Name: בידוד והתרבות של ניתק עצב סנסורי מאפרוח עוברים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-09-24T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 16 s
Description: למדו שיטה לבידוד והתרבה של נוירונים סנסוריים מאפרוחי עוף. הפרוטוקול כולל איסוף גנגליון שורש עצבי, פירוק תאים וזיהוי סמנים נוירונליים באימונוציטוכימיה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

ברצוננו להודות לאליסון Philbrook, בלינדה Barbagallo ומייקל פרנסיס להערות תובנה על נייר זה. המחקר המדווח בפרסום זה נתמכה על ידי הפרס R15 AREA 1R15NS070172-01A1 הוענק לMLL.

<ol><li>Millet, L. J., Gillette, M. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Over+a+century+of+neuron+culture%3A+from+the+hanging+drop+to+microfluidic+devices%5BTitle%5D)+AND+%22The+Yale+journal+of+biology+and+medicine%22%5BJournal%5D)">Over a century of neuron culture: from the hanging drop to microfluidic devices.</a> The Yale journal of biology and medicine. 85, 501-521 (2012).</li>
<li>Guan, W., Puthenveedu, M. A., Condic, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensory+neuron+subtypes+have+unique+substratum+preference+and+receptor+expression+before+target+innervation%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+neuroscience+%3A+the+official+journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Sensory neuron subtypes have unique substratum preference and receptor expression before target innervation.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 23, 1781-1791 (2003).</li>
<li>Kapitein, L. C., Hoogenraad, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Which+way+to+go%3F+Cytoskeletal+organization+and+polarized+transport+in+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+cellular+neurosciences%22%5BJournal%5D)">Which way to go? Cytoskeletal organization and polarized transport in neurons.</a> Molecular and cellular neurosciences. 46, 9-20 (2011).</li>
<li>Kapitein, L. C., Yau, K. W., Hoogenraad, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtubule+dynamics+in+dendritic+spines%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Microtubule dynamics in dendritic spines.</a> Methods in cell biology. 97, 111-132 (2010).</li>
<li>Snow, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pioneering+studies+on+the+mechanisms+of+axonal+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+neurobiology%22%5BJournal%5D)">Pioneering studies on the mechanisms of axonal regeneration.</a> Developmental neurobiology. 71, 785-789 (2011).</li>
<li>Melli, G., Hoke, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dorsal+Root+Ganglia+Sensory+Neuronal+Cultures%3A+a+tool+for+drug+discovery+for+peripheral+neuropathies%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+opinion+on+drug+discovery%22%5BJournal%5D)">Dorsal Root Ganglia Sensory Neuronal Cultures: a tool for drug discovery for peripheral neuropathies.</a> Expert opinion on drug discovery. 4, 1035-1045 (2009).</li>
<li>Condic, M. L., Letourneau, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ligand-induced+changes+in+integrin+expression+regulate+neuronal+adhesion+and+neurite+outgrowth%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Ligand-induced changes in integrin expression regulate neuronal adhesion and neurite outgrowth.</a> Nature. 389, 852-856 (1997).</li>
<li>Lemons, M. L., Condic, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combined+integrin+activation+and+intracellular+cAMP+cause+Rho+GTPase+dependent+growth+cone+collapse+on+laminin-1%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+neurology%22%5BJournal%5D)">Combined integrin activation and intracellular cAMP cause Rho GTPase dependent growth cone collapse on laminin-1.</a> Experimental neurology. 202, 324-335 (2006).</li>
<li>Beller, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+sensory+neuron+growth+cone+and+filopodial+responses+to+structurally+diverse+aggrecan+variants%2C+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+neurology%22%5BJournal%5D)">Comparison of sensory neuron growth cone and filopodial responses to structurally diverse aggrecan variants, in vitro.</a> Experimental neurology. 247, 143-157 (2013).</li>
<li>Condic, M. L., Snow, D. M., Letourneau, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+neurons+adapt+to+the+inhibitory+proteoglycan+aggrecan+by+increasing+integrin+expression%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+neuroscience+%3A+the+official+journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Embryonic neurons adapt to the inhibitory proteoglycan aggrecan by increasing integrin expression.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 19, 10036-10043 (1999).</li>
<li>Lemons, M. L., Barua, S., Abanto, M. L., Halfter, W., Condic, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adaptation+of+sensory+neurons+to+hyalectin+and+decorin+proteoglycans%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+neuroscience+%3A+the+official+journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Adaptation of sensory neurons to hyalectin and decorin proteoglycans.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 25, 4964-4973 (2005).</li>
