Name: דור יעיל iPS תא מהדם באמצעות Episomes וHDAC המעכבים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-10-28T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 14 s
Description: למד לייצר תאי גזע iPS ללא שילוב גנומי מדם פריפרי באמצעות פלסמידים אפיזומליים ומעכבי HDAC. שיטה זו מבטיחה יעילות גבוהה ומזערית סיכוני מוטגנזה להשתלות עתידיות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים מבקשים להודות מענקי מ- NIH הבאים לתמיכה במחקר זה: K08DK082783 (AR), P30DK56465 (BTS), U01HL099993 (BTS), T32HL00715036 (SKS), וK12HL0806406 (SKS); וקרן JP מקארתי (AR).

כתב הסכמה מדעת, כפי שאושר על ידי ועדות הביקורת המוסדית של המרכז לחקר סרטן פרד האצ&#39;ינסון והילדים &quot;בית החולים של פילדלפיה של, התקבל מחולים לפני איסוף דגימות דם היקפיים. כל ההנחיות מוסדיות נצפו. כל הניסויים בבעלי החיים, כולל דור MEF ו היווצרות תפלצת אושרה על ידי ועדת הטיפול ושימוש בבעלי חיים המוסדיים. 1. הפרדת Ficoll של PBMCs והרחבת Erythroblasts - יום 0 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל דם היקפי 1: 1 עם בופר פוספט של Dulbecco (DPBS). בתוך צינור קלקר מסביב לתחתית 15 מיליליטר, שכבה בזהירות 7 מיליליטר של דם מדולל על 3 מיליליטר של בטמפרטורת חדר Ficoll-Hypaque. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה המדגם ב 400 XG למשך 30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> PBMCs תהיה התיישבו לממשק בין הפלזמה וFicoll-Hypaque, נתפס כשכבת לבנה מעונן. בעזרת פיפטה העברת סטרילי, לאסוף את PBמנחים לתוך צינור חרוטי אחד 15 מיליליטר. תביא את הנפח ל 10 מיליליטר באמצעות DPBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות hemacytometer, לספור את PBMCs. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיפטה 2 × 10 6 PBMCs לתוך צינור נפרד 15 מיליליטר חרוטי ו צנטריפוגות ב XG 300 במשך 5 דקות. ספין למטה תאים וההקפאה נותרו בריכוז של 2 × 10 6 מיליליטר / PBMCs ב -90% בסרום שור העובר (FBS) sulfoxide דימתיל / 10% (DMSO). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן הרחבה בינונית: מדיום חופשי QBSF-60 בסרום (להגן מפני אור) + פניצילין / סטרפטומיצין (1%) + חומצה אסקורבית (50 ng / ml) + גזע גורם תא (SCF, 50 ng / ml) + interleukin 3 (אִי- גורם 3, 10 ng / ml) + אריתרופויאטין (EPO, 2 U / ml) + אינסולין כמו צמיחה 1 (IGF-1, 40 ng / ml) + דקסמתזון (1 מיקרומטר; להגן מפני אור; להפשיר aliquot טרי בכל אמצעי תקשורת לשנות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend 2 × 10 6 PBMCs 2 מיליליטר של הרחבה בינונית טריה ומקום לתוך אחד היטב צלחת תרבות 12 רקמות היטב דגירה בחממה humidified 37 ° C עם אווירה של 5% O 2, 5% CO 2, ו -90% N 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביום 3 ויום 6, להחליף תקשורת. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף את התאים ולשטוף היטב עם 2 מיליליטר של QBSF-60 כדי לאסוף את כל תאים שנותרו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה ההשעיה תא XG ב 300 במשך 5 דקות ולשאוב supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend התאים 2 מיליליטר של מדיום הרחבה החדש ולהחזיר אותם לאותה הצלחת גם 12. </li></ol></li></ol> 2. תאי תכנות מחדש על ידי nucleofection - יום 9 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיפטה פלסמידים תכנות מחדש לתוך צינור סטרילי 1.5 מיליליטר אפנדורף (טבלת 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים את פתרון nucleofection עם תוספת (שסופק על ידי יצרן) וטפטפתי לתוך צינור אפנדורף 1.5 מיליליטר סטרילי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיפטה 2 מיליליטר של הרחבה בינונית ולאחת מצלחת גם 12 ומקום בחממה 37 מעלות צלזיוס humidified (5% O 2, 5% CO 2, ו -90% N 2) לאיזון לפני הוספת תאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אסוףתאים בתרבית ולשטוף היטב עם 2 מיליליטר של QBSF-60 לאיסוף תאים שנותרו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה התאים ב XG 300 במשך 5 דקות ולשאוב supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את התאים על ידי resuspending ב 5 מיליליטר של DPBS וצנטריפוגה XG ב 300 במשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend התא גלולה בפתרון nucleofection + תוספת 100 μl, לטפל כדי למנוע בועות יצירה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיפטה ההשעיה התא לתוך הצינור המכיל פלסמידים תכנות מחדש, פיפטה למעלה ולמטה פעם אחת, ופיפטה המדגם לתוך החלק התחתון של קובט nucleofection. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את קובט לתוך מכשיר nucleofection ולהפעיל תכנית T-019. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת הרחבת prewarmed בינונית (מצלחת equilibrating בשלב 2.3) 100 μl לקובט nucleofection. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מייד לאסוף את כל מדגם והפקדה לתוך הבאר של הרחבה בינונית מחוממת מראש. הימנע מאיסוף הפסולת הלבנה, צף המתה התא. </li&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את הצלחת בחממה humidified 37 ° C (5% O 2, 5% CO 2, ו -90% N 2) לצמיחה. </li></ol> 3. תאי מזין ציפוי - יום 10 או 11 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביום 10, תאים מזינים צלחת. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צלחת מעיל אחד 6 גם תרבית רקמה עם ג&#39;לטין. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיפטה 1 ג&#39;לטין מ &#39;של 0.1% בנאגרו מלוח הפתרון של האנק (HBSS) לבאר כל הצלחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את הצלחת 37 מעלות צלזיוס חממת humidified במשך לפחות 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מייד לפני השימוש, לשאוב את פתרון ג&#39;לטין מהצלחת. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להפשיר בקבוקון אחד של 2 fibroblasts העוברי × 10 6 עכבר מוקרן ב3,000 cGy ל -10 מיליליטר של MEF מדיה prewarmed (הנשר בינוני השתנה Dulbecco (DMEM) + FBS (10%) + פניצילין / סטרפטומיצין (1%)). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה התאים ב XG 300 במשך 5 דקות ולשאוב supernatant. Resuspend התאים 12 מיליליטר של MEF מדיה ופיפטה 2 מיליליטר in כדי היטב בכל 6 הצלחת גם ג&#39;לטין מצופה. מניחים את הצלחת בחממה humidified 37 ° C (5% O 2, 5% CO 2, ו -90% N 2) עד ליום 12. </li></ol></li></ol> 4. תאי ציפוי בתאים מזין ושינוי בינוני - יום 12 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף את תאי nucleofected לאחת צינור חרוטי 15 מ&quot;ל ולאסוף את כל תאים שנותרו על ידי שטיפה היטב עם 2 מיליליטר של QBSF-60. צנטריפוגה המדגם XG ב 300 במשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן תכנות מחדש בינוני: של Iscove השתנה בינוני של Dulbecco (IMDM) + FBS (10%) + L-גלוטמין שאינם בעלי חיים (1 מ&quot;מ) + שאינו חיוני חומצות אמינו (NEAA, 1%) + פניצילין / סטרפטומיצין (1%) + β -mercaptoethanol (0.1 מ&quot;מ) + גורם גדילה פיברובלסטים בסיסי (bFGF, הוסיף טרי בהאכלה, 10 ng / ml) + חומצה אסקורבית (הוסיף טרי בהאכלה, 50 מיקרוגרם / מיליליטר). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב supernatant וresuspend התאים 12 מיליליטר של תכנות מחדש בינוני. פיפטה 2 מיליליטר לכל טוב של ההשעיה התא לתוךצלחת 6 היטב של תאים מזינים (כפי שהוכן בסעיף 3). צנטריפוגה את הצלחת ב 50 XG למשך 30 דקות בטמפרטורת חדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את הצלחת בחממה humidified 37 ° C (5% O 2, 5% CO 2, ו -90% N 2) לצמיחה. לשנות את תכנות מחדש בינוני בכל יום אחר עד מושבות iPSC מתחילות להופיע (1-2 שבועות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן hESC בינוני: DMEM / F12 1: 1 + החלפת נוק סרום (20%) + פניצילין / סטרפטומיצין (1%) + NEAA (1%) + L-גלוטמין שאינם בעלי חיים (1 מ&quot;מ) + פירובט נתרן (1%) + סודיום ביקרבונט (0.12%) + β-mercaptoethanol (0.1 מ&quot;מ) + bFGF (הוסיף טרי בהאכלה, 10 ng / ml) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן מעכבי HDAC: וטיראט נתרן (הוסיף טרי בהאכלה, 100 מיקרומטר), חומצת suberanilohydroxamic (סח&quot;ה, הוסיפה טרי בהאכלה, 200 ננומטר). ברגע שמושבות iPSC מופיעות, להתחיל להאכיל את התאים עם מעכבי hESC בינוני + HDAC, שינוי בינוני בכל יום. הערה: בוטיראט נתרן הוא מולקולה קטנה שנספחה לצינורות פלסטיק, therefore לאחסן אותו בצינור זכוכית בורוסיליקט על 4 מעלות צלזיוס. </li></ol> 5. משובט בידוד iPSC <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברגע שמושבות iPSC הם גדולות מספיק כדי להיות מבודדים (20-25 תאים), לאסוף אותם עם טפטפת P20. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן מעכבי HDAC: וטיראט נתרן (הוסיף טרי בהאכלה, 100 מיקרומטר), סח&quot;ה (הוסיף טרי בהאכלה, 200 ננומטר) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את המושבות מבודדות על iMEFs ב -35 מנות מ&quot;מ בודדות המכילות מעכבי hESC בינוני + HDAC + תוספת שיבוט ושחזור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> היום לאחר קטיף המושבות, לשנות את המדיום למעכבי hESC בינוני + HDAC. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשנות את המדיום כל יום עד מושבות iPSC מוכנות לpassaging. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר מעכבי HDAC מהמדיום פעם אחת מושבות יתייצבו במעבר 2-3. </li></ol>

