Name: טיפוח של תאי יונקים באמצעות מערכת פניאומטיים Bioreactor יחיד שימוש (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-10-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 42 s
Description: למד לטפח תאי יונקים בביוריאקטור פניאומטי חד-פעמי. הפרוטוקול כולל כיול חיישני pH וחמצן מומס, הרכבת המערכת וחיבור מיקרו-נשאים בסטריליות. השיטה מספקת סביבת גידול מבוקרת ומפחיתה סיכון זיהום.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

פרויקט זה נתמך בחלקו על ידי אוניברסיטת ג'ונס הופקינס, משרד הפרובוסט באמצעות יוזמת המדע Gateway.

.1 כניסה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שלטון את Bioreactor. לחץ בכל מקום כדי לפתוח את דף הכניסה. בחר שם משתמש והזן את הסיסמה ולחץ על &quot;כניסה&quot;. </li></ol> .2 כיול <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לכייל חיישן pH (2 נקודות לפני מעוקר). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדוק חיישן pH ולאשר קצה חיישן מלא בתמיסת אלקטרוליט. הכן שתי כוסות עם פתרונות כיול pH (אלקטרוליט) pH 4 וpH 7 ויש לי בקבוק לשטוף זמין במים מזוקקים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חבר את כבל pH לחיישן pH. נווט אל &quot;פעולות&quot; הכרטיסייה על הממשק שלום ולחץ על &quot;לכייל&quot;. הזן טמפרטורת חיץ בתחום טמפ פתרון כיול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח חיישן pH במאגר 1 (pH 4) ולהזין ערך בשדה &quot;אפס&quot;. חכה לגרף כדי לייצב ולחץ על כפתור &quot;לכייל 1&quot;. יש לשטוף את חיישן pH במים מזוקקים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חיישן מקום במאגר 2 (pH 7). הזן חיץ2 ערך בשדה &quot;תוחלת&quot;. חכה לגרף כדי לייצב ולחץ לכייל 2 כפתור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ על &quot;שמור&quot; לאחר מכן לחץ על &quot;סגור&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כייל את חיישן חמצן המומס (DO). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ודא חיישן DO כבר מקוטב על ידי להיות מחובר למערכת במשך כמה שעות. נווט אל &quot;פעולות&quot; הכרטיסייה על הממשק שלום ולחצו לכייל. לחץ על כפתור ה &quot;DO&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נתק את חיישן DO והזן 0 בשדה &quot;אפס&quot;. חכה לגרף כדי לייצב ולחץ על הלחצן &quot;כיול 1&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חבר מחדש את חיישן DO ולהיכנס 100 בשדה &quot;הטווח&quot;. חכה לגרף כדי לייצב ולחץ על הלחצן &quot;כיול 2&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ על &quot;שמור&quot; לאחר מכן לחץ על &quot;סגור&quot;. </li></ol> חיישני .3 החיטוי ולהתקין וכלי שייט מגיב <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר כיול, חיישני מקום וגם תרמית בautocשקיות לרחוץ וחיטוי ל30 דקות ב121 מעלות צלזיוס, 15 psi. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטהר שקיות החיטוי עם 70% איזופרופיל אלכוהול (IPA) ושקיות העברה לארון בטיחות ביולוגית (BSC). הסר אריזה חיצונית של כלי שיט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטהר אריזה פנימית עם 70% IPA ולהעביר כלי לארון ביולוגי בטיחות (BSC). הסר אריזה פנימית ולבדוק את הכלי וצינור לנזקים הנגרמים במהלך משלוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התקן את pH ולעשות חיישנים בשתי יציאות הקדמיות. התקן את גם התרמית ליציאה אחורית השמאלית. פתח את מכסה החיישן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדריך החיישן דרך יציאת החיישן. השחל את החיישן בחוזקה ליציאה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את הכלי מתוך BSC. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לתלות DO וכבלי חיישן pH מחוץ לשרוול הכלי ולבדוק ששום דבר לא בשרוול. חלק את הכלי לתוך השרוול, רגליים הראשונות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להתאים בזהירות את חיישן הטמפרטורה לתוך באר תרמית הכלי. ודא שהחלק התחתון של הכלי מונח כנגד חימום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסרצינורות סטים התיקים שלהם. קידוד צבע התאמה בצינורות למחברים המתאימים והמשאבות ביחידת בקרת bioreactor. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התקן את קו הגז הראשי על ידי לחיצה על המחבר לשקע הגז שלה. התקן את קו גז מיקרו על ידי סיבוב בכיוון השעון המחבר לשקע גז. התקן את צינורות מסנן פליטה: </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפתוח את תנור המסנן. אבטח את מסנן הפליטה על U-הערוץ כל כך צינורות שלה עוברים דרך שני הווים למסנן ויוצא מהתנור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התקן את צינורות על ידי שקית הקבל בבעל צינורות. סגור את הדלת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קווי מסלול בנוסף וB, שניהם קווי התקשורת, ואת קו הקציר מאחורי חיישן DO ועל הספסל בסמוך ליחידת בקרת bioreactor. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חבר את הכבלים לחיישני DO וpH. </li></ol> .4 בינוניים ומיקרו ספקים הוספה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נווט אל הכרטיסייה &quot;פעולות&quot; ולחץ על &quot;בקרת משאבות&quot; על ממשק המחשב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טופס Steriחיבור le בין שורה שאינו בשימוש בינונית בנוסף (להקה כתומה 1) ומקור בקבוק / שקית הבינוני על ידי ריתוך צינורות או באמצעות אבזרי Luer. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ על המחוון כדי להפעיל את משאבת התקשורת ב. לחץ על המחוון להפוך את התקשורת לשאוב את הסכום לאחר תוספת הרצויה של מדיום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח חרוזים microcarrier בCa 2 +, Mg 2 + PBS ללא תשלום עבור 3 שעות ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף חרוזים כמה פעמים עם Ca 2 +, Mg 2 + PBS חופשי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החיטוי במשך 15 דקות ב 115 ° C, 15 psi. הערה: הוסף L 3 גר &#39;/ (משקל יבש) בניסוי זה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> משאבה במייקרו ספקים כי כבר התייבשות, שטף וautoclaved לכור באותו אופן בינוני נוספה בשלב 4.1. </li></ol> .5 איזון ואחת נקודות DO כיול <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את הבקרים לאוטומטיים ולהיכנס לsetpoints הרצוי. כאן, להשתמש בתסיסת הסט פוינט (SP) = 15 סל&quot;ד, SP טמפרטורה = 37.0 ° C, pH = 7.2, DO = 100%. חכה לעמarameters לאזן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאשר חיישן הוא מקוטב באופן מלא. אשר ערך הנוכחי DO התייצב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נווט אל הכרטיסייה &quot;פעולות&quot; ולחץ על &quot;לכייל&quot;. לחץ על &quot;DO&quot;, לחץ על &quot;אחת נקודות&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הזן &#39;100&#39; בשדה &quot;הטווח&quot;. לחץ על הכפתור &quot;כיול 1&quot;, לחץ על &quot;שמור&quot; ולחץ על &quot;קרוב&quot;: </li></ol> .6 החל לרוץ <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נווט אל כרטיסיית פעולות. לחץ על &quot;אצווה&quot;. השתמש במקלדת שעל מסך או מקלדת חיצונית יש להזין שם אצווה 16 תווים או פחות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ על לחצן &quot;הסתר&quot; של המקלדת שעל מסך. לחץ על &quot;התחילו אצווה&quot; לאשר על ידי לחיצה על &quot;התחל&quot; בכיסוי. </li></ol> .7 לחסן עם תאים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ליצור קשר סטרילי בין שורה בנוסף בינונית שאינו בשימוש (להקה כתומה 1) ובקבוק תא / מקור שקית על ידי ריתוךצינורות או שימוש באבזרי Luer. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התקן את סעיף סיליקון של צינורות במשאבת התקשורת כל כך נקודות החץ לכיוון הצינור בין המשאבה וכלי השיט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדקו מהדק צינורות פתוח ומהדק צינורות מסועף שלה סגור. לחץ על המחוון כדי להפעיל את משאבת תקשורת ובלחץ על &quot;כבוי&quot; לאחר הוספת תאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נווט אל הכרטיסייה &quot;פעולות&quot; ולחץ על &quot;משאבות בקרה&quot;. </li></ol> .8 דגימה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר לחסן ובתדירות גבוהה ככל רצוי כדי לפקח על התרבות, לצייר מדגם מהתרבות באופן הבא: </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נווט אל הכרטיסייה &quot;פעולות&quot; ולחץ על &quot;לקחת דגימה&quot;. הנח את צינור הדגימה במשאבת הדגימה ולתפעל את ברזלים דגימה על פי ההוראות שעל מסך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע לפחות תצפית יומית מיקרוסקופית וספירת תאים בדגימות אלה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר התאים הגיעו הצפיפות הרצויה, בג זהASE 1.2 x 10 6 תאים / מ&quot;ל, להדביק את התאים עם התוספת של הבידוד נגיף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסביבה נקיה מהחיידקים להוסיף הבידוד למזרק 20 מ&quot;ל, ולחבר את המזרק לאחת מהיציאות בנוסף החילוף בכור. להציג את הבידוד לכור על ידי לחיצה על בוכנת המזרק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המשך דגימה וניתוח התרבות לריכוז החלקיקים תאיים אדנווירוס. </li></ol>