<li>Guan, W., Condic, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+Netrin-1%2C+Neogenin+and+cUNC-5H3+expression+during+chick+dorsal+root+ganglia+development%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Expr+Patterns%22%5BJournal%5D)">Characterization of Netrin-1, Neogenin and cUNC-5H3 expression during chick dorsal root ganglia development.</a> Gene Expr Patterns. 3, 369-373 (2003).</li>
<li>Guan, W., Wang, G., Scott, S. A., Condic, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shh+influences+cell+number+and+the+distribution+of+neuronal+subtypes+in+dorsal+root+ganglia%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+biology%22%5BJournal%5D)">Shh influences cell number and the distribution of neuronal subtypes in dorsal root ganglia.</a> Developmental biology. 314, 317-328 (2008).</li>
<li>Kolpak, A., Zhang, J., Bao, Z. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sonic+hedgehog+has+a+dual+effect+on+the+growth+of+retinal+ganglion+axons+depending+on+its+concentration%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+neuroscience+%3A+the+official+journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Sonic hedgehog has a dual effect on the growth of retinal ganglion axons depending on its concentration.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 25, 3432-3441 (2005).</li>
<li>Kolpak, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Negative+guidance+factor-induced+macropinocytosis+in+the+growth+cone+plays+a+critical+role+in+repulsive+axon+turning%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+neuroscience+%3A+the+official+journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Negative guidance factor-induced macropinocytosis in the growth cone plays a critical role in repulsive axon turning.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 29, 10488-10498 (2009).</li>
<li>Lemons, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrins+and+cAMP+mediate+netrin-induced+growth+cone+collapse%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+research%22%5BJournal%5D)">Integrins and cAMP mediate netrin-induced growth cone collapse.</a> Brain research. 1537, 46-58 (2013).</li>
<li>Snow, D. M., Atkinson, P. B., Hassinger, T. D., Letourneau, P. C., Kater, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chondroitin+sulfate+proteoglycan+elevates+cytoplasmic+calcium+in+DRG+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+biology%22%5BJournal%5D)">Chondroitin sulfate proteoglycan elevates cytoplasmic calcium in DRG neurons.</a> Developmental biology. 166, 87-100 (1994).</li>
<li>Snow, D. M., Brown, E. M., Letourneau, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+cone+behavior+in+the+presence+of+soluble+chondroitin+sulfate+proteoglycan+%28CSPG%29%2C+compared+to+behavior+on+CSPG+bound+to+laminin+or+fibronectin%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Dev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Growth cone behavior in the presence of soluble chondroitin sulfate proteoglycan (CSPG), compared to behavior on CSPG bound to laminin or fibronectin.</a> Int J Dev Neurosci. 14, 331-349 (1996).</li>
<li>Snow, D. M., Lemmon, V., Carrino, D. A., Caplan, A. I., Silver, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sulfated+proteoglycans+in+astroglial+barriers+inhibit+neurite+outgrowth+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+neurology%22%5BJournal%5D)">Sulfated proteoglycans in astroglial barriers inhibit neurite outgrowth in vitro.</a> Experimental neurology. 109, 111-130 (1990).</li>
<li>Snow, D. M., Letourneau, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurite+outgrowth+on+a+step+gradient+of+chondroitin+sulfate+proteoglycan+%28CS-PG%29%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+neurobiology%22%5BJournal%5D)">Neurite outgrowth on a step gradient of chondroitin sulfate proteoglycan (CS-PG).</a> Journal of neurobiology. 23, 322-336 (1992).</li>
<li>Snow, D. M., Mullins, N., Hynds, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nervous+system-derived+chondroitin+sulfate+proteoglycans+regulate+growth+cone+morphology+and+inhibit+neurite+outgrowth%3A+A+light%2C+epifluorescence%2C+and+electron+microscopy+study%5BTitle%5D)+AND+%22Microsc+Res+Tech%22%5BJournal%5D)">Nervous system-derived chondroitin sulfate proteoglycans regulate growth cone morphology and inhibit neurite outgrowth: A light, epifluorescence, and electron microscopy study.</a> Microsc Res Tech. 54, 273-286 (2001).</li>
<li>Barres, B. A., Silverstein, B. E., Corey, D. P., Chun, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunological%2C+morphological%2C+and+electrophysiological+variation+among+retinal+ganglion+cells+purified+by+panning%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Immunological, morphological, and electrophysiological variation among retinal ganglion cells purified by panning.</a> Neuron. 1, 791-803 (1988).</li>
<li>Firnhaber, C., Hammarlund, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuron-specific+feeding+RNAi+in+C.+elegans+and+its+use+in+a+screen+for+essential+genes+required+for+GABA+neuron+function%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+genetics%22%5BJournal%5D)">Neuron-specific feeding RNAi in C. elegans and its use in a screen for essential genes required for GABA neuron function.</a> PLoS genetics. 9, e1003921(2013).</li>
