Name: במבחנת הסינתזה של mRNA השתנה לאינדוקציה של ביטוי חלבון בתאים אנושיים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-11-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 7 s
Description: למד סינתזה של mRNA מותאם בתאים אנושיים לשם ביטוי חלבון. השיטה כוללת שכפול פלסמיד, תמליל in vitro, הסרת DNA תבנית וטיפול בפוספטאזה. הטכניקה מאפשרת ייצור חלבונים ללא שילוב בגנום המארח.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

פרויקט זה מומן על ידי קרנות החברתיות האירופיות באדן-וירטמברג, גרמניה.

<ol><li>Bangel-Ruland, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CFTR-mRNA+delivery%3A+a+novel+alternative+for+cystic+fibrosis+%26%2334%3Bgene+therapy%26%2334%3B%5BTitle%5D)+AND+%22The+journal+of+gene+medicine%22%5BJournal%5D)">CFTR-mRNA delivery: a novel alternative for cystic fibrosis &#34;gene therapy&#34;.</a> The journal of gene medicine. , (2013).</li>
<li>Benteyn, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+of+an+Optimized+Wilms%26%2334%3B+Tumor+1+%28WT1%29+mRNA+Construct+for+Enhanced+WT1+Expression+and+Improved+Immunogenicity+In+Vitro+and+In+Vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+therapy+Nucleic+acids%22%5BJournal%5D)">Design of an Optimized Wilms&#34; Tumor 1 (WT1) mRNA Construct for Enhanced WT1 Expression and Improved Immunogenicity In Vitro and In Vivo.</a> Molecular therapy Nucleic acids. 2, 134(2013).</li>
<li>Petsch, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protective+efficacy+of+in+vitro+synthesized%2C+specific+mRNA+vaccines+against+influenza+A+virus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Protective efficacy of in vitro synthesized, specific mRNA vaccines against influenza A virus infection.</a> Nature. 30, 1210-1216 (2012).</li>
<li>Mandal, P. K., Rossi, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reprogramming+human+fibroblasts+to+pluripotency+using+modified+mRNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+protocols%22%5BJournal%5D)">Reprogramming human fibroblasts to pluripotency using modified mRNA.</a> Nature protocols. 8, 568-582 (2013).</li>
<li>Warren, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+reprogramming+to+pluripotency+and+directed+differentiation+of+human+cells+with+synthetic+modified+mRNA%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+stem+cell%22%5BJournal%5D)">Highly efficient reprogramming to pluripotency and directed differentiation of human cells with synthetic modified mRNA.</a> Cell stem cell. 7, 618-630 (2010).</li>
<li>Yakubov, E., Rechavi, G., Rozenblatt, S., Givol, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reprogramming+of+human+fibroblasts+to+pluripotent+stem+cells+using+mRNA+of+four+transcription+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+biophysical+research+communications%22%5BJournal%5D)">Reprogramming of human fibroblasts to pluripotent stem cells using mRNA of four transcription factors.</a> Biochemical and biophysical research communications. 394, 189-193 (2010).</li>
<li>Anderson, B. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Incorporation+of+pseudouridine+into+mRNA+enhances+translation+by+diminishing+PKR+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+acids+research%22%5BJournal%5D)">Incorporation of pseudouridine into mRNA enhances translation by diminishing PKR activation.</a> Nucleic acids research. 38, 5884-5892 (2010).</li>
<li>Kariko, K., Buckstein, M., Ni, H., Weissman, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Suppression+of+RNA+recognition+by+Toll-like+receptors%3A+the+impact+of+nucleoside+modification+and+the+evolutionary+origin+of+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Suppression of RNA recognition by Toll-like receptors: the impact of nucleoside modification and the evolutionary origin of RNA.</a> Immunity. 23, 165-175 (2005).</li>
<li>Kariko, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Incorporation+of+pseudouridine+into+mRNA+yields+superior+nonimmunogenic+vector+with+increased+translational+capacity+and+biological+stability%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+therapy+%3A+the+journal+of+the+American+Society+of+Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Incorporation of pseudouridine into mRNA yields superior nonimmunogenic vector with increased translational capacity and biological stability.</a> Molecular therapy : the journal of the American Society of Gene Therapy. 16, 1833-1840 (2008).</li>
<li>Kariko, K., Weissman, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Naturally+occurring+nucleoside+modifications+suppress+the+immunostimulatory+activity+of+RNA%3A+implication+for+therapeutic+RNA+development%5BTitle%5D)+AND+%22Current+opinion+in+drug+discovery+%26+development%22%5BJournal%5D)">Naturally occurring nucleoside modifications suppress the immunostimulatory activity of RNA: implication for therapeutic RNA development.</a> Current opinion in drug discovery & development. 10, 523-532 (2007).</li>
<li>Kormann, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+therapeutic+proteins+after+delivery+of+chemically+modified+mRNA+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+biotechnology%22%5BJournal%5D)">Expression of therapeutic proteins after delivery of chemically modified mRNA in mice.</a> Nature biotechnology. 29, 154-157 (2011).</li>
<li>Hacein-Bey-Abina, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insertional+oncogenesis+in+4+patients+after+retrovirus-mediated+gene+therapy+of+SCID-X1%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+clinical+investigation%22%5BJournal%5D)">Insertional oncogenesis in 4 patients after retrovirus-mediated gene therapy of SCID-X1.</a> The Journal of clinical investigation. 118, 3132-3142 (2008).</li>
<li>Hacein-Bey-Abina, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficacy+of+gene+therapy+for+X-linked+severe+combined+immunodeficiency%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+journal+of+medicine%22%5BJournal%5D)">Efficacy of gene therapy for X-linked severe combined immunodeficiency.</a> The New England journal of medicine. 363, 355-364 (2010).</li>
<li>Avci-Adali, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+conditions+for+successful+transfection+of+human+endothelial+cells+with+in+vitro+synthesized+and+modified+mRNA+for+induction+of+protein+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+biological+engineering%22%5BJournal%5D)">Optimized conditions for successful transfection of human endothelial cells with in vitro synthesized and modified mRNA for induction of protein expression.</a> Journal of biological engineering. 8, 8(2014).</li>
</ol>

החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

יש טיפול mRNA פוטנציאל עצום בתחום של רפואת רגנרטיבית, טיפול במחלות וחיסונים. בסרטון הזה, אנחנו מדגימים את הייצור של ה- mRNA התייצב, שונה לזירוז של ביטוי חלבון בתאים. שימוש בפרוטוקול זה, יכול להיות שנוצר mRNA הרצוי אחר. הסינתזה במבחנה של mRNA שונה מאפשרת transfection של תאים עם mRNAs הרצוי כדי לגרום לביטוי של חלבוני יעד. וכך, החלבון הרצוי בא לידי ביטוי זמני בתנאים פיסיולוגיים עד mRNA מועבר באופן אקסוגני הוא מושפל לחלוטין. <p class="jove_content" style=";text-align:righ...

בתאים, השעתוק של RNA שליח (mRNA) והתרגום הבא של ה- mRNA לחלבונים רצויים להבטיח את התפקוד התקין של תאים. הפרעות גנטיות תורשתיות או נרכשות יכולות להוביל לסינתזה מספיקה ולא מתפקדת של חלבונים וגורמות למחלות קשות. כך, גישה טיפולית חדשה ללעורר את הייצור של חלבונים חסרים או פגומים הוא המשלוח אקסוגני של סינטטי שונה mRNA לתאים, שקודים לחלבון הרצוי. וכך, תאים מופעלים לסנתז חלבונים פונקציונליים, שבו הם בדרך כלל לא יכולים לייצר או באופן טבעי לא צריכים. שימוש בגישה זו, ניתן לתקן הפרעות גנטיות על ידי הקדמה של mRNA שמקודד לחלבון הפגום או חסר 1. גם טיפול mRNA יכול לשמש לחיסון לאנטיגנים synthetize חלבון, אשר באים לידי ביטוי על ידי תאי גידול או פתוגנים. ובכך, מערכת חיסונית מארח יכולה להיות מופעלת כדי לחסל ביעילות תאים סרטניים או למנוע infections 2,3. יתר על כן, בשנים האחרונות, mRNA היה בהצלחה המשמש לייצור תאים מושרה pluripotent גזע (iPSCs). לצורך כך, fibroblasts היה transfected עם mRNAs לגרום הביטוי של תכנות מחדש גורמי 4-6 ולהמיר אותם בiPSCs עם פוטנציאל עצום ברפואת רגנרטיבית. בעבר, השימוש בmRNA הקונבנציונלי היה קשור ביציבות נמוכה וחיסוני חזקים. כך, יישומים קליניים של mRNAs הקונבנציונלי היו מוגבלים. עם זאת, החלפת cytidine וuridine על ידי 5-methylcytidine וpseudouridine בתוך מולקולת mRNA על ידי Kariko ועמיתים שניתנו מולקולות mRNA יציבים בנוזלים ביולוגיים והפחתה דרמטית בהפעלת מערכת חיסונית 7-10, אשר כעת מאפשרת יישום הקליני של mRNAs שונה. באמצעות מיוצר באופן סינטטי mRNAs שונה, תמלילי גן רצויים יכולים להיות מועברים באופן זמני בvivo 11או במבחנה כדי לגרום לביטוי חלבון. MRNA הציג מתורגם בתנאים פיסיולוגיים על ידי מכונות תרגום הסלולריות. בשל חוסר האינטגרציה לתוך הגנום של התא הפונדקאי לעומת וקטורי ריפוי גנטי נגיפיים, הסיכון של oncogenesis נמנע 12,13. כך, טיפול באמצעות mRNA הסינתטי שונה יקבל קבלה קלינית טובה יותר בעתיד. כאן אנו מתארים פרוטוקול מפורט לייצור של ה- mRNA שונה, transfection של תאים עם mRNA וההערכה של ביטוי חלבון בתאי transfected (איור 1).

