Name: מדידות בזמן אמת של חלבון ממברנה: קולט אינטראקציות שימוש תהודה Plasmon Surface (SPR) (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-11-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 35 s
Description: למד כיצד לזהות אינטראקציות חלבון-קולט בזמן אמת באמצעות תהודת פלזמה פנייתית (SPR). שיטה זו מאפשרת מדידת אפיניות קישור ללא סימון וחקר דינמיקת אינטראקציות ביומולקולריות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחקר במעבדת לוינסון נתמך על ידי מענקים מהאקדמיה הלאומית הישראלית למדעים, מכון רפפורט למחקר ביו-רפואי, קרן המחקר Meriuex ומענק מארי קירי לשילוב מחדש בקריירה (OL). EV נתמך על ידי מלגת Fine ועל ידי הפקולטה לרפואה בטכניון. NLL נתמך על ידי מענקים מהאקדמיה הלאומית הישראלית למדעים.

1. לדוגמא חלבון והצפת הכנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדוגמא הכנה: לטהר את החלבונים של עניין ולוודא שכל אגרגטים יוסרו, על ידי הזרקת החלבון לפני הניסוי על עמודת ג&#39;ל סינון או על ידי ultracentrifugation (בדרך כלל 10 דקות ב 100,000 XG הוא מספיק). הערה: למרות הכנות רצויות, טהורות מאוד חלבון אינן חובה. SPR שמש בהצלחה עם purifications פחות מ-מושלם ואפילו עם סך 8,9 תמצית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנת חיץ: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את החיץ של הניסוי (שמכונה &quot;חיץ ריצה&quot;, או RB). לפרוטוקול מתואר כאן, להשתמש 50 מ&quot;מ טריס-HCl pH 7.5, 150 מ&quot;מ NaCl ו 0.05% (w / v) DDM (β-D-maltoside n-Dodecyl). זכור כי הבחירה של הרכב חיץ ניתן לשנות בקלות על פי השיטה למדה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לסנן את כל המאגרים ודגימות חלבון באמצעות 0.22 מיקרומטר מסננים. ודא מראש כי מסנני חלבוניםתואם. באופן כללי, פלטפורמות SPR שווקו לאחרונה להכיל דה-גאסר באונליין; אם זה לא המקרה, דה-גז המאגרים לפני שימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Dialyze הלילה או לדלל את הדגימות נגד RB, כדי למנוע חוסר התאמה חיץ. דיאליזה (או כל שיטה אחרת של חילופי חיץ) מומלצת במיוחד בעת שימוש בכימיקלים של צמיגות גבוהה (למשל, סוכרוז, גליצרול, DMSO). לפני חיבור בקבוק RB לכניסת המשאבה לשמור בצד 10 ​​מיליליטר של RB בצינור נפרד. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל את מניות יגנד מרוכזות לRB לריכוז סופי של ~ 20 מיקרוגרם / מיליליטר. ככלל אצבע, לקיבוע יגנד יציב, להשתמש בריכוזים נמוכים יגנד עם זריקות כבר בזרימה נמוכה, בניגוד לריכוזים גבוהים, תזרים גבוה וזריקות קצרות יותר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל את אנליטי לRB לריכוז הרצוי. בדרך כלל, לבדוק את הטווח של ריכוזים למערכת של זיקה לא ידועה מ10 מיקרומטר עד 10 ננומטר בדילולים של פי עשרה. תמיד להתחילעם הריכוזים הנמוכים הראשון. </li></ol> 2. שבב חיישן <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחירת שבב: השתמש בחומצת nitrilotriacetic (נת&quot;ע) שבב בשילוב מתאים ללכידת חלבונים עם תג אוליגו-היסטידין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש בשבב: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעת השימוש בשבב חדש, לקחת את השבב החוצה מהנדן, לשטוף בעדינות עם מים מזוקקים כפולים (DDW), לייבש את הנוזלים שנותרו בזהירות באמצעות מגבים עדינים, ולוודא שלא לגעת במשטח שכבת זהב. מניחים את השבב בחזרה לנדנה בכיוון הנכון (ההכנסה היא חלק כאשר השבב ממוקם כראוי). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר שימוש חוזר שבב, להוציא את השבב מאוחסן מהחיץ, לשטוף היטב עם DDW ויבש בעדינות כאמור לעיל, והנח לנדנה המקורי. הערה: ההצטברות של זבל חומר שאינו ספציפי על השבב יכולה להשפיע על &quot;הכדאיות&quot; שלה. זה יכול להיות במעקב על ידי השוואת RUS לפני קיבוע יגנד ופוסט הפשטה. למרות מדידות רבות יכולות להיותנעשה שימוש באותו השבב NiNTA, הנושא של אריכות הימים שלו הוא לא &quot;ברור&quot; ומשתנה מאוד בין שבבים שונים. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עגינה שבב: פתח את דלת שבב חיישן ולמקם את השבב בנדנה. בעת שימוש בשבב חדש, המספר הסידורי של קלט השבב לשמור תיעוד שימוש. סגור את הדלת ולחץ על &#39;שבב מזח &quot;. </li></ol> 3. הגדרות טמפרטורה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את טמפרטורת תא שבב 25 ° C (או בטמפרטורת הניסוי המועדפת). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אופציונאלי: להגדיר את תא הדגימות עד 7 מעלות צלזיוס כדי לשמור על החלבונים יציבים לאורך כל הניסוי. </li></ol> 4. פתרונות לטעינה ושלילה הכן את הפתרונות לטעינה וההפשטה הבאים: 0.5 מ&quot;מ NiCl 2 בRB, 350 mM EDTA בRB (להוסיף חומר ניקוי לפתרון EDTA לריכוז סופי כמו בRB), 0.25% SDS בH 2 O, ו -100 מ&quot;מ HCl בH 2 O. בעת שימוש באמבטית מיקרו צנטריפוגותes ולא SPR צינורות מיועדים, אל תשכח לנתק את הכובעים של הצינורות. 5. ראש Instrument SPR עם RB 6. התחל ניו הפעלה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את קצב הזרימה שישמש במהלך הניסוי. כדי להשיג את התוצאות שתוארו כאן להגדיר את הזרימה 50 μl / min. הערה: פרמטר זה יכול להיות שונה במהלך הניסוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את נתיבי הזרימה וחיסור התייחסות. כדי להשיג את התוצאות שתוארו כאן להגדיר את הנתיבים Fc = 1 וFc = 2, Fc חיסור = 2-1. הערה: התכנית תציג בזמן אמת החיסור של שני תאים נמדדו. זכור כי פרמטר זה לא ניתן לשנות במהלך הניסוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר את מדף המדגם המתאים (זה יכול להשפיע על מדגם צריכת הנפח). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור את קובץ התוצאות. </li></ol> 7. מחזורי ניסוי כל ניסוי מורכב ממחזורים, לשמור תיעוד ברור של הזריקות נעשו בeaמחזור ch, ולהפריד בין הטעינה &#39;ligands, ההזרקה ריקה של החיץ, וההזרקה אנליטי למחזורים שונים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טעינת הכנת צ&#39;יפ וניקל: מחזור 1 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ודא את הזרימה והנתיבים נקבעים בהתאם לצעד 6.1 ו -6.2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להזריק 350 mM EDTA ל1 דקות כדי לשטוף את השאריות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זרימה להגדיר עד 10 μl / min. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הזרק 0.5 מ&quot;מ NiCl 2 למשך 2 דקות. הערה: עכשיו שרף השבב מצופה על ידי יוני ניקל. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחזור 2: ligands קיבוע <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זרימת סט 15 μl / min, נתיב הזרימה Fc = 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הזרק יגנד עד שמגיעים ערכי RU כי הם 10-20 קפל של המשקל המולקולרי שלה. לדוגמא, טען יגנד של 50 kDa ל500-1,000 RUS. שמור תיעוד של ערך RU הושג. