Name: המניפולציה Murine דמעות בלוטת (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-11-18T13:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 56 s
Description: למדו לבודד בלוטות דמעות ממבטאים ביום 16 להתפתחות עוברית ולגדל אותן במערכת תרבית ex vivo. שיטה זו מאפשרת ניתוח מסלולי מסרים ושינויים בביטוי חלבונים במיקרוסקופיה פלואורסצנטית.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים מבקשים להודות מימון הניתן על ידי התכנית להקצאת משאבי קליפורניה בסן פרנסיסקו.

כל העבודה בבעלי החיים בוצעה תחת בהתאם קפדן עם ההמלצות במדריך לטיפול והשימוש בחי מעבדה של המכון הלאומי לבריאות. הפרוטוקול אושר על ידי הוועדה המוסדית טיפול בבעלי חיים והשימוש (IACUC) מאוניברסיטת קליפורניה, סן פרנסיסקו. 1. עכבר עוברי דמעות בלוטות (LG): קצירה וMicrodissection <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעקבות נהלים שאושרו על ידי בעלי חיים המוסדיים לועדת אתיקה המדעית מחקר, להרדים מתוזמן נשים CD-1 (או מהונדס) בהריון עם משאיפת CO 2 עולה, ואחריו אישור על ידי נקע בצוואר הרחם לעוברי קציר ביום העוברי המתאים. לייעד את היום של E0 גילוי תוסף נרתיק. הערה: בלוטות דמע (LGS) ניתן לקצור מבמת הניצן אחת E14 ואילך. עם זאת, E16 - עוברים (5 10 ניצנים) לתת תוצאות עקביות ביותר לתרבות ex vivo. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעקר את vצד entral של העכבר באמצעות אתנול 70%. לצבוט את העור ועושה חתך בקו האמצע עם מספריים כירורגיות סטרילי; לחתוך את העור הצפק לחשוף את חלל הבטן. הסר את קרן הרחם 2 על ידי חיתוך לאורך mesometrium בחלק העליון של כל קרן רחם ומקום בקור PBS (בופר פוספט) או תקשורת F12 DMEM בתוספת 100 U / פניצילין מיליליטר ו 100 מיקרוגרם / מיליליטר סטרפטומיצין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת מלקחיים (# 5), להסיר עוברים מהצ&#39;קים מי השפיר ומקום לתוך צלחת פטרי סטרילית המכילה שנייה PBS הקר. היזהר שלא לגעת בעיניים או באזור הראש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח עובר על מיקרוסקופ לנתח עם בסיס שקוף. אם העובר הוא &lt;E17, לבצע שלבי 1.5-1.7. אם הם עובר&gt; E17, השלבים הבאים עשויים להיות מועילים, אך אינם חיוניים, ולכן המשיכו לשלב 1.8. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתק את הראש מהגוף, ממש מתחת ללסת התחתונה התחתונה (השלב ​​1, איור 2) usinאזמל סטרילי ga (# 10 להב). לסובב את הראש כדי שהלסת התחתונה היא עכשיו על הצלחת לנתח. שימוש במלקחיים כדי לייצב את הראש ואזמל כדי להסיר כ ¼ מהצד הגב של מוח (שלב 2, 1 חתך st, איור 2) - זה חשוב במיוחד ברגע שהסחוס מתקשח סביב E15. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כוון את הראש כך שהאזמל יכול לחדור את האף בין העיניים. ביצוע חתך דרך מרכז הראש, כך שהעיניים נמצאות כעת בחצי נפרדים (שלב 2, 2 חתך nd, איור 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות שני # 5 מלקחיים, לקחת מחצית מהראש ולהסיר רקמה עודפת (ראה שלב 3, איור 2). הקפד לכוון את הראש כל כך LG (הממוקם בפינה האחורית התחתונה של העין) הוא לא איבד בתהליך ההסרה זה. הסר מוחי עודפים, סחוס, ורקמות האף מסביב ומתחת לעין. מאז הבלוטה היא בקושי נראית בשלב זה, להבטיח את העין בכיוון נכון לאחר t הסרת רקמה עודפתo להימנע מאיבוד המיקום של LG. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לתפוס בזהירות את העור מאחורי, בפינה תחתונה של העין עם שני המלקחיים. הסר את העור על ידי משיכת פתוחה בזהירות עם המלקחיים כדי לחשוף את LG. השתמש בתאורה נוספת מעל ומתחת לרקמה כדי לעזור להמחיש את LG. הערה: LG, להבחין במראה שלה כמו ניצן בצינור בתוך mesenchyme כהה יותר, תמצית, צריך להיות גלוי בשלב זה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יתחיל בזהירות לנתח את LG וmesenchyme קשור (ראה לשרטט ותמונות) מהרקמה הסובבת באמצעות מלקחיים, נזהר שלא לתפוס את LG או הצינור הקשורים אליו. ברגע שהבלוטה היא חופשית מהרקמה הסובבת, בעדינות להסיר את כל הבלוטה על ידי אחיזת האפיטל המקיף את העין בבסיס צינור LG. דואג לשמר את mesenchyme מקיף את האפיתל, אשר ניתן לצפות כmesenchyme תמצית לתוכו invaginates האפיתל. הערה: חלק ההסרה נוספת של tissuדואר (כל שברי עצמות קטנים, שרירים, ורקמות חיבור) עשויים להיות נחוצים כדי להימנע מאיתות גורמים / צמיחה לשכנתה רקמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לתרבות, קציר 4 - 5 בלוטות וmesenchyme קשורים לכל צלחת (LGS צופה מייד עם נתיחה); לאסוף מינימום של 14 בלוטות לשל חיץ תמוגה RNA לRT-PCR 6 100 μl. </li></ol> 2. להכין צלחות לאקס תרבות Vivo הליך זה מבוסס על שהעסיק לבלוטות רוק פיתוח 7,8. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 200 μl של F12 DMEM (בתוספת 100 U / פניצילין מיליליטר ו 100 מיקרוגרם / סטרפטומיצין מיליליטר) תקשורת ותרבות עם 50 מיקרוגרם / חומצה אסקורבית מיליליטר ו -50 מיקרוגרם / מיליליטר הולוגרמות transferrin לצלחת microwell קוטר 50 מ&quot;מ עם רצפת זכוכית 7. הערה: F12 DMEM נבחר כפי שמצאנו אותו בעבר על מנת למקסם את המורפוגנזה בבלוטת הרוק העוברית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לצוף polycarb 13 מ&quot;ממסנן קרום Onate עם 0.1 מיקרומטר נקבוביות על גבי מדיה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שלב אופציונאלי: לדלל laminin 3-D 1: 1 עם DMEM / F12 כדי להפוך את הריכוז סופי של 3 מ&quot;ג / מיליליטר (200 להשתמש פיפטה μl לערבב בעדינות; צנטריפוגות 1 דקות אם מופיעות בועות). הוסף 15 μl זה מדולל laminin 3-D כדי לסנן. הערה: דילול זו נמצא להיות אופטימלי לשמירת LG במצב 3D שלה מבלי להתפשר על הסתעפות אפיתל. עם זאת, זה לא חיוני לתרבות של LG. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים 4 - 5 LG על מסנן או לlaminin. תרבות LGS vivo לשעבר ל24-48 שעות (איור 3) או לתקן עם PFA 4% עבור 20 דקות לניתוח נוסף על ידי qPCR או immunostaining (איור 4). לניתוח qPCR של רקמת בלוטות עוברית, עיין באל Rebustini et., 2011. לניתוח immunofluorescent של רקמות בלוטות עוברי עיינו בציטוטים הבאים: et al הופמן, (2002) ו- e שטיינברג.t אל., (2005). </li></ol> 3. עכבר אחרי לידה ומבוגרי דמעות בלוטות (LG): Dissection <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים את העכבר לאחר הלידה על פי הסטנדרטים של ועדת אתיקה של בעלי החיים המתאימה. לגורים לאחר לידה יום 8 או צעירים יותר, להרדים על ידי ניתוק הראש עם מספריים סטריליים. ליום לידה 8 ומעלה, לרסס פרווה עם 70% אתנול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לאתר את LG, להניח את העכבר לרוחב צד כלפי מעלה, תחת מיקרוסקופ לנתח עם תאורה מלמעלה. הערה: LG לאחר הלידה והמבוגרת גובל בעורק הראשי, השריר המלעס והדרמיס (ראה תרשים 5). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת מספריים לנתיחה קטנים, לעשות חתך קטן בעור רוחבי משם צריך להיות ממוקם LG. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת מלקחיים, למשוך לפתוח את האפידרמיס לכיוון האוזן כדי לחשוף את LG. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש במלקחיים כדי לשחרר בעדינות LG מרקמה הסובבת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברגע שהוא שוחרר מבית LG רקמה הסובב, להסיר את LG בקפידה על ידי הצינור,על ידי אחיזה בי הצינור והאפיטל המקיף את העין להתחבר (איור 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח LGS במאגר תמוגה RNA לRT-PCR, או לתקן עם PFA 4% עבור 20 דקות לimmunostaining. </li></ol>