<li>Hamburger, V., Hamilton, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+series+of+normal+stages+in+the+development+of+the+chick+embryo.+1951%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+dynamics+%3A+an+official+publication+of+the+American+Association+of+Anatomists%22%5BJournal%5D)">A series of normal stages in the development of the chick embryo. 1951.</a> Developmental dynamics : an official publication of the American Association of Anatomists. 195, 231-272 (1992).</li>
<li>Hollyday, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chick+wing+innervation.+I.+Time+course+of+innervation+and+early+differentiation+of+the+peripheral+nerve+pattern%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+comparative+neurology%22%5BJournal%5D)">Chick wing innervation. I. Time course of innervation and early differentiation of the peripheral nerve pattern.</a> The Journal of comparative neurology. 357, 242-253 (1995).</li>
<li>Hollyday, M., Morgan-Carr, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chick+wing+innervation.+II.+Morphology+of+motor+and+sensory+axons+and+their+growth+cones+during+early+development%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+comparative+neurology%22%5BJournal%5D)">Chick wing innervation. II. Morphology of motor and sensory axons and their growth cones during early development.</a> The Journal of comparative neurology. 357, 254-271 (1995).</li>
<li>Honig, M. G., Kueter, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+expression+of+cell+adhesion+molecules+on+the+growth+cones+of+chick+cutaneous+and+muscle+sensory+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+biology%22%5BJournal%5D)">The expression of cell adhesion molecules on the growth cones of chick cutaneous and muscle sensory neurons.</a> Developmental biology. 167, 563-583 (1995).</li>
<li>Tosney, K. W., Landmesser, L. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+the+major+pathways+for+neurite+outgrowth+in+the+chick+hindlimb%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+biology%22%5BJournal%5D)">Development of the major pathways for neurite outgrowth in the chick hindlimb.</a> Developmental biology. 109, 193-214 (1985).</li>
<li>Dontchev, V. D., Letourneau, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nerve+growth+factor+and+semaphorin+3A+signaling+pathways+interact+in+regulating+sensory+neuronal+growth+cone+motility%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+neuroscience+%3A+the+official+journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Nerve growth factor and semaphorin 3A signaling pathways interact in regulating sensory neuronal growth cone motility.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 22, 6659-6669 (2002).</li>
<li>Munoz, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ephrin-A5+inhibits+growth+of+embryonic+sensory+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+biology%22%5BJournal%5D)">Ephrin-A5 inhibits growth of embryonic sensory neurons.</a> Developmental biology. 283, 397-408 (2005).</li>
<li>Roche, F. K., Marsick, B. M., Letourneau, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+synthesis+in+distal+axons+is+not+required+for+growth+cone+responses+to+guidance+cues%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+neuroscience+%3A+the+official+journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Protein synthesis in distal axons is not required for growth cone responses to guidance cues.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 29, 638-652 (2009).</li>
<li>Condic, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adult+neuronal+regeneration+induced+by+transgenic+integrin+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Adult neuronal regeneration induced by transgenic integrin expression.</a> Journal of Neuroscience. 21, 4782-4788 (2001).</li>
<li>Hory-Lee, F., Russell, M., Lindsay, R. M., Frank, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurotrophin+3+supports+the+survival+of+developing+muscle+sensory+neurons+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Neurotrophin 3 supports the survival of developing muscle sensory neurons in culture.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90, 2613-2617 (1993).</li>
<li>Toyofuku, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FARP2+triggers+signals+for+Sema3A-mediated+axonal+repulsion%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+neuroscience%22%5BJournal%5D)">FARP2 triggers signals for Sema3A-mediated axonal repulsion.</a> Nature neuroscience. 8, 1712-1719 (2005).</li>
<li>Steinmetz, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+enhancement+of+the+intrinsic+growth+capacity+of+sensory+neurons+combined+with+the+degradation+of+inhibitory+proteoglycans+allows+functional+regeneration+of+sensory+axons+through+the+dorsal+root+entry+zone+in+the+mammalian+spinal+cord%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+neuroscience+%3A+the+official+journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Chronic enhancement of the intrinsic growth capacity of sensory neurons combined with the degradation of inhibitory proteoglycans allows functional regeneration of sensory axons through the dorsal root entry zone in the mammalian spinal cord.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 25, 8066-8076 (2005).</li>
</ol>