<table><tbody><tr><td colspan="4"><חזק>תרבית תאים</חזק></td></tr><tr><td>DMEM, גלוקוז גבוה</td><td>PAA</td><td>E15-009</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Life Technologies</td><td>10500</td><td></td></tr><tr><td>פניצילין/סטרפטומיצין&nbsp;</td><td>PAA</td><td>P11-010</td><td>100x</td></tr><tr><td>L-גלוטמין&nbsp;</td><td>PAA</td><td>M11-004</td><td>200 מ"מ</td></tr><tr><td>DPBS ללא סידן ומגנזיום&nbsp;</td><td>PAA</td><td>E15-002</td><td></td></tr><tr><td>0.04% טריפסין / 0.03% EDTA&nbsp;</td><td>Promocell</td><td>C-41020</td><td></td></tr><tr><td>TNS</td><td>Promocell</td><td>C-41120</td><td>תמיסת נטרול טריפסין, 0.05% מעכב טריפסין ב-0.1% תאי</td></tr><tr><td>BSA HEK-293</td><td>ATCC</td><td>CRL-1573</td><td></td></tr><tr><td colspan="4" ><חזק>חומרים מתכלים</חזקים></td></tr><tr><td>צלחות תרבית רקמות, 12-well&nbsp;</td><td>קורנינג</td><td>3512</td><td></td></tr><tr><td>בקבוק תרבית תאים (75 ס"מ2)&nbsp;</td><td>קורנינג</td><td>430641</td><td></td></tr><tr><td>צינורות מיקרוצנטריפוגה סטריליים ללא DNase ו-RNase 1.5 מ"ל&nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>0030 121.589</td><td>Safe-Lock, Biopur</td></tr><tr><td>15 מ"ל צינורות חרוטיים&nbsp;</td><td>greiner bio-one</td><td>188271</td><td></td></tr><tr><td>PCR נקי וסטרילי epT.I.P.S. טיפים לפיפטה כפולה&nbsp;</td><td>אפנדורף</td><td>10 ומיקרו; l: 022491202; 100 ומיקרו; l: 022491237; 1,000 ומיקרו; l: 022491253</td><td></td></tr><tr><td>Cryovial</td><td>greiner bio-one</td><td>122279-128</td><td>Cryo.s&nbsp;</td></tr><tr><td>צינור תחתון עגול מפוליפרופילן 14 מ"ל לתרבית חיידקים&nbsp;</td><td>BD Falcon</td><td>352059</td><td></td></tr><tr><td colspan="4"><חזק>הגברה וטיהור פלסמיד</חזק></td></tr><tr><td>pcDNA 3.3_eGFP פלסמיד&nbsp;</td><td>Addgene</td><td>26822</td><td></td></tr><tr><td>One Shot Top10 מרכיב כימי Escherichia coli&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>C4040-10</td><td></td></tr><tr><td>מים סטריליים (אמפווה)</td><td>Fresenius Kabi</td><td>1636071</td><td></td></tr><tr><td>LB בינוני (לוריא/מילר)&nbsp;</td><td>Carl Roth</td><td>X968.1</td><td>ממיס 25 גרם L-1 במים סטריליים.</td></tr><tr><td>LB אגר (לוריא/מילר)&nbsp;</td><td>Carl Roth</td><td>X969.1</td><td>ממיס 40 גרם L-1 במים סטריליים.</td></tr><tr><td>Ampicillin Ready Made Solution</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A5354</td><td>, 100 מ"ג/מ"ל&nbsp;</td></tr><tr><td>גליצרול</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>G2025</td><td></td></tr><tr><td>QIAprep Spin Miniprep Kit&nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>27104</td><td></td></tr><tr><td colspan="4"><ייצור חזק>mRNA</td></tr><tr><td>HotStar HiFidelity Polymerase Kit&nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>202602</td><td></td></tr><tr><td>QIAערכת טיהור PCR מהירה&nbsp;</td><td>ערכת Qiagen</td><td>28106</td><td></td></tr><tr><td>MEGAscript T7&nbsp;</td><td>לייף טכנולוג'יז</td><td>AM1334</td><td></td></tr><tr><td>5-מתילציטידין-5&אקוטי;-טריפוספט&nbsp;</td><td>טרילינק</td><td>N1014</td><td>5-מתיל-CTP</td></tr><tr><td>פסאודורידין-5&אקוטי;-טריפוספט&nbsp;</td><td>Trilink</td><td>N1019</td><td>פסאודו-UTP</td></tr><tr><td>3&acute;-O-Me-m7G(5&acute;)ppp(5&acute;)מבנה כובע G RNA אנלוגי&nbsp;</td><td>ניו