מספוט 2DE-ג'ל לתפקוד חלבון: לקח מHS1 בכרוני לימפוציטית לוקמיה

המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא להשתמש בגישה פרוטאומית משולבת כדי לזהות סמנים פרוגנוסטיים פוטנציאליים ו/או מטרות טיפוליות במחלות אנושיות. זה מושג על ידי בידוד תאים לוקמיים ראשוניים מהדם ההיקפי של המטופל, הנושאים פרוגנוזה טובה או רעה, וביטוי הן CD 19 והן CD חמישה סמני שטח לשימוש לניתוח פרוטאומי כשלב שני. ליזטים של תאים לוקמיים נפתרים על ידי אלקטרופורזה דו-ממדית או שני de, וההשוואה של מפות פרוטאומיות מאפשרת זיהוי של כתמים המתבטאים באופן דיפרנציאלי בקרב חולי פרוגנוזה טובה לעומת רעה, אותם ניתן לזהות לאחר מכן על ידי ספקטרומטריית מסה או MS.

לאחר מכן ניתן להשתמש במבחנים שונים על מנת לאמת ולנתח את תפקידם של החלבונים שזוהו בהיסטוריה הטבעית של המחלה. התוצאות מראות כי סטטוס זרחון שונה של HS אחד שזוהה על ידי שני דה ג'לים, מתאם עם התוצאה הקלינית של המטופלים. ההשלכות של טכניקה זו משתרעות על הטיפול בלוקמיה לימפוציטית כרונית מכיוון שהיא יכולה לעזור לזהות חלבון המעורב בהתקדמות המחלה שניתן לנצל כסמן פרוגנוסטי או מטרות טיפוליות המדגימות הליך זה יהיה יחד איתי.

פמלה רצה לטכנאי במעבדה ולפוסט-דוקטורט ממעבדה חיצונית לפני תחילת הליך זה, אסוף דם היקפי בצינורות איסוף דם בוואקטיינר עם נתרן הפרין. מעבירים דם לצינור של 15 מיליליטר ומוסיפים קוקטייל העשרת תאי B אנושיים ב-50 מיקרוליטר למיליליטר דם מלא. לאחר מכן מערבבים היטב ודוגרים במשך 20 דקות בטמפרטורת החדר.

לאחר הדגירה, יש לדלל את הדגימה בנפח שווה של PBS בתוספת 2% ערבוב FBS בעדינות ובזהירות לכסות דם על קריאת הזבוב ולוודא שלא לשבור את הממשק. צנטריפוגה את הדגימה ב -400 פעמים G בטמפרטורת החדר למשך 20 דקות ללא הפסקה. בסיום, שאפו בזהירות את הממשק כדי לשחזר את התאים ולהניח אותם בצינור חדש.

שטפו את התאים פעם אחת עם PBS לאחר צנטריפוגה והסרת סופרנטנט. החייאה. השעו את הכדור בסופרנטנט שנותר על ידי הזזה ידנית של הצינור קדימה ואחורה לאחר הדילול. עם מדיום RPMI מלא, ספור את התאים בשיטת ההדרה הכחולה של Trian.

לאחר מכן, הוסף את הנוגדנים הבאים ל-100 מיקרוליטר של תרחיף התאים המטוהר בשפופרת פקס. דגרו את הדגימה למשך 20 דקות בארבע מעלות צלזיוס בחושך. לאחר שטיפת הדגימה בארבעה מיליליטר PBS, בדוק את הטוהר על ידי ציטומטריית זרימה.

בדוק את אחוז תאי הלוקמיה הלימפוציטית הכרונית או תאי CLL, ש-Coex מבטאים CD 19 ו-CD 5 על פני השטח שלהם. ודא שהתכשירים כמעט נטולי לימפוציטים ומונוציטים NK t על ידי בדיקת אחוז CD 3, CD 14 ו-CD 1656 בחלקה, שאמור להיות קרוב לאפס בשלב זה. מסיס כדורי תאי CLL בנפח סופי של 380 מיקרוליטר של מאגר אלקטרופורזה דו מימדי.

החל מיליגרם אחד מדגימות החלבון על 18 רצועות IPG כדי לבצע מיקוד איזו אלקטרו. לאחר הריצה, יש לאזן את הרצועות בשני מיליליטר של מאגר שיווי משקל, בתוספת 2% של DTT טרי למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר השלכת התמיסה, הוסף שני מיליליטר של מאגר שיווי משקל, בתוספת 2.5%I אוטו אצטמיד.

