אוסף, בידוד, וניתוח תזרים cytometric של דוגמאות האנדוצרוויקאלית אדם

המטרה הכוללת של הליך זה היא לבודד תאים חד-גרעיניים צוואריים מגירוד אנדו-צווארי באמצעות מברשת ציטו. לאחר הבידוד, ניתן להשתמש בתאים אלה בבדיקות מרובות, כולל ציטומטריית זרימה, שבה ניתן לקבוע את הפנוטיפ והתפקוד של תאי החיסון בדרכי המין הנשיות. איסוף דגימות מברשת ציטו ושטיפת צוואר הרחם הוא הליך לא פולשני שחייב להתבצע על ידי רופא נשים או רופא מיומן.

שטיפת הנרתיק של צוואר הרחם מבוצעת תחילה כאשר האנדו-צוואר הרחם נשטף עם שתי טחנות של PBS, אשר נאסף לאחר מכן מהפורניקס האחורי לאחר השטיפה. הקצה הקעור של מגרד צוואר הרחם מונח כנגד צוואר הרחם ומסובב כדי לדגום את פתח צוואר הרחם או את צוואר הרחם. לאחר מכן, מברשת ה-cyto מוכנסת למערכת ההפעלה האנדו-צווארית ומסובבת 360 מעלות.

השימוש בלחץ עדין יעזור להבטיח שלא יהיה זיהום דם של הדגימה. מברשת הציטו במגרד נאספת לתוך צינור המכיל חמישה מילים של PBS. לאחר שהועברה על קרח, הדגימה עוברת במהירות מערבולת כדי לנתק את התאים ממברשת הציטו.

לאחר ששטפת את הדגימות במדיה, הן מסוננות דרך מסנן ניילון של מאה מיקרון. זה מאפשר איסוף של הלימפוציטים, המונוציטים ותאי האפיתל מהדגימה. התאים מוכנים כעת לצביעה בנוגדנים כנגד חלבונים על פני השטח, ולאחר שהם תוקנו, ניתן להפעיל אותם על ציטומטר הזרימה.

אנו נראה לך כיצד אנו מנתחים את הנתונים המתקבלים כדי להעריך את הפנוטיפ של אוכלוסיות תאי ה-T CD 4 ו-CD 8 הקיימות בצוואר הרחם. היי, אני דוקטורנט במעבדה של ד"ר קית'. המחקר שלנו מתמקד בקשר בין הפעלה חיסונית ורגישות ל-HIV כמו גם התקדמות המחלה.

מכיוון שרוב מקרי ההידבקות ב-HIV מתרחשים כיום באמצעות יחסי מין הטרוסקסואליים, אנו מעוניינים גם לקבוע את המתאמים בין ההגנה להעברת HIV למערכת המין הנשית. למרבה הצער, איסוף דגימות ממערכת המין יכול להיות מאתגר מאוד כמו גם פולשני למדי עבור משתתפי המחקר. השימוש במברשות ציטו לאיסוף CMCs או תאים חד-גרעיניים בצוואר הרחם הוא שיטה מהירה וקלה יותר בהשוואה לפרוטוקולים אחרים כגון ביופסיות.

בסרטון זה, נראה לך כיצד לבודד ולהכין CMCs לשימוש בזרימה ציטומטרית או יישומים אחרים במורד הזרם. לאחר האיסוף, מברשת הציטו והמגרד מועברים בחמישה מיל של PBS קר. חשוב להעביר את הדגימות על קרח עד למועד העיבוד, שאמור להיות לא יותר משעתיים לאחר איסוף הדגימה.

יש להוציא כל דגימות מזוהמות בעקבות דם בנקודת זמן זו מניתוח נוסף כדי לנתק את התאים ממברשת הציטו. מערבול את הצינור גבוה למשך 45 שניות מכיוון שתאים עדיין יישארו על מברשת הציטו והמגרד. יש להסיר אותם ידנית.