אינגלנד Biolabs</td><td>S1411L</td><td></td></tr><tr><td>RiboLock RNase מעכב</td><td>Thermo Scientific</td><td>EO0381</td><td>40 U/&micro; l&nbsp;</td></tr><tr><td>טורבו DNase</td><td>Life Technologies</td><td>AM1334</td><td>2 U/&micro; l (מתוך ערכת MEGAscript T7)</td></tr><tr><td>פוספטאז אנטארקטי&nbsp;</td><td>ניו אינגלנד Biolabs</td><td>MO289S</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy מיני קיט &nbsp;</td><td>פתרון Qiagen</td><td>74104</td><td></td></tr><tr><td>RNaseZap&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>AM9780</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Transfection</td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000 Transfection Reagent&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>11668-019</td><td>מגיב טרנספקציה ליפידים קטיוני</td></tr><tr><td>Opti-MEM I מדיה סרום מופחתת&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>11058-021</td><td>מדיום חיוני מינימלי משופר (MEM) המאפשר הפחתה של תוספי סרום בקר עוברי (FBS)&nbsp;</td></tr><tr><td colspan="4"><חזק>ג'ל אלקטרופורזה</חזק></td></tr><tr><td>אגרוז</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>A9539</td><td></td></tr><tr><td>ג'לרד חומצת גרעין ג'ל כתם</td><td>ביוטיום</td><td>41003</td><td>10,000x במים&nbsp;</td></tr><tr><td>מגוון peqGOLD מיקס DNA-סולם&nbsp;</td><td>Peqlab</td><td>25-2210</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Flow cytometry analysiss</td></tr><tr><td>CellFIX (1x)</td><td>BD Biosciences</td><td>340181</td><td>תרכיז פי 10&nbsp;</td></tr><tr><td colspan="4" ><חזק>פריימר להגברת הכנסה ופולי (T) זנב PCR</חזק></td></tr><tr><td>פריימר קדימה (דרגת HPLC) 10 ומיקרו; M</td><td>Ella Biotech</td><td></td><td>5&acute;-TTGGACCCTCGTAC AGAAGCTAATACG-3&acute;</td></tr><tr><td>פריימר הפוך (דרגת HPLC) 10 ומיקרו; M</td><td>Ella Biotech</td><td></td><td>5&acute;- T120-CTTCCTACT CAGGCTTTATTCAA AGACCA-3&acute;</td></tr><tr><td colspan="4"><חזק>ציוד</חזק></td></tr><tr><td>חממת תאים</td><td>קלסר</td><td></td><td>CO<תת>2</תת> (5%) ו-O2 (20%)&nbsp;</td></tr><tr><td>מונה תאי CASY&nbsp;</td><td>Sch&auml; מערכת</td><td></td><td></td>rfe</tr><tr><td>שולחן עבודה סטרילי&nbsp;</td><td>BDK Luft-und Reinraumtecknik GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>אינקובטור חיידקים&nbsp;</td><td>אמבט מים Incutec</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td> ספקטרופוטומטר ScanDrop&nbsp;<td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>מחזור תרמי אנליטי Jena</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PCR&nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microcentrifuge</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vortex</td><td>peqlab</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Thermomixer</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ג'ל מכשיר לאלקטרופורזה&nbsp;</td>מערכת תיעוד <td>ביו-ראד</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ג'ל&nbsp;</td>מערכת <td>Bio-Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FACScan&nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ פלואורסצנטי&nbsp;</td><td>מיקרוסקופ ניגודיות פאזה של Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>צייס</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