יש לי המחברים אין לחשוף.

כאן אנו מציגים פרוטוקולים מפורטים לבידוד וניתק culturing עצב סנסורי מעובר אפרוח. הליך זה יוצר אוכלוסייה מועשרת של הנוירונים גדלו וחסונה במבחנה 7,8,10,16. ניתן ליישם טכניקות תאיות ומולקולריות רבות לנוירונים בתרבית אלה, כוללים immunocytochemistry, אשר מתואר כאן. פרוטוקול זה היה בשימוש לאחרונה על מנת להעריך את עוצמת immunolabeled integrins מופעל בקונוסים צמיחה חושיים 8,16 כמותית. במחקרים הקודמים אלה, תוכנה נעשה שימוש כדי ליצור קווי המתאר של 20 מיקרון הק...

הנוירונים הם תאים מורכבים שנושאים מידע חיוני עבור מגוון רחב של פונקציות, כולל תחושה, ראייה, תנועה מוטורית, למידה, וזיכרון. ייחודי מסוגי תאים אחרים, תאי עצב להרחיב את התהליכים כמו זרוע, האקסונים נקראים, כדי ליצור כבישים עצביים חיוניים לתקשורת. במהלך תאי פיתוח מתמחה ממוקמים בקצוות של אקסונים הגובר, נקרא קונוסים צמיחה, לנווט קונצרט של רמזים תאיים להוביל את האקסון ליעד המתאים. המנגנונים המולקולריים המורכבים העומדים בבסיס ניווט חרוט צמיחה אינם מובנים במלואם. כדי להבין טוב יותר את המנגנונים האלה, חוקרים השתמשו במודלי תרבית תאים ללמוד הנוירונים בסביבה חוץ גופית מוגדרת ופשוטה ב. הנוירונים לומדים בתרבות 1 הוביל להתקדמות משמעותית בהבנה שלנו של ביולוגיה של תא העצבי ובם: הבחנה עצבית 2, דינמיקת cytoskeletal, אנדוציטוזה וסחר, דנדריטתקנה 3,4, התחדשות axonal 5, ומצבים קליניים כגון מחלות עצבים 6. בנוסף, נוירונים בתרבית הם נוחים מאוד למגוון רחב של טכניקות מחקר כוללים immunocytochemistry, שיתוף immunoprecipitation פני תא, כתם מערבי, transfection, RNAi, והדמיה לחיות כגון ניתוח timelapse של תנועתיות החרוט צמיחה. לפיכך, culturing נוירונים עיקרי הוא גישה רבת עוצמה כדי להבהיר היבטים רבים של הביולוגיה של התא של תאי עצב. מודל תרבית תאים מספק לחוקרים עם שליטה מפורטת על תנאים ומשתנים סביבתיים. לדוגמא, ניתן להשפיע המצע שעליו נוירונים הם מצופים (ולגדול על) בקלות. כאן, אנו מספקים הוראות מפורטות ליצירת שני מצע ברור, אחד עם ריכוז laminin-1 נמוך והשני עם להרוות ריכוזים של laminin-1. באופן מפתיע, ריכוזים שונים של אותה המולקולה יכולים להיות השפעה דרמטיתעל המצב הפנימי של תאי עצב, כמו גם את רכב פני השטח של תאים שלהם. לדוגמא, רמות תאיות של רמות cAMP ופני השטח של integrins שונות באופן משמעותי בתאי עצב מצופים על שני 7,8 substrata אלה. מחקרים נוספים הראו כי מולקולות אחרות, ובכלל זה proteoglycans פיברונקטין וכונדרואיטין סולפט, השפעת הביטוי של מולקולות פני השטח של תא ותנועתיות עצביות 7-11. בנוסף, מולקולות מסיסה כגון neurotrophins וneurotropins גם להשפיע הרכב קרום תא ותנועתיות עצביות 12-16 והוא יכול להיות בקלות ובאופן מדויק מניפולציות במודל תרבית תאים. כאן, אנו מתארים שיטות לבודד ותרבות מנותקת עצב סנסורי מעובר חומוס. הליך זה נעשה שימוש כדי להפוך את פריצות דרך משמעותיות בנוירוביולוגיה, ובכלל זה תולדת האקסון 5,7,8,10,11,16-21 והיה שונה מהליך שנועד לבודד את תאי הגנגליון 22. ישמספר יתרונות לגישה זו. ראשית, תכונות רבות של גנגליון שורש הגבי חומוס פיתוח (DRG) הם גם מתאפיינים כוללים מסגרת הזמן ללידה, הארכת האקסון, וביטוי חלבון פרופילי 2,23-28, ובכך לספק בסיס מאלף שעליו לבנות אינפורמטיבי בניסויי מבחנה. שנית, ניתק תרבויות עצביות מאפשרות לחוקר ללמוד באופן ישיר יותר נוירונים בהשוואה לגישות חלופיות באמצעות explants שלם DRG (המכיל תאי עצב ותאים שאינם עצביים) ו / או תרבויות מעורבות המכיל גם תאי עצב ניתק ותאים שאינם עצביים. שלישית, ההליך המתואר כאן הוא פשוט, זול ונוח לסטודנטים לתואר ראשון. לכן, טכניקה זו יכולה לשמש למחקר, כמו גם למטרות הוראה. יתר על כן, שינויים קלים של פרוטוקול זה צריכים לאפשר טיהור תשואה גבוהה במהירות, של נוירונים ממקורות אחרים מאשר DRGs. לדוגמא, בהליך זה יכול להיות שונה כדי לספק neuronally enrתרבויות iched מרקמות אחרות כגון מוח קדמי עוברי או בחוט השדרה. פרוטוקולי Immunocytochemistry כבר מותאמים לתרבויות עצביות ניתק אלה ומתוארים בפירוט כאן. הליך immunocytochemistry הכפול נגד מולקולה עצבית הידבקות תא (NCAM) וintegrins β1 מסופק. הנתונים המופקים משיטות immunocytochemical אלה היו בשימוש כדי לבחון את הדפוסים מרחביים ועוצמתם של מספר מולקולות בנוירונים בתרבית 8,16.

