בידול יעילות גבוה של תאי גזע pluripotent האדם לשריר לב ואפיון על ידי cytometry הזרימה

המטרה הכוללת של הליך זה היא לייצר תרביות קרדיומיוציטים באיכות גבוהה מתאי גזע פלוריפוטנטיים ולאפיין כראוי את התוצר הסופי באמצעות ציטומטריית זרימה. כדי להשיג איכות גבוהה זו נוצרות תרביות חד-שכבתיות של תאי גזע פלוריפוטנטיים לא ממויינים. לאחר מכן מושרה מיוגנזה קרדיולוגית על ידי ויסות מסלול הרוח באמצעות מולקולות קטנות.

לאחר מכן, הקרדיומיוציטים מקובעים, מחלחלים ומוכתמים בתנאים המותאמים במיוחד לכל נוגדן. לבסוף, התאים מנותחים על ידי ציטומטריית זרימה. בסופו של דבר, ניתן להשיג תוצאות המראות תרביות חיוביות מאוד לסמנים לבביים, TNNI 3 ו-IRX 4 ומדגימות פוטנציאל פעולה דמוי חדר.

היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות כמו אלו בגופי עובדים וצמות, הוא שהיא פשוטה יחסית ליישום וחסכונית. יתר על כן, הטכניקה מייצרת תרביות של תאים חיוביים מאוד לכל טרופונין לבבי I.ללא השונות והיעילות הבסיסית הפנימית שנצפתה על ידי פרוטוקולים אחרים, הדגמה חזותית של השיטה היא קריטית מכיוון שאיכות התאים לפני ההתמיינות תשפיע באופן משמעותי על יעילות ההתמיינות. כמו כן, קיבוע לא תקין וחדיר לפני צביעת נוגדנים יוביל לתוצאות ציטומטריית זרימה לא אופטימליות המדגימות את ההליך יהיה שאבו בכר, סטודנט לתואר שני מהמעבדה שלי.

ההיבט המאתגר ביותר בהליך הבא הוא שמירה על תאי גזע פלוריפוטנטיים לא ממוינים באיכות גבוהה לפני התמיינות. השימוש בתאים בעלי מאפייני גידול לא אופטימליים ישפיע באופן משמעותי על יעילות ההתמיינות. התחל הליך זה עם HPCs מבוססים היטב הגדלים בשישה כלים מצופים מטריצה מוסמכים היטב HESC.

בדוק את התאים מתחת למיקרוסקופ כדי לוודא שהם מציגים מורפולוגיה הומוגנית. אם התאים מציגים אפיתל עצבי או פיברובלסט כמו מורפולוגיה כפי שמוצג כאן, אין להשתמש בהם. ודא שהתאים מתרבים בחוזקה כאשר הם יושבים ב-0.75 מיליון לבאר עוברים אותם בערך כל שלושה ימים ב-75%מפגש מעבר התאים עם דיסוציאציה לרמת התא הבודד לפחות חמש פעמים לפני תחילת ההתמיינות למעבר.

התאים שואבים תחילה את מדיום הגידול E שמונה ושוטפים את התאים פעמיים עם ארבעה מיליליטר PBS מחממים מראש לטמפרטורת החדר. לאחר מכן, הוסף מיליליטר אחד של תמיסת ניתוק תאים בטמפרטורת החדר לכל באר והשאיר את הבאר ללא הפרעה עד שגבולות התא מתחילים להתעגל. זה בדרך כלל לוקח שלוש עד שבע דקות וניתן לצפות בו באופן מקרוסקופי ולאשר אותו באמצעות מיקרוסקופ.

לאחר מכן, באמצעות פיפטת זכוכית סתומה מכותנה עם נורה עקרה את התאים והעבירה אותם לצינור חרוטי של 15 מיליליטר המכיל מיליליטר אחד של מדיום DM EMF 12. פעולה זו תשבית את פתרון ניתוק התאים. הסר 10 מיקרוליטר מתמיסת התא וערבב אותו עם 10 מיקרוליטר טריאן כחול בצינור מיקרו צנטריפוגה.