במבחנת הסינתזה של mrna השתנה לאינדוקציה של ביטוי חלבון בתאים אנושיים

In Vitro Synthesis of Modified mRNA for Induction of Protein Expression in Human Cells

המשלוח אקסוגני של קידוד RNA שליח סינטטי (mRNA) לזירוז סינתזה של חלבונים בתאים רצויים יש פוטנציאל עצום בתחומים של רפואת רגנרטיבית, ביולוגיה של תא בסיסי, טיפול במחלות, ותכנות מחדש של תאים. כאן, אנו מתארים צעד אחר צעד פרוטוקול לדור של mRNA שונה עם פוטנציאל מופחת חיסוני הפעלה ויציבות מוגברת, בקרת איכות של ה- mRNA מיוצר, transfection של תאים עם mRNA ואימות של ביטוי חלבון הנגרם על ידי זרימת cytometry. עד 3 ימים לאחר transfection יחיד עם eGFP mRNA, HEK293 תאי transfected לייצר eGFP. במאמר זה וידאו, הסינתזה של eGFP mRNA מתוארת כדוגמא. עם זאת, ההליך יכול להיות מיושם לייצור של ה- mRNA הרצוי האחר. שימוש בסינטטי שונה mRNA, יכולים להיגרם תאים לבטא את החלבונים הרצויים, שבו הם בדרך כלל לא מביעים זמניים.

באמצעות פלסמיד pcDNA 3.3 המכיל את ה- CDS של eGFP, הסינתזה של eGFP mRNA שונה הוקמה (איור 1). לאחר הגברה להוסיף על ידי PCR ופולי T-עוקב, להקה ברורה באורך של כ -1,100 נ"ב הוא זוהה (איור 2). הגדלת זמן IVT Augmented התשואה של mRNA (איור 3). לאחר IVT, להקת mRNA ברורה באורך של כ -1,100 נ"ב זוהתה, אשר תואמת את אורכו של eGFP mRNA שיופק (איור 4). הפונקציונ...

במאמר זה וידאו, אנו מתארים את הסינתזה במבחנה של mRNA שונה לזירוז של ביטוי חלבון בתאים.

במבחנת הסינתזה של mRNA השתנה לאינדוקציה של ביטוי חלבון בתאים אנושיים

The exogenous delivery of coding synthetic messenger RNA (mRNA) for induction of protein synthesis in desired cells has enormous potential in the fields ...