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זרימת סט 15 μl / min, נתיב הזרימה Fc = 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הזרק יגנד B (שליטה) עד אותו ערך RU לזה של א &#39;יגנד צג sensogram החיסור (Fc = 2-1) על השורה כדי לעזור לשלוט באורך הזרקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זרימת סט 50 μl / min, נתיב הזרימה Fc = 1 וFc = 2, לשטוף את המערכת ל5-20 דקות, עד שהבסיס (Fc = 2-1) מייצב. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחזור 3: הזרקה בלנק. הזרקה זה תשמש לחיסור ריק, ולכן כולל את כל המרכיבים שניתן להזריק עם אנליטי, למעט אנליטי עצמו. הערה: אורך הזרקה יכול להשתנות בהתאם לזמן שנדרש כדי להגיע לשיווי משקל (מישורי אות). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זרימת סט 15 μl / min, נתיב הזרימה Fc = 1 וFc = 2, Fc = 2-1 חיסור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס את הפקודה &quot;לחכות&quot; (להלן כ &#39;לחכות&#39;) במשך 30 שניות (יש בסיס יציב). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הזרק 15 שניות RB. הערה: משך ההזרקה ינוע בין מערכות שונות, בהתאם להקבועים מראש שיווי המשקל הקינטית (בעיקר k). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חכה 120-600 שניות כדי להקליט את שלב הניתוק. הערה: אורכו של שלב זה משתנה בהתאם ל <eמ &#39;&gt; k d: איטי דיסוציאציה עוד צעד זה צריך להיות. למתחמי dissociating איטיים מאוד (ד k &lt;10 -4 שניות -1), לחכות 10-15 דקות ולאחר מכן להמשיך אל פני השטח התחדשות (ראה בהמשך). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחזור 4: הזרקה אנליטי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העתק / דבק התנאים המדויקים המשמשים בהזרקת ההתייחסות (מחזור 3) ולכן שתי זריקות אלה יכולים להיות מופחתים מאוחר יותר. לשנות את המיקום של החריץ במעמד מהאחד מחזיק את פתרון שליטה לאחד שמחזיק את הפתרון אנליטי. בחר ריכוז שהוא מעט מעל D K הצפוי. אם אין ידע מוקדם זמין, לבחור 1 מיקרומטר כנקודת התחלה טובה. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחזור 5: הזרקת מאגר <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחזור חזור על 3. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחזור 6: הזרקה אנליטי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחזור חזור על 4. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחזור 7: צ&#39;יפ לערטל <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זרימה להגדיר עד 50 μl / min. &lt;/ Li&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> להזריק 350 mM EDTA דקות 1. חזור על פעולה זו עוד פעמיים. אל תשתמש בזריקה אחת של 3 דקות כפי שזה עלול לגרום נזק לשבב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להזריק 0.25% SDS 1 דקות. חזור על פעולה זו עוד פעמיים. אל תשתמש בזריקה אחת של 3 דקות כפי שזה עלול לגרום נזק לשבב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם הוא לא הגיע לרמה בסיסית, להזריק 100 מ&quot;מ HCl דקות 1 כצעד הפשטה נוסף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס את הפקודה &quot;לרוץ סוף &#39;שעוברת למצב המתנה. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחסון שבב <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפרד את שבב החיישן ומוציא אותו מהמכשיר זה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח את החיישן החוצה מנדנה, להימנע מנגיעה במשטח, לשטוף עם DDW, ומקום בצינור 50 מיליליטר מכיל RB. חנות ב 4 מעלות צלזיוס. </li></ol></li></ol> 8. ניתוח נתונים באמצעות תוכנה יעודיים להערכה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע את השלבים הבאים כדי לעבד את הנתונים הגולמיים שהושגו על ידי SPR לפני הגזירה של הפרמטרים קינטית. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש בתוכנת ההערכה, פתוחקובץ התוצאות, מחזורים בחרו 3-6 Fc = 2-1 (התייחסות מופחתים נתונים). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> משמרת ציר: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחזורי תצוגה 3-6. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אפס ערך ציר ה- Y של נקודת ההתחלה (זמן ההמתנה 30 שניות הראשוניות בכל מחזור) לכל ארבעת העקומות. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יישר את ציר X- של ארבע עקומות. בחרו תכונות בולטות (לדוגמא, קוצים של תחילת הזרקה או לסיים) כדי ליישר מושלם ארבע עקומות לאורך ציר ה- X. קבע את הזמן של תחילת אנליטי (או חיץ שליטה) לאפס. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חיסור התייחסות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפחת את תגובת רקע על ידי הפחתת עקומה של מחזור 3 מעקום של מחזור 4 ועקומה של מחזור 5 מעקום של מחזור 6. השתמש בפעולת חיסור עקומה שניתן למצוא בציר ה- Y משמרות תפריט. הערה: חשוב לבצע שלב זה כפי שהוא מבטל את כל רכיבים ספציפיים (שאינם קשורים לאנליטי) שאולי השפיעו על מקדם שבירת פני השטח. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור את העקומות מופחתים בtהוא גיליון של הפרויקט תחת שם אחר. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עיין בעקומות אלה כאל &quot;עקומות מופחתים כפליים&quot;: החיסור הראשון הוא החיסור 2-1 מבוצע בשני הזריקות, והשני הוא החיסור של עקומה אחד למשנהו. הערה: התייחסות כפולה כזה היא סטנדרטי בניסויי SPR זהב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כיסוי העקומות מופחתים על ידי ביצוע שינוי ציר כפי שהוסבר קודם לכן. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קביעת קבועי קינטיקה ומתאימה מודל <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביצוע ניסוי הקינטית <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הזרק סדרה של 6-7 ריכוזים אנליטי ליש לי אמין של נתונים לקביעת קבועים קינטית. בחר ריכוזים אנליטי מ10-לקפל מעל לפי 10 מתחת לאומדן K D, בדילולי 2-3 פי. כולל ריכוז &quot;אפס&quot;, מאוחר יותר המשמש לחיסור כפול התייחסות (ראה לעיל). לנהל זריקות בtriplicates ובסדר אקראיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יישרולחסר כל העקומות ביחס לציר Y וציר ה- X לפני שתנסה מודל מתאים. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מתאים מודל <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר תכנית ניתוח מתאימה. הערה: רוב התוכניות מתאימות הזמינות מציעות מספר דגמים שניתן להחיל על הולם ונחישות של קבועים קינטית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ליישם את המודל הפשוט ביותר (אנגמיור) בהנחת 1 הפיכה: אינטראקציה בין 1 אנליטי ויגנד למתאים. אלא אם כן לשכנע את הנתונים זמינים משיטות ניסיוניות אחרות לקיומה של אינטראקציה מורכבת יותר, תמיד להשתמש במודל אנגמיור פשוט. </li></ol></li></ol></li></ol>