ספרו את התאים ואז אספו אותם צנטריפוגה, הצינור החרוטי של 15 מיליליטר ב-130 GS למשך חמש דקות. בטמפרטורת החדר במהלך הצנטריפוגה סופרים את התאים באמצעות ציטומטר המו אוטומטי. צפו לכדאיות של 70 עד 80% בהמשך.

בסס את כל מספרי התאים על ספירת התאים הכוללת בניגוד לספירת תאים בת קיימא. לאחר שהספין שואב את המדיום ומשעה מחדש את כדור התא ב-D-M-E-M-F 12 לריכוז סופי של 0.75 כפול 10 לששת התאים לכל 500 מיקרוליטר, הוסף 0.5 מיליליטר של תרחיף התא לכל באר של צלחת שש בארות שבה כל באר מכילה שני מיליליטר של E שמונה מדיום. עם מעכב סלעים, נדנד בעדינות את הצלחת מלפנים לאחור ומצד לצד כדי לפזר את התאים באופן אחיד על פני הבאר.

מחזירים את התאים לחממה ב-5% פחמן דו חמצני ו-37 מעלות צלזיוס. 24 שעות לאחר האריזה. התחל להחליף את המדיום מדי יום באמצעות שני מיליליטר לבאר של E 8 ללא מעכב סלעים.

בצע אופטימיזציה של צפיפות הזריעה כדי להשיג מפגש של 100% לפני תחילת ההתמיינות. ביום האפס, התאים מתכנסים ב-100% עם מורפולוגיה קומפקטית ופסולת תאים מינימלית. התחל את תהליך ההתמיינות על ידי החלפת מדיום E שמונה בשני מיליליטר של התמיינות. בינוני.

ראשית, הוסף 1.2 מיקרוליטר CHIR לכל אחד. ובכן, בימים הראשון והשני, מקובל לראות מוות משמעותי של 40 עד 50% תאים. עם זאת, התאים המחוברים ישמרו על מורפולוגיה קומפקטית.

במהלך תקופה זו, המדיום הופך לכתום ועכור. אם נצפה מדיום ורוד, המעיד על מוות מוגזם של תאים, אשר את כדאיות התאים עם טריאם כחול והפסק אם מוות התאים עולה על 70%אחרת, ביום הראשון, חזור על תהליך החלפת המדיה בשני מיליליטר של התמיינות טרייה. בינוני. ראשית, הוסף 1.2 מיקרוליטר CHIR לכל באר ובימים שניים עד שלושה, החלף במדיום התמיינות טרי.

ראשית, במהלך הימים השלישי עד הרביעי, התאים יתאוששו והצפיפות תגדל ביום הרביעי. החלף את המדיום בכל באר בבידול טרי. בינוני מספר אחד ומיקרוליטר אחד של IWR one.

במהלך הימים החמישי עד השישי, מתרחש מוות תאים מינימלי וכתמים צפופים עשויים להתחיל להופיע ביום החמישי, ולהחליף את המדיום בהתמיינות חדשה. בינוני מספר אחד, והוסף מיקרוליטר אחד של IWR אחד לכל באר ביום השישי עד השביעי, החלף את המדיום בבידול טרי. בינוני מספר אחת.

ביום השביעי עד השמיני, מושגת שכבה חד-שכבתית עם מורפולוגיה קומפקטית משובצת בכתמים צפופים. ביום השמיני, התאים יתחילו להתכווץ באופן ספונטני וההתכווצויות הראשונות יהיו לרוב גלויות בכתמים הצפופים. ביום השמיני, החלף את המדיום בבידול טרי. בינוני.

מספר שתיים, המשיכו להחליף באמצעי דיפרנציאציה מספר שתיים, כל יומיים למשך התרבות. ביום ה-10 נצפית התכווצות חזקה יותר ותמשיך להתפשט ברחבי התרבית בימים הבאים. הסרטון הזה מראה את התאים ביום ה-30, וכאן התאים מוצגים ביום ה-55.

כדי לאסוף תאים לזרימה ציטומטרית, בצע את איסוף הדיסוציאציה והספירה של התאים כפי שבוצע קודם לכן. שימו לב שאין צורך לשמור על התאים סטריליים בשלב זה. תוך כדי מערבולת עדינה של גלולת התא, הוסף 100 מיקרוליטר של תמיסת קיבוע לכדור התא טיפה.

