב מהאסטרוציטים ומיקרוגליה עם כ 10: 1 יחס 19. </li></ol> .2 אינדוקציה סלולארי Globoid בתרבויות גליה מעורבות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את coverslips ECM מצופה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> משרים coverslips העגול עם חומצת סטרילי 1 N הידרוכלורית (HCl) בצלחת פטרי סטרילית למשך 30 דקות. לשטוף coverslips עם 3x מים סטריליים ולאחר מכן לטבול ב95% EtOH לפחות 20 דקות. ואז לתת לי אוויר יבש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טיפות מקום matr תאי המדוללחומרי ix ציפוי (ECM) חלבון על גיליון של Parafilm (למשל 150-250 μl / טיפה של laminin 10 מיקרוגרם / מ&quot;ל מומס בתמיסת חיץ פוספט סטרילי [PBS]). להפיץ את הטיפות כדי שcoverslips לא לגעת כאשר הניח על גבי הטיפות הללו. מניח בעדינות כל coverslip מיובש על אגל באמצעות מלקחיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השאר את coverslips על הטיפות למשך כ. 4-6 שעות בתוך מכסה המנוע התרבות עם האבנט סגור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את coverslips ECM מצופה (בצד עד מצופה ECM) לכל אחת מהבארות של צלחת 24 גם. לשטוף היטב עם כל PBS 3x סטרילי ולשמור על 4 מעלות צלזיוס עד צורך. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנת תאי גלייה לציפוי על coverslips. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב את התקשורת מתרבויות גליה ולשטוף בעדינות 3x monolayer גליה עם 10 מ&quot;ל של PBS סטרילית. לאחר מכן, להוסיף 8-10 מ&quot;ל פתרון טריפסין-EDTA לT-175, ודגירה של 5-10 דקות ב37 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר רוב monolayer כבר מנותק, להוסיף 20 מ&quot;ל של מדיה מלאהלבקבוק כדי להפסיק trypsinization. לאסוף את המדיה המכילה את התאים מנותקים לתוך צינור חרוטי 50 מ&quot;ל וספין 10 דקות ב XG 300 בטמפרטורת חדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב supernatant מבלי להפריע גלולה, ולאחר מכן מחדש להשעות את התאים ב2 מ&quot;ל של מדיה מלאה טרי בעדינות על ידי pipetting הפתרון באמצעות pipet P1000. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקבוע את מספר התאים באמצעות hemocytometer ולאחר מכן מחדש להשעות תאים בינוניים מלא בצפיפות הרצויה (10 5 תאים / מ&quot;ל לדוגמא). פלייט התאים על coverslips ECM מצופה (למשל 500 μl לבאר כל הצלחת 24 גם). הוסף מדיה שלמה טרי נוספת לכל גם ל3-5 ימים של דגירה על 37 מעלות צלזיוס, או עד שתאים לגדול למפגש החזותי הרצוי. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טיפול בPsychosine. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחדש את psychosine לריכוז המניה (108.3 מ&quot;מ) בsulfoxide דימתיל (DMSO). לדלל מניות זה ב100% EtOH לעשות מניית עובדת שיכולn יתווסף לבאר כל צלחת 24 גם כדי להשיג ריכוז סופי של 10 מיקרומטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעת הוספת psychosine, בעדינות מערבולת צלחת התרבות לערבב psychosine לתקשורת והתרבות. להשלים את psychosine ידי הוספה המקבילה של 10 מיקרומטר בכל יום אחר במשך שבוע אחד. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 7 ימי טיפול psychosine, לאסוף את התקשורת ו500 μl pipet של paraformaldehyde הקר 4% (PFA) לתוך כל אחד. דגירה בטמפרטורת חדר למשך 20 דקות כדי לתקן את התאים. לאחר מכן, לשטוף היטב 3x כל אחד עם PBS ולאחר מכן לשמור על צלחות ב 4 ° C. עד מעובד לimmunocytochemistry (ראה להלן). הערה: תקשורת תרבית תאים ניתן לאסוף להאנזימטית או assay ELISA בשלב זה אם תרצה בכך. </li></ol> .3 Immunocytochemistry (ICC) לדמיין תאי Globoid <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החלף PBS עם חיץ חסימה [+ 0.3% Tween-20 5 +% עזים בסרום נורמלי PBS (NGS)], ודגירת התאים עבור שעה 1 בטמפרטורת חדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בcubate תאים הקבועים בantisera העיקרי נגד איבא-1 [(1: 1,000) בדילול מלא PBS + 0.3% Tween-20 + 2% NGS] במשך שעה לפחות 1 בטמפרטורת חדר, ולאחר מכן לשטוף היטב עם כל דקות 3x PBS 5 / לשטוף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוסיף את נוגדן פלואורסצנטי מצומדות- המשני המתאים כדי לזהות את עיקרי תיוג נוגדן ונגד כתם עם 4 &#39;, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI, 1: 1,000) לזהות גרעינים. דגירה בפתרון נוגדנים משני עבור שעה 1 בטמפרטורת חדר ולשטוף עם דקות 3x PBS 5. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הר כל coverglass לשקופיות מיקרוסקופ באמצעות הרכבה בינונית. צפה בשקופיות במיקרוסקופ פלואורסצנטי עבור ניתוחים חזותיים וכמותית. </li></ol> .4 ניתוח ואפיון של תאי Globoid בתרבות ראשית <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בשלושה הקריטריונים מורפולוגיים הבאים כדי לזהות תא globoid בתרבות: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לזהות תאי globoid באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי על ידי תיוג immunopositive עבור סמן microglial, + איבא-1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זההתאי globoid כ( כלומר שתיים או יותר גרעינים חיוביים DAPI המכילים) polynucleated. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לזהות תאי globoid ידי מורפולוגיה מעוגלת להבדיל מההופעה מסועפת מאוד של מנוחה תאי microglial. הערה: תאים יכולים להיות גם שנאסף לצורך ניתוח סמן פני תא וכימות על ידי cytometry זרימה מתרבויות אלה. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדידת הפעלת phagocytic של מיקרוגליה ותאי globoid <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להעריך את פעילות phagocytic של מיקרוגליה טופל psychosine, להוסיף חרוזים לטקס FITC שכותרתו לבארות בהתאם להוראות היצרן. להוסיף חרוזים לטקס ניאון מצומדות- 48 שעות לפני קיבוע עם PFA. תקן תאים שטופלו בחרוזים (כאמור בסעיף 2.4), ותהליך לimmunocytochemistry (כאמור בסעיף 3). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר נוגדנים משני fluorophore מצומדות-, כך שהם אינם חופפים ספקטרום פליטת הניאון של חרוזים fluorophore שכותרתו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Analyzדואר פרופילי phagocytotic של איבא-1 + מיקרוגליה על ידי זיהוי אותם התאים שישתפו למקם עם חרוזים fluorescently שהכותרת. הערה: Psychosine יפעיל מיקרוגליה. חרוזים phagocytosed יזוהו בתוך איבא-1 תאים + mononucleated וmultinucleated בהגדרת התרבות זו. </li></ol></li></ol> .5 אינדוקציה של תאי Globoid מתרבויות מזוקקים microglial הערה: גישה חלופית לפענח איתות בין תאית בין astrocyte ומיקרוגליה היא יתרון נוסף של במבחנה globoid מודל זה תא. טיהור של תאי microglial העיקריים לreplating או שיתוף culturing יכולה להיות מושגת על ידי רכוש הדבקות הנמוך שלהם בתרבות, כפי שמתוארת בשלבים הבאים (ראה סעיף 5.2). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף את התקשורת מתרבויות גליה מעורבות ומחוברות לצינור חרוטי 50 מ&quot;ל ולתחזק אותו על 37 מעלות צלזיוס בחממה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בידוד microglial מתרבויות גליה מעורבות ראשית.<ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הסרת התקשורת מבקבוק T175 מחוברות מעורבת תרבות גליה, להוסיף מדיה רועדת חמה [בהיקף של מדיה מלאה + 25 מ&quot;מ 4 החומצה (2-Hydroxyethyl) -1-piperazineethanesulfonic (HEPES) + 25 סודיום ביקרבונט מ&quot;מ (Sigma)]. לנער את צלוחיות ל3-4 שעות בייקר מסלולית ב100 סל&quot;ד (37 מעלות צלזיוס). לאסוף את המדיה מצלוחיות מזועזעות אלה לתוך 50 צינורות חרוטי מ&quot;ל. הערה: תקשורת זה תכלול מיקרוגלים פחות חסיד מהצלוחיות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספין התקשורתי XG 300 10 דקות בטמפרטורת חדר. לשאוב supernatant ולאחר מכן מחדש להשעות את התאים ב2 מ&quot;ל של תקשורת מיזוג astrocyte (שנאסף בשלב 5.1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להקים את מספר התאים שנרכש באמצעות hemocytometer ולאחר מכן צלחת תאי microglial על coverslips מצופה מצע (ראה סעיף 2.1) לimmunocytochemistry, או צלחת על גבי צלחות גם דבקות ultralow לאוסף עתידי של תאי globoid לתרבות משותפת עם סוגי תאים אחרים, כגון oligodendrocytes (כיורדribed בסעיף הבא). הערה: ברגע שמצופית המיקרוגלים יכולים להיות מטופלים עם psychosine (10 מיקרומטר) כפי שתואר לעיל (ראה סעיף 2.3). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שיתוף תרבות עם ראשוני Oligodendrocytes לניתוח רעיל. הערה: אוסף של מיקרוגליה טופל psychosine מצלחות ההיענות הנמוכה לתרבות משותפת שלאחר מכן על תרבויות עיקריות של oligodendrocytes, או תאי אב oligodendrocyte, יכולה לשמש כדי לבחון את התפקוד ציטוטוקסיות הפוטנציאל של תאים דמויי globoid אלה במבחנה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפתח תרבויות של oligodendrocytes העיקרית בשיטות הוקמו 18,20. כדי לאסוף את מיקרוגליה טופל psychosine, בעדינות pipet לנתק את התאים חסיד רופף מהחלק התחתון של הבארות. לאסוף את התאים, צנטריפוגות ב XG 300 10 דקות, ולאחר מכן resuspend בזהירות בתקשורת בידול oligodendrocyte [מורכבת מתקשורת Neurobasal, L-גלוטמין (1x), B-27 תוספת (1x), וtriiodothyronine (T3, 10 ng / ml )]. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לספור את מספר התאים באמצעות hemocytometer ולאחר מכן זרע מיקרוגליה על תרבות oligodendrocyte ב1 x 10 5 תאים / מ&quot;ל, וכתוצאה מכך 1 משוער: 2 מיקרוגליה / יחס oligodendrocyte. דגירה כשיתוף תרבות לתקופה של עד 3 ימים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תקן את התאים לimmunocytochemistry (ראה סעיף 2.4). אסוף תקשורת תרבית תאים לELISA או בדיקות כימיות לפי צורך. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Rafi, M. A., Luzi, P., Chen, Y. Q., Wenger, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+large+deletion+together+with+a+point+mutation+in+the+GALC+gene+is+a+common+mutant+allele+in+patients+with+infantile+Krabbe+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mol+Genet%22%5BJournal%5D)">A large deletion together with a point mutation in the GALC gene is a common mutant allele in patients with infantile Krabbe disease.</a> Hum Mol Genet. 4, 1285-1289 (1995).</li>
<li>Duffner, P. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+long-term+outcomes+of+presymptomatic+infants+transplanted+for+Krabbe+disease%3A+report+of+the+workshop+held+on+July+11+and+12%5BTitle%5D)+AND+%22Genet+Med%22%5BJournal%5D)">The long-term outcomes of presymptomatic infants transplanted for Krabbe disease: report of the workshop held on July 11 and 12.</a> Genet Med. 11, Holiday Valley, New York. 450-454 (2008).</li>
<li>Duffner, P. K., Jalal, K., Carter, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Hunter%27s+Hope+Krabbe+family+database%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatr+Neurol%22%5BJournal%5D)">The Hunter's Hope Krabbe family database.</a> Pediatr Neurol. 40, 13-18 (2009).</li>
<li>Duffner, P. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Newborn+screening+for+Krabbe+disease%3A+the+New+York+State+model%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatr+Neurol%22%5BJournal%5D)">Newborn screening for Krabbe disease: the New York State model.</a> Pediatr Neurol. 40, 245-252 (2009).</li>
<li>Krabbe, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+familial%2C+infantile+form+of+brain+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">A new familial, infantile form of brain sclerosis.</a> Brain. 39, 74-114 (1916).</li>
<li>Percy, A. K., Odrezin, G. T., Knowles, P. D., Rouah, E., Armstrong, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Globoid+cell+leukodystrophy%3A+comparison+of+neuropathology+with+magnetic+resonance+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathol%22%5BJournal%5D)">Globoid cell leukodystrophy: comparison of neuropathology with magnetic resonance imaging.</a> Acta Neuropathol. 88, 26-32 (1994).</li>
