במבחנת הסינתזה של mRNA השתנה לאינדוקציה של ביטוי חלבון בתאים אנושיים

המטרה הכוללת של הליך זה היא סינתזה חוץ גופית של mRNA שונה לאינדוקציה של ביטוי חלבון בתאים. זה מושג על ידי הגברה ראשונה של הכנסת הפלסמיד או רצף ה-DNA המקודד והוספת זנב פולי T של 120 תימידין באמצעות תגובת שרשרת פולימראז. השלב השני הוא שעתוק חוץ גופי של ה-DNA שנוצר ל-mRNA עם זנבות פולי אדנין.

לאחר מכן, ה-DNA של התבנית מוסר על ידי טיפול D'S בתערובת תגובת השעתוק במבחנה. השלב האחרון הוא טיפול בפוספטאז אנטארקטי ב-mRNA המיוצר להסרת חמישה פוספטים ראשוניים. בסופו של דבר, תאים עוברים טרנספטציה על ידי ה-mRNA שנוצר, קומפלקסים של שומנים.

מיקרוסקופיה פלואורסצנטית וניתוח ציטומטריית זרימה משמשים להצגת סינתזה של GFP משופר בתאים. היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות כמו טרנספקט נגיפי, הוא חוסר האינטגרציה בגנום התא המארח, מה שמונע את הסיכון לאונקוגנזה. שיטה זו יכולה לסייע בייצור חלבונים חסרים או פגומים בתאים, ויכולה לשמש לטיפול חיסוני בהפרעות גנטיות.

ובתחום הרפואה הרגנרטיבית, מי שמדגים את ההליך יהיה סטיינל, סטודנט לתואר שני מהמעבדה שלי. לפני תחילת הליך זה, הפלסמידים המכילים את רצפי ה-DNA המקודדים הנדרשים או CDS הוגברו באי קולי ובודדו כמתואר בטקסט הפרוטוקול. בדוגמה זו, ה-CDS המעניין הוא חלבון פלואורסצנטי ירוק משופר או EGFP כדי להגביר ולהוסיף בו זמנית פרט פולי ל-CDS של EGFP.

הכן תערובת PCR כמפורט בטקסט הפרוטוקול. הנח את צינור ה-PCR בתרמו-סייקלר והפעל את פרוטוקול הרכיבה על ה-PCR המתואר בטקסט הפרוטוקול. לאחר השלמת תגובת ה-PCR, נקה את תגובת ה-PCR באמצעות ערכת טיהור PCR זמינה מסחרית ודלל את ה-DNA באמצעות 20 מיקרוליטר מים נטולי נוקלאז.

כדי לבדוק את איכות מוצר ה-PCR, בצע אלקטרופורזה של ג'ל DNA ודמיין את רצועות ה-DNA במערכת הדמיה. יש לזהות רצועת DNA ברורה באורך של כ-1,100 זוגות בסיסים במהלך שעתוק חוץ גופי או IVT. ה-DNA שנוצר קודם לכן יתועתק ל-mRNA.

הכן את התערובת האנלוגית של מכסה NTP כפי שמוצג כאן. מערבבים היטב את התערובת האנלוגית של מכסה NTP על ידי מערבולת. לאחר מכן סובב אותו למטה הרכיבו בקצרה את תערובת תגובת ה-IVT כמתואר בטבלה זו.

ערבבו היטב את תערובת תגובת ה-IVT על ידי פיפטינג עדין למעלה ולמטה. לאחר מכן צנטריפוגה את צינור ה-PCR לזמן קצר כדי לאסוף את התערובת בתחתית הצינור. דגרו את תערובת תגובת ה-IVT ב-37 מעלות צלזיוס למשך שלוש שעות במיקסר תרמו.

לאחר שלוש שעות, הסר את ה-DNA של התבנית על ידי הוספת מיקרוליטר אחד של DNA לתערובת תגובת IVT. מערבבים היטב ומדגרים בחום של 37 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות. טהר את תערובת התגובה באמצעות ערכת טיהור RNA ודלל את ה-MR NA השונה מממברנת עמוד הספין פעמיים עם 40 מיקרוליטר מים נטולי נוקלאז, יש לטפל ב-mRNA השונה שנוצר על ידי IVT בפוספטאז כדי להסיר חמישה טרי-פוספטים ראשוניים, מה שעלול להוביל להפעלה חיסונית.

כדי להתחיל בהליך זה, הוסף תשעה מיקרוליטרים של 10 x מאגר תגובת פוספטאז אנטארקטי ל-79 מיקרוליטר של תמיסת mRNA מטוהרת. לאחר מכן, הוסיפו שני מיקרוליטרים של פוספטאז אנטארקטי וערבבו בעדינות את הדגימה. דוגרים על התערובת בחום של 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.