לבש זוג כפפות טריות והשתמש במברשת הציטו כדי לגרד את כל החומר שנותר מהמגרד. לאחר השלכה לתמיסת אקונומיקה, השתמש באגודל ובאצבע המורה כדי להסיר את כל התאים הנותרים ממברשת הציטו על ידי לחיצה למעלה ולמטה על צינור הבז. לאחר השלכת מברשת הציטו, החלף את הכפפות לפני הכנת דגימה נוספת, השתמש בפיפטה להעברה כדי לשטוף את דפנות הצינור עם PBS כדי להבטיח שכל הדגימה נאספת.

התאימו ניילון של מאה מיקרון. סנן מעל צינור פלקון טרי והשתמש בפיפטה כדי לסנן את כל נפח תמיסת PBS. הוסף חמישה מיל של מדיית RPMI חסרת FBS לצינור המקורי.

השתמש בפיפטה כדי לשטוף היטב את דפנות הצינור על מנת להסיר ריר או פסולת דביקים. לאחר מכן העבר את המדיה דרך המסנן. השתמש בחלק מהמדיה המסוננת כדי לשטוף את תחתית המסנן לפני השלכתו לאקונומיקה.

לגלול את התאים המבודדים. צנטריפוגה את הדגימות למשך 10 דקות בשעה 1500 סל"ד כדי למנוע את עקירת הגלולה. זכור לכבות את בלם הצנטריפוגה אם התאים ישמשו לציטומטריית זרימה.

הכן את תמיסת החסימה הנדרשת למניעת קשירת נוגדנים לא ספציפיים. במהלך שלב הצנטריפוגה, השתמש ב-100 מיקרוליטר של תמיסת חסימה לכל דגימה. תמיסת החסימה מכילה 93.2 מיקרוליטר פקס, כביסה או PBS בתוספת 2% FBS חמישה מיקרוליטר FBS ו-1.8 מיקרוליטר IgG של עכבר.

לאחר הסיבוב, לרוב הדגימות עם תאים ברי קיימא תהיה גלולה גלויה. במקרים מסוימים, הגלולה תהיה די גדולה. בעוד שבדגימות אחרות זה עשוי להיות בקושי נראה.

גודל הגלולה לא תמיד קשור לתפוקת התאים. בזהירות כדי להקל על הסופרנטנט ולהבטיח שלא תפריע לתאים, השהה את הגלולה על ידי תסיסה עדינה. שוטפים את התאים עם חמישה מילים של PBS וחוזרים על הצנטריפוגה למשך 10 דקות בשעה 1500.

RRP M עם ההפסקה, שוב, שפכו את הסופרנטנט והשעו את הכדור כמו קודם. בשלב זה, התאים מוכנים לשימור בהקפאה או לצביעה על פני השטח לפני הצביעה עם נוגדנים פלואורסצנטיים, כדאי לחסום קשירה לא ספציפית על ידי דגירה של תאים עם תמיסת חסימה שהוכנה במהלך צנטריפוגה מוקדמת יותר. לאחר השעיית גלולת התא, הוסיפו לדגימה מאה מיקרוליטר של תמיסת חסימה וערבבו היטב.

ניתן לבצע את שלבי הפרוטוקול הנותרים בצלחת 96 באר או בשפופרת פקס. תלוי בגודל גלולת ה- CMC. העבירו את תמיסת החסימה ותערובת התאים לצינור פקס.

דגרו את הדגימה למשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס. במהלך הדגירה של 10 דקות, הכינו את צבע הכדאיות שישמש להבחנה בין תאים חיים ומתים. במהלך ניתוח הנתונים, הכן את צבע הכדאיות בהתאם ליצרן וטיטראט מראש כנדרש.

