מדידות בזמן אמת של חלבון ממברנה: קולט אינטראקציות שימוש תהודה Plasmon Surface (SPR)

המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא להדגים אינטראקציה של קולטן חלבון באמצעות פלזמה ותהודה על פני השטח. זה מושג על ידי הזרקת יוני הניקל על גבי החומצה האצטית הניטרו או מטריצת NT a. לאחר מכן, אחד החלבונים המכונים ליגנד משותק על שבב החיישן לאחר הזרקה ריקה.

החלבון השני המכונה אנליט מוזרק מעל הליגנד המשותק. על מנת לזהות אינטראקציה בין שני החלבונים, התוצאות מראות ששני החלבונים מקיימים אינטראקציה זמנית בין האנליט המקושר ומתנתק מהליגנד. ניתן לחשב את הזיקה של האינטראקציה על סמך שיעורי הדיסוציאציה והדיסוציאציה הנמדדים של שני החלבונים.

היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות כמו משיכה כלפי מטה או משקעים חיסוניים, הוא שהיא יכולה לזהות אינטראקציה חולפת או נמוכה שלעתים קרובות יש לה השלכות ביולוגיות גדולות. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בביוכימיה כגון האם החלבון המעניין נקשר לחלבון אחר או למולקולה קטנה אחרת, ניתן לקבוע את אופי האינטראקציה ולמדוד את הזיקה. כדי להכין את הדגימה, הסר את כל האגרגטים מהחלבון המטוהר כמתואר בפרוטוקול הטקסט.

הכן את המאגר הפועל וסנן את כל המאגרים ודגימות החלבון באמצעות מסנני נקודת אפס 22 מיקרון. ודא שהמסננים תואמים לחלבון מראש לפני חיבור בקבוק החיץ הפועל לכניסת המשאבה. שמור בצד 10 מיליליטר מהמאגר הפועל בצינור נפרד.

לאחר מכן יש לדלל את הדגימות כנגד המאגר הפועל כדי למנוע אי התאמות של המאגר. ככלל אצבע, לפירוק ליגנד יציב השתמש בריכוזי ליגנד נמוכים עם זריקות ארוכות יותר בזרימה נמוכה בניגוד לריכוזי ליגנד גבוהים עם זריקות קצרות יותר בזרימה גבוהה יש לדלל את מלאי הליגנד המרוכז למאגר רץ לריכוז סופי של כ-20 מיקרוגרם למיליליטר. לבסוף יש לדלל את האנליט לתוך המאגר הפועל לריכוז הרצוי.

עבור מערכת בעלת זיקה לא ידועה, בדוק טווח של ריכוזי אנליטים מ-10 מיקרומולר עד 10 אנו מולארי בדילולים פי עשרה. בהדגמה זו, נעשה שימוש חוזר בשבב מצומד NTA המתאים ללכידת חלבונים עם תג oli histidin. לאחר הוצאת הצ'יפס המאוחסן מהמאגר, יש לשטוף היטב במים מזוקקים כפולים, לייבש בעדינות ולהניח במעטפת המקורית שלו.

כדי לעגן את השבב על מכשיר ה-SPR, פתח את דלת שבב החיישן והנח את השבב במעטפת שלו. סגור את הדלת ולחץ על שבב העגינה. הגדר את טמפרטורת תא השבב ל-25 מעלות צלזיוס.

הגדר את תא הדגימות לשבע מעלות צלזיוס כדי לשמור על יציבות החלבון לאורך כל הניסוי. לאחר הכנת הפתרונות לטעינה והפשטה כמתואר בפרוטוקול הטקסט, יש להניח את מכשיר ה-SPR עם מאגר פועל. לשלב הבא, הגדר את הזרימה ל -50 מיקרוליטר לדקה.

הגדר את נתיבי הזרימה וחיסור ההתייחסות כדי לקבל את התוצאות המתוארות כאן. הגדר את הנתיבים לתא זרימה מספר אחד ותא זרימה מספר שתיים ותא זרימה מספר אחד, מופחת מתא זרימה מספר שתיים, לאחר בחירת מתלה הדגימה המתאים, שמור את קובץ התוצאות לפני תחילת הניסוי כך שהנתונים יישמרו במהלך הריצה. כל ניסוי מורכב ממחזורים.

שמור תיעוד ברור של ההזרקות שבוצעו בכל מחזור והפרד את הליגנדים המעמיסים את הזריקה הריקה של המאגר ואת הזרקת האנליט למחזורים שונים. המחזור הראשון הוא הכנת שבבים וטעינת ניקל. ודא שהזרימה והנתיבים מוגדרים ולאחר מכן הזריק 350 מילי-מולרי EDTA למשך דקה אחת כדי לשטוף את המולקולות הנותרות.

לאחר מכן, הגדר את הזרימה ל -10 מיקרוליטר לדקה. לאחר מכן הזרקו 0.5 מילי-מולרי ניקל כלוריד למשך שתי דקות. כעת שרף השבבים מצופה ביוני ניקל.

המחזור השני הוא קיבוע ליגנד. הגדר את הזרימה ל-15 מיקרוליטר לדקה והגדר את נתיב הזרימה לתא זרימה. מספר שתיים, הזריק ליגנד A עד שתגיע לערכי יחידת תגובה או R ru שהם פי 10 עד 20 מהמשקל המולקולרי של הליגנד.