<ol><li>Freshney, R. I. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFreshney%2C+RI+%22Culture+of+Animal+Cells+A+Manual+of+Basic+Techniques+and+Specialized+Applications%22">Culture of Animal Cells A Manual of Basic Techniques and Specialized Applications</a>. , 6th edition, John Wiley & Sons, Inc. Hoboken, NJ. (2010).</li>
<li>Healthcare, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microcarrier+Cell+Culture+Principles+and+Methods%5BTitle%5D)+AND+%22GE+Healthcare+Data+File+18-1140-62%22%5BJournal%5D)">Microcarrier Cell Culture Principles and Methods.</a> GE Healthcare Data File 18-1140-62. , (2005).</li>
<li>Simaria, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Allogeneic+cell+therapy+bioprocess+economics+and+optimization+Single-Use+cell+expansion+Technologies%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+and+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Allogeneic cell therapy bioprocess economics and optimization Single-Use cell expansion Technologies.</a> Biotechnol and Bioeng. 111 (1), 69-83 (2014).</li>
<li>Lee, B., Fang, D., Croughan, M., Carrondo, M., Paik, S. -H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+novel+pneumatic+mixing+for+single-use+bioreactor+application%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Proc%22%5BJournal%5D)">Characterization of novel pneumatic mixing for single-use bioreactor application.</a> BMC Proc. 5 (S8), O12(2011).</li>
<li>Eibl, R., Eibl, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disposable+bioreactors+in+cell+culture-based+upstream+processing%5BTitle%5D)+AND+%22BioProcess+Int%22%5BJournal%5D)">Disposable bioreactors in cell culture-based upstream processing.</a> BioProcess Int. 7 (S1), 18-23 (2009).</li>
<li>Chaubard, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disposable+bioreactors+for+viral+vaccine+production+challenges+and+opportunities%5BTitle%5D)+AND+%22Biopharm+Int+Supp%22%5BJournal%5D)">Disposable bioreactors for viral vaccine production challenges and opportunities.</a> Biopharm Int Supp. , (2010).</li>
<li>Croughan, M. S., Hamel, J. F., Wang, D. I. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrodynamic+Effects+on+Animal+Cells+Grown+in+Microcarrier+Cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+and+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Hydrodynamic Effects on Animal Cells Grown in Microcarrier Cultures.</a> Biotechnol and Bioeng. 95 (2), 295-305 (2006).</li>
<li>DePalma, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-use+Equipment+on+Cusp+of+Industrialization%5BTitle%5D)+AND+%22Genet+Eng+Biotechnol+News%22%5BJournal%5D)">Single-use Equipment on Cusp of Industrialization.</a> Genet Eng Biotechnol News. 32 (1), (2012).</li>
<li>Baltz, R. H., Demain, A. L., Davies, J. E. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBaltz%2C+RH+%22Manual+of+Industrial+Microbiology+and+Biotechnology%22">Manual of Industrial Microbiology and Biotechnology</a>. , 3rd ed, ASM Press. Washington, DC. (2010).</li>
<li>Applied Technical Bioreactors, , Seminole (FL), USA. <a target="_blank" href="http://www.infors-ht.com/index.php/en/products/bioreactors/bench-top-bioreactors/minifors">http://www.infors-ht.com/index.php/en/products/bioreactors/bench-top-bioreactors/minifors</a> (2012).</li>
<li>Sousa, M. F., Giroux, D., Clemente, J., Lee, B., Carrondo, M. J., Alves, P. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSousa%2C+MF+%22Impact+of+Bioreactor+Design+on+the+Performance+of+Microcarrier+Cultures%22">Impact of Bioreactor Design on the Performance of Microcarrier Cultures</a>. , 3rd ed, Abstract. Cell Culture Engineering XIII. Scottsdale, Arizona. (2012).</li>
</ol>