<ol><li>Liu, K. C., Huynh, K., Grubbs, J., Davis, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autoimmunity+in+the+pathogenesis+and+treatment+of+keratoconjunctivitis+sicca%5BTitle%5D)+AND+%22Current+allergy+and+asthma+reports%22%5BJournal%5D)">Autoimmunity in the pathogenesis and treatment of keratoconjunctivitis sicca.</a> Current allergy and asthma reports. 14, 403(2014).</li>
<li>Makarenkova, H. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FGF10+is+an+inducer+and+Pax6+a+competence+factor+for+lacrimal+gland+development%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">FGF10 is an inducer and Pax6 a competence factor for lacrimal gland development.</a> Development. 127, Cambridge, England. 2563-2572 (2000).</li>
<li>Dartt, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+regulation+of+lacrimal+gland+secretory+processes%3A+relevance+in+dry+eye+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+retinal+and+eye+research%22%5BJournal%5D)">Neural regulation of lacrimal gland secretory processes: relevance in dry eye diseases.</a> Progress in retinal and eye research. 28, 155-177 (2009).</li>
<li>Nigam, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concise+review%3A+can+the+intrinsic+power+of+branching+morphogenesis+be+used+for+engineering+epithelial+tissues+and+organs%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+cells+translational+medicine%22%5BJournal%5D)">Concise review: can the intrinsic power of branching morphogenesis be used for engineering epithelial tissues and organs.</a> Stem cells translational medicine. 2, 993-1000 (2013).</li>
<li>Qu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycosaminoglycan-dependent+restriction+of+FGF+diffusion+is+necessary+for+lacrimal+gland+development%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Glycosaminoglycan-dependent restriction of FGF diffusion is necessary for lacrimal gland development.</a> Development. 139, Cambridge, England. 2730-2739 (2012).</li>
<li>Rebustini, I. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MT2-MMP-dependent+release+of+collagen+IV+NC1+domains+regulates+submandibular+gland+branching+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+cell%22%5BJournal%5D)">MT2-MMP-dependent release of collagen IV NC1 domains regulates submandibular gland branching morphogenesis.</a> Developmental cell. 17, 482-493 (2009).</li>
<li>Hoffman, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+Expression+Profiles+of+Mouse+Submandibular+Gland+Development%3A+FGFR1+Regulates+Branching+Morphogenesis+in+Vitro+Through+BMP-+and+FGF-Dependent+Mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Gene Expression Profiles of Mouse Submandibular Gland Development: FGFR1 Regulates Branching Morphogenesis in Vitro Through BMP- and FGF-Dependent Mechanisms.</a> Development. 129, 24-5778 (2002).</li>
<li>Steinberg, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FGFR2b+signaling+regulates+ex+vivo+submandibular+gland+epithelial+cell+proliferation+and+branching+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">FGFR2b signaling regulates ex vivo submandibular gland epithelial cell proliferation and branching morphogenesis.</a> Development. 132, Cambridge, England. 1223-1234 (2005).</li>
<li>Knox, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKnox%2C+SM+%22Parasympathetic+innervation+maintains+epithelial+progenitor+cells+during+salivary+organogenesis%22">Parasympathetic innervation maintains epithelial progenitor cells during salivary organogenesis</a>. 329, Science. New York, N.Y. 1645-1647 (2010).</li>
<li>Magenheim, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood+vessels+restrain+pancreas+branching%2C+differentiation+and+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Blood vessels restrain pancreas branching, differentiation and growth.</a> Development. 138, Cambridge, England. 4743-4752 (2011).</li>
<li>Jaskoll, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FGF10%2FFGFR2b+signaling+plays+essential+roles+during+in+vivo+embryonic+submandibular+salivary+gland+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+developmental+biology%22%5BJournal%5D)">FGF10/FGFR2b signaling plays essential roles during in vivo embryonic submandibular salivary gland morphogenesis.</a> BMC developmental biology. 5, 11(2005).</li>
<li>Takasato, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directing+human+embryonic+stem+cell+differentiation+towards+a+renal+lineage+generates+a+self-organizing+kidney%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Directing human embryonic stem cell differentiation towards a renal lineage generates a self-organizing kidney.</a> Nature cell biology. 16, 118-126 (2014).</li>
<li>Knox, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parasympathetic+stimulation+improves+epithelial+organ+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+communications%22%5BJournal%5D)">Parasympathetic stimulation improves epithelial organ regeneration.</a> Nature communications. 4, 1494(2013).</li>
</ol>

יש לי המחברים אין לחשוף.