המטרה הכוללת של הליך זה היא סינתזה חוץ גופית של mRNA שונה לאינדוקציה של ביטוי חלבון בתאים. זה מושג על ידי הגברה ראשונה של הכנסת הפלסמיד או רצף ה-DNA המקודד והוספת זנב פולי T של 120 תימידין באמצעות תגובת שרשרת פולימראז. השלב השני הוא שעתוק חוץ גופי של ה-DNA שנוצר ל-mRNA עם זנבות פולי אדנין.לאחר מכן, ה-DNA של התבנית מוסר על ידי טיפול D'S בתערובת תגובת השעתוק במבחנה. השלב האחרון הוא טיפול בפוספטאז אנטארקטי ב-mRNA המיוצר להסרת חמישה פוספטים ראשוניים. בסופו של דבר, תאים עוברים טרנספטציה על ידי ה-mRNA שנוצר, קומפלקסים של שומנים.מיקרוסקופיה פלואורסצנטית וניתוח ציטומטריית זרימה משמשים להצגת סינתזה של GFP משופר בתאים. היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות כמו טרנספקט נגיפי, הוא חוסר האינטגרציה בגנום התא המארח, מה שמונע את הסיכון לאונקוגנזה. שיטה זו יכולה לסייע בייצור חלבונים חסרים או פגומים בתאים, ויכולה לשמש לטיפול חיסוני בהפרעות גנטיות.ובתחום הרפואה הרגנרטיבית, מי שמדגים את ההליך יהיה סטיינל, סטודנט לתואר שני מהמעבדה שלי. לפני תחילת הליך זה, הפלסמידים המכילים את רצפי ה-DNA המקודדים הנדרשים או CDS הוגברו באי קולי ובודדו כמתואר בטקסט הפרוטוקול. בדוגמה זו, ה-CDS המעניין הוא חלבון פלואורסצנטי ירוק משופר או EGFP כדי להגביר ולהוסיף בו זמנית פרט פולי ל-CDS של EGFP.הכן תערובת PCR כמפורט בטקסט הפרוטוקול. הנח את צינור ה-PCR בתרמו-סייקלר והפעל את פרוטוקול הרכיבה על ה-PCR המתואר בטקסט הפרוטוקול. לאחר השלמת תגובת ה-PCR, נקה את תגובת ה-PCR באמצעות ערכת טיהור PCR זמינה מסחרית ודלל את ה-DNA באמצעות 20 מיקרוליטר מים נטולי נוקלאז.כדי לבדוק את איכות מוצר ה-PCR, בצע אלקטרופורזה של ג'ל DNA ודמיין את רצועות ה-DNA במערכת הדמיה. יש לזהות רצועת DNA ברורה באורך של כ-1,100 זוגות בסיסים במהלך שעתוק חוץ גופי או IVT. ה-DNA שנוצר קודם לכן יתועתק ל-mRNA.הכן את התערובת האנלוגית של מכסה NTP כפי שמוצג כאן. מערבבים היטב את התערובת האנלוגית של מכסה NTP על ידי מערבולת. לאחר מכן סובב אותו למטה הרכיבו בקצרה את תערובת תגובת ה-IVT כמתואר בטבלה זו.ערבבו היטב את תערובת תגובת ה-IVT על ידי פיפטינג עדין למעלה ולמטה. לאחר מכן צנטריפוגה את צינור ה-PCR לזמן קצר כדי לאסוף את התערובת בתחתית הצינור. דגרו את תערובת תגובת ה-IVT ב-37 מעלות צלזיוס למשך שלוש שעות במיקסר תרמו.לאחר שלוש שעות, הסר את ה-DNA של התבנית על ידי הוספת מיקרוליטר אחד של DNA לתערובת תגובת IVT. מערבבים היטב ומדגרים בחום של 37 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות. טהר את תערובת התגובה באמצעות ערכת טיהור RNA ודלל את ה-MR NA השונה מממברנת עמוד הספין פעמיים עם 40 מיקרוליטר מים נטולי נוקלאז, יש לטפל ב-mRNA השונה שנוצר על ידי IVT בפוספטאז כדי להסיר חמישה טרי-פוספטים ראשוניים, מה שעלול להוביל להפעלה חיסונית.כדי להתחיל בהליך זה, הוסף תשעה מיקרוליטרים של 10 x מאגר תגובת פוספטאז אנטארקטי ל-79 מיקרוליטר של תמיסת mRNA מטוהרת. לאחר מכן, הוסיפו שני מיקרוליטרים של פוספטאז אנטארקטי וערבבו בעדינות את הדגימה. דוגרים על התערובת בחום של 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.לאחר 30 דקות, יש לטהר את תערובת התגובה באמצעות ערכת טיהור RNA ולדלל את ה-mRNA שהשתנה מקרום עמוד הספין פעמיים עם 50 מיקרוליטר מים ללא נוקלאז. לאחר מדידת ריכוז ה-mRNA ששונה, התאם את הריכוז ל-100 ננוגרם למיקרוליטר על ידי הוספת מים ללא נוקלאז. בדוק את איכות ה-mRNA השונה המסונתז על ידי אלקטרופורזה של ג'ל RNA ודמיין את איסורי הסולם וה-mRNA על תאורת טרנס UV.