דור יעיל iPS תא מהדם באמצעות Episomes וHDAC המעכבים

המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא ליצור תאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים ללא אינטגרציה מכמות קטנה של דם היקפי. זה מושג על ידי תרבית תאים חד-גרעיניים מבודדים בדם היקפי בגורמי גדילה מוגדרים כדי להניב אוכלוסיית אב אריתרוציטים המגיבה מאוד לתכנות מחדש. כשלב שני, פלסמידים אפיזומליים שאינם משתלבים הנושאים גנים לתכנות מחדש מוחדרים לאריתרובלסטים על ידי חיבה נוקלאו כדי להתחיל את תהליך התכנות מחדש.

לאחר מכן, התאים המושפעים מהגרעין מצופים על שכבה של פיברובלסטים עובריים של עכברים מוקרנים כדי לאפשר המשך תכנות מחדש בסופו של דבר בהצלחה. ניתן לזהות מושבות תאי גזע פלוריפוטנטיות מתוכנתות מחדש על סמך המאפיינים המורפולוגיים שלהן, פעילות פוספטאז אלקליין, אימונוכימיה חיובית לסמני פלוריפוטנטיות וביטוי גנים פלוריפוטנטיים אנדוגניים. היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות כמו תכנות מחדש מבוסס ויראלי, הוא שפרוטוקול זה מבטיח יצירה עקבית של IPSC ללא אינטגרציה מדגימים את ההליך היום ג'סי, אני וגרטשן ג'ונסון.

טכנאי במעבדה התחל בדילול דם היקפי ביחס של אחד לאחד ב-DPBS. לאחר מכן בצינור פוליסטירן תחתון עגול של 15 מיליליטר, שכבו בזהירות שבעה מיליליטר של הדם המדולל על שלושה מיליליטר בטמפרטורת החדר fi call hi pack. לאחר הפרדת הדגימה למשך 30 דקות ב-400 GS וטמפרטורת החדר, ה-pbmc יתיישב בשכבת הממשק הלבנה והעכורה בין הפלזמה לאריזה הגבוהה.

בעזרת פיפטת העברה סטרילית, העבירו את ה-P BMCs לצינור חרוטי של 15 מיליליטר והביאו את הנפח עד 10 מיליליטר עם DPBS טריים. לאחר מכן, לאחר ספירת התאים, העבירו פעמיים כפול 10 לששת ה-P BMCs לתוך צינור חרוטי חדש של 15 מיליליטר וסובבו את התאים הנותרים, הקפיאו את התאים הגלולים בריכוז כפול 10 ל-6 pbmc למיליליטר בסרום בקר עוברי 90% עם 10% דימתיל סולפוקסיד. לאחר מכן, לאחר סיבוב ה-BMCs P שהונחו בצד, אנו תולים את הגלולה בשני מיליליטר של מדיום התפשטות טרי שהוכן ומצלחים אותם לבאר אחת של צלחת תרבית רקמות של 12 בארות דוגרים על התאים באינקובטור לח של 37 מעלות צלזיוס עם אטמוספירה של 5% חמצן, 5% פחמן דו חמצני ו-90% חנקן.

לאחר מכן, ביום השלישי והשישי, החלף את המדיה על ידי איסוף התאים מהבאר. שטיפת הבאר בשני מיליליטר QBSF 60 כדי לאסוף את כל התאים שנותרו, כדורי התאים על ידי צנטריפוגה, ולאחר מכן החייאת הגלולה בשני מיליליטר של מדיום התפשטות טרי. לאחר מכן החזירו את התאים לאותה צלחת 12 בארות והמשיכו את הדגירה ביום התשיעי, פיפטה את הפלסמידים המתכנתים מחדש לצינור עינור סטרילי של 1.5 מיליליטר כמתואר בטבלה.

לאחר מכן, מערבבים את תמיסת החיבה של הנוקליאו עם התוספים המסופקים על ידי היצרן ומעבירים את התערובת לצינור DPH סטרילי של 1.5 מיליליטר. לאחר מכן מחלקים שני מיליליטר של מדיום התפשטות לבאר אחת של צלחת חדשה של 12 בארות ומאזן את המדיום בחממה הלחה של 37 מעלות צלזיוס עד שהתאים מוכנים. אסוף את התאים, שטוף היטב את תרבית התאים כפי שהודגם זה עתה ושטוף את התאים בחמישה מיליליטר DPBS.

