במבחנה דגם לחקר נייד פתופיזיולוגיה בLeukodystrophy הסלולרי Globoid

המטרה הכוללת של הליך זה היא להדגים את הטרנספורמציה הייחודית של מיקרוגליה לתאי GLO בנוכחות הרעלן ציקלין. זה מושג על ידי ציפוי ראשון של החלקות כיסוי עם חלבוני מטריצה חוץ-תאיים. בשלב השני, תאי גליה מצופים על גבי החלקות הכיסוי, ולאחר מכן ניתנים חרוזי ציקלין ולטקס לתרביות.

בשלב האחרון, התאים מוכתמים על ידי אימונוכימיה. בסופו של דבר, ניתן להעריך את השפעות הציקלין על הגרעין והיכולת הפגוציטית של תאי המיקרוגליה על ידי מיקרוסקופיה אימונו-פלואורסצנטית. היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות כמו שימוש בשורות תאי מיקרוגליה, הוא שהשימוש בתרביות גליה ראשוניות מחקה את האינטראקציות המשוערות בין אסטרוציטים ומיקרוגליה במוחם של אנשים עם לויקודיסטרופיה של תאים ריקים GLO או GLD המדגים את ההליך יהיה KO Claycomb, סטודנט לתואר שני מהמעבדה שלי.

כדי להכין את המטריצה החוץ-תאית או תלושי הכיסוי המצופים ECM, יש להשרות תחילה פתקי כיסוי עגולים עם חומצה הידרוכלורית סטרילית בצלחת פטרי סטרילית. לאחר 30 דקות יש לשטוף את החלקות הכיסוי שלוש פעמים במים סטריליים ולאחר מכן להשרות אותם באתנול 95% למשך 20 דקות לפחות. לאחר שנתנו לכיסוי להחליק באוויר, הוסיפו 150 עד 250 טיפות מיקרוליטר של חומרי ציפוי חלבון ECM מדוללים על יריעת פרפורם המפיצה את הטיפות כך שהחלקות הכיסוי לא יחפפו לאחר המיקום.

לאחר מכן, השתמש במלקחיים כדי להניח בעדינות החלקת כיסוי על כל טיפה ולאחר מכן הנח את הפרפורם בתוך מכסה מנוע לתרבית תאים כשהאבנט סגור לאחר ארבע עד שש שעות, הנח את החלקות הכיסוי המצופות ECM כלפי מעלה לבארות בודדות של צלחת 24 בארות. לאחר מכן שטפו כל באר עם PB S3 סטרילי פעמים ואחסנו את החלקות הכיסוי בארבע מעלות צלזיוס. כדי להכין את תאי הגליה לציפוי על החלקות הכיסוי, שאפו את המדיה מתרביות תאי גליה ולאחר מכן שטפו בעדינות את החד-שכבות שלוש פעמים עם 10 מיליליטר PBS סטרילי.

נתק את התאים עם שמונה עד 10 מיליליטר של טריפסין EDTA לאחר חמש עד 10 דקות. בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, הוסף 20 מיליליטר של מדיה שלמה לבקבוק כדי לעצור את התגובה. לאחר מכן העבירו את תרחיף התאים לצינור חרוטי של 50 מיליליטר וסובבו את התאים למשך 10 דקות.

ב-300 גרם ובטמפרטורת החדר, השתמש ב-P 1000 כדי להשעות בעדינות את החך בשני מיליליטר של מדיה טרייה ושלמה. לאחר הספירה, יש לדלל את התאים לכ-10 פעמים 10 עד 5 תאים למיליליטר. כעת צלחו 500 מיקרוליטר מהתאים על כל אחת מהחלקות הכיסוי המצופות ECM.

הוסף מדיה שלמה טרייה נוספת לכל באר ולאחר מכן דגר את הצלחת בחום של 37 מעלות צלזיוס למשך שלושה עד חמישה ימים. לאחר שהתאים הגיעו למפגש הרצוי, הוסיפו ציקלין טרי שהוכן לכל באר וסובבו בעדינות את צלחת התרבית לערבוב. לאחר שבוע של טיפול בציקלין, אספו את המדיה וקבעו את התאים ב-500 מיקרוליטר קור, 4% פרה-פורמלדהיד לבאר בטמפרטורת החדר.

לאחר מכן שוטפים כל באר שלוש פעמים עם PBS ומאחסנים את הצלחות בארבע מעלות צלזיוס. כדי לדמיין את תאי ה-GLO על ידי כימיה של ציטו חיסוני, החלף תחילה את ה-PBS במאגר חוסם ודגר את התאים בטמפרטורת החדר. לאחר שעה, דגרו את התאים באנטי-סרום ראשוני כנגד סמן המיקרוגליה IO 1 למשך שעה אחת לפחות בטמפרטורת החדר, ולאחר מכן שטפו כל באר שלוש פעמים ב-PBS למשך חמש דקות.

לאחר הדגירה של התאים עם הנוגדן המשני הפלואורסצנטי המתאים, יש לצבוע את התאים ב-DAPI כדי לזהות את הגרעינים. לאחר מכן, לאחר שטיפת התאים כפי שהודגם זה עתה, השתמש במדיום הרכבה כדי להרכיב כל החלקת כיסוי על שקופיות מיקרוסקופ בודדות ולהציג את השקופיות במיקרוסקופ פלואורסצנטי לניתוח חזותי וכמותני. כדי להעריך את הפעילות הפגוציטית של המיקרוגליה שטופלה בציקלין לאחר הטיפול בציקלין, אך לפני הקיבוע, הוסף חרוזי לטקס עם תווית FITC לכל תרבית תאי G OID בהתאם להוראות היצרן וההוראות.

לאחר 48 שעות, תקן את התאים ב-PFA כפי שהודגם זה עתה, ולאחר מכן עבד את התאים לאימונוכימיה כפי שהוצג. לבסוף, העריכו את מספר המיקרוגליה החיובית של IBO המתמקמת יחד עם החרוזים המסומנים בפלואורסצנט על ידי מיקרוסקופיה פלואורסצנטית אימונוכימית. צביעה של מיקרוגליה באמצעות IO אחד בשילוב עם כתם נגדי גרעיני מאפשרת זיהוי של תאים מרובי גרעינים מעוגלים גדולים.

שימו לב שבמקרים רבים, ההגדלה הגסה של גודל הגרעין משקפת את המצב הרב-גרעיני של תאים אלה כפי שנצפה בתמונה זו, טיפול בציקלין מעורר גם הפעלה כללית של המיקרוגליה הניתנת למדידה על ידי עלייה בפעילות החומצית PHA של המיקרוגליה החד-גרעינית, כמו גם תאי GLO מרובי גרעינים. כפי שנצפה בתמונה מייצגת זו, ניתן לזהות בקלות את הפרופילים הפעילים של PHA Acidly של IBO אחד חיובי במהלך תרבית משותפת עם תאי אב אוליגודנדרוציטים. ההשלכות של טכניקה זו משתרעות על הטיפול ב-GLD שכן היווצרות תאים מרובי גרעינים אלה בתגובה לטיפול בציקלין היא מאפיין מגדיר של הנוירופתולוגיה של GLD ותרומתם של תאים אלה לפתולוגיה זו לא נחקרה בדרך זו בעבר.