<table><tbody><tr><td>כלי תרבית קטנים סטריליים (35 מ"מ)</td><td>קורנינג</td><td>430165</td><td></td></tr><tr><td>כלי תרבית גדולים סטריליים (100 מ"מ)</td><td>פלקון</td><td>353003</td><td></td></tr><tr><td>צלחות פטרי גדולות סטריליות (100 מ"מ)</td><td>VWR</td><td>89000-302</td><td></td></tr><tr><td>צלחת פטרי מזכוכית (100 מ"מ)</td><td>VWR</td><td>D108962</td><td></td></tr><tr><td>מלקחיים עדינים</td><td>כלי מדע עדינים</td><td>11251-10</td><td></td></tr><tr><td>מלקחיים</td><td>סטנדרטיים Fine Science Tools</td><td>1100-12</td><td></td></tr><tr><td>כיסויים (22 x 22 מ"מ)</td> <td>Fisher</td><td>12 518 105K</td><td>0.13-0.17 מ"מ עובי אופטימלי למיקרוסקופיה</td></tr><tr><td>מחזיק כיסוי פורצלין</td><td>תומאס סיינטיפיק</td><td>8542E40</td><td></td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי</td><td>Gibco</td><td>17502-048</td><td>השתמש ב-50 מ"ל ציפוטים לכל 500 מ"ל של מדיה F12 של Ham</td></tr><tr><td>HCl</td><td>VWR</td><td>VW3204-1</td><td>לשימוש ב-2 M, ניתן להשתמש פעמיים לפני השלכת</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S9888</td><td>השתמש בתמיסת NaCl 5 M לתמיסת מלאי laminin-1</td></tr><tr><td>Laminin-1</td><td>Invitrogen</td><td>23017-015</td><td>הוסף 72 &micro; l של 5 M NaCl סטרילי ו-aliquot ל-50 &micro; l</td></tr><tr><td>15 מ"ל</td><td>טיפול בתאי</td> צינור חרוטי <td>229411</td><td></td></tr><tr><td>PBS CMF 10x</td><td>Gibco</td><td>14200</td><td>בשימוש ב-1x, לדלל במים מסוננים סטריליים של Millipore</td></tr><tr><td>PBS 10x</td><td>Gibco</td><td>14080</td><td>בשימוש ב-1x, לדלל במים מסוננים סטריליים של Millipore</td></tr><tr><td>Ham's F12</td><td>Lonza</td><td>12-615F</td><td></td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי אלבומין (BSA)</td><td>Gibco</td><td>10438</td><td>שימוש ב-F12HS20 ב-10%</td></tr> <tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H3375</td><td>ליצור תמיסה סטרילית של 1 M במים מזוקקים, לדלל במדיה F12 כדי לקבל ריכוז סופי של 10 מ"מ</td></tr><tr><td>פניצילין/סטרפטומיוצין</td><td>Sigma</td><td>P0781</td><td>השתמש ב-5 מ"ל ב-500 מ"ל של מדיה F12</td></tr><tr><td>NT3</td><td>Millipore</td><td>GF031</td><td>יש להוסיף 1 מ"ל מים סטריליים של Millipore, בתנאים סטריליים, לאחסן בטמפרטורה של -20 מעלות; C, יש להשתמש בריכוז סופי של 10 ננוגרם/מ"ל במדיית F12H, לשמור בטמפרטורה של -20 מעלות; C מקפיא ללא הפשרה</td></tr><tr><td>מערכות NGF</td><td>RnD</td><td>256-GF</td><td>הוסף 1 מ"ל של PBS סטרילי 1x עם 0.1% BSA, aliquot בתנאים סטריליים, אחסן בטמפרטורה של -20 מעלות; C, בשימוש בריכוז סופי של 10 ננוגרם/מ"ל במדיה F12H</td></tr><tr><td>L-Glutamine</td><td>Sigma</td><td>G7513</td><td>aliquot בתנאים סטריליים, יש לאחסן בטמפרטורה של -20 מעלות; C, השתמש בריכוז סופי של 200 מ"מ במדיה F12H</td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Sigma</td><td>T4049</td><td>aliquot בתנאים סטריליים, יש לאחסן בטמפרטורה של -20 מעלות; </td></tr><tr><td>C סרום בקר אלבומין (BSA)</td><td>Gibco</td><td>15260</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">פריטים אחרים הדרושים: מכשירי דיסקציה כלליים, כולל פיפטות פסטר מזכוכית, ביצי עוף לבנים פוריים, חממת ביצים (לחות, 37 & deg; C), תא דגירה של תאים (לחות, 37 מעלות; C), קולט אדים למינארי, היקף ניתוח סטריאוויז'ן דו-עיני</td></tr><td colspan="4"><חזק>טבלת ריאגנטים אימונוציטוכימיים</חזק>סוכרוז סיגמא S9378 המשמש בתמיסה מקבעת (4% פרפורמלדהיי, 30% סוכרוז, 2x PBS)טריטון-X 100 סיגמא T-8787 פרפורמלדהיד סיגמא P6148 המשמש בתמיסה מקבעת (4% פרפורמלדהיי, 30%<tr></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> סוכרוז, 2x PBS)</td></tr><tr><td>Fluoromount G</td><td>Southern Biotech</td><td>0100-01</td><td></td></tr><tr><td>סרום עזים רגיל</td><td>טכנולוגיות חיים</td><td>PCN500</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ שקופיות</td><td>VWR</td><td>16004-430</td><td></td></tr><tr><td colspan="4" ><חזק>טבלת נוגדנים ראשונית</חזק></td></tr><tr><td>נוגדן נגד NCAM</td><td>Millipore</td><td>AB5032</td><td>נוגדן פוליקלונלי</td></tr><tr><td>נגד מופעל ובטא; 1 ingegrin</td><td>Millipore</td><td>MAB19294</td><td>monoclonal</td></tr><tr><td colspan="4" ><חזק>טבלת נוגדנים משנית</חזק></td></tr><tr><td>עז נגד עכבר IgG Alexa 488</td><td>Life technologies</td><td>A11001</td><td></td></tr><tr><td>עיזים נגד ארנב IgG Alexa 548</td><td>Life technologies</td><td>A11036</td><td></td></tr></tbody></table>