המחברים ד ג&#39;ירו וי &#39;Hashimura הם עובדים של PBS ביוטק שמייצר חומרים כימיים ומכשירים המשמשים במאמר זה.

מערכת bioreactor שימוש יחיד זה היא יחסית פשוטה לשימוש ומספקת ניתוח בזמן אמת לניטור כור וניתוח. הוא מאוד מתאים גם לתרבית תאים של יונקים וחרקים עם צפיפות תאים מגיעה ליותר מ 30 מיליון תאים / מ&quot;ל. חוץ תאי A549 מתוארים בדוח זה 11, יש לנו גדלתי SF-9 תאי חרקים בbioreactor גם כן. הערבוב העדין הניתן על ידי גלגל אוויר פנאומטי מפחית נזק לתאים. כמה צעדים הם קריטיים בעת הגדרת כור זה. הכיול הראשון, נכון של pH ולעשות חיישנים חשוב לניטור אופטימלי של התרבות ולתוספת של חומרים כימיים כדי להתאים את pH או החמצן במערכת. שנית, הבקבוקים מגיב וזרע חייבים להיות מלאים ואת הקבצים המצורפים luer שנעשו בסביבת סטרילית, כגון BSC. ברגע שהבקבוקים מגיב מועברים אל מחוץ לסביבת סטרילית, החיבורים לקווי הזנת bioreactor חייבים להיעשות בזהירות כדי למנוע זיהום מיקרוביאלי. <pclass = &quot;jove_content&quot;&gt; בעוד מערכת bioreactor זה עובדת היטב עבור שורות תאי יונקים וחרקים זה אינו מיועד לתרבויות חיידקים. המערכת אינה יכולה לספק את הערבוב המהיר וחמצון שנדרש לתאי חיידקים. התפתחות חיידקים נעשה הכי טובה בbioreactor טנק עורר. בהשוואה לbioreactors ליחד אחר לתרבית תאי יונקים או חרקים, מערכת זו היא קלה לשימוש, מספקת נתונים מספיקים לניתוח של ריצות, ויש צמיחת תאים דומה או טובה יותר מהמערכת לשימוש חד אחרת שהערכנו. מערכת bioreactor פנאומטי ליחד יש פוטנציאל לפגוש רב של המחקר ויישומים קליניים בתחומי יות&#39;רפיוטיקס, חיסונים, תאי גזע, ורפואה אישית 4. בנוסף, הגמישות של מערכת זו מאפשרת לתצווי, Fed-אצווה, זלוף, ויישומי bioreactor Transfection מבוסס 5. לבסוף, יש לי מערכות bioreactor חד פעמיות לשימוש חד פעמי אין הסופיותTial כדי לענות על הצרכים של ייצור תעשייתי בקנה מידה גדולה ולדבוק בהנחיות והמלצות של גופי רגולטורים לאומיים ובינלאומיים 6-10.