<ol><li>Takahashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+adult+human+fibroblasts+by+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors.</a> Cell. 131 (5), 861-872 (2007).</li>
<li>Koche, R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reprogramming+factor+expression+initiates+widespread+targeted+chromatin+remodeling%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Reprogramming factor expression initiates widespread targeted chromatin remodeling.</a> Cell Stem Cell. 8 (1), 96-105 (2011).</li>
<li>Baum, C., Kustikova, O., Modlich, U., Li, Z., Fehse, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutagenesis+and+oncogenesis+by+chromosomal+insertion+of+gene+transfer+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Mutagenesis and oncogenesis by chromosomal insertion of gene transfer vectors.</a> Human Gene Therapy. 17 (3), 253-263 (2006).</li>
<li>Okita, K., Ichisaka, T., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+germline-competent+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Generation of germline-competent induced pluripotent stem cells.</a> Nature. 448 (7151), 313-317 (2007).</li>
<li>Yu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+induced+pluripotent+stem+cells+free+of+vector+and+transgene+sequences%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Human induced pluripotent stem cells free of vector and transgene sequences.</a> Science. 324 (5928), 797-801 (2009).</li>
<li>Hong, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Suppression+of+induced+pluripotent+stem+cell+generation+by+the+p53-p21+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Suppression of induced pluripotent stem cell generation by the p53-p21 pathway.</a> Nature. 460 (7259), 1132-1135 (2009).</li>
<li>Okita, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+more+efficient+method+to+generate+integration-free+human+iPS+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">A more efficient method to generate integration-free human iPS cells.</a> Nature Methods. 8 (5), 409-412 (2011).</li>
<li>Yates, J. L., Warren, N., Sugden, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stable+replication+of+plasmids+derived+from+Epstein-Barr+virus+in+various+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Stable replication of plasmids derived from Epstein-Barr virus in various mammalian cells.</a> Nature. 313 (6005), 812-815 (1985).</li>
<li>Ware, C. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+deacetylase+inhibition+elicits+an+evolutionarily+conserved+self-renewal+program+in+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Histone deacetylase inhibition elicits an evolutionarily conserved self-renewal program in embryonic stem cells.</a> Cell Stem Cell. 4 (4), 359-369 (2009).</li>
<li>Mali, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Butyrate+greatly+enhances+derivation+of+human+induced+pluripotent+stem+cells+by+promoting+epigenetic+remodeling+and+the+expression+of+pluripotency-associated+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Butyrate greatly enhances derivation of human induced pluripotent stem cells by promoting epigenetic remodeling and the expression of pluripotency-associated genes.</a> Stem Cells. 28 (4), 713-720 (2010).</li>
<li>Azuara, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+signatures+of+pluripotent+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Chromatin signatures of pluripotent cell lines.</a> Nature Cell Biology. 8 (5), 532-538 (2006).</li>
<li>Sommer, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+human+induced+pluripotent+stem+cells+from+peripheral+blood+using+the+STEMCCA+lentiviral+vector%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Generation of human induced pluripotent stem cells from peripheral blood using the STEMCCA lentiviral vector.</a> J. Vis. Exp. (68), e4327(2012).</li>
<li>Yoshida, Y., Takahashi, K., Okita, K., Ichisaka, T., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypoxia+enhances+the+generation+of+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Hypoxia enhances the generation of induced pluripotent stem cells.</a> Cell Stem Cell. 5, 237-241 (2009).</li>
<li>Abbondanzo, S. J., Gadi, I., Stewart, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivation+of+Embryonic+Stem+Cell+Lines%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Derivation of Embryonic Stem Cell Lines.</a> Methods in Enzymology. 225, 803-823 (1993).</li>
<li>Kim, H. J., Bae, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+deacetylase+inhibitors%3A+molecular+mechanisms+of+action+and+clinical+trials+as+anti-cancer+drugs%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Translational+Research%22%5BJournal%5D)">Histone deacetylase inhibitors: molecular mechanisms of action and clinical trials as anti-cancer drugs.</a> American Journal of Translational Research. 3 (2), 166-179 (2011).</li>
</ol>

החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

עבור דור iPSC מוצלח בעת שימוש בפרוטוקול זה, יש כמה אזהרות חשובות שיש לקחת בחשבון. בשלב התרחבות erythroblast, לוח הזמנים של שינוי התקשורת צריך להיות רק אחריו, כסטיות עלולות להוביל לגירוי לא יעיל של אוכלוסיית תא אב היעד ויעילות נמוכה יותר של דור iPSC. זה חשוב לעשות בינוני הרחבה חדשה עם dexamethasone הטרי עם כל שינוי תקשורת; ובינוני בסיס QBSF-60 ודקסמטזון צריכים להיות מוגן מפני אור במהלך האחסון. במהלך nucleofection, לשטוף DPBS הוא קריטי כדי להסיר מומסים עודף מהשעית התא שעלול לגרום לז...

iPSCs נגזרים מרקמות סומטיות באמצעות ביטוי חוץ-רחמי של מספר מינימלי של גני pluripotency. טכניקה זו הייתה בתחילה הודגמה על ידי התמרה retroviral של פיברובלסטים אנושיים עם Oct4, Sox2, KLF4, וcMYC, אשר באות לידי ביטוי ביותר במדינת pluripotent 1. זמנית הביעו &quot;גורמי תכנות מחדש&quot; אלה לשנות את פרופיל הביטוי של תא המטרה אפיגנטיים נוף והגן דומה לתאי גזע עובריים אנושיים 2. לאחר שנוצר, iPSCs יכול להיות מובחן פוטנציאלי לכל סוג רקמה לחקירה נוספת. כך, יש להם הבטחה לשימוש ברפואת רגנרטיבית, דוגמנות מחלה, ויישומי ריפוי גנטי. עם זאת, לשבש את הגנום עם וירוסי שילוב יש את הפוטנציאל לשנות את ביטוי הגנים אנדוגני, פנוטיפ הסלולר השפעה, וסופו של דבר מטה את תוצאות מדעיות. יתר על כן, אינטגרציה נגיפית אקראית יכולה להוביל לדואר סלולארי מזיקffects, כולל האפשרות לשינוי ממאיר 3 מחדש או ביטוי של הגנים המושתלים שעור 4. יישומים קליניים בעתיד ידרשו דור iPSC-שילוב שאינו. Episomes, שהם מולקולות הדנ&quot;א בכרומוזומים מעגליים נוספות, מציע אסטרטגיה ליצירת iPSCs חסכוני, ללא אינטגרציה 5. השילוב של וקטורי episomal מוצגים בטבלה 1 להביע את תכנות מחדש של גורמי Oct4, Sox2, KLF4, MYCL, וLIN28A. פלסמיד pCXLE_hOCT3 / 4 shp53-F מכיל גם p53 shRNA לדיכוי זמני של TP53 כדי לשפר את תכנות מחדש של תאי 6. וקטור pCXWB-EBNA1 חסר השכפול מקדם הגברה של גורמי תכנות מחדש ויעילות תכנות מחדש מוגברת על ידי מתן עלייה זמנית בביטוי EBNA1 7. פלסמיד pCXLE_EGFP ניתן להוסיף לתערובת nucleofection לצורך Determining יעילות transfection או ליישומי מיון תא. למעט CXWB-EBNA1 p, פלסמידים episomal שימוש בפרוטוקול זה מכילים את מקור נגיף אפשטיין-באר בשכפול נגיף וגן EBNA1, אשר מתווך שכפול וחלוקת episome במהלך חלוקת התא המארח 8. Episomes באופן ספונטני לאיבוד עם התרחבות iPSC רצוף 7. Subcloning ואפיון של iPSCs עם אובדן וקטור episomal, שניתן להסיק מאובדן של ביטוי eGFP, יכולים להוביל ללחלוטין iPSCs החופשי אינטגרציה ליישומים קליניים בעתיד. טבוע בתהליך של דור iPSC הוא דיכוי של גנים ספציפיים שושלת והפעלה מחדש של גנים הקשורים pluripotency. רגולציה של ביטוי גנים מתרחשת במספר הרמות בתוך הגרעין, ובכלל זה שינויים ב- DNA והכרומטין כדי לאפשר גורמי שעתוק, רצפי דנ&quot;א רגולציה, וגישה RNA פולימראז למקדגנים. עיצוב מחדש של הנוף ההתווצרותי באמצעות שינויי הכרומטין הגלובליים הוא מרכיב מרכזי מחדש ביטוי של התכנית הגנטית pluripotency. שינוי הכרומטין ספציפי שהוא חשוב בויסות של ביטוי גנים הוא acetylation של ההיסטונים בשאריות ליזין מסוימים, המאפשר גישה ליעד גנים באמצעות מתח נמוך יותר של סליל היסטון-DNA. מעכבי HDAC הם מולקולות קטנות אשר הוכחו כדי לשפר את תכנות מחדש iPSC וhESC התחדשות עצמית 9,10, ככל הנראה בשל תמיכה מדינת acetylated 11. הפרוטוקול המתואר להלן, שהותאם מפרסום קודם באמצעות lentiviruses שילוב 12, מספק שיטת צעד-אחר-צעד לדור iPSC מותאם מepisomes באמצעות דם היקפי ומעכבי HDAC. ריכוזי מעכב HDAC משמשים כאן הם חצי מאלה המתוארים על ידי ור, et al 9., והובלתי באופן שגרתי לעלייה של 2 לקפל במושבות iPSC לתכנות מחדש באופן מלא על תקןפרוטוקולי תכנות מחדש episomal ללא מעכבי HDAC. רמה זו של תכנות מחדש היא באחידות עם היעילות שאנו רואים עם שיטות lentiviral. שימוש בפרוטוקול זה, יש לנו ביעילות שנוצר iPSC מאנשים זקנים כמו 87 שנים של גיל.