לאחר מכן, השעו את גלולת התא ב-100 מיקרוליטר של תמיסת חיבה גרעינית בתוספת תוסף תוך הקפדה על יצירת בועות והעברת תרחיף התא לתוך הצינור המכיל את הפלסמיד המתכנת מחדש. מערבבים את התאים על ידי פיפטינג למעלה ולמטה פעם אחת ומעבירים את התמיסה כולה לתחתית ווט חיבה גרעיני. לאחר מכן הכנס את הווט למכונת החיבה של Nucle והפעל את תוכנית T 0 1 9.

כעת הוסף 100 מיקרוליטר של מדיום ההרחבה EQUILIBRATED לבדיקת חיבה גרעינית, ואסוף מיד את כל הדגימה תוך הימנעות מכל פסולת תאים מתים צפים לבנים והפקיד אותה לבאר של המדיום הקדם-חם. לאחר מכן הכניסו את התאים בחזרה לאינקובטור הלח ביום 10 או 11. מצפים כל באר של צלחת תרבית רקמות של שש בארות בג'לטין במיליליטר אחד של 0.1% ג'לטין ב-HBSS, ולאחר מכן מניחים את הצלחת באינקובטור הלח או לפחות חמש דקות במהלך הדגירה מעבירים בקבוקון אחד של הפשרה, פעמיים כפול 10 לשש עכברים מוקרנים 3000 מעלות צלזיוס, עובריים, פיברובלסטים או MES לתוך 10 מיליליטר של מדיה מת' חמה מראש, ואז צנטריפוגה של התאים בזמן שהתאים מסתובבים מטה.

שאפו את תמיסת הג'לטין מצלחת שש הבארות, ולאחר מכן השעו מחדש את ה-mes ב-12 מיליליטר של מדיה מת' טרייה. מוציאים מיד שני מיליליטר OFM לכל באר של ציפוי הג'לטין. שש. צלחת טובה והנח את הצלחת בחזרה לאינקובטור הלח עד יום 12.

ביום ה-12, אספו את התאים הנגועים בגרעין מהבאר לתוך צינור חרוטי אחד של 15 מיליליטר, ושטפו את הבאר כפי שהודגם כדי לאסוף את כל התאים שנותרו. לאחר סיבוב התאים, אנו משעים את הגלולה ב-12 מיליליטר של מדיום תכנות טרי שהוכן מחדש, ומחלקים שני מיליליטר תאים לכל באר של תאי הזנה. בצלחת שש הבארות צנטריפוגה את הצלחת למשך 30 דקות ב-75 GS וטמפרטורת החדר, ולאחר מכן הנח את הצלחת בחזרה לאינקובטור הלח, והחלף את המדיום כל יומיים למשך שבוע עד שבועיים.

לאחר הופעת מושבות התאים הפלוריפוטנטיות הניתנות להשראה, התחל להזין את התאים במדיום תאי גזע עוברי אנושי טרי שהוכן המכיל מעכבי היסטון דאצטילאז שלושה ימים לאחר חיבה לגרעין ולפני הציפוי, התאים המושפעים מהגרעין על המת' הניתן להשראה. יש להעריך את היעילות של חיבה גרעינית מוצלחת של NU על ידי מיקרוסקופיה פלואורסצנטית עבור EGFP, למשל, מוצג כאן ניסוי חיבה גרעיני טיפוסי עם כחמישה עד 10% מכלל אוכלוסיית התאים המבטאת מושבות תאי גזע פלוריפוטנטיות מתוכנתות מחדש של EGFP יתחילו להופיע כשבועיים לאחר החיבה הגרעינית של NU. המושבות הן בדרך כלל עגולות עם גבולות מוגדרים היטב וניתן לזהות אותן על ידי המורפולוגיה האופיינית של תאי גזע עובריים אנושיים, כולל תאים קטנים ארוזים היטב עם יחס גרעיני לציטופלזמי גבוה וגרעינים גלויים של הקווים המייצגים שאופיינו במלואם.

כל הבדיקות החיוביות לפעילות פוספטאז אלקליין מבטאות את סמני הפלוריפוטנטיות הסטנדרטיים ומפעילות מחדש גנים פלוריפוטנטיים אנדוגניים לאחר שליטה. טכניקה זו יכולה ליצור באופן עקבי IPSC ללא אינטגרציה תוך ארבעה שבועות אם היא מבוצעת כראוי. לאחר הליך זה, ניתן לבצע מחקרי התמיינות כדי לענות על שאלות לגבי כל סוג רקמה.