<ol><li>Rich, R. L., Myszka, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+surface+plasmon+resonance+biosensor+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Advances in surface plasmon resonance biosensor analysis.</a> Current Opinion in Biotechnology. 11, 54-61 (2000).</li>
<li>Rich, R. L., Myszka, D. G. H. igher-throughput <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((label-free%2C+real-time+molecular+interaction+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">label-free, real-time molecular interaction analysis.</a> Analytical Biochemistry. 361, 1-6 (2007).</li>
<li>Helmerhorst, E., Chandler, D. J., Nussio, M., Mamotte, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+and+label-free+bio-sensing+of+molecular+interactions+by+surface+plasmon+resonance%3A+a+laboratory+medicine+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22The+Clinical+Biochemist+Reviews%22%5BJournal%5D)">Real-time and label-free bio-sensing of molecular interactions by surface plasmon resonance: a laboratory medicine perspective.</a> The Clinical Biochemist Reviews. 33, 161(2012).</li>
<li>Kyo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+MafG+interaction+with+Maf+recognition+element+arrays+by+surface+plasmon+resonance+imaging+technique%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+to+Cells%22%5BJournal%5D)">Evaluation of MafG interaction with Maf recognition element arrays by surface plasmon resonance imaging technique.</a> Genes to Cells. 9, 153-164 (2004).</li>
<li>Katsamba, P. S., Park, S., Laird-Offringa, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetic+studies+of+RNA%E2%80%93protein+interactions+using+surface+plasmon+resonance%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Kinetic studies of RNA–protein interactions using surface plasmon resonance.</a> Methods. 26, 95-104 (2002).</li>
<li>Vigonsky, E., Ovcharenko, E., Lewinson, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+molybdate%2Ftungstate+ABC+transporters+that+interact+very+differently+with+their+substrate+binding+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Two molybdate/tungstate ABC transporters that interact very differently with their substrate binding proteins.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 110, 5440-5445 (2013).</li>
<li>Lewinson, O., Lee, A. T., Locher, K. P., Rees, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+distinct+mechanism+for+the+ABC+transporter+BtuCD-BtuF+revealed+by+the+dynamics+of+complex+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Struct.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">A distinct mechanism for the ABC transporter BtuCD-BtuF revealed by the dynamics of complex formation.</a> Nat. Struct. Mol. Biol. 17, 332-338 (2010).</li>
<li>Kyo, M., Usui-Aoki, K., Koga, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Label-Free+Detection+of+Proteins+in+Crude+Cell+Lysate+with+Antibody+Arrays+by+a+Surface+Plasmon+Resonance+Imaging+Technique%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Label-Free Detection of Proteins in Crude Cell Lysate with Antibody Arrays by a Surface Plasmon Resonance Imaging Technique.</a> Analytical Chemistry. 77, 7115-7121 (2005).</li>
<li>Mori, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+protein+kinase+activities+of+cell+lysates+using+peptide+microarrays+based+on+surface+plasmon+resonance+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Evaluation of protein kinase activities of cell lysates using peptide microarrays based on surface plasmon resonance imaging.</a> Analytical Biochemistry. 375, 223-231 (2008).</li>
<li>Mol, N., Fischer, M. E. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMol%2C+N+%22Surface+Plasmon+Resonance+Vol.+627+Methods+in+Molecular+Biology%22">Surface Plasmon Resonance Vol. 627 Methods in Molecular Biology</a>. Mol, N. J., Fischer, M. J. E. 1, Humana Press. 1-14 (2010).</li>
<li>Van Der Merwe, P. A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aVan+Der+Merwe%2C+PA+%22Surface+plasmon+resonance.+Protein%E2%80%93+ligand+interactions%3A+hydrodynamics+and+calorimetry%22">Surface plasmon resonance. Protein– ligand interactions: hydrodynamics and calorimetry</a>. , Oxford University Press. Oxford. 137-170 (2001).</li>
<li>Lewinson, O., Lee, A. T., Locher, K. P., Rees, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+distinct+mechanism+for+the+ABC+transporter+BtuCD-BtuF+revealed+by+the+dynamics+of+complex+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Struct.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">A distinct mechanism for the ABC transporter BtuCD-BtuF revealed by the dynamics of complex formation.</a> Nat. Struct. Mol. Biol. 17, 332-338 (2010).</li>
</ol>