<table><tbody><tr><td>Ficoll-Paque PLUS</td><td>Fisher Scientific</td><td>45-001-750</td><td>יש לאחסן בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.</td></tr><tr><td>חנות DPBS</td><td>Life Technologies</td><td>14190-250</td><td>ב-4 מעלות צלזיוס.</td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Life Technologies</td><td>11875-093</td><td>חנות ב-4 מעלות צלזיוס.</td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי (FBS)</td><td>Life Technologies</td><td>חנות 10437028</td><td>ב-20 מעלות; C עד הצורך. הפשרה, עליון, חנות ב -4 מעלות צלזיוס.</td></tr><tr><td>דימתיל סולפוקסיד (DMSO)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>154938</td><td>יש לאחסן בטמפרטורת החדר.</td></tr><tr><td>QBSF-60 בינוני ללא סרום</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-983-234</td><td>חנות ב -4 מעלות צלזיוס.</td></tr><tr><td>פניצילין/סטרפטומיצין</td><td>Life Technologies</td><td>חנות 15140122</td><td>ב-4 מעלות צלזיוס.</td></tr><tr><td>ערכת נוקלאופקטור קו תאים V</td><td>Lonza</td><td>VCA-1003</td><td>חנות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.</td></tr><tr><td>תמיסת ג'לטין 2%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1393</td><td>חנות ב-4 מעלות; C, נוזל ב-37 מעלות; C אמבט מים לפני השימוש.</td></tr><tr><td>תמיסת מלח מאוזנת של האנק (HBSS)</td><td>Life Technologies</td><td>14175-103</td><td>חנות ב-4 מעלות צלזיוס.</td></tr><tr>חנות <td>Modified Eagle Medium (DMEM) Life</td> <td>Technologies</td><td>11965-092</td> של Dulbecco <td>ב-4 מעלות צלזיוס.</td></tr><tr>חנות <td>Medium Medium (IMDM)</td><td>Life Technologies</td><td>12440-061</td> של Iscove <td>ב-4 מעלות</td></tr> צלזיוס.<tr><td>L-גלוטמין, 200 מ"מ</td><td>Life Technologies</td><td>25030-081</td><td>Aliquot, הקפאה ב-20 מעלות צלזיוס.</td></tr><tr><td>חומצות אמינו לא חיוניות (NEAA), 100X</td><td>Life Technologies</td><td>11140-050</td><td>יש לאחסן בטמפרטורה של 4 מעלות; C, הרחק מאור.</td></tr><tr><td>DMEM/Ham's F12, 1:1</td><td>חנות פישר סיינטיפיק</td><td>SH30023.02</td><td>ב-4 מעלות צלזיוס.</td></tr><tr><td>KnockOut Serum Replacement</td><td>Life Technologies</td><td>10828-028</td><td>Aliquot, הקפאה ב-20 & מעלות צלזיוס.</td></tr><tr><td>נתרן פירובט, 100 מ"מ</td><td>Life Technologies</td><td>11360-070</td><td>חנות ב-4 מעלות צלזיוס.</td></tr><tr><td>נתרן ביקרבונט, 7.5%</td> <td>Life Technologies</td><td>חנות 25080094</td><td>ב-4 מעלות צלזיוס.</td></tr><tr><td>גורם גדילה פיברובלסטים בסיסי (bFGF)</td><td>Life Technologies</td><td>PHG0263</td><td>הכינו מלאי של 10 מ"ג/מ"ל ב-DPBS, להקפיא ב-20 מעלות צלזיוס. לאחר ההפשרה, יש לאחסן בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.</td></tr><tr><td>נתרן בוטיראט&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B5887-1G</td><td>הכינו מלאי 2000x (400 מ"מ) ב-DPBS, עליון, הקפאה ב-20 מעלות צלזיוס. לאחר ההפשרה, יש לאחסן בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.</td></tr><tr><td>שיבוט תאי hES & תוסף התאוששות</td><td>Stemgent</td><td>01-0014-500</td><td>חנות ב-20 מעלות; C עד הצורך. לאחר ההפשרה, יש לאחסן בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.</td></tr><tr><td>מטריגל BD מוסמך ESC</td><td>BD Biosciences</td><td>35-4277</td><td>מפשיר לילה על קרח ב-4 מעלות; C, מכניסים לצינורות מקוררים מראש באמצעות קצות פיפטה מקוררים מראש. יש לאחסן בטמפרטורה של -20 מעלות; C עד הצורך. הפשרה ב-4 מעלות; ג, יש להשתמש מיד.</td></tr><tr><td>StemSpan SFEM&nbsp;</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>9650</td><td>Aliquot, הקפאה ב-20 מעלות צלזיוס.</td></tr><tr><td>חומצה אסקורבית, אבקת</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4403-100MG</td><td>הכינו מלאי של 5 מ"ג/מ"ל ב-DPBS, מסנן סטרילי, אחסן ב-4 מעלות צלזיוס.</td></tr><tr><td>גורם תאי גזע אנושי רקומביננטי (SCF)</td><td>R & D Systems</td><td>255-SC-010</td><td>Make 100 &mu; מלאי g/m ב-SFEM, aliquot, קפוא ב-20 &deg;C. לאחר ההפשרה, יש לאחסן בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.</td></tr><tr><td>אינטרלוקין אנושי רקומביננטי 3 (IL-3)</td> <td>מו"פ & D Systems</td><td>203-IL-010</td><td>Make 100 &mu; מלאי גרם/מ"ל ב-SFEM, aliquot, להקפיא ב-20 מעלות צלזיוס. לאחר ההפשרה, יש לאחסן בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.</td></tr><tr><td>אריתרופויטין (EPO)</td><td>מו"פ & D Systems</td><td>287-TC-500</td><td>הכינו מלאי של 1000 U/ml ב-SFEM, להקפיא ב-20 מעלות צלזיוס. לאחר ההפשרה, יש לאחסן בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.</td></tr><tr><td>גורם גדילה רקומביננטי דמוי אינסולין אנושי 1 (IGF-1)</td> <td>מו"פ & D Systems</td><td>291-G1-200</td><td>Make 100 &mu; מלאי גרם/מ"ל ב-SFEM, aliquot, להקפיא ב-20 מעלות צלזיוס. לאחר ההפשרה, יש לאחסן בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.</td></tr><tr><td>&בטא;-מרקפטואתנול</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>M7522</td><td>הכינו מלאי פי 1000 (100 מ"מ) ב-DPBS.</td></tr><tr><td>דקסמתזון</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>D4902-25MG</td><td>הכינו מלאי פי 50 (50 &mu; M) ב-DPBS, מסנן סטרילי, יש לאחסן בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.</td></tr><tr><td>SAHA (vorinostat)</td><td>קיימן כימיקלים</td><td>149647-78-9</td><td>הכינו מלאי פי 2,000 (400 מ"מ) ב-DPBS, aliquot, הקפיאו ב-20 מעלות צלזיוס. לאחר ההפשרה, יש לאחסן בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.</td></tr><tr><td>צלחת תרבית רקמות 12 באר</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>08-772-29</td><td></td></tr><tr><td>15 מ"ל צינור חרוטי</td><td>Sarstedt</td><td>62553002</td><td></td></tr><tr><td>1.5 מ"ל צינור אפנדורף</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>05-408-129</td><td></td></tr><tr><td>6 צלחת תרבית רקמות</td><td>באר פישר סיינטיפיק</td><td>08-772-1B</td><td></td></tr><tr><td>35 מ"מ צלחות תרבית tisue BD</td><td>Biosciences</td><td>353001</td><td></td></tr><tr><td>10 מ"ל פיפטות סרולוגיות חד פעמיות</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>13-675-20</td><td></td></tr><tr><td>5 מ"ל פיפטות סרולוגיות חד פעמיות</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>13-675-22</td><td></td></tr><tr><td>2 מ"ל פיפטות סרולוגיות חד פעמיות</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>13-675-17</td><td></td></tr><tr><td>20 &mu; l קצות פיפטה, קצות מחסום</td><td>Genessee</td><td>24-404</td><td></td></tr><tr><td>פיפטות פסטר זכוכית</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>13-678-20D</td><td></td></tr><tr><td>סיוע פיפטה</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>13-681-15</td><td></td></tr><tr><td>pCXLE-hOCT3/4-shp53-F</td><td>Addgene</td><td>27077</td><td></td></tr><tr><td>pCXLE-hSK</td><td>Addgene</td><td>27078</td><td></td></tr><tr><td>pCXLE-hUL</td><td>Addgene</td><td>27080</td><td></td></tr><tr><td>pCXLE-EGFP</td><td>Addgene</td><td>27082</td><td></td></tr><tr><td>pCXWB-EBNA1</td><td>Addgene</td><td>37624</td><td></td></tr></tbody></table>