לדוגמה, טען ליגנד של 50 קילודלטון בין 501,000 רוס. שמור תיעוד של ערך ה-RU שהושג. לאחר מכן הגדר את הזרימה ל-15 מיקרוליטר לדקה ואת נתיב הזרימה לתא הזרימה מספר אחת, הזריק ליגנד בקרה B עד לאותו ערך RU כמו זה של ליגנד a לפקח על החיסור, סנסורי גרהם באינטרנט כדי לעזור לשלוט באורך ההזרקה.

לאחר מכן, הגדר את הזרימה ל-50 מיקרוליטר לדקה ואת נתיב הזרימה לתא זרימה מספר אחד ותא זרימה. מספר שתיים, המשך לשטוף את המערכת למשך חמש עד 20 דקות עד שקו הבסיס מתייצב. המחזור השלישי הוא הזריקה הריקה.

זריקה זו תשמש לחיסור ריק. לכן כלול את כל הרכיבים שיוזרקו עם האנליט למעט האנליט עצמו. אורך ההזרקה יכול להשתנות בהתאם לזמן שלוקח להגיע לשיווי משקל.

הגדר את הזרימה ל-15 מיקרוליטר לדקה והגדר את נתיב הזרימה לתא זרימה מספר אחד ותא זרימה מספר שתיים, ותא זרימה מספר אחד, מופחת מתא הזרימה. מספר שתיים, הכנס את פקודת המשקל למשך 30 שניות כדי להשיג קו בסיס יציב. לאחר מכן הזרקו את המאגר הפועל למשך 13 שניות.

המתן 120 עד 600 שניות כדי להקליט את שלב הניתוק. אורך שלב זה משתנה בהתאם ל-kd. ככל שהדיסוציאציה איטית יותר, כך הצעד הזה צריך להיות ארוך יותר.

המחזור הרביעי הוא הזרקת אנליטים. העתק והדבק את התנאים המדויקים ששימשו במחזור השלישי כך שניתן יהיה להחסיר את שתי הזריקות הללו מאוחר יותר. שנה את מיקום החריץ בארון התקשורת מזה המחזיק את תמיסת הבקרה לזה המכיל את תמיסת האנליט

בחר ריכוז שהוא מעט מעל קבוע דיסוציאציה של שיווי משקל צפוי. אם אין ידע מוקדם זמין, בחר מיקרוטולר אחד כנקודת התחלה טובה. לאחר ביצוע הזרקת המאגר והזרקת האנליט בפעם השנייה, בצע שבבי מחזור שביעי.

הגדר את הזרימה ל-50 מיקרוליטר לדקה, ולאחר מכן הזריק 350 מילי-מולארי EDTA למשך דקה אחת. חזור על שלב זה פעמיים נוספות. אל תשתמש בזריקה אחת של שלוש דקות מכיוון שהדבר עלול לגרום נזק לשבב.

לאחר מכן, יש להזריק 0.25% נתרן dcal סולפט למשך דקה אחת. חזור על שלב זה פעמיים. אל תשתמש בהזרקה אחת של שלוש דקות מכיוון שהדבר עלול לגרום נזק לשבב לאחר העמסת ניקל, הטרנספורטר המעניין משותק על תא זרימה מספר שתיים עד 3, 500 R rus.

לאחר מכן, תוך שימוש באותה זרימה ומשך הזרקה, ליגנד הבקרה מוזרק לתא הזרימה מספר אחת, בתחילה מגיע רק עד 3000 R כדי לוודא שכמויות חלבון דומות משותקות בשני תאי הזרימה. ליגנד הבקרה נטען עוד יותר בהזרקה קצרה יותר תוך ניטור העומס של עד 3,500 RDUs. צורת המדרגות מייצגת את העלייה ההדרגתית במסה בתא הזרימה מספר אחת בכל הזרקה המוצגת כאן היא תא זרימה מספר אחת, מופחת מתא הזרימה.

שנית, חשוב לשנות את משך הזרקת הליגנדים כדי להשיג עומס שווה. לעומת זאת, יש לשמור על משך הזרקת האנליט קבוע עבור כל הריכוזים המשמשים להשגת נתונים כמותיים. מוזרק מגוון של ריכוזי אנליטים.

מוצגות כאן זריקות בריכוזי אנליטים שונים עם אורך הזרקה קבוע. ריכוזי האנליטים השונים מוזרקים בסדר אקראי והגרמים הסנסוריים הריקים הכפולים מיושרים על ציר x לפני הניתוח כדי לגזור את הזיקה וקבוע הקצב. מוחל התאמת דגם.

קבוע דיסוציאציה של שיווי המשקל המחושב עבור אינטראקציית mod BCA הוא בערך שלוש פעמים 10 למינוס שש טוחנת עם KA מהיר למדי ו-KD מהיר לאחר שליטה. ניתן לבצע טכניקה זו תוך מספר שעות לאחר צפייה בסרטון זה. אתה צריך להיות בעל הבנה טובה כיצד לתכנן ולבצע ניסוי SPR באמצעות החלבון המעניין אותך.