ניתן לסווג קווי תאי יונקים לאחת משלוש קטגוריות המבוססות על המאפיינים שלהם צמיחה: תאים שגדלים בהשעיה, תאים שגדלים כאגרגטים, ותאים שגדלים מעוגן למצע. למרות bioreactor אוויר הגלגל הפגין בסרט הזה הוא מסוגל לגדול כל שלושת סוגים של תאים, בסרטון זה ידגים שימוש בbioreactor לגדל תאים תלויים מעגן במייקרו ספקים. תאי יונקים תלויים Anchorage ניתן לגדל לצורך הפקת תאים נוספים - שבו התאים עצמם הם התוצר. לדוגמא, תאי גזע mesenchymal מח עצם נגזר אנושי נמצאים בשלבים טיפחו במטרה לקצור את התאים והזרקה אותם לרקמה חולה. Bioreactor פנאומטי הפגין בסרט הזה הוכיח מתאים לייצור תאי גזע mesenchymal כזה עבור יישום זה (Serra et al., תקשורת אישית, 2013). dep Anchorageתאי יונקים endent בדרך כלל גדלים בקנה מידה קטנה בכלי תרבות 2D כגון צלחות תרבית תאים, צלוחיות תרבית תאים, או בקבוקי רולר, שבו הם לדבוק משטח צמיחת טיפול מיוחד 1. כאשר יותר תאים רצויים, ניתן להרחיב את הצלחות או צלוחיות באמצעות יותר או גדולים יותר כלים. עם זאת, לגידול חסכוני יותר של כמויות גדולות של תאים תלויים מעגן, הגדלת שטח הפנים להתקשרות סלולארי ניתן להשיג על ידי שימוש בחרוזים מוצקים קטנים בשם מיקרו ספקים. בהתאם למאפייני ההתקשרות של התא, כמה סוגים שונים של מיקרו-נשאים זמינים מסחרי, כגון dextran, פפטיד, או קולגן מצופה. יש לי מייקר נשאים שטח פנים גדול יחס נפח מתן שטח פנים גדול יותר לצמיחת תאים; ויכולים להישמר מיקרו ספקים בהשעיה עם תסיסה, המאפשרת לתאים להיות מעובדות לצפיפויות גבוהות במערכות bioreactor 2. נכון לעכשיו, את סוגי bioreactors בי תאים חסיד גדלים על מיקרו-נשאים כוללים צלוחיות טווה ומערכות טנק עוררו, אשר משתמשות במדחפים צירי כדי לשמור על השעיה של מיקרו-נשאי התא מצופה. מספר גורמים חשובים לגידול המוצלח של תאים כולל מתח חמצן, מאמץ גזירה, מטריצת פני השטח, ומזין וריכוזי המטבוליט. השימוש בbioreactors מאפשר ניטור בזמן אמת של תנאי גידול ואת הפוטנציאל לעלויות ייצור נמוך באופן משמעותי 1. ישנם מספר עיצובי bioreactor הנפוץ לגידול במבחנה תא כולל, השעיה עוררה, קיר כלי מסתובב, חלולים סיבים, bioreactor תיק על פלטפורמת נדנדה, ומערכות מיטה מרחפות 3. רבות ממערכות אלה להציג את הבעיות ייחודיות לטיפוח תא ואת קנה המידה -up, כגון עלות גבוהה, שיפועי ריכוז חומרי תזונה, גזירה הידרודינמית, צבירת תא, וקושי בדגימה, ניטור, וcel שליטהבהיקף של עד ליטר. שורות תאים חסיד שונות המשמשות בייצור של וירוסים, או בייצור של חיסונים נגיפיים או לייצור של וקטורים ויראליים ליישומי ריפוי גנטי. בסרטון הזה, באמצעות פנאומטי ליחד המערכת (Air-Wheel) bioreactor, אנחנו מדגימים את התרבות של תאים אנושיים קרצינומה של ריאה (A549) תאים על מיקרו-נשאים לייצור של אדנווירוס oncolytic. עיצוב bioreactor פנאומטי משתמש בגלגל תסיסה אנכי המופעל על ידי כוח העילוי של גז sparged לתוך החלק התחתון של bioreactor. שיטת ערבוב עדינה זה מגבילה כוחות גזירה הידרודינמית, אבל עדיין מבטיחה בינוני ותא אופטימליים ערבוב 4. בהשוואה לכור הטנק עורר, יש כור פנאומטי מתח קיר גזירה נמוך אפילו עם מערכות בנפח גבוה bioreactor Air-הגלגל (איור 1). בניגוד לbioreactors טנק עורר, המאיץ האנכי של כור ליחד זו מופעל על ידי זרם של בועות גז בתוךהכלי, המאפשר לערבוב עדין ואחיד בינוני (איור 2).

<table><tbody><tr><td>PBS 3&nbsp;</td><td>PBS</td><td></td><td></td></tr><tr><td>מכלול לשימוש חד פעמי</td><td>PBS</td><td></td><td></td></tr><tr><td>תאי קרצינומה של ריאות אנושיות (A549)</td> <td>ATCC</td><td>CCL-185</td><td></td></tr><tr><td>DMEM גלוקוז גבוה</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>בינוני סרום</td><td></td><td></td><td></td>בקר עוברי</tr><tr><td>טריפסין EDTA, 0.25%</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>ציטודקס 1 מיקרו-נשאים</td><td>GE</td><td>3781</td><td></td></tr><tr><td>נוגד קצף C</td><td>Sigma</td><td>A8011</td><td></td></tr></tbody></table>