יש לזהות רצועת mRNA ברורה באורך של כ-1,100 זוגות בסיסים. הכן את תאי HEC 2 9 3 לטרנספקציה עם ה- mRNA השונה המסונתז על ידי ציפוי פעמיים. מרכז את חמשת התאים לבאר של צלחת 12 בארות דגרו על התאים למשך הלילה ב-37 מעלות צלזיוס בחממת תאים למחרת, התא היה אמור להגיע למפגש של 80 עד 90%.צור את מקלעת הליפו לטרנספקציה. הכן מספיק תערובת טרנספקציה לכל הבארות להעברה כל באר של צלחת 12 בארות דורשת 2.5 מיקרוגרם של mRNA שונה, שני מיקרוליטר של מגיב טרנספקציה ליפידים ו -473 מיקרוליטר של אופציה אחת. יש להפחית את מדיום הסרום.מערבבים את הרכיבים בעדינות על ידי פיפטינג כבקרה שלילית. הכינו תערובת טרנספקציה ללא Mr.NA, דגרו את תערובות הטרנספקציה בטמפרטורת החדר למשך 20 דקות ליצירת מקלאות ליפו. לטרנספקציה.שטפו את התאים עם 500 מיקרוליטר DPBS לכל . ובכן מוסיפים 500 מיקרוליטר של תערובת טרנספקציה לכל באר של צלחת 12 הבארות, דוגרים על התאים למשך ארבע שעות בחום של 37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו חמצני לאחר ארבע שעות, שואבים את תערובת הטרנספקציה ומוסיפים מיליליטר אחד של תרבית תאים שלמה. בינוני לתאים בכל באר.דגרו את התאים למשך 24 שעות בחממת התאים. לאחר מכן בצע ניתוח מיקרוסקופי פלואורסצנטי של התאים באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי להכנת תאים לזרימה ציטומטרית. הסר את מדיום תרבית התאים מהבארות ושטוף כל באר עם אחד מ- DPBS ללא סידן ומגנזיום.הוסף 500 מיקרוליטר של TRIPSIN EDTA לכל באר כדי לנתק את התאים מפני השטח של לוחות תרבית התאים. לאחר מכן, הוסף 500 מיקרוליטר של תמיסת נטרול טריפסין לבאר כדי לנטרל את צנטריפוגת הטריין התאים המנותקים למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר פי 300 G. לאחר הסרת ה-Supinate Reese, השעו את חיך התא ב-150 מיקרוליטר של תמיסת קיבוע תאים והעבירו את תרחיף התא לתוך צינור ציטומטריית זרימה.נתח את אחוז התאים המבטאים EGFP ואת עוצמת הקרינה באמצעות הממוצע הגיאומטרי של עוצמת הקרינה. ביטוי החלבון לאורך זמן מוערך גם על ידי ניתוח ציטומטריית זרימה של תאים המבטאים EGFP ביום, יומיים ושלושה לאחר הטרנספקציה כמתואר בטקסט הפרוטוקול, הפונקציונליות של ה-mRNA EGFP שנוצר נבדקה על ידי טרנספקציה של תאי HEC 2 9 3. ייצור ה-EGFP בתאים זוהה 24 שעות לאחר הטרנספקציה באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי.כאן, תמונת ניגודיות פנים של התאים מוצגת לצד תמונה פלואורסצנטית של התאים. ביטוי EGFP בתאים זוהה גם על ידי זרימה ציטומטרית 24 שעות לאחר הטרנספקציה. הקו הוורוד מייצג תאים ללא mRNA, טרנספקציה, והקו הכחול מייצג תאים חיוביים ל-EGFP.לאחר טרנספקציה של EGFP mRNA, 93.91% מכלל התאים שנמדדו היו חיוביים, והממוצע הגיאומטרי של עוצמת הקרינה היה 720.16. משך ביטוי החלבון בתאי HC 2 93 הוערך על ידי מדידת ביטוי EGFP יום, יומיים ושלושה לאחר mRNA. ביטוי חלבון הטרנספקציה היה הגבוה ביותר בתאים 24 שעות לאחר הטרנספקציה.הכמות הופחתה פי 1.6 בכל יום למחרת, אך גם לאחר שלושה ימים, התאים הכילו EGFP לאחר שליטה. ניתן לבצע טכניקה זו תוך יומיים אם היא מבוצעת כראוי. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לייצר MRNA שונה מיוצב לאינדוקציה של ביטוי חלבון רצוי בתאים.