לאחר מכן דגרו את הדגימה למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר על פלטפורמת נדנדה. לאחר מכן, יבש את הרצועות על נייר מבלי לגעת בג'ל כדי להסיר את התמיסה העודפת. לאחר הייבוש, טען כל רצועה על גבי ג'ל דף SDS בשיפוע של 9 עד 16%.

הוסף נפח קטן של מאגר אלקטרופורזה SDS על גבי הג'ל כדי להקל על העמסת הרצועה. לאחר מכן, אטמו את הג'ל על ידי הוספת כחמישה מיליליטר של תמיסת 0.8% אגר כדי למנוע ציפה של הרצועה. לאחר הרכבת יחידת האלקטרופורזה, מלא אותה במאגר אלקטרופורזה SDS.

לאחר מכן בצע את הריצה ב-60 מיליאמפר לג'ל למשך ארבע שעות, ארבע מעלות צלזיוס, או באמצעות מערכת קירור. לאחר הוצאת הג'ל מהיחידה האלקטרופורטית, הניחו אותו בקופסת הצביעה המתאימה. הכינו כ -200 מיליליטר מכל תמיסה.

הוסף בזהירות כל תמיסה לקופסת הצביעה המכילה את הג'ל. בצע את כל הדגירות על פלטפורמת נדנדה. לאחר הצביעה, הסר את תמיסת העצירה והשאיר את הג'ל בתמיסה של 1% חומצה אצטית עד לרכישה.

לצורך בדיקת הנדידה, החייאת התאים מטוהרים בעבר. ב-RPMI מלא הכינו את תא ה-transwell התחתון על ידי הוספת 600 מיקרוליטר של RPMI שלם עם או בלי הגירויים הספציפיים. כדי למדוד את הנדידה המושרית והספונטנית בהתאמה, הניחו את החדר העליון למעלה ותנו למערכת להתייצב למשך 30 דקות ב-37 מעלות צלזיוס באינקובטור.

בסיום, זרעו 10 עד ששת התאים לכל 200 מיקרוליטר בתא העליון ודגרו על הצלחת למשך ארבע שעות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס בחממה. לאחר הדגירה, הסר את החדר העליון ואסוף את המדיה בתא התחתון. לאחר מכן שטפו את החדר התחתון פעם אחת עם מיליליטר אחד של PBS.

לאחר איסוף ה-PBS בשפופרת, צנטריפוגה את הדגימה למשך חמש דקות ב-300 פעמים G לאחר הסרת סופרנטנט. השעו מחדש את הדגימה ב-500 מיקרוליטר PBS על ידי ציטומטריית זרימה. ספור את מספר התאים שהועברו לאחר דקה אחת של רכישה.

בדוק את מספר התאים בתרשים נקודות דו-ממדי בהתחשב בפיזור הצד של התאים ובמספר האירועים המוצגים בדקה אחת, שהוא המספר שישמש לחישוב. דגימות תאי לוקמיה ראשוניות מבודדות מחולי CLL קובצו לשתי תת-קבוצות עיקריות על סמך המאפיינים הקליניים של כל מטופל ונותחו על ידי שני מסות DE וטרשת נפוצה בתוך סבילות מסה מסוימת. הוקצו לרצפי פפטידים במסד הנתונים ולאחר מכן הורכבו לחלבון שנחשב מזוהה אם הוא עובר ציון הסתברות מסוים.

על ידי ניתוח זה, חלבונים המעורבים בעיקר בפעילות השלד התא ותהליכים מטבוליים זוהו בין חלבונים אלה. שושלת המטופויאטית, חלבון ספציפי לתא או hs. אחד שהזרחון הדיפרנציאלי שלו קשור מאוד למהלך הקליני של המחלה התבטא באופן דיפרנציאלי.

בפרט, חולים הנושאים נקודה אחת חווים תוצאה קלינית גרועה בעוד שלמטופלים עם שתי נקודות יש פרוגנוזה טובה. תאי CLL הנושאים HS אחד כנקודה אחת, נמצאו כבעלי פעילות לקויה של השלד הציטו-שלד במונחים של נדידה, הידבקות ופילמור אקטין בהשוואה ל-HS היפו-זרחני. דוגמאות נקודתיות אחת, שתיים. ובכך מסביר התנהגות קלינית שונה.

לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד להשתמש בפרוטאומיקה כדי לזהות מועמדים ביולוגיים המעורבים בהתקדמות המחלה שיכולים לשמש כסמן פרוגנוסטי ו/או מטרות טיפוליות.