בידוד והתרבות של ניתק עצב סנסורי מאפרוח עוברים

Isolation and Culture of Dissociated Sensory Neurons From Chick Embryos

הנוירונים הם תאים רב פנים שנושאים מידע חיוני עבור מגוון רחב של פונקציות, כולל תחושה, תנועה מוטורית, למידה, וזיכרון. חקר תאי עצב in vivo יכול להיות מאתגר בשל המורכבות שלהם, הסביבות המגוונות ודינמיות שלהם, ומגבלות טכניות. מסיבות אלה, חקרו תאי עצב במבחנה יכול להוכיח מועיל לפענח את המסתורין המורכב של תאי עצב. הטבע המוגדר היטב של דגמי תרבית תאים מספק שליטה מפורטת על תנאים ומשתנים סביבתיים. כאן אנו מתארים כיצד לבודד, לנתק, ונוירונים עיקרי תרבות מעוברת חומוס. טכניקה זו היא מהירה, זולה, ומייצרת וחסונה גדלה עצב סנסורי. ההליך מייצר באופן עקבי תרבויות שהעשירו מאוד עבור תאי עצב ויש לו מעט מאוד תאים שאינם עצביים (פחות מ -5%). נוירונים עיקרי אינו דבק גם לזכוכית שלא טופלה או מפלסטיק בתרבית רקמה, ולכן נהלים מפורטים ליצירת שתי distinct, מצע המכיל laminin מוגדר היטב לציפוי עצבי מתוארים. נוירונים בתרבית הם נוחים מאוד לטכניקות תאיות ומולקולריות מרובות, כוללים שיתוף immunoprecipitation, דמיון תא חי, RNAi, וimmunocytochemistry. נהלים לimmunocytochemistry כפול על נוירונים בתרבית אלה כבר מותאמים ושתוארו כאן.