טיפוח של תאי יונקים באמצעות מערכת פניאומטיים bioreactor יחיד שימוש

Cultivation of Mammalian Cells Using a Single-use Pneumatic Bioreactor System

ההתקדמות האחרונה בגידול ותאי גזע של יונקים, חרקים ותאי גזע יצרה הזדמנויות אדירות לטיפולים חדשים וחידושים ברפואה מותאמת אישית. עם זאת, תרגום ההתקדמות הללו ליישומים טיפוליים ידרוש מערכות מבחנה המאפשרות מערכות ביו-ריאקטור חזקות, גמישות וחסכוניות. ישנן מספר מערכות ביו-ריאקטור המשמשות כיום במסגרות מחקר ומסחר; עם זאת, רבות מהמערכות הללו אינן אופטימליות לביסוס, הרחבה וניטור הצמיחה של סוגי תאים שונים. פרמטרי התרבות המאתגרים ביותר לשליטה במערכות אלו כוללים, מזעור גזירה הידרודינמית, מניעת היווצרות שיפוע נוטריינטים, יצירת אוורור אחיד של מדיום התרבית, מניעת זיהום מיקרוביאלי וניטור והתאמת תנאי התרבית בזמן אמת. באמצעות מערכת ביו-ריאקטור פנאומטית חד-פעמית, אנו מדגימים את ההרכבה והתפעול של ביו-ריאקטור חדשני זה עבור תאי יונקים הגדלים על מיקרו-נשאים. מערכת ביו-ריאקטור זו מבטלת רבים מהאתגרים הקשורים למערכות הזמינות כיום על ידי מזעור גזירה הידרודינמית והיווצרות שיפוע נוטריינטים, ומאפשרת אוורור אחיד של מדיום תרבית. יתר על כן, תוכנת הביוריאקטור מאפשרת ניטור מרחוק בזמן אמת והתאמה של פרמטרי ההפעלה של הביוריאקטור. למערכת ביו-ריאקטור זו יש גם פוטנציאל אדיר להגדלה של תאי יונקים נצמדים ותרחיפים לייצור מגוון חלבונים טיפוליים, נוגדנים חד-שבטיים, תאי גזע, ביוסימילרים וחיסונים.

באיור 3, הפרמטרים לייזום של ריצת bioreactor מוצגים. נתון זה מראה את המסך לפני קביעת הפרמטרים של טמפרטורה, חמצן מומס, pH ותסיסה. ברגע שהפרמטרים מוגדרים, הפרמטרים הריצה ברציפות במעקב והתאמות יכולות להתבצע כדי לשמור על התנאים הנדרשים. התוכנה מייצרת קריאה רציפה המאפשרת זיהוי קל של בעיות. בניסוי זה באמצעות 2.5 L של DMEM מכיל 10% FBS, 250 ppm של C SAFC אנטי קצף, L-גלוטמין 2 מ"מ ו3 גר '/ L של מיקרו ספקים, המערכת התייצבה ולכן חמצן אחוזים הוא 50%, טמפרטורה היא 37 מעלות צלזיוס, וpH הוא 7.2. הכור מחוסן עם תאי A549 בריכוז של 7 x 10 4 תאים / מ"ל (או 10 תאים / מיקרו מוביל). הפרמטרים שנבחרו לריצה זו הביאו ברוב המכריע של תאי שמירה על מיקרו-נושאות בתוך שעה 2 (איור 4). לאחר שעה 12, תאי שדיםסימני trating של השטחה ומתפשט על פני השטח מיקרו מוביל (איור 5). על ידי 24 שעות, יש לי מייקר ספקים אפילו יחסית חלוקת תאים, ללא מיקרו ספקים ללא תאים וללא גושים גדולים של תאים על מיקרו-הנשאים (איור 6). אחוז של קולוניזציה מיקרו מוביל על ידי תאי A549 הוא 75% על ידי 24 שעות ו90% לאחריו (איור 7). התאים ממשיכים לגדול באופן אקספוננציאלי ל~ 1 מיליון תאים / מ"ל לאחר 48 שעה (איור 8). לאחר הדבקה על ידי מינון של אדנווירוס oncolytic (2 x 10 8 מ"ל / virions) בשעה 50 שעה, הצפיפות מוגברת ל1.2 מיליון תאים / מ"ל ולאחר מכן החלה לרדת כזיהום ממס התקדם. הייתה ~ 10,000 הגברה חיק הבידוד הנגיפי. בניסויים קודמים, שמצאנו כי הניטור והתאמת זרימת גז היא קריטי למקסם את צמיחת תאים (נתונים שלא פורסמו). במהירות תאי גידול יכולים לרוקן את המערכת של חמצן עם רמת DO יורדת לאפס. בעוד התאים המשיכו לגדול, זה היה בקצב הרבה יותר איטי. זה קריטי כדי לפקח ולכוון את זרימת החמצן כדי לעמוד בדרישות של התאים בשלב צמיחת לוגריתמים. כל ריצה ניתן לנתח לצמיחה אופטימלית על ידי השוואת pH, DO, וטמפרטורה עם ספירת תאים יומית. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/52008/52008fig1highres.jpg"> איור 1 דינמיקת נוזלים של המערכה bioreactor פנאומטיים (PBS) בהשוואה לbioreactor טנק סטירר מדידת כוחות גזירת קיר בהיקפי כור שונים. <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/52008/52008fig2highres.jpg"> איור 2 מאיץ כור פניאומטיים אוויר גלגל. 52008 / 52008fig3highres.jpg "/&gt; איור 3 צילום מסך תוכנת פניאומטיים אוויר גלגל הפרמטרים ליזום ריצת bioreactor. <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/52008/52008fig4highres.jpg"> .4 קולוניזציה איור מיקרו מוביל עם תאי A549 לאחר חיסון 2 שעות. (קוטר מיקרו מוביל הממוצע ~ 180 מיקרומטר.) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52008/52008fig4highres.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 5" src="/files/ftp_upload/52008/52008fig5highres.jpg"> איור 5 שעות 12 לאחר תחילתה של התרבות, תאי A549 מצרפים, השטחה, ומתפשטים על מיקרו ספקים."Target =" 5highres.jpg _blank "&gt; לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. <img alt="איור 6" src="/files/ftp_upload/52008/52008fig6highres.jpg"> איור 6 מיקרו ספקים מצופים בתאים לאחר 24 שעות בתרבות. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52008/52008fig6highres.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 7" src="/files/ftp_upload/52008/52008fig7highres.jpg"> אחוז .7 איור של קולוניזציה מיקרו מוביל על ידי תאי A549 חיסון הודעה. <img alt="איור 8" src="/files/ftp_upload/52008/52008fig8highres.jpg"> איור 8 מספר תאי A549 קיימא בטרום תרבות ולאחר זיהום עם adenovirשלנו. שים לב שצעד זיהום ויראלי התרחש ב50 שעה.