<li>Itoh, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunohistological+study+of+globoid+cell+leukodystrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Dev%22%5BJournal%5D)">Immunohistological study of globoid cell leukodystrophy.</a> Brain Dev. 24, 284-290 (2002).</li>
<li>Reddy, A. S., Patel, J. R., Vogler, C., Klein, R. S., Sands, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Central+nervous+system+pathology+progresses+independently+of+KC+and+CXCR2+in+globoid-cell+leukodystrophy%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Central nervous system pathology progresses independently of KC and CXCR2 in globoid-cell leukodystrophy.</a> PLoS One. 8, (2013).</li>
<li>McNally, A. K., Anderson, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+fusion+and+multinucleated+giant+cells+of+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Exp+Med+Biol%22%5BJournal%5D)">Macrophage fusion and multinucleated giant cells of inflammation.</a> Adv Exp Med Biol. 713, 97-111 (2011).</li>
<li>Kaneko, Y., Kitamoto, T., Tateishi, J., Yamaguchi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ferritin+immunohistochemistry+as+a+marker+for+microglia%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathol%22%5BJournal%5D)">Ferritin immunohistochemistry as a marker for microglia.</a> Acta Neuropathol. 79, 129-136 (1989).</li>
<li>Graeber, M. B., Streit, W. J., Kreutzberg, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+microglial+cytoskeleton%3A+vimentin+is+localized+within+activated+cells+in+situ%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurocytol%22%5BJournal%5D)">The microglial cytoskeleton: vimentin is localized within activated cells in situ.</a> J Neurocytol. 17, 573-580 (1988).</li>
<li>Kondo, Y., Adams, J. M., Vanier, M. T., Duncan, I. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophages+counteract+demyelination+in+a+mouse+model+of+globoid+cell+leukodystrophy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Macrophages counteract demyelination in a mouse model of globoid cell leukodystrophy.</a> J Neurosci. 31, 3610-3624 (2011).</li>
<li>Pollanen, M. S., Brody, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fetal+globoid+cell+leukodystrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Pathol+Lab+Med%22%5BJournal%5D)">Fetal globoid cell leukodystrophy.</a> Arch Pathol Lab Med. 114, 213-216 (1990).</li>
<li>Martin, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fetal+Krabbe+leukodystrophy.+A+morphologic+study+of+two+cases%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathol%22%5BJournal%5D)">Fetal Krabbe leukodystrophy. A morphologic study of two cases.</a> Acta Neuropathol. 53, 87-91 (1981).</li>
<li>Ijichi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MMP-3+mediates+psychosine-induced+globoid+cell+formation%3A+Implications+for+leukodystrophy+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">MMP-3 mediates psychosine-induced globoid cell formation: Implications for leukodystrophy pathology.</a> Glia. , (2013).</li>
<li>Pellegatta, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+therapeutic+potential+of+neural+stem%2Fprogenitor+cells+in+murine+globoid+cell+leukodystrophy+is+conditioned+by+macrophage%2Fmicroglia+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol+Dis%22%5BJournal%5D)">The therapeutic potential of neural stem/progenitor cells in murine globoid cell leukodystrophy is conditioned by macrophage/microglia activation.</a> Neurobiol Dis. 21, 314-323 (2006).</li>
<li>Crocker, S. J., Milner, R., Pham-Mitchell, N., Campbell, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+and+agonist-specific+regulation+of+genes+for+matrix+metalloproteinases+and+their+tissue+inhibitors+by+primary+glial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurochemistry%22%5BJournal%5D)">Cell and agonist-specific regulation of genes for matrix metalloproteinases and their tissue inhibitors by primary glial cells.</a> Journal of Neurochemistry. 98, 812-823 (2006).</li>
<li>Schildge, S., Bohrer, C., Beck, K., Schachtrup, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+culture+of+mouse+cortical+astrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation and culture of mouse cortical astrocytes.</a> J Vis Exp. , (2013).</li>
<li>Crocker, S. J., Frausto, R. F., Whitton, J. L., Milner, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+method+to+establish+microglia-free+astrocyte+cultures%3A+comparison+of+matrix+metalloproteinase+expression+profiles+in+pure+cultures+of+astrocytes+and+microglia%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">A novel method to establish microglia-free astrocyte cultures: comparison of matrix metalloproteinase expression profiles in pure cultures of astrocytes and microglia.</a> Glia. 56, 1187-1198 (2008).</li>
<li>Moore, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astrocytic+Tissue+Inhibitor+of+Metalloproteinase-1+%28TIMP-1%29+Promotes+Oligodendrocyte+Differentiation+and+Enhances+CNS+Myelination%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Astrocytic Tissue Inhibitor of Metalloproteinase-1 (TIMP-1) Promotes Oligodendrocyte Differentiation and Enhances CNS Myelination.</a> J Neurosci. 31, 6247-6254 (2011).</li>
<li>Im, D. S., Heise, C. E., Nguyen, T., O'Dowd, B. F., Lynch, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+molecular+target+of+psychosine+and+its+role+in+globoid+cell+formation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Identification of a molecular target of psychosine and its role in globoid cell formation.</a> J Cell Biol. 153, 429-434 (2001).</li>
</ol>