הקפידו לשמור על תערובת הצבע מכוסה מאור עד שהיא מוכנה לשימוש. לאחר הדגירה של 10 דקות, שטפו את התאים עם 500 מיקרוליטר פקס, שטיפה או PBS עם 2% FBS, ולאחר מכן צנטריפוגה למשך 10 דקות ב-1600 סל"ד. לאחר הסיבוב, יש לשפוך את הסופרנטנט מצינור הפקס.

השעו מחדש את התאים על ידי תסיסה. כעת הוסף את הנפח המתאים של צבע הכדאיות שהוכן בעבר. דגירה של תאים למשך 30 דקות בארבע מעלות צלזיוס מבטיחה שהדגימות יישארו מכוסות מהאור על ידי עטיפה בנייר כסף.

במהלך הדגירה הזו, אתה יכול להכין את תערובת המאסטר של נוגדנים פלואורסצנטיים שישמשו לתיוג התאים. הקפד לבצע טיטרציה מראש ולאמת את הנוגדנים שלך בדגימות בקרת דם היקפיות לפני השימוש בהן ב-CMC. מערבבים את הנוגדנים המצויגים ומביאים לנפח סופי של מאה מיקרוליטר לדגימה.

עם פקס, שטיפה, הגן על כל הנוגדנים מפני האור במהלך שלבים אלה. לאחר הדגירה של 30 דקות, שוב יש לשטוף את הדגימה עם 500 מיקרוליטר פקס, לשטוף, לצנטריפוגה, לשפוך ולהשעות את התאים כמו קודם. כעת הגיע הזמן לדגור על התאים עם 100 מיקרוליטר מקוקטייל הנוגדנים שהוכן במהלך הדגירה הקודמת.

שוב, דגרו את הדגימות למשך 30 דקות בארבע מעלות צלזיוס, וודאו שהן מוגנות מפני האור. ה-CMCs הדגירה מוכנים כעת לשטיפה עם 500 מיקרוליטר PBS בפעם האחרונה. צנטריפוגה את הדגימה ב-1600 סל"ד למשך 10 דקות.

לאחר סילוק והחייאה, יש לדלל את התאים בנפח סופי של 750 מיקרוליטר בתמיסת 1% פרלדהיד. כדי לתקן אותם, חשוב להשעות מחדש את התאים בנפח גדול זה על מנת למנוע סתימת ציטומטר הזרימה. אפילו בנפח זה, צינור הדגימה עשוי להיראות מעונן למדי.

שמור את התאים בחושך בארבע מעלות צלזיוס עד שהם נרכשים בציטומטר הזרימה. בנוסף לדגימת מברשת הציטו, אנו אוספים באופן שגרתי שני מילים של שטיפת PBS מצוואר הרחם והנרתיק. דגימה זו היא צנטריפוגה במהירות של 1400 סל"ד למשך שבע דקות כדי להסיר פסולת תאית מהשטיפה.

לאחר מכן ניתן להקצות ולהקפיא את הסופרנטנט הנותר במינוס 80 מעלות צלזיוס לניתוח עתידי של ריכוז החלבון המסיס. נתונים אלה יכולים להיות שימושיים במיוחד בשילוב עם נתוני פנוטיפ סלולרי המתקבלים על ידי ציטומטריית זרימה. לפני הפעלת דגימת ה-CMC שלך.

כדאי להכין בקרות PBMC כדי לסייע בצינורות פיצוי ריצת שער, באמצעות חרוזים או תאי כתם בודדים על מנת להתאים לחפיפה ספקטרלית. רכוש את כל צינור ה-CMC כדי לאסוף את כל האירועים בהשוואה לדגימות PBMC. CMCs יציגו יותר כפולות בשטח FSC לעומת עלילת גובה וייתכן שלא יציגו אוכלוסיית לימפוציטים מובחנת כמו pbmc.

לאחר רכישת הדוגמאות שלך, ייצא את הקבצים לניתוח בתוכנית כגון FlowJo. כאן נציג את המרכיבים העיקריים של אסטרטגיית שער טיפוסית עבור תאי CD שמקורם ב-CMC ארבעה חיוביים ו-CD שמונה חיוביים. השתמש באזור FSC לעומת תרשים גובה ל-G בסינגלים בדגימה שלך.