באמצעות ביו-ריאקטור פנאומטי, אנו מדגימים את ההרכבה, התפעול והביצועים של מערכת ביו-ריאקטור חד-פעמית זו לגידול תאי יונקים.

טיפוח של תאי יונקים באמצעות מערכת פניאומטיים Bioreactor יחיד שימוש

Recent advances in mammalian, insect, and stem cell cultivation and scale-up have created tremendous opportunities for new therapeutics and personalized ...

המטרה הכוללת של הליך זה היא לגדל כמויות גדולות של תאי יונקים. זה מושג על ידי כיול תחילה של ה-pH והחמצן המומס או ביצוע בדיקות, ולאחר מכן חיטוי ה-pH, ביצוע בדיקות ושרוול בדיקת הטמפרטורה. השלב השני הוא הכנסת הבדיקות והשרוול לתוך הכלי ולמקם את הכלי על הביוריאקטור ולחבר את הפליטה, המסנן, קווי הגז ובדיקת הטמפרטורה.השלב הבא הוא לחבר את כבלי ה-DO וה-pH ולחבר באופן אספטי את הנשאים הבינוניים והמיקרו הנשאבים לתוך הביוריאקטור. השלב האחרון הוא להפעיל את הבקרים כדי להבטיח שהביו-ריאקטור משיג את מהירות האימפלר, הטמפרטורה וריווי החמצן הרצויים. בסופו של דבר, לאחר חיסון וניטור ממוחשב, ניתן לעבד את התרבית למיצוי וטיהור המוצר הרצוי.היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות כמו ביו-ריאקטור מיכל ערבוב רב פעמי, הוא שהביו-ריאקטור של גלגל האוויר קל לשימוש וממזער את הסיכויים לזיהום מיקרוביאלי. בואו נתחיל. כדי להתחיל את הפרוטוקול, היכנס למסך שלום.לאחר מכן, בדוק את חיישן ה-pH וודא שקצה החיישן מלא בתמיסת אלקטרוליטים. השג אחת עם תמיסת pH ארבע, נוספת עם תמיסת pH שבע ובקבוק כביסה עם מים מזוקקים. לאחר מכן חבר את כבל ה-pH לחיישן ה-pH.נווט אל הכרטיסיה פעולות בממשק Hello, בחר כיול. לאחר מכן בחר בכרטיסייה PHA וכיול שתי נקודות. הזן את טמפרטורת המאגר לשדה טמפרטורת תמיסת הכיול.הנח את החיישן בתמיסת pH ארבע לכיול הזן את הערך בשדה האפס. לאחר שהגרף מתייצב, דחף, כייל ושטוף את חיישן ה-pH במים מזוקקים. חזור על הכיול עבור pH 7 ושמור את ההגדרות.הזן את ערך המאגר בשדה הטווח והמתן עד שהשתל יתייצב. כדי להתחיל חמצן מומס או לבצע כיול. ודא שחיישן ה-DO מחובר למערכת במשך מספר שעות והיה מקוטב בתוך לשונית הכיול, בחר DOA וכיול שתי נקודות.נתק את חיישן ה-DO. הזן אפס בכרטיסיית האפס והמתן עד שהגרף יתייצב. לפני בחירת כיול אחד, חבר מחדש את חיישן ה-do והזן 100 בשדה הטווח.כאשר התרשים מתייצב, לחץ על כייל שניים. לאחר מכן שמור את ההגדרות וסגור את התוכנית. לאחר הכיול, הנח את החיישנים ואת הבאר התרמית בשקיות חיטוי ובצע חיטוי למשך 30 דקות ב-121 מעלות צלזיוס ו-15 PSI.לאחר סיום החיטוי, חטאו את שקיות החיטוי עם 70% אלכוהול איזופרופיל והעבירו את השקיות לארון בטיחות ביולוגי או BSC. לחטא ולהכניס את כלי המגיב לתוך ה-BSC. הסר את האריזה הפנימית ובדוק את הכלי והצינורות לאיתור נזק.לאחר מכן, התקן את חיישן ה-DO ביציאה השמאלית הקדמית של כלי המגיב ואת הבאר התרמית ביציאה השמאלית האחורית. התקן את חיישן ה-pH ביציאה הקדמית הימנית להתקנה. פתח את מכסה החיישן והשחיל את החיישן קלות לתוך היציאה בחלק העליון של הכלי.לאחר מכן העבירו את הכלי אל מחוץ ל-BSC. ודא שכבלי חיישן ה-pH וה-DO נמצאים מחוץ לשרוול הכלי ושום דבר לא ממוקם בתוך השרוול. החזק את הכלי כך שאתה פונה לחזית והחלק את רגלי הכלי תחילה לתוך השרוול.ודא שתחתית הכלי מונחת על תנורי החימום. לאחר מכן הכנס בזהירות את חיישן הטמפרטורה לתוך הכלי התרמי. ובכן. לאחר מכן, הסר את ערכות הצינורות מהשקית.