המחברים מצהירים שאין ניגודי אינטרסים.

הפרוטוקול המתואר במסמך זה מספק מערכת מודל חדשה שבו ללמוד פיתוח ואפיון פונקציונלי של מיקרוגליה מופעלים ותאים globoid. עבודה מוקדמת של אל Im et. באמצעות שורת תאי HEK293 סיפק תבנית לפיתוח הפרוטוקול הנוכחי לחקר תא globoid היווצרות 21. כמו כן, חשוב להצביע על כך שתאי globoid נגזרים במודל שונה מתאי globoid האם של זיהוי בGLD. לדוגמא, יש לנו ציינו באופן שגרתי quadranucleation של מיקרוגליה בתרבויות העכבריות שלנו, בזמן שהתאים globoid בGLD נצפו לעתים קרובות מכילים...

leukodystrophy Globoid התא (GLD), המכונה גם מחלת Krabbe, היא מחלה demyelinating קטלנית כתוצאה מאובדן של מוטציות פונקציה בgalatocerebrosidase הגן (galc) 1. הצורה השכיחה ביותר של GLD היא הגרסה הילדותית המתאפיינת בהתפרצות בילדות מוקדמת ומאופיינת במהלך קליני אגרסיווי של מנוע וירידה קוגניטיבית שמובילה למוות בטרם עת לעתים קרובות לפני חמש שנים בגיל 2,3. בדיקות גנטיות משמשות לאימות אבחנה של 4 GLD. נוירופתולוגיה של GLD חושפת פגיעה במיאלין נפוצה, ניוון עצבי, astrogliosis ונוכחות של מיקרוגליה רב גרעיניים צבה נקרא תאי globoid 5-7. זיהוי של תאי globoid, לעתים קרובות המכיל תכלילים tubulous בהציטופלסמה שלהם, היה תכונה מגדירה של GLD ל97 השנים האחרונות, למרות שהתפקיד הספציפי של תאים הבולטים אלה נותר חמקמק. מעורבותם של הלא myelגליה (מיקרוגליה ואסטרוציטים) inating בפתוגנזה של GLD כבר מזמן נחשבים תגובה משנית לפגיעה במיאלין העמוקה במחלה זו 8. מעניין לציין, כי התיאור הראשון של מחלה זו, שנעשה על ידי Knud Krabbe 1916 5, היווצרות מדווחת של phagocytes multinucleated המכיל פסולת שומנים שכבר בשם &#39;globoid תאים&#39; והוא מאפיין מגדיר של מחלה זו. תאי Globoid הם תכונת סימן ההיכר של פתולוגיה GLD, למרות שהתפקיד שלהם בGLD זכה להתעלמות ארוכה. מעניין, תאים אלה הם בין השינויים האופייניים המוקדמים ברקמת מערכת העצבים המרכזית של GLD. זה חוסר הידע אולי היה בשל ההנחה כי ההיווצרות של phagocytes multinucleated, תאים ענק הנקראים במחלות אחרות, נחשבות בדרך כלל כתוצאה של פתולוגיה ולא כוח פתוגניים ראשוני נהיגה 9. לכן, היו מעט מחקרים החוקרים את המנגנון שבאמצעות WHIתאי globoid ch נוצרים מphagocytes, במיוחד במערכת העצבים המרכזית של GLD. ההליך המתואר בדוח זה מתמקד בחשיבות של היווצרות תאי globoid במערכת העצבים המרכזית וההפגנה הקודמת שלנו שmultinucleation המושרה psychosine של מיקרוגליה במבחנה ותאים אלה הציג רמות גבוהות יותר של פעילות phagocytic. עולה בקנה אחד עם תצפיות אלה, תאי globoid במוח Twitcher לעתים קרובות מכילים פסולת PAS-חיובי, המצביעים על רמות גבוהות של פעילות phagocytic. תאי Globoid גם הם מצאו להיות immunopositive לפריטין (סמן מיקרוגליה) 10, KP-1 / CD68 (סמן מונוציטים), וחלקם גם חיובי עבור vimentin (חלבון ביניים נימה וסמן של האסטרוציטים ומיקרוגליה הופעלו) 11, HLA-DRA (קולטן משטח MHCII), וTNF-α 7, וייבא-1 (חלבון קושר סידן המשמש לזיהוי מיקרוגליה) 12. בהתבסס על אוסף זה של סמנים, תאי globoid מקורן מיקרוגליה המתפתחיםהפנוטיפ ייחודי. למרות הייחוד שלהם, את הפונקציה ותרומתו של GCS לפתוגנזה GLD הספציפיים הוזנחה. תאי Globoid כבר חשבו להיות תוצאה משנית של פגיעה במיאלין הכרונית. עם זאת, המחקרים האחרונים שבחנו את הקשר הזמני של תאי globoid לפתולוגיה בחומר הלבן של GLD זיהו הנוכחות של תאי globoid בסוף העוברי לתקופות לאחר לידה מוקדמת; פעמים הקודמות אפופטוזיס oligodendrocyte ופגיעה במיאלין הגלוי 13. כך, הרצף הזמני של פיתוח בנוירופתולוגיה של GLD מצביע על כך שתאי globoid נוצרים מראש של פגיעה במיאלין במחלה זו 14. זה הוביל להשערה שלנו כי ההיווצרות המוקדמת של תאי globoid בGLD עשויה לייצג אירוע פתוגניים הגדרה ולא תגובה משנית, תגובתי לנזק oligodendrocyte 15. בנוסף, חוסר ויסות של פעילות microglial בGLD כבר נחשב פקטוr הגבלת היעילות ארוך הטווח של טיפולים בתאי גזע hematopeotic לטיפול במחלה זו 16. כך, חוקר את התפקודים התאיים ורגולציה של מיקרוגליה, ותאי globoid, בתגובה לpsychosine צפוי לספק תובנות חדשות בפתוגנזה של GLD. עד לאחרונה, חוסר המודל מתאים שבו תוכל ללמוד היווצרות תא globoid הגביל את ההבנה של התפקיד והתרומה של תאים אלה לפתולוגיה של GLD המדויקים. במחקרים שנעשה לאחרונה, נקבע כי יכולים להיווצר תאי globoid-כמו בתגובה ישירה לpsychosine, רעלן שומנים פתוגניים שמצטבר בGLD. מצאנו מיקרוגליה את זה, אבל לא מקרופאגים, מופעלים ולהפוך לתאי globoid בתרבויות גליה עיקריות בתגובה לpsychosine 15. השינוי הזה לתאי globoid נמצא להיות מתווך על ידי פרוטאז תאי, metalloproteinase מטריקס (MMP) -3 15. לאחרונה, אנוהרחיבו את הממצאים הללו וקבע כי תאי מיקרוגליה וgloboid מופעל psychosine פותחו במבחנת מערכת מודל זה הם בעצמה רעילה לoligodendrocytes ובתאי oligodendrocyte. לפיכך, כאשר נחשבו בהקשר של GLD, ההצטברות המוקדמת של psychosine והיווצרות של תאי globoid לפני הפגיעה במיאלין יתמוך תפקיד עיקרי ואולי פתוגניים המתעוררים למיקרוגליה במחלה זו. אנו מציעים מחקר שהיווצרות תא globoid יחשפו מידע חדש על הפתוגנזה של GLD שיתרום להבנה של מחלה זו שלנו. יתר על כן, מודל הסלולרי החדש של GLD עשוי לספק פורמט חדש שממנו הגישות טיפוליות חדשניות לטיפול בשינויים פתולוגיים במחלה זו יכולים להיבדק. לפיכך, בדוח זה אנו מספקים פרוטוקול מפורט לפיתוח במבחנה של תאי globoid מושרה psychosine מתרבויות עיקריות של גליה myelinating שאינו.