בהשוואה מותאמת זו, ניתן לראות בבירור את המספר המוגבר של כפולות במדגם CMC בהשוואה ל-p BMCs. לאחר מכן, התוויית סמן פלואורסצנטי או FSC לעומת זמן משמשת כשלב בקרת איכות. אם שינויים כלשהם בקצב הזרימה הכניסו חפצים לנתונים, ניתן להסיר אותם בשלב זה.

בחלק העליון, ניתן לראות פרופיל פלואורסצנטי עקבי לאורך זמן המעיד על דגימה באיכות גבוהה. להלן תוכלו לראות מדגם עם הפרעות מרובות וקצב זרימה, שניתן לשלול מניתוח נוסף. זיהוי אוכלוסיית הלימפוציטים בדגימות CMC יכול להיות מאתגר.

שימוש בבקרת A-P-B-M-C יסייע במיקום ההליכה. כפי שאתם יכולים לראות, חלק מהדגימות מציגות אוכלוסיות גדולות וברורות בעוד שדגימות אחרות חסרות אוכלוסיות לימפוציטים. בסך הכל, יש לשלול דגימות אלה.

אם כי נתמקד באוכלוסיות לימפוציטים. אפשר גם להדביק מונוציטים על ידי שער על תאים חסרי ביטוי של סמני שושלת. ניתן לזהות תאים המבטאים שילובים של סמני תאים דנדריטיים ומונוציטים כגון CD 16 ו-CD 11 C.הכללת סמן כדאיות או צבע היא חיונית לניתוח CMC גם על תאים טריים.

כפי שאתה יכול לראות, רוב לימפוציטים CMC הם ברי קיימא, אך חלק מהדגימות מכילות תדרים גבוהים של תאים מתים שיש להוציא מהניתוח. תאים מתים עשויים לאכול נוגדנים באופן לא ספציפי ולבלבל את ניתוח הנתונים בתוך הליכת הלימפוציטים. מכתים של תקליטור 3 צריכים להיות חזקים.

שיעור תאי ה-T החיוביים של CD שלושה נמוך ומשתנה יותר מאשר בדגימות PBMC, ולכן חיוני לרכוש את כל דגימת ה-CMC ולמקסם את מספר האירועים שנאספו. ניתן לזהות את אוכלוסיות תאי ה-T החיוביים CD ארבע ו-CD שמונה חיוביים בדיוק כמו בדגימות TBMC. בחלק מדגימות CMC.

היחס בין CD 4 ל-CD 8 נמוך ממה שנצפה בדם היקפי וחלק מהפרטים מציגים אוכלוסיית תאי T שלילית כפולה גדולה. לאחר זיהוי אוכלוסיות תאי T חיוביים CD ארבע ו-CD שמונה חיוביים, ניתן לכמת את הביטוי של סמנים פנוטיפיים רבים. למרות שניתן לזהות ביטוי CD 1 61 ב-CMC, האוכלוסייה הבהירה CD 1 61 הניכרת בדם נעדרת במערכת המין.

באופן דומה, ביטוי של סמני הפעלה כגון CD 69 ו-H-L-A-D-R, כמו גם סמנים כמו CCR five ו-PD one ניתן למדוד באופן אמין בין דגימות CMC ולכמת. השימוש בדגימות מברשת ציטו מאפשר לנו לאפיין הן את הפנוטיפ והן את התפקוד של תאי חיסון ריריים, במיוחד בהקשר של מחלות זיהומיות. לא רק שזה נותן לנו תובנה טובה יותר לגבי המנגנונים המווסתים את האימונולוגיה הרירית והרבייה, וגם מספק את הבסיס לפיתוח מדדים חדשים ליעילות החיסון הרירי