התאם את קידוד הצבע על הצינור למחברים ולמשאבות המתאימים ביחידת הבקרה של הביוריאקטור. נתב את הוספת המדיה וקווי הדגימה מאחורי חיישן ה-DO והתרמי. ובכן הכנס את הצינור למשאבה המקודדת בצבע בצד שמאל של הביוריאקטור.חבר את קווי הגז הראשיים והמיקרו. לחץ על מחבר קו הגז הראשי לשקע הגז שלו כדי להתקין את קו הגז הראשי. לאחר מכן סובב את מחבר קו הגז המיקרו בכיוון השעון לתוך יציאת הגז שלו כדי להתקין את קו הגז המיקרו.כדי להתקין את צינורות תנור המסנן, פתח את תנור המסנן ואבטח את צינור מסנן הפליטה ל-uan. ודא שהצינור עובר דרך שני הווים למסנן ויוצא מהתנור. נתב את הקו התחתון דרך הוו בתחתית תנור המסנן וסגור את הדלת.לאחר מכן חבר את הכבלים לחיישני DO ו-pH. לאחר השלמת ההתקנה, צור חיבור סטרילי באמצעות אביזרי פיתוי בין קו מהדורה בינונית שאינו בשימוש למקור שקית הבקבוק הבינונית. נווט ללשונית הפעולות בממשק Hello.לחץ על משאבות בקרה, בחר משאבת מדיה ולחץ על המחוון כדי להפעיל את משאבת המדיה. לאחר מכן הוסף 1.5 עד 3.0 ליטר מדיה ולחץ על המחוון כדי לכבות את המשאבה. המערכת מוכנה כעת לשאוב לכור מיקרו-נשאים שהוכנו בעבר.ניתן להוסיף אותם באמצעות שורת חיבור. חבר את בקבוק ה-MICROCAR לקו התוספת המתאים באמצעות מנעול פיתוי סטרילי. הפעל את משאבת התוספת בתוך מסך משאבת הבקרה.לאחר הוספת מנשאי המיקרו כבה את המשאבה באמצעות המחוון, נווט בחזרה למסך הראשי בממשק Hello, בחר פעולות ולאחר מכן התקדם. בחר את הבקר המתאים כדי לערוך את ההגדרות. הגדר את הבקרים לאוטומטי והזן את נקודות ההגדרה.לאחר הגדרת הבקרים, הפעל את משאבת האוויר. הסתכל בתוך כלי המגיב כדי לוודא שגלגל האוויר מסתובב. ודא שחיישן ה-DO מקוטב לחלוטין ושערך ה-DO התייצב.לאחר מכן כייל את טופס חיישן הביצוע, חיבור סטרילי בין קו תוספת בינוני שאינו בשימוש המזוהה על ידי פס כתום אחד לבין מקור שקית בקבוק התא באמצעות אביזרי פיתוי. לאחר מכן, התקן את חלק הסיליקון של הצינור במשאבת המדיה. ודא שהצינור clamp פתוח ושהצינור המסועף clamp סגור.נווט אל לשונית משאבת הבקרה ולאחר מכן הפעל את משאבת המדיה. הוסף את התאים וכבה את משאבת המדיה. לאחר החיסון, נווט אל לשונית הפעולות ובחר קח דגימה.ודא שצינור הדגימה נמצא במשאבת הדגימה ותפעל את זין עצירת הדגימה בהתאם להוראות שעל המסך. הסר את המזרק עם הדגימה לספירת תאים ויישומים אחרים במורד הזרם מבצעים ספירת תאים. לבסוף, כאשר התאים הגיעו לצפיפות הרצויה של 1.2 כפול 10 לששת התאים למיליליטר, יש להוסיף את חיסון הנגיף למזרק של 20 מיליליטר.חבר את המזרק ליציאת תוספת רזרבית בכור. השתמש במסך משאבת הבקרה כדי להפעיל את משאבת התוספת ולהוסיף את חיסון הנגיף. רוב תאי A 5 49 נדבקו לנשאי המיקרו תוך שעתיים.לאחר 12 שעות, התאים הראו סימני השטחה והתפשטות על פני המיקרו-מכונית. עד 24 שעות, נשאי מיקרו הציגו פיזור אחיד של תאים. קולוניזציה של מיקרו-מכוניות מתרחשת במהירות כפי שמודגם כאן.אחוז ההתיישבות של מיקרו-מכוניות על ידי 54 9 תאים הוא 75% על ידי 24 שעות. גרף זה מציג את מספר התאים הקיימים 54 9 בתרבית לפני ואחרי הדבקה באדנו-וירוס. התאים ממשיכים לגדול באופן אקספוננציאלי למיליון תאים למיליליטר לאחר 48 שעות.לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד להרכיב ולהפעיל ביו-ריאקטור גלגל אוויר לגידול תאי יונקים בצפיפות גבוהה לייצור תאים או חלבונים. תודה על הצפייה ובהצלחה בניסויים שלך.