הפרוטוקול המתואר כאן מאפשר לחוקרי תרבות אוכלוסייה מועשרת של עצב סנסורי עוברי ניתק עם מעט מאוד תאים (לדוגמא, &lt;5%) שאינם עצביים 7,8,10,16. ניתן להשיג DRGs רב מlumbosacral, בית החזה ואזורי צוואר רחם. בהתאם לצרכים של החוקר, DRGs מאזורים אנטומיים שונים אלה יכולים להיות מבודדים בקלות. לדוגמא, איור 1 מציג תמונות של עובר אפרוח דרך שלבים שונים של נתיחה עם DRGs המותני מודגש ב1C דמויות ו1D וDRGs בית החזה ב1E דמויות ו1F.</strong...

מודלים תרבית תאים מספקים שליטה מפורטת על תנאים סביבתיים ובכך מספקים פלטפורמה רבת עוצמה על מנת להבהיר היבטים רבים של ביולוגיה של תא עצבי. אנו מתארים שיטה מהירה, זולה, ואמינה לבודד, לנתק, ותרבות תאי עצב תחושתי מעובר חומוס. פרטים של הכנת המצע וimmunocytochemistry גם מסופקים.

Neurons are multifaceted cells that carry information essential for a variety of functions including sensation, motor movement, learning, and memory. ...

המטרה הכוללת של הליך זה היא לתרבית אוכלוסייה מועשרת של נוירונים חושיים ראשוניים מנותקים מעוברי תרנגולות. זה מושג על ידי איסוף גרעיני שורש גב שלמים מהיום העוברי, שבעה עד 10 עוברי עוף לתוך צינור חרוטי, ולאחר מכן פירוקם לתרחיף התאים המנותק שלו. כשלב שני מנותק, תאי DRG מצופים על צלחת תרבית לדגירה.לאחר מכן, צלחת התרבית נשטפת בעדינות כדי לעקור את הנוירונים. השלב האחרון כולל ציפוי הנוירונים החושיים המנותקים על התשתית המוגדרת היטב, כגון החלקות כיסוי שטופות בחומצה ואפויות המקודדות מראש בריכוזים גבוהים או נמוכים של למינין. כימיה חיסונית אחת משמשת להצגת נוכחות של NCA ואינטגרינים מופעלים של בטא אחד בגופי התאים, נויריטים וחרוטי גדילה של נוירונים חושיים עובריים מתורבתים מנותקים.שיטה זו היא כלי רב עוצמה להבהרת היבטים רבים של נוירוביולוגיה, כולל מנגנונים של הנחיית אקסונים, חרוטי גדילה, דינמיקה של שלד התא, כמו גם הרכב וויסות פני התא. טכניקה זו מאפשרת לחוקרים להשיג במהירות תרביות מועשרות מאוד בנוירונים חושיים מנותקים, המכילים מעט מאוד תאי גליה. זה שונה מתרביות גנגלינג שורש הגב השלמות המכילות גם נוירונים וגם תאים שאינם עצביים.יתר על כן, וריאציות קלות של פרוטוקול זה אמורות לאפשר תפוקה גבוהה של תרביות עצביות ממקורות שאינם גרעיני שורש גבי, כולל מוח קדמי עוברי. במכסה מנוע זרימה למינארי מפצחים ביצת אפרוח

isolation-culture-dissociated-sensory-neurons-from-chick

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

וידאו זה מדגים כיצד לדמיין מסלולי axonal של קבוצות מוגדרות גנטית של נוירונים בחוט השדרה ניצול חומוס...

פענוח מסלולים axonal של קבוצות מוגדרות גנטית של נוירונים התחתית צ&#39;יק עצבית ניצול ב אובו Electroporation

אנו מדגימים כיצד לנתח ותרבות חומוס הגנגליון E4 statoacoustic ו E6 explants חוט השדרה. Explants הם תרבותי תחת בסרום ללא תנאים ג'ל קולגן 3D עבור 24 שעות. ההיענות Neurite נבדק עם המדיום גורם הגדילה, שיושלם עם חלבון מצופים חרוזים.