כל המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

SPR הוא שיטה רגישה מאוד ללמוד אינטראקציות מולקולריות, ולעתים קרובות היא הגישה היחידה שמספקת ניטור של אינטראקציות חולפות (עדיין חשובות) בזמן אמת. דוגמה לכך היא האינטראקציה החולפת המוצגת כאן, שלא ניתן הייתה לזהות בכל דרך אחרת (מבחני נפתחים, מבחני שקיעת יפוזומים 6). יתר על כן, בעוד ששיטות אחרות מוגבלות לשיווי משקל מדידות (אם כמותי או איכותי), SPR הוא אחת הטכניקות רק המודדות גם קינטיקה מראש שיווי המשקל. הר...

אינטראקציות חלבון-חלבון (PPI); ההיווצרות והניתוק של קומפלקסי חלבונים, הם אירועי מפתח בתהליכים ביולוגיים רבים (למשל, שכפול, שעתוק, תרגום, איתות, תקשורת תאי תאים). מחקרים חצי כמותית של PPI לעתים קרובות מתבצעים באמצעות נפתחים או ניסויים חיסוניים ממטרים. עם זאת, בטכניקות אלה (ודומים) מוגבלים בטווח של זיקות שניתן למדוד (מייקרו הנמוך וזיקה גבוהה יותר) בשל צעדי הכביסה כי הם טבועים בטכניקות כאלה. טכניקות &quot;נקודת סיום&quot; כזה לא יכול לזהות אינטראקציות זיקה חולפות או נמוכות, כי הם לעתים קרובות השלכות ביולוגיות גדולות. בנוסף, ההחלטה הזמנית של גישות כגון מוגבלת מאוד, בדרך כלל בסדרי גודל איטי יותר מאשר שיעורי התגובה. SPR מתגבר חסרונות אלה בשל רגישותו והחלטה זמנית מעולה 1,2. SPR הוא שיטה ללא תווית, ובתור שכזואינטראקציה מולקולרית ניתן למדוד (כל עוד ניתן לאתר את שינויי המסה). בנוסף למדד המחירים ליצרן, זה כבר נעשה שימוש נרחב כדי לאפיין חלבון ליגנד, חלבון תרופתי (או מולקולה קטנה), חלבון ה- DNA, ואינטראקציות החלבון-RNA 3-5. תוצאות נרשמות וזממו בזמן אמת, המאפשר שינוי מהיר של תנאי ניסוי ועיצוב ניסיוני גמיש. העיקרון הפיזי מאחורי מכשירים מבוססים SPR הוא הניצול של מערכת אופטית המודדת שינוי של מקדם השבירה על פני השטח החיישן על המסה משתנה 2. אחד מהשותפים באינטראקציה (ליגנד להלן) הוא משותק על גבי שבב מטריצת פולימר והמולקולה השנייה (אנליטי להלן) הוא זרם על פני השטח. אנליטי מחייב ליגנד משנה את המסה על פני השטח השבב. שינוי מסה זו באופן ישיר ויחסי הקשורים לשינויים במדד השבירה של פני השטח. התוצאות נרשמות בזמן אמת ומוצג כיחידות תגובה (RU) כפונקציה של זמן. כגון עלילה נקראת sensogram (למשל, איור 1). מאז SPR עוקב אחרי מסלול הזמן השלם של האינטראקציה, קבועי קצב הקינטית מראש שיווי משקל נגזרים, בנוסף לשיווי משקל זיקות. כפי שיפורט להלן, מראש שיווי משקל התנהגותה של מערכת נתונה מחזיקה הרבה מידע, ומספקת נקודת מבט שונה מאוד משיווי המשקל לבד. ברגע שהמערכת מכוילת, ניסויים הם מהירים מאוד ודורשים רק כמויות קטנות של חומר חלבונים (מיקרוגרם לננוגרם כמויות). איסוף המידע הקינטית המלא של מערכת נתונה ניתן להשיג בימים. הרגישות הגבוהה של SPR מאפשרת מדידות שאינן אפשריים באמצעות כל טכניקה אחרת 6. עם זאת, רגישות גבוהה זה היא &quot;חרב פיפיות&quot; שכן הוא יכול להיות מקור עיקרי לנתונים חיוביים כוזבים. כל גורם המשפיע על המדד רעיוני נרשם וזמם על sensogram. ככזה, apבקרות propriate יש להשתמש כדי לחסל שווא-תוצאות חיוביות, ותמיכה מגישות משלימות מומלצת מאוד. איור 1 מדגים את ההתקדמות של ניסוי SPR באמצעות שבב חיישן מצופה נת&quot;ע. Sensogram בפנל מראה את הזריקה של יוני ניקל על מטריצת נת&quot;ע (נתונים unsubtracted), וBD לוחות להציג את הנתונים לאחר הפחתת האות נגזרת מתא הבקרה השלילי. אדום וחצים כחולים מראים תחילת הזרקה וסופו של דבר, בהתאמה. קיבוע של יגנד על השבב משנה בהדרגה את המסה עד ההזרקה מסתיימת. הרמה היציבה נצפתה לאחר סיום ההזרקה של יגנד משקפת את העמותה היציבה של יגנד אל פני השטח (איור 1, מחזור 2). ברגע שבסיס יציב מושגת חיץ מוזרק מעל ליגנד ותא ההתייחסות (איור 1, מחזור 3) הזרקת .זה משמש כ&#39;ביקורת ריקה &quot;, ויהיהנגרע במהלך ניתוח. על הזריקה, שינויים קלים נרשמים, המשקפים זרימת המונית דרך השבב. לאחר מכן, במחזור נפרד (איור 1 ב, מחזור 4), אנליטי מוזרק; העלייה ההדרגתית בRU מייצגת עמותה של אנליטי ליגנד. אתרי הקישור הופכים בהדרגה הכבושה עד שיגיע לשיווי המשקל. ברגע שההזרקה מסתיימת, ירידה בRUS משקפת ניתוק של המתחם. מsensograms כזה ניתן לגזור קבוע שיעור ריבית לפני שיווי משקל ושיווי המשקל (ראה בהמשך). איור 1 מתאר אינטראקציה בין חולפת יגנד ואנליטי. כאשר האינטראקציה היא יציבה יותר, הירידה ברמת RU היא איטית יותר, המשקף ד k נמוך יותר. במסמך זה, אנו מתארים ניסוי SPR שנועד לאפיין את האינטראקציה בין טרנספורטר קרום (חומר ניקוי solubilized) והשותף הפונקציונלי שלה, מצעו המקור שלה מחייב חלבון 6,7. Mod נבחרמערכת אל היא טרנספורטר קלטת מחייבת ATP (ABC), ModBC-של fulgidus Archeaglobus. מערכת זו נבחרה לתוצאות מאוד לשחזורה, גבוהה יחס אות לרעש, וקלאסי &quot;on / off&quot; שיעורים. בנוסף, מובילי homologues ABC זמינים לשרת בקרות שליליות חשובות. טרנספורטר, ModBC (ליגנד) מופק מקרום שימוש בחומרי ניקוי, מטוהר ומשותק על השבב. שותפו המסיס באינטראקציה, Moda, הוא אנליטי. כיגנד שליטה שלילי, RbsBC טרנספורטר ABC שונה משמש (&quot;ליגנד B&quot;).