דור יעיל ips תא מהדם באמצעות episomes וhdac המעכבים

Efficient iPS Cell Generation from Blood Using Episomes and HDAC Inhibitors

כתב יד זה מדגים פרוטוקול ליעילות יצירת תאים ללא אינטגרציה אנושית הנגרם גזע pluripotent (iPSCs) מהדם היקפי באמצעות פלסמידים episomal וdeacetylase היסטון מעכבים (HDAC). היתרונות של גישה זו כוללים: (1) השימוש בכמות מינימאלית של דם היקפי כחומר מקור; (2) nonintegrating וקטורי תכנות מחדש; שיטה חסכונית ליצירת iPSCs החופשי וקטור (3); transfection יחיד (4); ו- (5) השימוש במולקולות קטנות כדי להקל על תכנות מחדש אפיגנטיים. בקצרה, תאים היקפיים mononuclear הדם (PBMCs) מבודדים מדגימות לקיחת דם שגרתיות ולאחר מכן בתרבית גורמי גדילה מוגדרת להניב אוכלוסיית תא אב כדורית אדומה שגשוג מאוד כי להפליא ניתן לתכנות מחדש. Nonintegrating, פלסמידים episomal nontransmissible להביע Oct4, Sox2, KLF4, MYCL, LIN28A, וסיכת ראש קצרה RNA p53 (SH) הם introduCED לerythroblasts נגזר באמצעות nucleofection יחיד. Cotransfection של episome שמבטא משופר חלבון פלואורסצנטי ירוק (eGFP) מאפשר זיהוי קל של תאי transfected. פלסמיד כפול מחסרת נפרד להביע אפשטיין-באר אנטיגן הגרעיני 1 (EBNA1) הוא גם הוסיף לתערובת התגובה לביטוי מוגבר של חלבוני episomal. אז תאי transfected הם מצופים על שכבת פיברובלסטים עכבר המוקרן עובריים (iMEFs) לתכנות מחדש המשיך. ברגע שהמושבות כמו-iPSC מופיעות בכ-עשרה ימים לאחר nucleofection, מעכבי HDAC מתווספים למדיום כדי להקל על שיפוץ אפיגנטיים. מצאנו כי הכללת מעכבי HDAC באופן שגרתי מגבירה את הדור של מושבות iPSC לתכנות מחדש באופן מלא על ידי 2 קיפול. ברגע שמושבות iPSC להציג מורפולוגיה טיפוסית של תאי גזע עובריים אנושיים (hESC), הם מועברים בעדינות לצלחות אישיות מצופות iMEF רקמת תרבות לצמיחה והתרחבות.

שלושה ימים לאחר nucleofection ולפני ציפוי תאי nucleofected על iMEFs, את היעילות של nucleofection המוצלח צריכה להיות מוערכת על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי לeGFP. איור 1 מציג ניסוי nucleofection טיפוסי עם כ 5-10% מאוכלוסיית התא הכוללת להביע eGFP. מושבות iPSC תכנות מחדש יתחילו להופיע כשבועיים לאחר nucleofection. המושבות הן בדרך כלל עגולות עם גבולות מוגדרים היטב וניתן לזהות על ידי מורפולוגיה hESC אופיי...

כאן אנו מתארים פרוטוקול להפקת תאי גזע pluripotent אנושי הנגרם מהדם היקפי באמצעות אסטרטגית תכנות מחדש episome מבוסס ומעכבי היסטון deacetylase.

דור יעיל iPS תא מהדם באמצעות Episomes וHDAC המעכבים

This manuscript illustrates a protocol for efficiently creating integration-free human induced pluripotent stem cells (iPSCs) from peripheral blood using ...

המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא ליצור תאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים ללא אינטגרציה מכמות קטנה של דם היקפי. זה מושג על ידי תרבית תאים חד-גרעיניים מבודדים בדם היקפי בגורמי גדילה מוגדרים כדי להניב אוכלוסיית אב אריתרוציטים המגיבה מאוד לתכנות מחדש. כשלב שני, פלסמידים אפיזומליים שאינם משתלבים הנושאים גנים לתכנות מחדש מוחדרים לאריתרובלסטים על ידי חיבה נוקלאו כדי להתחיל את תהליך התכנות מחדש.לאחר מכן, התאים המושפעים מהגרעין מצופים על שכבה של פיברובלסטים עובריים של עכברים מוקרנים כדי לאפשר המשך תכנות מחדש בסופו של דבר בהצלחה. ניתן לזהות מושבות תאי גזע פלוריפוטנטיות מתוכנתות מחדש על סמך המאפיינים המורפולוגיים שלהן, פעילות פוספטאז אלקליין, אימונוכימיה חיובית לסמני פלוריפוטנטיות וביטוי גנים פלוריפוטנטיים אנדוגניים. היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות כמו תכנות מחדש מבוסס ויראלי, הוא שפרוטוקול זה מבטיח יצירה עקבית של IPSC ללא אינטגרציה מדגימים את ההליך היום ג'סי, אני וגרטשן ג'ונסון.טכנאי במעבדה התחל בדילול דם היקפי ביחס של אחד לאחד ב-DPBS. לאחר מכן בצינור פוליסטירן תחתון עגול של 15 מיליליטר, שכבו בזהירות שבעה מיליליטר של הדם המדולל על שלושה מיליליטר בטמפרטורת החדר fi call hi pack. לאחר הפרדת הדגימה למשך 30 דקות ב-400 GS וטמפרטורת החדר, ה-pbmc יתיישב בשכבת הממשק הלבנה והעכורה בין הפלזמה לאריזה הגבוהה.בעזרת פיפטת העברה סטרילית, העבירו את ה-P BMCs לצינור חרוטי של 15 מיליליטר והביאו את הנפח עד 10 מיליליטר עם DPBS טריים. לאחר מכן, לאחר ספירת התאים, העבירו פעמיים כפול 10 לששת ה-P BMCs לתוך צינור חרוטי חדש של 15 מיליליטר וסובבו את התאים הנותרים, הקפיאו את התאים הגלולים בריכוז כפול 10 ל-6 pbmc למיליליטר בסרום בקר עוברי 90% עם 10% דימתיל סולפוקסיד. לאחר מכן, לאחר סיבוב ה-BMCs P שהונחו בצד, אנו תולים את הגלולה בשני מיליליטר של מדיום התפשטות טרי שהוכן ומצלחים אותם לבאר אחת של צלחת תרבית רקמות של 12 בארות דוגרים על התאים באינקובטור לח של 37 מעלות צלזיוס עם אטמוספירה של 5% חמצן, 5% פחמן דו חמצני ו-90% חנקן.לאחר מכן, ביום השלישי והשישי, החלף את המדיה על ידי איסוף התאים מהבאר. שטיפת הבאר בשני מיליליטר QBSF 60 כדי לאסוף את כל התאים שנותרו, כדורי התאים על ידי צנטריפוגה, ולאחר מכן החייאת הגלולה בשני מיליליטר של מדיום התפשטות טרי. לאחר מכן החזירו את התאים לאותה צלחת 12 בארות והמשיכו את הדגירה ביום התשיעי, פיפטה את הפלסמידים המתכנתים מחדש לצינור עינור סטרילי של 1.5 מיליליטר כמתואר בטבלה.לאחר מכן, מערבבים את תמיסת החיבה של הנוקליאו עם התוספים המסופקים על ידי היצרן ומעבירים את התערובת לצינור DPH סטרילי של 1.5 מיליליטר. לאחר מכן מחלקים שני מיליליטר של מדיום התפשטות לבאר אחת של צלחת חדשה של 12 בארות ומאזן את המדיום בחממה הלחה של 37 מעלות צלזיוס עד שהתאים מוכנים. אסוף את התאים, שטוף היטב את תרבית התאים כפי שהודגם זה עתה ושטוף את התאים בחמישה מיליליטר DPBS.לאחר מכן, השעו את גלולת התא ב-100 מיקרוליטר של תמיסת חיבה גרעינית בתוספת תוסף תוך הקפדה על יצירת בועות והעברת תרחיף התא לתוך הצינור המכיל את הפלסמיד המתכנת מחדש. מערבבים את התאים על ידי פיפטינג למעלה ולמטה פעם אחת ומעבירים את התמיסה כולה לתחתית ווט חיבה גרעיני. לאחר מכן הכנס את הווט למכונת החיבה של Nucle והפעל את תוכנית T 0 1 9.כעת הוסף 100 מיקרוליטר של מדיום ההרחבה EQUILIBRATED לבדיקת חיבה גרעינית, ואסוף מיד את כל הדגימה תוך הימנעות מכל פסולת תאים מתים צפים לבנים והפקיד אותה לבאר של המדיום הקדם-חם. לאחר מכן הכניסו את התאים בחזרה לאינקובטור הלח ביום 10 או 11. מצפים כל באר של צלחת תרבית רקמות של שש בארות בג'לטין במיליליטר אחד של 0.1% ג'לטין ב-HBSS, ולאחר מכן מניחים את הצלחת באינקובטור הלח או לפחות חמש דקות במהלך הדגירה מעבירים בקבוקון אחד של הפשרה, פעמיים כפול 10 לשש עכברים מוקרנים 3000 מעלות צלזיוס, עובריים, פיברובלסטים או MES לתוך 10 מיליליטר של מדיה מת' חמה מראש, ואז צנטריפוגה של התאים בזמן שהתאים מסתובבים מטה.שאפו את תמיסת הג'לטין מצלחת שש הבארות, ולאחר מכן השעו מחדש את ה-mes ב-12 מיליליטר של מדיה מת' טרייה. מוציאים מיד שני מיליליטר OFM לכל באר של ציפוי הג'לטין. שש. צלחת טובה והנח את הצלחת בחזרה לאינקובטור הלח עד יום 12.ביום ה-12, אספו את התאים הנגועים בגרעין מהבאר לתוך צינור חרוטי אחד של 15 מיליליטר, ושטפו את הבאר כפי שהודגם כדי לאסוף את כל התאים שנותרו. לאחר סיבוב התאים, אנו משעים את הגלולה ב-12 מיליליטר של מדיום תכנות טרי שהוכן מחדש, ומחלקים שני מיליליטר תאים לכל באר של תאי הזנה. בצלחת שש הבארות צנטריפוגה את הצלחת למשך 30 דקות ב-75 GS וטמפרטורת החדר, ולאחר מכן הנח את הצלחת בחזרה לאינקובטור הלח, והחלף את המדיום כל יומיים למשך שבוע עד שבועיים.לאחר הופעת מושבות התאים הפלוריפוטנטיות הניתנות להשראה, התחל להזין את התאים במדיום תאי גזע עוברי אנושי טרי שהוכן המכיל מעכבי היסטון דאצטילאז שלושה ימים לאחר חיבה לגרעין ולפני הציפוי, התאים המושפעים מהגרעין על המת' הניתן להשראה. יש להעריך את היעילות של חיבה גרעינית מוצלחת של NU על ידי מיקרוסקופיה פלואורסצנטית עבור EGFP, למשל, מוצג כאן ניסוי חיבה גרעיני טיפוסי עם כחמישה עד 10% מכלל אוכלוסיית התאים המבטאת מושבות תאי גזע פלוריפוטנטיות מתוכנתות מחדש של EGFP יתחילו להופיע כשבועיים לאחר החיבה הגרעינית של NU. המושבות הן בדרך כלל עגולות עם גבולות מוגדרים היטב וניתן לזהות אותן על ידי המורפולוגיה האופיינית של תאי גזע עובריים אנושיים, כולל תאים קטנים ארוזים היטב עם יחס גרעיני לציטופלזמי גבוה וגרעינים גלויים של הקווים המייצגים שאופיינו במלואם.כל הבדיקות החיוביות לפעילות פוספטאז אלקליין מבטאות את סמני הפלוריפוטנטיות הסטנדרטיים ומפעילות מחדש גנים פלוריפוטנטיים אנדוגניים לאחר שליטה. טכניקה זו יכולה ליצור באופן עקבי IPSC ללא אינטגרציה תוך ארבעה שבועות אם היא מבוצעת כראוי. לאחר הליך זה, ניתן לבצע מחקרי התמיינות כדי לענות על שאלות לגבי כל סוג רקמה.

efficient-ips-cell-generation-from-blood-using-episomes-hdac

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

תאי גזע pluripotent מושרה קווים מניבים (iPSC) מייצרים שורות של פוטנציאל ההתפתחותי שונים גם כאשר הם עוברים בדיקות תקן לpluripotency. כאן אנו מתארים פרוטוקול לייצר עכברים נגזרים לחלוטין מiPSCs, המגדיר את קווי iPSC כבעל pluripotency...