צדדיות לתרבות ולתפעל את LG vivo לשעבר מספק יתרונות משמעותיים ללימוד הפיתוח שלה. זה כולל את המהירות שבה החוקר הוא מסוגל לבחון השערות והריבוי של הפרעות שניתן לבצע כדי להעריך עד כמה אפיתל, עצבי, אנדותל ותאי mesencyhmal אינטראקציה ליצירת האיברים. עם זאת, ישנם מספר סייגים כאשר ניצול מודל זה. ראשית, מכוח בידודה הבלוטה כבר לא מחוברת לכלי הדם ההיקפיים או במערכת עצבים, אשר עשוי להשפיע על מסלולי האיתות נבדקים אם הם עובדים בשיתוף עם אותות מועברים על ידי העצבים או כלי דם 9,10.</...

בלוטת הדמעות (LG) היא אחראית להפרשת דמעות מימית קריטית לחדות ראייה והבריאות, תחזוקה, והגנה על התאים של פני השטח העין. תוצאות תפקוד לקוי של LG באחת מההפרעות עיניות הנפוצות והמתישות ביותר: יבשים חסר מימית מחלות עיניים, אשר מאופיינת על ידי גירוי עיני, רגישות לאור וירידה בראייה 1. באדם LG מתגורר במסלול מעל הקצה הלטרלי של העין שבו 3 - 5 דמעות הפקדת צינוריות הפרשה על פני השטח של העין. יש העכבר שלושה זוגות של בלוטות עיניות גדולות, למד שרובם הוא בלוטת הדמעות הקדמית (LG) ממוקם וגחון לאוזן (exorbital) עם דמעות בנסיעות לעין באמצעות צינור הפרשה אחד. בדומה לאיברים אחרים בלוטי, LG מתפתח בתהליך של הסתעפות המורפוגנזה אפיתל שבניצן אפיתל יחיד בתוך mesenchyme תמצית עובר סבבים רבים של ניצן והיווצרות צינור למ &#39;רשת מקושרת ביניהם סבוכה של acini וצינוריות הפרשה (איור 1) 2. במהלך פיתוח האפיתל הופך כלי דם, כמו גם בכבדות innervated על ידי העצבים הפאראסימפתטית של גנגליון pterygopalatine ומידה פחותה יותר על ידי עצבים סימפטיים מצוואר רחם הגנגליון מעולה 3. יחסי גומלין בין כל אחד מהתאים האלה סוגים כלומר תאים עצביים, אפיתל, אנדותל וmesenchymal, חיוניים לתפקוד ולתחזוקה של הרקמות בוגרות. עם זאת, המנגנונים המולקולריים שבבסיס תיאום פיתוח LG והתחדשות כמו גם איך תקשורת בין-סוג התא מנחה תהליכים אלה עדיין לא ברורים. כניסתו של עוברי לשעבר טכניקות תרבות vivo אפשרה זיהוי של מסלולים התפתחותיים ומשובים באיברי הסתעפות מרובים 4. Culturing ex vivo נותן החוקר היכולת לתפעל את האיבר (chanical, גנטי או כימי) בתנאים מוגדרים, כמו גם לאפיין אינטראקציות התפתחות איברים ותאי תאים בזמן אמת. LG exorbital של העכבר הוא נוח מאוד בטכניקה זו ומחקרים שנעשו לאחרונה הוגדרו מערכות אזעקה המווסתות את התפתחותה 2,5. עם זאת, על אף הצורך להבין רמזים מולקולריים שבבסיס התפתחות LG והתחדשות, זה כרגע נשאר understudied, ככל הנראה בשל הקשיים הטכניים בבידוד האיברים. במאמר זה, אנו מתארים כיצד לבודד ולבצע תרבות vivo לשעבר של LG העכברי העוברי להגדיר תוכניות התפתחותיות.