cultivation-mammalian-cells-using-single-use-pneumatic-bioreactor

Research

JoVE Journal

Bioengineering

הנדסה ביולוגית

אנו מתארים פלטפורמת השבבים מבוססי לעיבוד תלת ממדי של תאים מיקרו bioreactors. אחת שבב יכול בית עד 10 Mio. תאים שיכולים להיות מעובדים בתנאים מוגדרים במדויק לגבי זרימת נוזלים, מתח וכו 'חמצן בלולאה, סטרילי במחזור סגור.

שבב מבוסס תלת ממדי נייד תרבות Micro-bioreactors perfused

הקבוצה שלנו פיתחה תרבות bioreactor מערכת המחקה את מדגיש pulsatile פיזיולוגיות של מערכת הלב וכלי הדם להתחדש מושתלת בקוטר קטן שתלי כלי דם.

הנדסה ביולוגית המבוססת דם שתלי שימוש bioreactor pulsatile

בפרוטוקול זה מוצג הייצור, ההתקנה והתפעול הבסיסי של ביו-ריאקטור פיקוליטר מיקרופלואידי (PLBR) לניתוח תאים בודדים של מיקרואורגניזמים פרוקריוטיים. מיקרואורגניזמים רלוונטיים מבחינה תעשייתית נותחו כהוכחה עקרונית המאפשרת תובנות לגבי קצב גדילה, מורפולוגיה והטרוגניות פנוטיפית על פני תקופות זמן מסוימות, בקושי אפשרי בשיטות קונבנציונליות.

ביו-ריאקטור מיקרו-נוזלי פיקוליטר לניתוח מיקרוביאלי של תאים בודדים: ייצור, הגדרת מערכת ותפעול

אנחנו פיתחו תרבות תא אוטומטית וחקירת פלטפורמה לניסויי גירוי תא מיקרו בקנה מידה. הפלטפורמה מציעה שליטה פשוטה, תכליתית, ומדויקת בטיפוח ועידוד אוכלוסיות קטנות של תאים, ומחל lysates לניתוחים מולקולריים. הפלטפורמה מתאימה גם למחקרים המשתמשים בתאים ו / או חומרים כימיים יקרים.

פלטפורמה אוטומטית צדדי לניסויים בגירוי תא מיקרו בקנה מידה

ויסות נוטריינטים באמצעות הזנה מותאמת לצמיחה מתמשכת משפר את שיעורי הגדילה של ספרואידים של תאי יונקים בהשוואה להזנת אצווה לסירוגין עבור תרביות בביו-ריאקטורים מעורבבים.  מחקר זה מדגים את השיטות הנדרשות להקמת תרביות פשוטות המוזנות בקצב מותאם.

תקנת מזין ידי האכלה רציפה להרחבה בקנה מידה הגדולה של בתאי יונקים ב Spheroids

ההתנהגות התפקודית של תאים בתרבית ניתן לשפר על ידי culturing בלמעלה in vivo-כמו 3 ממדי סביבות תרבות 16-21. כתב יד זה מתאר את פעולת הגדרה ושל מערכת bioreactor סיבים חלולה עבור in vivo-כמו בתרבית רקמה יונקת.

ריאקטורים סיבים חלולים עבור<em&gt; In vivo</em&gt; תרבות הרקמות היונקת-כמו

פרוטוקול מפורט עבור הפעולה בו-זמניות של תרביות תאים מקבילים 48 בתנאים מגוונים במערכת microbioreactor מוצג. תהליך התרבות תאים, קציר וניתוח כייל נוגדנים הבאים מתוארים.

השימוש תפוקה גבוהה אוטומטית Microbioreactor מערכת לייצור של מודל IgG1 בתאים צ'ו

כאן, אנו מציגים הליך מפורט כדי להריץ עיצוב של ניסוי במיקרו-bioreactor חקן אוטומטי ואחריו הקציר התאים וכימות החלבון באמצעות חלבון A עמודה.

מיטוב תהליכים באמצעות תפוקה גבוהה מיקרו-Bioreactors שחקנים בסינית טיפוח תא שחלה אוגר

אנו מציגים כאן שיטה המשלבת את השימוש במחיקה אפיגנטית כימית עם רמזים הקשורים למכנוזנסינג כדי ליצור ביעילות תאים פלוריפוטנטיים של יונקים, ללא צורך בטרנספקציה גנטית או בווקטורים רטרו-ויראליים. אסטרטגיה זו מבטיחה, אם כן, לרפואה תרגומית ומייצגת התקדמות ניכרת בטכנולוגיית האורגנואידים של תאי הגזע.

אסטרטגיה דו-שלבית המשלבת שינוי אפיגנטי ורמזים ביומכניים ליצירת תאים פלוריפוטנטיים של יונקים

כאן, אנו מציגים פרוטוקול להשגת ייצור בקנה מידה גדול של תאים דבקים באמצעות מערכת סגורה לחלוטין המבוססת על מיקרו-נשאים נמסים ברמת GMP. הטיפוח של תאי גזע מזנכימליים אנושיים, תאי HEK293T ותאי ורו אומת ועמד הן בדרישות הכמות והן בקריטריוני האיכות של תעשיית התרפיה התאית והגנטית.

ייצור תאים בקנה מידה גדול המבוסס על מיקרו-נשאים נקבוביים נמסים ברמת GMP (תנאי ייצור נאותים)

פרוטוקול זה מתאר כיצד להשתמש במערכת Omics של תרבית מיקרוליטר טיפה חד-תאית (תא MISS) כדי לבצע בידוד, טיפוח וקטיף חד-שבטי מיקרוביאלי. תא ה-MISS משיג זרימת עבודה משולבת המבוססת על טכנולוגיית מיקרופלואידית טיפות, המציעה פיזור חד-טיפתי מעולה, גידול מקביל גבוה וזיהוי ביומסה בתפוקה גבוהה.

גידול וקטיף חד-שבטי מיקרוביאלי אוטומטי ובתפוקה גבוהה באמצעות מערכת אומיקס תרבית מיקרוליטר-טיפה חד-תאית

למד לטפח תאי יונקים בביוריאקטור פניאומטי חד-פעמי. הפרוטוקול כולל כיול חיישני pH וחמצן מומס, הרכבת המערכת וחיבור מיקרו-נשאים בסטריליות. השיטה מספקת סביבת גידול מבוקרת ומפחיתה סיכון זיהום.

טיפוח של תאי יונקים באמצעות מערכת פניאומטיים Bioreactor יחיד שימוש

גלה סרטונים נוספים