<table><tbody><tr><td>Biacore T200</td><td>GE Healthcare</td><td>28-9750-01</td><td></td></tr><tr><td>שבב חיישן NTA&nbsp;</td><td>GE Healthcare</td><td>14100532</td><td></td></tr><tr><td>BIAevaluation</td><td>GE Healthcare</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Biacore T200 תוכנה&nbsp;</td><td>GE Healthcare</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ניקל כלוריד</td><td>Sigma</td><td>N6136</td><td></td></tr><tr><td>נתרן טונגסטאט דיהידראט</td><td>Sigma</td><td>T2629</td><td></td></tr><tr><td>נתרן כלורי&nbsp;</td><td>ביו-לאב בע"מ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>19030591 בסיס טריזמה</td><td>Sigma</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>אתילדיאמין-חומצה טטראצטית דיסודיום מלח דיהידרט (EDTA)</td><td>Sigma</td><td>E5134</td><td></td></tr><tr><td>n-Dodecyl-&beta;-D-Maltopyranoside (DDM)</td><td>Affymetrix</td><td>D310</td><td></td></tr><tr><td>תמיסת נתרן דודציל סולפט&nbsp;</td><td>סיגמא</td><td>05030</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipes KIMTECH</td><td>קימברלי-קלארק</td><td>34120</td><td></td></tr><tr><td>חומצה הידרוכלורית</td><td>GADOT</td><td>7647-01-0</td><td></td></tr><tr><td>ניילון (ניו יורק) מסנן ממברנה</td><td>Sartorius</td><td>25007--47------N</td><td></td></tr><tr><td>ModBC ABC טרנספורטר</td><td>לוינסון מעבדת</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RbsBC ABC טרנספורטר</td><td>לוינסון מעבדה</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ModA מצע קושר חלבון</td> מעבדת <td>לוינסון</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

מדידות בזמן אמת של חלבון ממברנה: קולט אינטראקציות שימוש תהודה plasmon surface (spr)

Real Time Measurements of Membrane Protein:Receptor Interactions Using Surface Plasmon Resonance (SPR)

אינטראקציות חלבון-חלבון הן מרכזיות ברוב התהליכים הפיזיולוגיים, אם לא בכולם, והבנת טבען של אינטראקציות כאלה היא צעד מרכזי במחקר הביולוגי. תהודה פלזמון פני השטח (SPR) היא טכניקת זיהוי רגישה למחקר ללא תוויות של אינטראקציות ביו-מולקולריות בזמן אמת. בניסוי SPR טיפוסי, רכיב אחד (בדרך כלל חלבון, המכונה 'ליגנד') משותק על משטח שבב חיישן, בעוד שהשני (ה'אנליט') חופשי בתמיסה ומוזרק על פני השטח. אסוציאציה ודיסוציאציה של האנליט מהליגנד נמדדים ומשורטטים בזמן אמת על גבי גרף הנקרא סנסוגרמה, ממנו נגזרים נתוני קדם שיווי משקל ושיווי משקל. בהיותו נטול תוויות, צריכת כמויות נמוכות של חומר ומתן נתונים קינטיים טרום-שיווי משקל, הופך לעתים קרובות את SPR לשיטה המועדפת בעת חקר דינמיקה של אינטראקציות חלבון. עם זאת, יש לזכור כי בשל הרגישות הגבוהה של השיטה, יש לנתח בקפידה את הנתונים המתקבלים, ולתמוך בשיטות ביוכימיות אחרות. 
SPR מתאים במיוחד לחקר חלבוני ממברנה מכיוון שהוא צורך כמויות קטנות של חומר מטוהר, ותואם לליפידים וחומרי ניקוי. פרוטוקול זה מתאר ניסוי SPR המאפיין את התכונות הקינטיות של האינטראקציה בין חלבון ממברנה (טרנספורטר ABC) לחלבון מסיס (חלבון קושר הסובסטרט הקוגנטי של הטרנספורטר).