<table><tbody><tr><td>DMEM/F12 ללא HEPES</td><td>SH3027101</td><td>תרמו מדעי</td><td></td></tr><tr><td>פניצילין-סטרפטומיצין</td><td>P0781</td> תמיסת אלבומין <td>סיגמא-אולדריץ'</td><td></td></tr><tr><td>מסרום בקר</td><td>A9576</td><td>תמיסת סיגמא-אולדריץ'</td><td></td></tr><tr><td>פרפורמלדהיד 16%</td><td>15710</td><td>מדעי מיקרוסקופ אלקטרונים</td><td>מדולל ל-4% ב-1x PBS</td></tr><tr><td>פוספט מאגר מלח 10x</td><td>BP665-1</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td></td></tr><tr><td>פוספט מאגר מי מלח 1x</td><td></td><td></td><td>מוכן מ-10x</td></tr><tr><td>בקר הולו-טרנספרין</td><td>T1283</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>25&nbsp; תמיסת מלאי מ"ג/מ"ל במים. הקפיא מינכסות חד פעמיות ב-20&nbsp; &deg;C. הוסף למדיה DMEM/F12 לריכוז סופי של 50&nbsp; &mu; גרם/מ"ל.</td></tr><tr><td>חומצה L-אסקורבית (ויטמין C)</td> <td>A4544</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>25&nbsp; תמיסת מלאי מ"ג/מ"ל במים. הקפיא מינכסות חד פעמיות ב-20&nbsp; &deg;C. הוסף למדיה DMEM/F12 לריכוז סופי של 50&nbsp; &mu; גרם/מ"ל.</td></tr><tr>ניתן להשתמש גם <td>בכלים שטופלו בתרבית רקמות BioLite 100 מ"מ</td><td>130182</td><td>צלחות שאינן מטופלות בתרבית רקמות</td> של <td>Thermo Scientific</td>.</tr><tr><td>מיקרוסקופ סטריאו עם תאורה תת-שלבית</td><td>Stemi 2000</td><td>Carl Zeiss</td><td>ניתן להשתמש בכל מיקרוסקופ מנתח סטריאו בעל בסיס אור מועבר.</td></tr><tr><td>בסיס תאורה תת-שלב למיקרוסקופ סטריאו</td><td>TLB 4000</td><td>Diagnostics Instruments, Inc.</td><td></td></tr><tr><td>פלקון 35&nbsp; מ"מ ניתן להשתמש בכלים שטופלו בתרבית רקמות</td><td>353001</td><td>קורנינג</td> ניתן <td>להשתמש גם בצלחות שאינן מטופלות בתרבית רקמות.</td></tr><tr><td>כלי תחתית זכוכית לא מצופים 50 מ"מ</td><td>P50G-1.5-14-F</td><td>MatTek Corporation</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ פלואורסצנטי רחב שדה</td><td>Axio Observer Z1</td><td>Carl Zeiss</td><td>ניתן להשתמש בכל מיקרוסקופ פלואורסצנטי (מיקרוסקופ זקוף, הפוך או סטריאו) לניטור ביטוי GFP בהגדלה נמוכה באמצעות מצלמה דיגיטלית מחוברת.</td></tr><tr><td>מיקרוסקופ קונפוקלי</td><td>TCS SP5</td><td>Leica Microsystems</td><td>מיקרוסקופיה קונפוקלית נחוצה כדי לראות מבני תאים מפורטים. ניתן להשתמש בכל מיקרוסקופ קונפוקלי.</td></tr><tr><td>מלקחיים מיקרו-עדינים של SWISS, #5 (11.2&nbsp; ס"מ)</td> <td>17-305X</td><td>Integra LifeSciences Corporation</td><td>נדרשים טיפים עדינים להסרת מזנכימה מהאפיתל. ניתן להשתמש גם במחטי טונגסטן.</td></tr><tr><td>מלקחיים סטנדרטיים של Dumont, #5 (11&nbsp; ס"מ)</td> <td>91150-20</td><td>Fine Science Tools (ארה"ב), בע"מ.</td><td>אידיאלי לקצירת בלוטות מעוברים.</td></tr><tr><td>ידיות סכין כירורגיות מפלסטיק לשימוש חוזר, סגנון מס' 3.</td><td>4-30</td><td>Integra LifeSciences Corporation</td><td></td></tr><tr><td>להבים כירורגיים סטריליים מנירוסטה, מס' 10</td><td>4-310</td><td>Integra LifeSciences Corporation</td><td></td></tr><tr><td>RNAqueous-Micro Total RNA Isolation</td><td>Kit AM1931</td><td>Life Technologies</td><td></td></tr><tr><td>Cultrex 3D Culture Matrix Laminin I</td><td>3446-005-01</td><td>Trevigen</td><td>6 מ"ג/מ"ל מלאי מדולל 1:1 עם DMEM/F12</td></tr><tr><td>Crl:CD1 (ICR) עכברים</td><td></td><td>מעבדות צ'ארלס ריבר</td><td>העוברים נקצרים ביום ה-14 (כאשר יום גילוי הפקק מוגדר כיום 0).</td></tr><tr><td>ממברנות הידרופיליות חרוטות במסלול נוקלאופורים, 0.1&nbsp; &mu; גודל נקבוביות M, 13&nbsp; מ"מ</td><td>110405</td><td>ווטמן</td><td></td></tr><tr><td>בהריון מתוזמן Pax6-Cre, עכברי GFP</td><td>Tg(Pax-Cre, GFP)1Pgr</td><td>מעבדת ג'קסון</td><td>עכברים אופציונליים ללימוד כיצד לאתר את ה-LG.</td></tr></tbody></table>