לאחר מכן דגרו את הצינור על קרח למשך 15 דקות. הוסף שלושה מיליליטר תמיסת שטיפת תאים, אסוף תאים על ידי צנטריפוגה לאחר הסיבוב, שאב את התמיסה תוך כדי מערבולת. הוסף 100 מיקרוליטר של תמיסה חדירה לכדור התא טיפה כמו קודם.

לאחר מכן דגרו את הצינור על קרח למשך 30 דקות. הוסף שלושה מיליליטר תמיסת שטיפת תאים. אוספים את התאים על ידי צנטריפוגה ושואבים את התמיסה.

חזור על הפעולה בסך הכל שתי כביסות לאחר החלחול. בצע צביעת נוגדנים כמתואר במסמך הנלווה באמצעות פיפטה P 1000 ב-400 מיקרוליטר של תמיסת תחזוקת תאים לתאים ופירוקם על ידי פיפטינג למעלה ולמטה. לאחר מכן, הרטיבו מראש מכסה מסננת תאים על צינור תחתון עגול עם 50 מיקרוליטר של תמיסת תחזוקת תאים.

הנח את הצינור על קרח. מכסה מסננת התאים מונע מצברי תאים לסתום את ציטומטר הזרימה. לאחר מכן, העבירו את תמיסת התא למכסה מסננת התא ואפשרו לתרחיף התא להתנקז על ידי כוח הכבידה.

הקש בעדינות על תחתית הצינור על החלק העליון של הספסל כך שהתאים ייאספו לתוך צינור. הנח את הצינור בחזרה על קרח במהירות האפשרית. שטפו את המסננת עם 250 מיקרוליטר של תמיסת תחזוקת תאים כדי להבטיח התאוששות מקסימלית של התאים.

שמור על התאים על הקרח והגן עליהם מפני אור עד שהם מנותחים על ידי ציטומטריית זרימה כדי לקבוע את איכות הקרדיומיוציטים שנוצרו. באמצעות פרוטוקול זה, התאים התמיינו במשך 10 ימים ונצבעו בנוגדנים כנגד TNNI 3 a, סמן פאן קרדיומיוציטים, TNNT 2 סמן שריר מפוספס וסמן IRX 4 A קרדיומיוציטים חדריים. שימו לב שקיבוע ותנאים חדירים עברו אופטימיזציה עבור כל נוגדן כדי להשיג את האחוז המקסימלי של תאים חיוביים.

היסטוגרמות מראות כי 99% מהתאים המגודררים היו חיוביים ל-TNNI 3 ו-96% היו חיוביים ל-IRX 4. בנוסף, התאים היו חיוביים מאוד לסמנים אחרים של התמיינות לבבית, כולל TNNT 2, MLC 2 V ו-MLC 2. הערה כי הקביעה לגבי טוהר הקרדיומיוציטים וזהות התא מבוססת על TNNI 3 ו-IRX 4.

צביעת MC 2 V ו-MC 2 A אינה מוגבלת בתא במהלך ההתפתחות ו-TNNT 2 נמצא גם בשרירי השלד. פוטנציאל הפעולה המוצג כאן נרשם מהתכווצות ספונטנית של קרדיומיוציט בודד ביום ה-46 של ההתמיינות באמצעות הידוק טלאי תא שלם. פרופיל פוטנציאל הפעולה מצביע על כך שהתקבלו קרדיומיוציטים דמויי חדרים.

נצפה גם אחוז קטן של פרופילים דמויי צמתים. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לייצר תרביות באיכות גבוהה של קרדיומיוציטים מתאי גזע פלוריפוטנטיים וכיצד לאפיין אותם על ידי ציטומטריית זרימה. בדרך כלל, אנשים חדשים בשיטה זו יתקשו בגלל האתגרים הנפוצים בהם נתקלים בשמירה על תאי הגזע כחד-שכבות באיכות גבוהה לפני תחילת ההתמיינות.

אל תשכח שעבודה עם מקבע יכולה להיות מסוכנת ואישית. יש ללבוש תמיד ציוד מגן כגון מעיל מעבדה או כפפות בעת ביצוע הליך זה.