במערכת המתוארת במסמך זה, שבב NiNTA משמש כדי לשתק את טרנספורטר הקרום מתויג 6,7. להיות הומו-דימר, כל טרנספורטר מתויג כפליים, שיפור שלה מחייב את שבב NiNTA. בעקבות טעינת ניקל, יגנד (טרנספורטר של עניין) הוא משותק על Fc = 2, עד ~ 3500 RU (מחזור 2 פרוטוקול, איור 2 א תווית שחורה). ואז, תוך שימוש באותה הזרימה ומשך הזרקה, יגנד B (ליגנד השליטה) מוזרק על Fc = 1, בתחילה להגיע רק עד ~ 3000 RU. כדי לוודא שסכומי חלבון דומים הם משותקים בשני תאי הזרימה; יגנד B נטען עוד, ...

משטח Plasmon תהודה (SPR) היא שיטה ללא תווית לזיהוי אינטראקציות ביו-מולקולרי בזמן אמת. במסמך זה, פרוטוקול לחלבון קרום: ניסוי אינטראקציה קולט מתואר, תוך דיון על היתרונות וחסרונות של השיטה.

מדידות בזמן אמת של חלבון ממברנה: קולט אינטראקציות שימוש תהודה Plasmon Surface (SPR)

Protein-protein interactions are pivotal to most, if not all, physiological processes, and  understanding the nature of such interactions is a central ...

המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא להדגים אינטראקציה של קולטן חלבון באמצעות פלזמה ותהודה על פני השטח. זה מושג על ידי הזרקת יוני הניקל על גבי החומצה האצטית הניטרו או מטריצת NT a. לאחר מכן, אחד החלבונים המכונים ליגנד משותק על שבב החיישן לאחר הזרקה ריקה.החלבון השני המכונה אנליט מוזרק מעל הליגנד המשותק. על מנת לזהות אינטראקציה בין שני החלבונים, התוצאות מראות ששני החלבונים מקיימים אינטראקציה זמנית בין האנליט המקושר ומתנתק מהליגנד. ניתן לחשב את הזיקה של האינטראקציה על סמך שיעורי הדיסוציאציה והדיסוציאציה הנמדדים של שני החלבונים.היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות כמו משיכה כלפי מטה או משקעים חיסוניים, הוא שהיא יכולה לזהות אינטראקציה חולפת או נמוכה שלעתים קרובות יש לה השלכות ביולוגיות גדולות. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בביוכימיה כגון האם החלבון המעניין נקשר לחלבון אחר או למולקולה קטנה אחרת, ניתן לקבוע את אופי האינטראקציה ולמדוד את הזיקה. כדי להכין את הדגימה, הסר את כל האגרגטים מהחלבון המטוהר כמתואר בפרוטוקול הטקסט.הכן את המאגר הפועל וסנן את כל המאגרים ודגימות החלבון באמצעות מסנני נקודת אפס 22 מיקרון. ודא שהמסננים תואמים לחלבון מראש לפני חיבור בקבוק החיץ הפועל לכניסת המשאבה. שמור בצד 10 מיליליטר מהמאגר הפועל בצינור נפרד.לאחר מכן יש לדלל את הדגימות כנגד המאגר הפועל כדי למנוע אי התאמות של המאגר. ככלל אצבע, לפירוק ליגנד יציב השתמש בריכוזי ליגנד נמוכים עם זריקות ארוכות יותר בזרימה נמוכה בניגוד לריכוזי ליגנד גבוהים עם זריקות קצרות יותר בזרימה גבוהה יש לדלל את מלאי הליגנד המרוכז למאגר רץ לריכוז סופי של כ-20 מיקרוגרם למיליליטר. לבסוף יש לדלל את האנליט לתוך המאגר הפועל לריכוז הרצוי.עבור מערכת בעלת זיקה לא ידועה, בדוק טווח של ריכוזי אנליטים מ-10 מיקרומולר עד 10 אנו מולארי בדילולים פי עשרה. בהדגמה זו, נעשה שימוש חוזר בשבב מצומד NTA המתאים ללכידת חלבונים עם תג oli histidin. לאחר הוצאת הצ'יפס המאוחסן מהמאגר, יש לשטוף היטב במים מזוקקים כפולים, לייבש בעדינות ולהניח במעטפת המקורית שלו.כדי לעגן את השבב על מכשיר ה-SPR, פתח את דלת שבב החיישן והנח את השבב במעטפת שלו. סגור את הדלת ולחץ על שבב העגינה. הגדר את טמפרטורת תא השבב ל-25 מעלות צלזיוס.הגדר את תא הדגימות לשבע מעלות צלזיוס כדי לשמור על יציבות החלבון לאורך כל הניסוי. לאחר הכנת הפתרונות לטעינה והפשטה כמתואר בפרוטוקול הטקסט, יש להניח את מכשיר ה-SPR עם מאגר פועל. לשלב הבא, הגדר את הזרימה ל -50 מיקרוליטר לדקה.הגדר את נתיבי הזרימה וחיסור ההתייחסות כדי לקבל את התוצאות המתוארות כאן. הגדר את הנתיבים לתא זרימה מספר אחד ותא זרימה מספר שתיים ותא זרימה מספר אחד, מופחת מתא זרימה מספר שתיים, לאחר בחירת מתלה הדגימה המתאים, שמור את קובץ התוצאות לפני תחילת הניסוי כך שהנתונים יישמרו במהלך הריצה. כל ניסוי מורכב ממחזורים.שמור תיעוד ברור של ההזרקות שבוצעו בכל מחזור והפרד את הליגנדים המעמיסים את הזריקה הריקה של המאגר ואת הזרקת האנליט למחזורים שונים. המחזור הראשון הוא הכנת שבבים וטעינת ניקל. ודא שהזרימה והנתיבים מוגדרים ולאחר מכן הזריק 350 מילי-מולרי EDTA למשך דקה אחת כדי לשטוף את המולקולות הנותרות.לאחר מכן, הגדר את הזרימה ל -10 מיקרוליטר לדקה. לאחר מכן הזרקו 0.5 מילי-מולרי ניקל כלוריד למשך שתי דקות. כעת שרף השבבים מצופה ביוני ניקל.המחזור השני הוא קיבוע ליגנד. הגדר את הזרימה ל-15 מיקרוליטר לדקה והגדר את נתיב הזרימה לתא זרימה. מספר שתיים, הזריק ליגנד A עד שתגיע לערכי יחידת תגובה או R ru שהם פי 10 עד 20 מהמשקל המולקולרי של הליגנד.לדוגמה, טען ליגנד של 50 קילודלטון בין 501,000 רוס. שמור תיעוד של ערך ה-RU שהושג. לאחר מכן הגדר את הזרימה ל-15 מיקרוליטר לדקה ואת נתיב הזרימה לתא הזרימה מספר אחת, הזריק ליגנד בקרה B עד לאותו ערך RU כמו זה של ליגנד a לפקח על החיסור, סנסורי גרהם באינטרנט כדי לעזור לשלוט באורך ההזרקה.לאחר מכן, הגדר את הזרימה ל-50 מיקרוליטר לדקה ואת נתיב הזרימה לתא זרימה מספר אחד ותא זרימה. מספר שתיים, המשך לשטוף את המערכת למשך חמש עד 20 דקות עד שקו הבסיס מתייצב. המחזור השלישי הוא הזריקה הריקה.זריקה זו תשמש לחיסור ריק. לכן כלול את כל הרכיבים שיוזרקו עם האנליט למעט האנליט עצמו. אורך ההזרקה יכול להשתנות בהתאם לזמן שלוקח להגיע לשיווי משקל.הגדר את הזרימה ל-15 מיקרוליטר לדקה והגדר את נתיב הזרימה לתא זרימה מספר אחד ותא זרימה מספר שתיים, ותא זרימה מספר אחד, מופחת מתא הזרימה. מספר שתיים, הכנס את פקודת המשקל למשך 30 שניות כדי להשיג קו בסיס יציב. לאחר מכן הזרקו את המאגר הפועל למשך 13 שניות.המתן 120 עד 600 שניות כדי להקליט את שלב הניתוק. אורך שלב זה משתנה בהתאם ל-kd. ככל שהדיסוציאציה איטית יותר, כך הצעד הזה צריך להיות ארוך יותר.המחזור הרביעי הוא הזרקת אנליטים. העתק והדבק את התנאים המדויקים ששימשו במחזור השלישי כך שניתן יהיה להחסיר את שתי הזריקות הללו מאוחר יותר. שנה את מיקום החריץ בארון התקשורת מזה המחזיק את תמיסת הבקרה לזה המכיל את תמיסת האנליט.בחר ריכוז שהוא מעט מעל קבוע דיסוציאציה של שיווי משקל צפוי. אם אין ידע מוקדם זמין, בחר מיקרוטולר אחד כנקודת התחלה טובה. לאחר ביצוע הזרקת המאגר והזרקת האנליט בפעם השנייה, בצע שבבי מחזור שביעי.הגדר את הזרימה ל-50 מיקרוליטר לדקה, ולאחר מכן הזריק 350 מילי-מולארי EDTA למשך דקה אחת. חזור על שלב זה פעמיים נוספות. אל תשתמש בזריקה אחת של שלוש דקות מכיוון שהדבר עלול לגרום נזק לשבב.לאחר מכן, יש להזריק 0.25% נתרן dcal סולפט למשך דקה אחת. חזור על שלב זה פעמיים. אל תשתמש בהזרקה אחת של שלוש דקות מכיוון שהדבר עלול לגרום נזק לשבב לאחר העמסת ניקל, הטרנספורטר המעניין משותק על תא זרימה מספר שתיים עד 3, 500 R rus.לאחר מכן, תוך שימוש באותה זרימה ומשך הזרקה, ליגנד הבקרה מוזרק לתא הזרימה מספר אחת, בתחילה מגיע רק עד 3000 R כדי לוודא שכמויות חלבון דומות משותקות בשני תאי הזרימה. ליגנד הבקרה נטען עוד יותר בהזרקה קצרה יותר תוך ניטור העומס של עד 3,500 RDUs. צורת המדרגות מייצגת את העלייה ההדרגתית במסה בתא הזרימה מספר אחת בכל הזרקה המוצגת כאן היא תא זרימה מספר אחת, מופחת מתא הזרימה.שנית, חשוב לשנות את משך הזרקת הליגנדים כדי להשיג עומס שווה. לעומת זאת, יש לשמור על משך הזרקת האנליט קבוע עבור כל הריכוזים המשמשים להשגת נתונים כמותיים. מוזרק מגוון של ריכוזי אנליטים.מוצגות כאן זריקות בריכוזי אנליטים שונים עם אורך הזרקה קבוע. ריכוזי האנליטים השונים מוזרקים בסדר אקראי והגרמים הסנסוריים הריקים הכפולים מיושרים על ציר x לפני הניתוח כדי לגזור את הזיקה וקבוע הקצב. מוחל התאמת דגם.קבוע דיסוציאציה של שיווי המשקל המחושב עבור אינטראקציית mod BCA הוא בערך שלוש פעמים 10 למינוס שש טוחנת עם KA מהיר למדי ו-KD מהיר לאחר שליטה. ניתן לבצע טכניקה זו תוך מספר שעות לאחר צפייה בסרטון זה. אתה צריך להיות בעל הבנה טובה כיצד לתכנן ולבצע ניסוי SPR באמצעות החלבון המעניין אותך.

real-time-measurements-membrane-proteinreceptor-interactions-using

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

אנחנו מדגימים סריג בין polydiacetylene מצומדת פולימר (PDA) וfluorophore מחובר אל פני השטח של כף יד ליפוזומים את החישה של ביומולקולות. יפוזומים PDA הכילו גם מולקולות הקולטן על משטחיהם לביומולקולות כדי לשמש כחלליות. אינטראקציות יגנד רצפטור להוביל לשינויים ביעילות סריג בין fluorophore ומחשבי כף היד, שהוא הבסיס של מנגנון החישה.