דור של עכברים שמקורם בתאי גזע pluripotent מושרים

כאן אנו מציגים פרוטוקול פשוט ויעיל עבור הדור של iPSCs אדם ממ"ל של 3-4 דם היקפי באמצעות וקטור תכנות מחדש lentiviral אחת. תכנות מחדש של תאי דם זמינים ונגישים מבטיח להאיץ את הניצול של טכנולוגית iPSC ידי ההפיכה לנגישה לקהילת מחקר רחבה יותר.

דור של תאים אנושיים מושרים pluripotent גזע מדם היקפי באמצעות STEMCCA lentiviral הווקטור

כאן, אנו מציגים שיטה הוקמה לתכנת מחדש תאים סומטיים אנושיים לiPSCs אדם נטול transgene בוירוס סנדאי, אשר מראה תוצאות עקביות ויעילות משופרת.

תאי גזע יעיל דור מושרה אדם פלוריפוטנטיים מתאים הסומטיים של אדם עם סנדאי וירוס

תאים מושרה pluripotent גזע (iPSCs) מהווים מקור של רקמות מטופל ספציפי ליישומים קליניים ומחקר בסיסי. כאן, אנו מציגים פרוטוקול מפורט לתכנת מחדש תאים אנושיים היקפיים mononuclear הדם (PBMNCs) המתקבלים ממעיילי אפים קפואים לiPSCs הנגיפי ללא שימוש בפלסמידים episomal הלא שילוב.

דור של גזע תאים המושרה pluripotent מקפוא באפי מעילים באמצעות Episomal פלסמידים ללא שילוב

אנו מציעים פרוטוקול לתכנות מחדש של תאים חד-גרעיניים בדם היקפי (PBMCs) לתאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים (iPSCs). על ידי ציפוי תאי הדם המומרים על צלחות מצופות מטריצה עם צנטריפוגה, iPSCs מושרים בהצלחה מתאים צפים. טכניקה זו מציעה פרוטוקול תכנות מחדש פשוט ויעיל עבור תאים כגון PBMCs ו-CBMCs.

נייד דור גזע מושר מתאי דם באמצעות וירוס Sendai ו צנטריפוגה

פרוטוקול זה מתאר שיטה מפורטת לייצור יעיל של iPSCs ללא אינטגרציה מתאי דם היקפיים אנושיים בוגרים. עם שימוש בארבעה וקטורים אפיזומליים מבוססי oriP/EBNA כדי לבטא את גורמי התכנות מחדש, KLF4, MYC, BCL-XL, או OCT4 ו-SOX2, ניתן להשיג אלפי מושבות iPSC מ-1 מ"ל של דם היקפי.

דור של תאי גזע מושרים אינטגרציה נטולה מן אדם הדם ההיקפי mononuclear תאי שימוש וקטורי Episomal

זה הפרוטוקול מתאר בפירוט הדור של תאי גזע pluripotent המושרה ללא טביעת רגל (iPSCs) מתאי הלבלב האנושי בתנאים ללא מזין, ואחריו עריכה באמצעות ribonucleoproteins CRISPR/Cas9 ואפיון שונה תא בודד שיבוטים.

דור יעיל ועריכה של נטול מזין IPSCs מתאי הלבלב האנושי באמצעות מערכת CRISPR-Cas9

פרוטוקול זה ממחיש את האינדוקציה של תוכנית המטוגניים בתוך הגוף האנושי פיברותקיעות על ידי ביטוי נאכף של הגורמים שעתוק GATA2, GFI1B ו-FOS כדי ליצור גזע המטפאות ובתאי קדמון.

הומוגניים מתיכנות מראש של האדם פיברותקיעות על ידי ביטוי שנאכף של גורמים שעתוק

מתכנות התא מחייב הקדמה של גנים מרכזיים, אשר לווסת ולתחזק את מצב התאים pluriפוטנטי. הפרוטוקול המתואר מאפשר היווצרות של תאי גזע מושרה pluripotent iPSCs) מושבות של האדם המעטפת הגוף ללא ויראלי/שילוב שיטות אך באמצעות RNAs שאינו משתנה (ננומטר-RNAs) בשילוב עם גורמי התחמקות החיסון הפחתת מנגנוני ההגנה הסלולריים.

בידוד של האדם למבוגרים פיברוכדורים מעור הבטן הדור של המושרה בתאי גזע Pluriפוטנטי באמצעות שיטה שאינה משלבת

הפרוטוקול הנוכחי מפרט שלבים לאיתור תאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים (iPSC) מתאי דם מונו-גרעיניים היקפיים (PBMCs) של דגימות מטופלים, שקשה היה לתכנת מחדש בהתאם להוראות היצרן. פרוטוקול זה ייחודי לדגימות שכבת באפי קפואה, אך ניתן ליישמו גם לתכנות מחדש של PBMCs מטוהרים.

תכנות מחדש של קווי תאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים מדגימות מעילי באפי קפוא

למד לייצר תאי גזע iPS ללא שילוב גנומי מדם פריפרי באמצעות פלסמידים אפיזומליים ומעכבי HDAC. שיטה זו מבטיחה יעילות גבוהה ומזערית סיכוני מוטגנזה להשתלות עתידיות.

דור יעיל iPS תא מהדם באמצעות Episomes וHDAC המעכבים

גלה סרטונים נוספים