in-vitro-synthesis-modified-mrna-for-induction-protein-expression

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

בעידן שאחרי האדם הגנומיקה, הזמינות של חלבונים רקומביננטיים של תצורות המקומיים הוא חיוני למחקר מבנית, תפקודית טיפולית ופיתוח. כאן אנו מתארים מבחן רחב היקף של ביטוי חלבונים מערכת עובריים אנושיים לתאי כליה 293T, שניתן להשתמש בהם כדי לייצר מגוון של חלבונים רקומביננטיים.

פלטפורמת ביטוי נוח כללי לייצור חלבונים המופרשים מ תאים אנושיים

ביטוי חלבונים רקומביננטיים על ידי מערכות יונקים הופך לשיטה אטרקטיבית לייצור קומפלקסים של חלבונים לביולוגיה מבנית. כאן אנו מציגים מערכת ביטוי פשוטה אך יעילה ביותר המשתמשת בתאי יונקים שגדלו בתרחיף לטיהור קומפלקסים של חלבונים למחקרים מבניים.

ביטוי חלבון רקומביננטי לביולוגיה מבנית בתאי ההשעיה HEK 293F: רומן וגישה נגישה

ייצור בקנה מידה מעבדתי של חלבונים אוקריוטיים עם שינוי מתאים לאחר התרגום מייצג מחסום משמעותי. להלן פרוטוקול חזק עם התבססות מהירה ותפנית לביטוי חלבון באמצעות מערכת ביטוי יונקים. מערכת זו תומכת בחומצות אמינו סלקטיביות, תיוג סלקטיבי של חלבונים ומודולטורים של מולקולות קטנות של הרכב הגליקן.

ביטוי תשואה גבוהה של חלבונים אנושיים רקומביננטי עם transfection חולף של תאי HEK293 בהשעיה

כאן נתאר פרוטוקול לדור של cationic nanoliposomes, אשר מבוססת על שיטת יבש-סרט והוא יכול לשמש עבור הכספת, אספקה יעילה של במבחנה עיבד RNA שליח.

דור של Cationic Nanoliposomes למסירה יעיל של במבחנה עיבד RNA שליח

כאן נתאר שיטת הרלוונטית קלינית, יעילות גבוהה, ללא מזין לתכנת fibroblasts העיקרי אנושי לתוך תאי גזע pluripotent המושרה משתמש ששונה mRNAs קידוד גורמים התיכנות, בוגרת microRNA-367/302 מחקה. נכללים גם הם שיטות להערכת יעילות התיכנות, להרחיב iPSC המשובטים מושבות, לאשר את הביטוי של סמן pluripotency טרה-1-60.

מבוסס-RNA תכנות מחדש של האנושי Fibroblasts הראשי לתוך תאי גזע Pluripotent המושרה

פרוטוקולים מפורט עבור שני acylation במבחנה, בתא סלקטיבי 2'-הידרוקסיל נותחו על ידי פריימר ניסויים סיומת (צורה) כדי לקבוע את מבנה שניוני של רצפי ה-pre-mRNA עניין בנוכחות מולקולה קטנה פילוח RNA הם הציג במאמר זה.

שימוש בחוץ גופית וצורה בתא לחקור מולקולה קטנה המושרה שינויים מבניים Pre-mRNA

מקרופאגים, במיוחד מקרופאגים ראשוניים, מאתגרים transfect כפי שהם מתמחים בזיהוי מולקולות של מוצא לא עצמי. אנו מתארים פרוטוקול המאפשר העברה יעילה מאוד של מקרופאגים הראשי עם mRNA שנוצר מתבניות DNA כגון פלמידים.

העברה יעילה במיוחד של מקרופאגים ראשוניים עם מחוץ לגופית

פרוטוקול זה מתאר את השיטה, חומרים, ציוד ושלבים עבור הכנת מלמטה למעלה של RNA וחלבון הפקת תאים סינתטיים. התא הפנימי מימית של התאים הסינתטיים הכיל S30 ליפוסט חיידקי כדורית בתוך bilayer ליפיד (כלומר, ליפוזומים יציבים), באמצעות העברת תחליב המים בשמן שיטה.

הכנת חלבון הפקת תאים סינתטיים באמצעות שולפת תא חינם בקטריאלי, ליפוזומים והעברת אמולסיה

ננו-חלקיק פפטיד-פולוקסאמין בהרכבה עצמית (PP-sNp) פותח באמצעות מכשיר ערבוב מיקרופלואידי כדי לתמצת ולהעביר רנ"א שליח מתועתק במבחנה . ה-mRNA/PP-sNp המתואר יכול להעביר ביעילות תאים בתרבית במבחנה.

טרנספקציה יעילה של mRNA מתועתק במבחנה בתאים בתרבית באמצעות ננו-חלקיקים פפטיד-פולוקסאמין

פרוטוקול זה מתאר את מערכת סינתזת החלבונים ללא תאים (CFPS) המשמשת לבניית תאים סינתטיים. הוא מתאר שלבי מפתח עם תוצאות מייצגות במיקרו-תאים שונים. מטרת הפרוטוקול היא לבסס שיטות עבודה מומלצות למעבדות מגוונות בקהילת התאים הסינתטיים, ולקדם את ההתקדמות בפיתוח תאים סינתטיים.

מערכת סינתזת חלבונים ללא תאים לבניית תאים סינתטיים

למד סינתזה של mRNA מותאם בתאים אנושיים לשם ביטוי חלבון. השיטה כוללת שכפול פלסמיד, תמליל in vitro, הסרת DNA תבנית וטיפול בפוספטאזה. הטכניקה מאפשרת ייצור חלבונים ללא שילוב בגנום המארח.

במבחנת הסינתזה של mRNA השתנה לאינדוקציה של ביטוי חלבון בתאים אנושיים

גלה סרטונים נוספים