<table><tbody><tr><td>האנק' תמיסת מלח מאוזנת (HBSS) שאינה מכילה קטיונים (Mg2+ ו-Ca2+).</td><td>טכנולוגיות חיים</td><td>14175-095</td><td></td></tr><tr><td>ערכת דיסוציאציה של רקמות עצביות</td><td>Miltenyi</td><td>130-092-628</td><td></td></tr><tr><td>40 & #956; מסננת תאים m</td><td>פישרברנד</td><td>22363547</td><td></td></tr><tr><td>האנק' תמיסת מלח מאוזנת (HBSS) המכילה קטיונים (Mg2+ ו-Ca2+).</td><td>Gibco</td><td>14025-092</td><td></td></tr><tr><td>מדיום הנשר השונה של Dulbecco (DMEM)</td><td>Gibco</td><td>11995-065</td><td></td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי (FBS)</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S11150</td><td></td></tr><tr><td>Penicilin/Streptomycin</td><td>Life technologies</td><td>15070-063</td><td></td></tr><tr><td>Laminin</td><td>Sigma</td><td>L2020</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA</td><td>solution Life technologies</td><td>25299-056</td><td></td></tr><tr><td>פסיכוזין</td><td>סיגמא</td><td>P9256</td><td></td></tr><tr><td>דימתיל סולפוקסיד (DMSO)</td> <td>סיגמא</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>פרפורמלדהיד (PFA)</td> <td>מדע מיקרוסקופיה אלקטרונית</td><td>19208</td><td></td></tr><tr><td>סרום עיזים רגיל (NGS)</td> <td>Invitrogen</td><td>PCN5000</td><td></td></tr><tr><td>Iva-1</td><td>WAKO</td><td>019-19741</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor מצומד antisera</td><td>Life Technologies</td><td>מדיה הרכבה שונות</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Southern Biotech</td><td>OB100-01</td><td></td></tr><tr><td>ערכת בדיקה פגוציטית קיימן</td><td>כימיקלים</td><td>500290</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>BP310-500</td><td></td></tr></tbody></table>