לאחר 30 דקות, יש לטהר את תערובת התגובה באמצעות ערכת טיהור RNA ולדלל את ה-mRNA שהשתנה מקרום עמוד הספין פעמיים עם 50 מיקרוליטר מים ללא נוקלאז. לאחר מדידת ריכוז ה-mRNA ששונה, התאם את הריכוז ל-100 ננוגרם למיקרוליטר על ידי הוספת מים ללא נוקלאז. בדוק את איכות ה-mRNA השונה המסונתז על ידי אלקטרופורזה של ג'ל RNA ודמיין את איסורי הסולם וה-mRNA על תאורת טרנס UV.

יש לזהות רצועת mRNA ברורה באורך של כ-1,100 זוגות בסיסים. הכן את תאי HEC 2 9 3 לטרנספקציה עם ה- mRNA השונה המסונתז על ידי ציפוי פעמיים. מרכז את חמשת התאים לבאר של צלחת 12 בארות דגרו על התאים למשך הלילה ב-37 מעלות צלזיוס בחממת תאים למחרת, התא היה אמור להגיע למפגש של 80 עד 90%.

צור את מקלעת הליפו לטרנספקציה. הכן מספיק תערובת טרנספקציה לכל הבארות להעברה כל באר של צלחת 12 בארות דורשת 2.5 מיקרוגרם של mRNA שונה, שני מיקרוליטר של מגיב טרנספקציה ליפידים ו -473 מיקרוליטר של אופציה אחת. יש להפחית את מדיום הסרום.

מערבבים את הרכיבים בעדינות על ידי פיפטינג כבקרה שלילית. הכינו תערובת טרנספקציה ללא Mr.NA, דגרו את תערובות הטרנספקציה בטמפרטורת החדר למשך 20 דקות ליצירת מקלאות ליפו. לטרנספקציה.

שטפו את התאים עם 500 מיקרוליטר DPBS לכל . ובכן מוסיפים 500 מיקרוליטר של תערובת טרנספקציה לכל באר של צלחת 12 הבארות, דוגרים על התאים למשך ארבע שעות בחום של 37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו חמצני לאחר ארבע שעות, שואבים את תערובת הטרנספקציה ומוסיפים מיליליטר אחד של תרבית תאים שלמה. בינוני לתאים בכל באר.

דגרו את התאים למשך 24 שעות בחממת התאים. לאחר מכן בצע ניתוח מיקרוסקופי פלואורסצנטי של התאים באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי להכנת תאים לזרימה ציטומטרית. הסר את מדיום תרבית התאים מהבארות ושטוף כל באר עם אחד מ- DPBS ללא סידן ומגנזיום.

הוסף 500 מיקרוליטר של TRIPSIN EDTA לכל באר כדי לנתק את התאים מפני השטח של לוחות תרבית התאים. לאחר מכן, הוסף 500 מיקרוליטר של תמיסת נטרול טריפסין לבאר כדי לנטרל את צנטריפוגת הטריין התאים המנותקים למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר פי 300 G. לאחר הסרת ה-Supinate Reese, השעו את חיך התא ב-150 מיקרוליטר של תמיסת קיבוע תאים והעבירו את תרחיף התא לתוך צינור ציטומטריית זרימה.

נתח את אחוז התאים המבטאים EGFP ואת עוצמת הקרינה באמצעות הממוצע הגיאומטרי של עוצמת הקרינה. ביטוי החלבון לאורך זמן מוערך גם על ידי ניתוח ציטומטריית זרימה של תאים המבטאים EGFP ביום, יומיים ושלושה לאחר הטרנספקציה כמתואר בטקסט הפרוטוקול, הפונקציונליות של ה-mRNA EGFP שנוצר נבדקה על ידי טרנספקציה של תאי HEC 2 9 3. ייצור ה-EGFP בתאים זוהה 24 שעות לאחר הטרנספקציה באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי.

כאן, תמונת ניגודיות פנים של התאים מוצגת לצד תמונה פלואורסצנטית של התאים. ביטוי EGFP בתאים זוהה גם על ידי זרימה ציטומטרית 24 שעות לאחר הטרנספקציה. הקו הוורוד מייצג תאים ללא mRNA, טרנספקציה, והקו הכחול מייצג תאים חיוביים ל-EGFP.

לאחר טרנספקציה של EGFP mRNA, 93.91% מכלל התאים שנמדדו היו חיוביים, והממוצע הגיאומטרי של עוצמת הקרינה היה 720.16. משך ביטוי החלבון בתאי HC 2 93 הוערך על ידי מדידת ביטוי EGFP יום, יומיים ושלושה לאחר mRNA. ביטוי חלבון הטרנספקציה היה הגבוה ביותר בתאים 24 שעות לאחר הטרנספקציה.

הכמות הופחתה פי 1.6 בכל יום למחרת, אך גם לאחר שלושה ימים, התאים הכילו EGFP לאחר שליטה. ניתן לבצע טכניקה זו תוך יומיים אם היא מבוצעת כראוי. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לייצר MRNA שונה מיוצב לאינדוקציה של ביטוי חלבון רצוי בתאים.