המניפולציה murine דמעות בלוטת

Manipulating the Murine Lacrimal Gland

בלוטת הדמעות (LG) מפרישה דמעות מימיות הכרחיות לשמירה על המבנה והתפקוד של הקרנית, רקמה שקופה חיונית לראייה. באדם LG יחיד מתגורר במסלול מעל הקצה לרוחב של כל עין ומספקת דמעות על פני השטח של העין באמצעות 3 - 5 צינורות. יש העכבר שלושה זוגות של בלוטות עיניות גדולות, למד שרובם הוא בלוטת דמעות exorbital הקדמית (LG) ממוקם וגחון לאוזן. בדומה לאיברים אחרים בלוטי, LG מתפתח בתהליך של הסתעפות המורפוגנזה אפיתל שבניצן אפיתל יחיד בתוך mesenchyme תמצית עובר סבבים רבים של ניצן והיווצרות צינור כדי ליצור רשת מקושרת ביניהם סבוכה של acini וצינוריות הפרשה. תהליך מורכב זה תועד היטב באיברים רבים אפיתל אחרים כגון הלבלב ובלוטות רוק. עם זאת, LG היה הרבה פחות חקר ומנגנוני השליטה המורפוגנזה הם גרוע תחתעמד. אנו חושדים כי תת-ייצוג זה כמערכת מודל הוא תוצאה של הקשיים הקשורים במציאה, לנתח וculturing LG. לכן, כאן אנו מתארים טכניקות לנתיחה לעובריים קציר ולאחר הלידה LG ושיטות לתרבות vivo לשעבר של הרקמה.

LG מתפתח בתהליך של הסתעפות המורפוגנזה אפיתל. תמונות Brightfield של LGS העוברי גזור בE14, E15, E16, E17, וP2 להמחיש את האירוע הזה. <img alt="איור 1" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51970/51970fig1highres.jpg" width="600"> איור 1. LG מתפתח בתהליך של אפיתל הסתעפות המורפוגנזה. תמונות Brightfield של LGS העוברי טרי גזור בE14, E15, E16, E17 ו- P2. <...

בלוטת הדמעות (LG) היא איבר הסתעפות שמייצר את הרכיבים מימיים של דמעות הכרחיות לשמירה על חזון ועל בריאות העין. כאן אנו מתארים עכברי נתיחת LG ולשעבר טכניקות תרבות vivo לפענח מסלולי איתות מעורבים בפיתוח LG.

המניפולציה Murine דמעות בלוטת

The lacrimal gland (LG) secretes aqueous tears necessary for maintaining the structure and function of the cornea, a transparent tissue essential for ...

המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא לנתח את התפתחות בלוטת הדמעות באמצעות גישת ex vivo למניפולציה וניתוח של אירועי איתות במהלך התפתחות הבלוטה. זה מושג על ידי ניתוח תחילה של בלוטות הדמעות של עוברי יום 16. כשלב שני, הבלוטות מונחות על פילטרים, צפים בתרבית, מדיום המכיל מעכבי מולקולות קטנות או גורמי גדילה המשנים את התפתחות בלוטות הדמעות.לאחר 24 שעות, הבלוטות מקובעות וכתם חיסוני לחלבונים ההתפתחותיים המעניינים. בסופו של דבר, ניתן לנתח את השינויים בביטוי החלבון במהלך התפתחות בלוטת הדמעות ex vivo על ידי מיקרוסקופיה אימונופלואורסצנטית. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום התפתחות בלוטת הדמעות.לדוגמה, מהם מנגנוני האיתות המגדירים את בלוטת הדמעות? מורפוגנזה הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית מכיוון שקשה לזהות את בלוטת הדמעות במהלך ההתפתחות העוברית המוקדמת ללא הדרכה חזותית ותרגול באיתורה. כדי לקצור את בלוטת הדמעות מעכבר עוברי, השתמש באתנול 70% כדי לעקר את הצד הגחוני של יום עוברי, 14 עד 16 עכברים בהריון.לאחר מכן צובטים את העור וחותכים את העור לאורך קו האמצע של החיה כדי לחשוף את הצפק, חותכים את הצפק כדי לחשוף את חלל הבטן והשריר ומסירים את שתי קרני השריר ומכניסים ל-PBS קר. לאחר מכן, השתמש במלקחיים מספר חמש כדי להעביר את העוברים משקי מי השפיר לצלחת פטרי סטרילית שנייה המכילה PBS קר תוך הקפדה לא לגעת בעיניים או באזור הראש. לאחר ניתוק הראש מהגו, ממש מתחת ללסת התחתונה, סובב את הראש כך שהלסת התחתונה תהיה כעת על צלחת הניתוח.לאחר מכן השתמשו במלקחיים כדי לייצב את הראש ובאזמל כדי להסיר כרבע מהצד הגבי של המוח, כוונו את הראש כך שהאזמל יוכל לנקב את האף בין העיניים, ואז עשו חתך דרך מרכז הראש כך שהעיניים יהיו כעת בחצאים נפרדים. לאחר מכן, באמצעות התאורה מעל ומתחת, תפסו את העור מהפינה התחתונה האחורית של העין ומשכו בזהירות את העור בעזרת המלקחיים כדי לחשוף את בלוטת הדמעות, שאמורה להופיע כניצן על צינור בתוך מזנכימה מרוכזת כהה יותר. נתח בזהירות את בלוטת הדמעות ואת המזנכימה הקשורה הרחק מהרקמה שמסביב, והקפיד לא לתפוס את בלוטת הדמעות או את הצינור הקשור אליה.לאחר מכן, ברגע שבלוטת הדמעות משוחררת מהרקמה שמסביב, אחזו בעדינות באפיתל המקיף את העין בבסיס צינור בלוטת הדמעות, והסירו את הבלוטה כולה. הקפידו לשמר את המין צ'י המקיף את האפיתל, אותו ניתן לראות כרקמה מרוכזת שלתוכה פולש האפיתל. לאחר מכן תרבית ארבע עד חמש בלוטות דמעות לכל מסנן בצלחת פטרי המכילה מדיום תרבית ומעכבי מולקולות קטנות או גורמי גדילה מעניינים למשך 24 שעות כדי לקצור את בלוטת הדמעות מעכבר לאחר לידה או מבוגר, תחילה לרסס את אזור העיניים באתנול 70%.לאחר מכן הניחו את הצד הצדדי של החיה כלפי מעלה תחת מיקרוסקופ מנתח עם תאורה מלמעלה. לאחר מכן, השתמש במספריים לדיסקציה קטנה כדי לבצע חתך באפידרמיס לרוחב מהמקום שבו יש למקם את בלוטת הדמעות. לאחר מכן משוך את האפידרמיס לכיוון האוזן כדי לחשוף את בלוטת הדמעות, אשר בעכבר לאחר הלידה והבוגר גובלת בעורק הצוואר, השריר השריר והדרמיס שחרר בעדינות את בלוטת הדמעות מהרקמה שמסביב בעזרת המלקחיים, ואז ברגע שבלוטת הדמעות משתחררת מאחיזת הרקמה שמסביב, היכן שהצינור והאפיתל המקיף את העין מתחברים ומסירים בזהירות את הבלוטה.לבסוף, יש לתקן את בלוטות הדמעות עם 4%para formaldehyde למשך 20 דקות לפני צביעה חיסונית. עבור החלבונים ההתפתחותיים המעניינים, בלוטת הדמעות מתפתחת בתהליך של מורפוגנזה של הסתעפות אפיתל. תמונות השדה הבהירות הללו של בלוטות דמעות עובריות, שנותחו בימים העובריים 14, 15, 16, 17 וביום השני שלאחר הלידה, ממחישות את התהליך הזה.שימו לב שככל שהאפיתל גדל בגודלו, כמות המזנכימה פוחתת כפי שמוצג בתמונות אלה. בלוטות דמעות מתפתחות בתנאי תרבית vivo באופן דומה לתרביות בלוטות in vivo, וניתן לתקן בלוטות דמעות שזה עתה נותחו לניתוח אימונו-פלואורסצנטי. לדוגמא, בתמונה זו, צביעת עצבי האפיתל וכלי הדם.בעובר, ניתן לראות בלוטת דמעות 16 מבלוטת דמעות מסוג CD אחד עובר אחד בבלוטת הדמעות על ידי עכברי PAC שישה CRE לאחר לידה או בוגרים מקל על זיהוי מהיר ונתיחה של בלוטת הדמעות מבעלי חיים טרנסגניים אלה. למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנה לגבי התפתחות בלוטת הדמעות, ניתן ליישם אותה גם על מערכות אחרות כגון תפקוד לקוי של בלוטת הדמעות עקב מחלה אוטואימונית או טיפול בקרינה. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לאתר ולבודד את בלוטת הדמעות של העכברים לצורך ניתוח תרבית ex vivo.

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

סרטון זה מתאר את ההליך הכירורגי להסרת שני החלקים: מישוש ואורביטל של בלוטת הדמעות העליונה מארנב ליצירת מודל של מחלת עין יבשה. מודל ארנב זה מתאים למחקרים של הומאוסטזיס משטח העין, פתופיזיולוגיה וטיפולי עיניים.