במבחנה דגם לחקר נייד פתופיזיולוגיה בleukodystrophy הסלולרי globoid

An In Vitro Model for the Study of Cellular Pathophysiology in Globoid Cell Leukodystrophy

הפונקציה המדויקת של מיקרוגליה רב גרעיניים, הנקראת תאי globoid, כי הם ייחודיים בשפע במערכת העצבים המרכזית של leukodystrophy תא globoid (GLD) אינה ברורה. פער בידע זה התעכב בשל חוסר מתאים במודל חוץ גופית למחקר. במסמך זה, אנו מתארים מערכת תרבות העיקרית עכברית גליה שבו טיפול עם תוצאות psychosine בmultinucleation של מיקרוגליה הדומים לתאי globoid האופייניים שנמצאו בGLD. שימוש במערכת הרומן הזה, שהגדרנו את התנאים ומצבים של ניתוח למחקר של תאי globoid. פוטנציאל השימוש של מערכת מודל זה קבל תוקף במחקר הקודם שלנו, שזיהה את התפקיד פוטנציאלי לmetalloproteinase מטריקס (MMP) -3 בGLD. רומן במערכת מבחנה זה עשוי להיות מודל שימושי שבו ללמוד את המבנה ותפקוד, אלא גם מניפולציה הטיפולית הפוטנציאלית, של תאים הייחודיים אלה.

פרוטוקול זה, כפי שנכתב, צפוי להימשך כ 36 ימים כדי להשלים מהתחלה ועד הסוף (ראה איור 1: ניסיוני זרימת העבודה Scheme). זה היה הניסיון שלנו כי התפתחותם של תאים 'כמו globoid' במערכת התרבות העיקרית זה היא גם אמינה ושחזור: ההיווצרות של תאי multinucleated בתגובה לpsychosine הוא ציינה באופן עקבי עם 7 ימים של טיפול. צביעת Immunocytochemical של מיקרוגליה באמצעות איבא-1 בשיתוף עם נגד גרעיני כתם יאפשר זיהוי ש...

תאים גלובואידים הם מאפיין פתולוגי מגדיר של מחלת קראב, לויקודיסטרופיה שכיום חסר טיפול יעיל לטווח ארוך. פיתחנו מודל תרבית תאים כדי לחקור את הביולוגיה המולדת והפוטנציאל הפתוגני של מיקרוגליה מופעלת והפיכתם לתאים גלובואידים.

במבחנה דגם לחקר נייד פתופיזיולוגיה בLeukodystrophy הסלולרי Globoid

The precise function of multi-nucleated microglia, called globoid cells, that are uniquely abundant in the central nervous system of globoid cell ...