Dissection והתרבות של גנגליון צ&#39;יק Statoacoustic Explants ואת חוט השדרה ג&#39;ל קולגן עבור מבחני תוצאה Neurite

אנו מתארים מתודולוגיה מהירה לבודד ותרבות נוירונים בהיפוקמפוס ואת קליפת המוח של עוברי מכרסמים. פרוטוקול זה מאפשר לנו לבצע ניסויים שבהם תרבויות עצביים כמעט טהור נדרשים.

בידוד והתרבות של תאים עובריים עצביים עכברוש: ​​פרוטוקול מהיר

סרטון זה מדגים טכניקה לבידוד קפלים עצביים גולגולתיים מאזור המוח התיכון של עוברי אפרוחים. הוא מציג תהליך דיסקציה מפורט של הקפלים העצביים, מיקומם וחיבורם על כיסויים מצופים פיברונקטין ואחריו תצפית על נדידת תאי הפסגה העצבית מהקפלים העצביים.

בידוד קפלים עצביים גולגולתיים מעובר אפרוח לצורך תרבית תאי קרסט עצבית

הסרטון מדגים את הבידוד של נוירונים מוטוריים, טרוכליאריים ומוטוריים בעמוד השדרה מעובר עכבר מהונדס. העובר מבטא נוירונים מוטוריים המסומנים בחלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) להדמיה וזיהוי קלים. הנוירונים המוטוריים מבודדים בניתוח תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי ונשמרים בתווך תרבית.

בידוד ותרבית של נוירונים אוקולומוטוריים, טרוכליאריים ומוטוריים בעמוד השדרה מעובר עכבר

סרטון זה מדגים שיטה לבודד תאי עצב מהמוח הקדמי של עובר אפרוח בשלב מוקדם ולתרבית אותם במערך מיקרואלקטרודות ליצירת רשת עצבית.

בידוד וטיפוח תאי עצב עובריים של אפרוחים במערך מרובה אלקטרודות

תרבויות פרוסות להקל על המניפולציה של התפתחות עובר על ידי גן והפרעות תרופתיות. עם זאת, תנאי התרבות חייבים להבטיח שהתפתחות תקינה יכולה להמשיך בסביבה המופחתת של הפרוסה. אנו מדגימים פרוטוקול המאפשר פיתוח חוט שדרה רגיל להמשיך לפחות 24 שעות.

פרוטוקול עוף עובר חוט שדרת Slice תרבות

אנו מתארים את הנתיחה של מערכת העצבים של ים הארנבת...

בידוד של נוירונים חושיים של<em&gt; Aplysia californica</em&gt; להקלטות מהדק תיקון של זרמי glutamatergic

כאן, אנחנו מציגים בטכניקה המיקרוכירורגית הרומן על בידודו של תאי גזע עצביים מ E13 העכבר עובר ganglionic קדושתו.

בידוד והתרבות של תאי גזע עצביים עובריים בעכבר

עבודה זו מציגה פרוטוקול להניב התרבויות תאים הומוגנית של מנוע התנועה הראשוני, trochlear, ומנועי השדרה נוירונים. תרבויות אלה ניתן להשתמש לניתוחים השוואתיים של מורפולוגית, תאית, מולקולרית, ו אלקטרופיזיולוגיה המאפיינים של נוירונים מנוע העינית השדרה.

בידוד ותרבות של והעושות, טרוליר, ושדרה מוטוריים נוירונים מ בטרום לידתי : עכברים הטרנסגניים

גנגוליה (CG) היא חלק ממערכת העצבים הפאראסימפתטית. תרבויות נוירואליות של אפרוח CG הנוירונים הוכחו להיות מודלים תא יעיל במחקר של אינטראקציות שרירים עצביים. אנו מתארים פרוטוקול מפורט עבור הניתוח, דיסוציאציה ותרבות מבחנה של CG נוירונים מ עוברי האפרוח.

בידוד ותרבות של צ'יק סילייון גנגליון נוירונים

למדו שיטה לבידוד והתרבה של נוירונים סנסוריים מאפרוחי עוף. הפרוטוקול כולל איסוף גנגליון שורש עצבי, פירוק תאים וזיהוי סמנים נוירונליים באימונוציטוכימיה.

בידוד והתרבות של ניתק עצב סנסורי מאפרוח עוברים

גלה סרטונים נוספים