הסרת בלוטת הדמעות העליונה: טכניקה כירורגית להסרת החלקים המישושיים והמסלוליים של בלוטת הדמעות העליונה ממודל ארנב

בסרטון זה אנו מתארים הליך כירורגי להסרת בלוטת הדמעות הגדולה והנחותה ממודל ארנב כדי ללמוד את ההשפעה על ייצור הדמעות בחיה.

הסרת בלוטת דמעות נחותה ממודל ארנב: הליך כירורגי להסרת בלוטת הדמעות התחתונה הגדולה יותר ממסלול עין הארנב

סרטון זה מתאר את ההליך לגרימת מחלת עין יבשה במודל ארנב באמצעות הזרקה של Concanavalin A לאונה המסלולית של בלוטת הדמעות העליונה. המודל שפותח שימושי לחקר יעילותן של תרופות שונות לטיפול במחלת העין היבשה.

ביצוע הזרקה לאונה אורביטלית של בלוטת הדמעות העליונה: טכניקה לגרימת מחלת עין יבשה במודל ארנב

בלוטת lacrimal (LG) יש שני סוגי תאים המבטא α-השריר החלקה אקטין (αSMA): מיואפיתל תאים (mecs) ו קרום הלב. MECs הם של מוצא העורי, נמצא ברקמות הבלוטות רבות, בעוד קרום הלב הם תאים שריר וסקולריים חלקה של מקור אנדועורי. פרוטוקול זה מבודד מנות וכלי קרום.

בידוד של תאים מיואפיתל מתוך למבוגרים מורנה לקטמל בלוטות הלסת

מאמר זה מתאר את ההתפתחות של שיטה לגרום למחלת עיניים חריפה או כרונית בארנבים על ידי הזרקת concanavalin A לכל החלקים של מערכת בלוטת מסלולית לקטמאל. שיטה זו, מעולה לאלה שכבר דיווחו, יוצר מודל מותאם, יציב של עין יבשה מתאים לחקר של סוכני תרופתי.

מודל ארנב של מחלה מימית לקויה עין יבש הנגרמת על ידי Concanavalin זריקה לתוך בלוטות לקטמאל: יישום ללימודי יעילות הסמים

הגישה הרומן מוצגת כדי לגרום כרונית מחלת עיניים יבשות בארנבים על ידי הסרת בניתוח כל בלוטות מסלולית לקטמאל. שיטה זו, ברורה מאלה שדווחו בעבר, מייצרת מודל יציבה, מובחנות של עין יבשה לקויה מימית מתאים היטב לחקור את הפיזיולוגיה של הקרע ו פתופסיולוגיה therapeutics עינית.

הקמת מודל העין יבש קשה באמצעות השלמת דקרייוקטומיה בארנבונים

שיטת התרבית התלת-ממדית, ללא סרום, לתאי גזע של בלוטת דמעה בוגרת (LG) מבוססת היטב על אינדוקציה של היווצרות והתמיינות של אורגנואידים LG לתאים דמויי אצינר או צינור.

מערכת תרבית תלת-ממדית, ללא סרום, לתאי גזע של בלוטת הדמעות

פרוטוקול זה מתאר כיצד להקים, לתחזק, לשנות גנטית, להבדיל, לאפיין תפקודית ולהשתיל אורגנואידים של בלוטת הדמעות שמקורם ברקמת עכבר ראשונית ורקמה אנושית.

הקמה, תחזוקה, בידול, מניפולציה גנטית והשתלה של אורגנואידים של עכבר ובלוטת הדמעות האנושית

כאן, אנו מבססים מודל חולדה של תפקוד לקוי של בלוטת הדמעות כדי לספק בסיס לחקר עין יבשה חסרת מים.

מודל עין יבשה של חולדה עם תפקוד לקוי של בלוטת הדמעות המושרה על ידי סקופולמין

כאן, אנו מציגים שיטה לבסס מודל עכברי של עין יבשה חסרה מימית על ידי כריתת בלוטות הדמעות החוץ-אורביטליות והאינפרא-אורביטליות ולהעריך את השינויים במשטח העין בעין יבשה חסרה במימית.

הקמת מודל עכבר של עין יבשה במחסור מימי

למדו לבודד בלוטות דמעות ממבטאים ביום 16 להתפתחות עוברית ולגדל אותן במערכת תרבית ex vivo. שיטה זו מאפשרת ניתוח מסלולי מסרים ושינויים בביטוי חלבונים במיקרוסקופיה פלואורסצנטית.

המניפולציה Murine דמעות בלוטת

גלה סרטונים נוספים