המטרה הכוללת של הליך זה היא להדגים את הטרנספורמציה הייחודית של מיקרוגליה לתאי GLO בנוכחות הרעלן ציקלין. זה מושג על ידי ציפוי ראשון של החלקות כיסוי עם חלבוני מטריצה חוץ-תאיים. בשלב השני, תאי גליה מצופים על גבי החלקות הכיסוי, ולאחר מכן ניתנים חרוזי ציקלין ולטקס לתרביות.בשלב האחרון, התאים מוכתמים על ידי אימונוכימיה. בסופו של דבר, ניתן להעריך את השפעות הציקלין על הגרעין והיכולת הפגוציטית של תאי המיקרוגליה על ידי מיקרוסקופיה אימונו-פלואורסצנטית. היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות כמו שימוש בשורות תאי מיקרוגליה, הוא שהשימוש בתרביות גליה ראשוניות מחקה את האינטראקציות המשוערות בין אסטרוציטים ומיקרוגליה במוחם של אנשים עם לויקודיסטרופיה של תאים ריקים GLO או GLD המדגים את ההליך יהיה KO Claycomb, סטודנט לתואר שני מהמעבדה שלי.כדי להכין את המטריצה החוץ-תאית או תלושי הכיסוי המצופים ECM, יש להשרות תחילה פתקי כיסוי עגולים עם חומצה הידרוכלורית סטרילית בצלחת פטרי סטרילית. לאחר 30 דקות יש לשטוף את החלקות הכיסוי שלוש פעמים במים סטריליים ולאחר מכן להשרות אותם באתנול 95% למשך 20 דקות לפחות. לאחר שנתנו לכיסוי להחליק באוויר, הוסיפו 150 עד 250 טיפות מיקרוליטר של חומרי ציפוי חלבון ECM מדוללים על יריעת פרפורם המפיצה את הטיפות כך שהחלקות הכיסוי לא יחפפו לאחר המיקום.לאחר מכן, השתמש במלקחיים כדי להניח בעדינות החלקת כיסוי על כל טיפה ולאחר מכן הנח את הפרפורם בתוך מכסה מנוע לתרבית תאים כשהאבנט סגור לאחר ארבע עד שש שעות, הנח את החלקות הכיסוי המצופות ECM כלפי מעלה לבארות בודדות של צלחת 24 בארות. לאחר מכן שטפו כל באר עם PB S3 סטרילי פעמים ואחסנו את החלקות הכיסוי בארבע מעלות צלזיוס. כדי להכין את תאי הגליה לציפוי על החלקות הכיסוי, שאפו את המדיה מתרביות תאי גליה ולאחר מכן שטפו בעדינות את החד-שכבות שלוש פעמים עם 10 מיליליטר PBS סטרילי.נתק את התאים עם שמונה עד 10 מיליליטר של טריפסין EDTA לאחר חמש עד 10 דקות. בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, הוסף 20 מיליליטר של מדיה שלמה לבקבוק כדי לעצור את התגובה. לאחר מכן העבירו את תרחיף התאים לצינור חרוטי של 50 מיליליטר וסובבו את התאים למשך 10 דקות.ב-300 גרם ובטמפרטורת החדר, השתמש ב-P 1000 כדי להשעות בעדינות את החך בשני מיליליטר של מדיה טרייה ושלמה. לאחר הספירה, יש לדלל את התאים לכ-10 פעמים 10 עד 5 תאים למיליליטר. כעת צלחו 500 מיקרוליטר מהתאים על כל אחת מהחלקות הכיסוי המצופות ECM.הוסף מדיה שלמה טרייה נוספת לכל באר ולאחר מכן דגר את הצלחת בחום של 37 מעלות צלזיוס למשך שלושה עד חמישה ימים. לאחר שהתאים הגיעו למפגש הרצוי, הוסיפו ציקלין טרי שהוכן לכל באר וסובבו בעדינות את צלחת התרבית לערבוב. לאחר שבוע של טיפול בציקלין, אספו את המדיה וקבעו את התאים ב-500 מיקרוליטר קור, 4% פרה-פורמלדהיד לבאר בטמפרטורת החדר.לאחר מכן שוטפים כל באר שלוש פעמים עם PBS ומאחסנים את הצלחות בארבע מעלות צלזיוס. כדי לדמיין את תאי ה-GLO על ידי כימיה של ציטו חיסוני, החלף תחילה את ה-PBS במאגר חוסם ודגר את התאים בטמפרטורת החדר. לאחר שעה, דגרו את התאים באנטי-סרום ראשוני כנגד סמן המיקרוגליה IO 1 למשך שעה אחת לפחות בטמפרטורת החדר, ולאחר מכן שטפו כל באר שלוש פעמים ב-PBS למשך חמש דקות.לאחר הדגירה של התאים עם הנוגדן המשני הפלואורסצנטי המתאים, יש לצבוע את התאים ב-DAPI כדי לזהות את הגרעינים. לאחר מכן, לאחר שטיפת התאים כפי שהודגם זה עתה, השתמש במדיום הרכבה כדי להרכיב כל החלקת כיסוי על שקופיות מיקרוסקופ בודדות ולהציג את השקופיות במיקרוסקופ פלואורסצנטי לניתוח חזותי וכמותני. כדי להעריך את הפעילות הפגוציטית של המיקרוגליה שטופלה בציקלין לאחר הטיפול בציקלין, אך לפני הקיבוע, הוסף חרוזי לטקס עם תווית FITC לכל תרבית תאי G OID בהתאם להוראות היצרן וההוראות.לאחר 48 שעות, תקן את התאים ב-PFA כפי שהודגם זה עתה, ולאחר מכן עבד את התאים לאימונוכימיה כפי שהוצג. לבסוף, העריכו את מספר המיקרוגליה החיובית של IBO המתמקמת יחד עם החרוזים המסומנים בפלואורסצנט על ידי מיקרוסקופיה פלואורסצנטית אימונוכימית. צביעה של מיקרוגליה באמצעות IO אחד בשילוב עם כתם נגדי גרעיני מאפשרת זיהוי של תאים מרובי גרעינים מעוגלים גדולים.שימו לב שבמקרים רבים, ההגדלה הגסה של גודל הגרעין משקפת את המצב הרב-גרעיני של תאים אלה כפי שנצפה בתמונה זו, טיפול בציקלין מעורר גם הפעלה כללית של המיקרוגליה הניתנת למדידה על ידי עלייה בפעילות החומצית PHA של המיקרוגליה החד-גרעינית, כמו גם תאי GLO מרובי גרעינים. כפי שנצפה בתמונה מייצגת זו, ניתן לזהות בקלות את הפרופילים הפעילים של PHA Acidly של IBO אחד חיובי במהלך תרבית משותפת עם תאי אב אוליגודנדרוציטים. ההשלכות של טכניקה זו משתרעות על הטיפול ב-GLD שכן היווצרות תאים מרובי גרעינים אלה בתגובה לטיפול בציקלין היא מאפיין מגדיר של הנוירופתולוגיה של GLD ותרומתם של תאים אלה לפתולוגיה זו לא נחקרה בדרך זו בעבר.

an-vitro-model-for-study-cellular-pathophysiology-globoid-cell

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

פרוטוקול זה מתאר את הגזירה של מבשרי מוגבלים גליה מ מיתרי השדרה העובר ומתוחזק במבחנה או להשתלה או למחקר של שושלת oligodendrocytic.