ניטור בזמן אמת של אינטראקציות יגנד רצפטור עם פלואורסצנטי תהודת העברת אנרגיה

סרטון זה מתאר את טכניקת תהודת פלסמון פני השטח, או SPR, לחקר האינטראקציה בין שתי מולקולות באמצעות שבב חיישן. השינוי בזווית התהודה ובעוצמת האור המוחזר מזוהים כפונקציה של אסוציאציה ודיסוציאציה של שתי מולקולות, וזה מספק מידע על יחסי הגומלין בין שתי המולקולות.

תהודה פלסמונית פני השטח לחקר אינטראקציות ביומולקולריות באמצעות שבב חיישן

סרטון זה מדגים הדמיית תהודה פלסמונית מקומית על פני השטח כדי לזהות הפרשות חלבונים מתא יחיד. באמצעות מערך מיקרופלואידי ושבב ננו-מבנה פלסמוני הקשור לפפטידים, שינויים בעוצמת האור המוחזר בזווית התהודה חושפים אינטראקציות עם חלבונים המופרשים מתא יחיד.

הדמיית תהודה פלסמונית מקומית על פני השטח לאיתור הפרשות חלבונים מתא בודד

פרוטוקול זה מתאר כיצד להשתמש במיקרוסקופ פלואורסצנטי של השתקפות פנימית כוללת כדי לדמיין ולעקוב אחר קולטנים בודדים על פני תאים חיים ובכך לנתח את הניידות הרוחבית של הקולטן, גודל קומפלקסי הקולטנים וכן לדמיין אינטראקציות קולטן-קולטן חולפות. ניתן להרחיב פרוטוקול זה לחלבוני ממברנה אחרים.

רזולוציה גבוהה ניתוח Spatiotemporal של קולטן Dynamics ידי המולקולה בודדת מיקרוסקופ פלואורסצנטי

תקשורת בין-תאית היא קריטית לשליטה בפעילות פיזיולוגית שונות בתוך ומחוץ לתא. מאמר זה מתאר פרוטוקול למדידת טבע מרחב ובזמן של הפרשות תא בודדות. כדי להשיג זאת, גישה רב תחומית המשלבת משמשת nanoplasmonic ללא תווית חישה עם הדמיה תא חי.

טכניקה ללא תווית להדמית החלל-הזמן של פרשות תא בודדת

אינטראקציות של גורמי שעתוק (TFs) עם RNA פולימראז הם בדרך כלל לומדים באמצעות הנפתח assays. אנו מיישמים טכנולוגיה של ביואולייר אינטרפרומטריה (בלי) כדי לאפיין את האינטראקציה של GrgA עם לא RNA פולימראז. בהשוואה למטה מוסר, בלי מזהה בזמן אמת שיוך ודיסוציאציה, מציע רגישות גבוהה יותר, והוא כמותי מאוד.

יישום של ביואולייר אינטרפרומטריה (בלי) ללימוד אינטראקציות חלבונים-חלבונים בתמלול

מאמר זה מציע דור חדש של פלטפורמות אנליטיות רב-פרמטריות עם תפוקה מוגברת לאפיון תת-קבוצות שלפוחית חוץ-תאיות. השיטה מבוססת על שילוב של שיטות חישה ביולוגית מרובות עם אנליזות מטרולוגיות ומורפומכניות על ידי מיקרוסקופ כוח אטומי, יחד עם ספקטרוסקופיית ראמאן, כדי להכשיר מטרות שלפוחיתיות הכלואות על שבב ביולוגי של מיקרו-מערך.

פלטפורמה אנליטית רב-מודאלית על שבב דימות תהודה פלסמון מרובה פני שטח לניתוח תת-קבוצות שלפוחית חוץ-תאית

מחקר זה מציג הליך מפורט לביצוע ניסויים של העברת אנרגיה בתהודה פלואורסצנטית של מולקולה בודדת (smFRET) על קולטנים מצומדים לחלבון G (GPCRs) באמצעות תיוג ספציפי לאתר באמצעות שילוב חומצות אמינו לא טבעיות (UAA). הפרוטוקול מספק מדריך שלב אחר שלב להכנת דגימות smFRET, ניסויים וניתוח נתונים.

הדמיה של הדינמיקה הקונפורמציונית של קולטני ממברנה באמצעות FRET של מולקולה בודדת

במאמר זה אנו מתארים שתי שיטות כמותיות לחקר יחסי הגומלין בין חלבונים לליגנדים של קולטני קרום ויטמין A ואופסין פוטורצפטור עם הליגנדות הפיזיולוגיות שלהם.

מתודולוגיה לחקר אינטראקציות של קולטני קרום ויטמין A וחלבון אופסין עם הליגנדות שלהם ביצירת חלבון רטיניל

במאמר זה אנו מתארים כיצד נקבל סריג עקבות של מולקולות דנ"א בודדות משותקת על משטח באמצעות מיקרוסקופ סריקה אוטומטית confocal.

אוטומטי של המערכת עבור מדידות הקרינה מולקולה בודדת של Surface-משותקת ביומולקולות

למד כיצד לזהות אינטראקציות חלבון-קולט בזמן אמת באמצעות תהודת פלזמה פנייתית (SPR). שיטה זו מאפשרת מדידת אפיניות קישור ללא סימון וחקר דינמיקת אינטראקציות ביומולקולריות.

מדידות בזמן אמת של חלבון ממברנה: קולט אינטראקציות שימוש תהודה Plasmon Surface (SPR)

גלה סרטונים נוספים