הגזירה של מבשרי מוגבלים גליה מ E13 עכברים

הסרטון מדגים פרוטוקול להבחנה של תאים מקדימים אוליגודנדרוציטים (OPC) לאוליגודנדרוציטים וגרימת מיאלינציה בתרבית משותפת עם נוירונים של גנגליון שורש גבי (DRG). ה-OPCs מומרים עם וקטורים לנטי-ויראליים המקודדים חלבון איתות המווסת את המיאלינציה. ה-OPCs המומרים מתורבתים יחד עם נוירוני DRG כדי להעריך את ההתמיינות לאוליגודנדרוציטים ואת המיאלינציה הנגרמת על ידי חלבון איתות.

בדיקת מיאלינציה הנגרמת על ידי התמרה חוץ גופית עבור תאים מבשרי אוליגודנדרוציטים

כאן, אנו מציגים גישה שיטתית לפיתוח רלוונטי מבחינה פיזיולוגית, רגיש...

בדוגמנות Vivo של הגנום האנושי החולנית באמצעות Danio rerio

אסטרוציטים מסוג פרא פנוטיפי ותאי גזע עצביים שנאספו מעכברים שהונדסו עם אללים אונקוגניים מותנים ומותנים ועברו טרנספורמציה ויראלית יכולים לשמש למודל פתוגנזה של אסטרוציטומה במבחנה ובגוף החי על ידי הזרקה אורתוטופית של תאים שעברו טרנספורמציה למוחם של חברים סינגניים בעלי יכולת חיסונית.

דוגמנות אסטרוציטומה פתוגנזה במבחנה ו בVivo שימוש בקליפת מוח האסטרוציטים או בתאי גזע עצביים מעכברים מותנים, מהונדסים גנטי

כאן אנו מציגים פרוטוקולים המציעים בסיס גמיש ואסטרטגי למניפולציה ויראלית של תאי מבשר אוליגודנדרוציטים כדי לבטא יתר על המידה חלבונים מעניינים על מנת לחקור באופן ספציפי את תפקידם באוליגודנדרוציטים באמצעות מודל מבחנה של מיאלינציה של מערכת העצבים המרכזית.

ייצור ושימוש בLentivirus לתאי סלקטיבי transduce הראשי oligodendrocyte מבשר ל במבחנה מבחני myelination

כדי לטפל במנגנונים של דה-מיאלינציה ואפופטוזיס עצבי בנגעים בקליפת המוח של הפרעות דמיאלינטיות דלקתיות, נעשה שימוש במודלים שונים של בעלי חיים. אנו מתארים כאן גישה ex vivo על ידי שימוש בתאי CD8+ T ספציפיים לאוליגודנדרוציטים על פרוסות מוח, וכתוצאה מכך מוות אוליגודנדרוגליאלי ועצבי. נדונים יישומים ומגבלות פוטנציאליים של המודל.

Ex vivo דגם של התקפת T-Cell-מכוון oligodendrocyte בפרוסות המוח חריף

בפרוטוקול זה, אנו מציגים את ההליכים בהקמת מודלי myoblast myotonic ניוון 1, כוללים תחזוקת תא מותאם C2C12, transfection גן / תמרה, והבחנת myocyte.

דוגמנות Myotonic ניוון 1 בתאים C2C12 myoblast

מטרת טכניקה זו היא להכין תרבות מועשר של ראשי motoneurons (MNs) של חוט השדרה מאתר. כדי להעריך את ההשלכות של מוטציות גורמות למחלות MN, נתאר כאן ניתוקה של אלה מבודדים MNs של תרביות תאים שלהם על-ידי magnetofection.

מידול שארקו-מארי-טות במבחנה על-ידי Transfecting Motoneurons ראשי העכבר

אורגנואידים במוח משמשים כמודל רב ערך למחקרי אנצפלומיופתיה מיטוכונדריאלית, חמצת לקטית ואפיזודות דמויות שבץ (MELAS), מציעים תובנות לגבי הפתופיזיולוגיה הבסיסית שלהם ומספקים פלטפורמה לסינון תרופות. אורגנואידים שמקורם בקווי תאים עם רמות שונות של הטרופלזמיה של גנים גורמי מחלות מציגים הבדלים פנוטיפיים משמעותיים.

מידול מחלות מיטוכונדריאליות באמצעות אורגנואידים במוח: התמקדות באנצפלומיופתיה מיטוכונדריאלית, חמצת לקטית ואפיזודות דמויות שבץ

אטקסיות של פוליגלוטמין ספינוצרבלריות נגרמות על ידי התפשטות CAG המייצרת חלבונים המועדים להצטברות. פרוטוקול זה מתאר ייצור וקטורים, מסירה סטריאוטקסית וניתוח הכללות ואובדן סמנים נוירונים, ומספק פלטפורמה מבוקרת לחקר מנגנונים ולהערכת טיפולים ממוקדים למחלות ניווניות עצביות.

פתולוגיה סטריאטלית שנגרמה על ידי לנטריאלי כמודל פרה-קליני של אטקסיות תפינוצרבלריות פוליגלוטמין

חקור את השתנות המיקרוגליה לתאי גלובואיד במחלת קראבה באמצעות תרביות תאים ראשוניות וטיפול בציקלין. שיטה זו מאפשרת הערכת יכולת הפאגוציטוזה ותובנות לגבי אסטרוציטים ומיקרוגליה.

במבחנה דגם לחקר נייד פתופיזיולוגיה בLeukodystrophy הסלולרי Globoid

גלה סרטונים נוספים